JP2022500070A - プログラム可能なsiRNA及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年8月10日に出願の米国仮特許出願第62/717,686号及び2019年2月27日に出願の米国仮特許出願第62/811,183号に対する優先権を主張し、それらの内容は、図面を含め、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、National Science Foundation(NSF)によって授与された助成金番号NSF EFRI-ODISSEI 1332411及びCMMI-SNM 1120890の下で、政府の支持によって部分的になされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
プログラム可能な、条件的に活性化されたsiRNA(Cond-siRNA)を開発するためのアプローチが、本明細書で開示される。これらの単純なリボスイッチは、哺乳動物サイトゾルにおいて数日間にわたってその完全性を維持することができ、足掛かり媒介性の鎖置換を介して、特定のインプット鎖の遺伝子からの細胞内のRNA転写物を検出することができる。インプット鎖検出の際に、Cond-siRNAは、インプット鎖から完全に独立した配列を有する特定された標的遺伝子をサイレンシングする強力なRNAiトリガー9を放出することができる。実施例において実証されるように、数十のCond-siRNAバリアントのスイッチング活性をヒト接着細胞において試験して、多様なインプット:アウトプットの組合せにわたる良好なデバイス性能を可能にする必要かつ十分な化学的改変モチーフを同定した。一部の最適化されたCond-siRNAは、配列マッチしたRNA転写物を発現する細胞において、標的遺伝子の90%を超えるサイレンシング(ベースラインと比較したタンパク質発現)を達成し、ミスマッチしたインプット鎖を発現する細胞において、強く抑制されたバックグラウンドRNAi活性(<25%ノックダウン)を達成した。したがって、生きた哺乳動物細胞における鎖置換スイッチの性能を実質的に改善する方法が本明細書において提供される。Cond-siRNAテクノロジーは、遺伝子発現により活性化されたRNAiスマートドラッグ(smart drug)のための実用的かつ多用途のプラットフォームを提供する。
Cond-siRNAのためのインプット鎖は、Cond-siRNAのスイッチをオンにする「トリガー」であり、通常、標的化細胞(例えばがん細胞)においては比較的高い発現量で存在し、非標的化細胞(例えば正常細胞)においては比較的低い発現量で存在する、細胞内のRNA転写物である。開示されたCond-siRNA構築物の設計に基づいて、標的化細胞においてのみRNAiはオンにされる;一方、非標的化細胞においては、RNAiはオフ状態のままである。標的化細胞においては、インプット鎖は、非標的化細胞中よりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍又は少なくとも100倍高いレベルで発現される。あるいは、標的化細胞においては、インプット鎖は、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも600個、少なくとも700個、少なくとも800個、少なくとも900個、少なくとも1000個の転写物のレベルで発現される;非標的化細胞においては、インプット鎖は、50個未満、40個未満、30個未満、20個未満又は10個未満の転写物のレベルで発現される。好ましくは、非標的化細胞は、インプット鎖の検出可能な発現を有さない。
本明細書に開示するように、以下に例示される反復プロトコールを使用して、インプット鎖及び標的の特異的な塩基対形成のためのCond-siRNA構築物を設計する:
1.以前に確証されたsiRNA、文献又はsiRNA設計ツールから、RNAiドメインのためのガイド鎖配列を得る。一部の態様では、ガイド鎖は、21ntのサイズを有する。
2.4つのG/Cリッチ塩基をガイド鎖の5’に付加することによって、選択されたガイド鎖からDicer基質を創出する。一部の態様では、Dicer基質は、23bpのサイズを有する。Nupack(RNA鎖、Mathewsら 1999のパラメーター、ある程度のダングル処理(some dangle treatment))を使用して、1nM濃度のガイド(アンチセンス)鎖及びセンス鎖において、95%を超える確率でRNAi二重鎖が形成されることを確認する。
3.インプットバイオマーカーの配列から、インプット鎖に対してアンチセンスである全ての可能なセンサーセグメントのリストを生成する。一部の態様では、センサーセグメントは、サイズが31〜33ntである。CBFβ(CBFB)−MYH11融合配列について、図3bに示すパラメーターをおよそ満たすセンサーセグメントのみを検討した。
4.NCBI BLASTを使用して、標的動物のトランスクリプトームにおけるユニークさについて、センサー配列をランク付けする。ヒトがん細胞株について、BLASTnアルゴリズムを使用して、ヒト転写物及びゲノムコレクションに対して配列を確認した。可能な場合、既知の又は予測されたRNA転写物に対して17塩基を超える配列相補性を有し、完全なオーバーハング相補性を有するセンサーセグメントを排除する。
5.最もユニークなセンサーセグメントから出発して、コア鎖配列を、Cond-siRNAのための所望の構造パラメーターに従って構築する。コア鎖は、形態5’−B−C3−P−C3−A−3’の配列を有し、式中、A及びBはセンサー鎖の推定二重鎖ドメインの5’末端及び3’末端に対して相補的で、Pは推定ガイド鎖に対して相補的で、C3はC3リンカーである。
6.Nupackを使用して、センサー鎖セグメントとそれらの対応する5’及び3’コア鎖オーバーハングとの間で形成される二重鎖の熱力学的安定性をランク付けする。RNA鎖、Mathewsら 1999のパラメーター、ある程度のダングル処理ありを使用する。理想的には、95%を超える鎖が、1nMの鎖濃度で塩基対を形成するはずである。コア鎖が、程度が大きな内部二次構造を有さないことも検証する。
7.工程1〜6で生成された最良の構築物(ガイド鎖、コア鎖及びセンサー鎖の配列)を選択する。
8.本明細書で開示する化学的改変を付加する。
9.オリゴヌクレオチド設計ツール、例えば「LNA Oligo Tm Prediction」(www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/technologies-and-research-topics/lna/custom-lna-design-and-applications/lna-design-tools-calculators/lna-oligo-tm-prediction/)又は「LNA Oligo Optimizer」(www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/technologies-and-research-topics/lna/custom-lna-design-and-applications/lna-design-tools-calculators/lna-oligo-optimizer/)を使用して、LNA改変の配置を最適化する。LNA改変を、センサー鎖に、3〜4塩基毎におよそ1つのLNAで付加する。「LNA Oligo Optimizer」ツールを使用して、使用するLNAのパターンが60を超えるスコアの二次構造も自己塩基対形成の相互作用ももたらさないことを確認する。自己相補性スコア及び自己塩基対形成スコアを、可能な限り最小化する。「LNA Tm Prediction」ツールを使用して、RNAと塩基対を形成した場合のLNA改変オリゴのTmを確認する。「LNA Oligo Optimizer」ツールを使用して、60を超えるスコアの自己塩基対形成の相互作用及び二次構造を回避しつつTmを最大化する配置を選択する。
図12に示すように、一部の態様では、コア鎖は以下の特徴の1つ以上を有する。
a.5’上の末端塩基は、2’-F、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である。
b.3’上の末端塩基は、2’-F、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である。
c.5’上の3つの末端塩基は、パターンMRMを有し、式中、Mは、改変された塩基(2'-O-メチル、2'-F)であり、Rは、RNA塩基である。
d.3’上の3つの末端塩基は、パターンMRMを有し、式中、Mは、改変された塩基(2'-O-メチル、2'-F)であり、Rは、RNA塩基である。
e.3’及び5’上の3つの末端塩基は、連続したPS骨格改変を有さない。
f.センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の部分は、交互の化学的改変パターン(MR)nを有する。
g.上記において、Mは、等価なRNA塩基と比較した場合に二重鎖のTmを減少させない化学的に改変された塩基である。
h.コア鎖の5’末端及び3’末端が、a〜gの特徴の少なくとも1つを有する、上記の任意の組合せ。
i.センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の3’及び5’領域I及びIIIが、以下である:
(a)パターン(M)nで完全にできており、式中、Mは、2'-O-メチル又は2'-F改変された塩基である、あるいは
(b)この領域中の塩基の少なくとも50%は、2'-O-メチル又は2'-Fであり、かつ
骨格結合の30%、50%、80%又は100%以下は、ホスホロチオエートではない。
a.M*+*Mパターンであって、式中、Mが、2’改変された塩基(例えば2'-O-メチル又は2'-F)であり、*が、PS骨格結合であり、+が、LNA塩基又は他の2’−4’架橋した塩基である、パターン、
b.上で定義したとおりの、M*+*+パターン、
c.+*+*+パターン、
d.R*+*Mパターンであって、式中、Rが、RNA塩基である、パターン、
e.R*+*+パターン、
f.+*M*Mパターン、及び
g.a〜fのパターンであって、式中、*が、PS結合又は未改変の(ホスホジエステル)結合のいずれかであることができる、パターン。
a.M*Rパターンであって、式中、Mが、2’改変された塩基(例えば2'-O-メチル又は2'-F)であり、*が、PS結合であり、Rが、LNA塩基又は他の2’−4’架橋した塩基である、パターン、
b.上で定義したとおりの、M*Mパターン、
c.+*Mパターン、
d.+*Rパターンであって、式中、Rが、RNA塩基である、パターン、
e.+*+パターン、
f.M*+パターン、及び
g.a〜fのパターンであって、式中、*が、PS結合又は未改変の(ホスホジエステル)結合のいずれかであることができる、パターン。
図12に示すように、一部の態様では、センサー鎖は以下の特徴の1つ以上を有する。センサー鎖は、5’オーバーハング、3’オーバーハング又は両者を有する。
配列(5’−>3’)
ガイド鎖A:mCmG CGUCUGAGGGAUCUCUAGU UACCUU
ガイド鎖B:mCmG+CGUCUGAGGGAUCUCUAGU+TACCUU
3’パッセンジャーセグメント:cccucagacg mc*mg* 9s idT
5’パッセンジャーセグメント
0(対照):c3 mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU
1:C G A C G A G C U C A U C A c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU
2:18s *C*G*A*C*G*A*A*G*C*U*C*A*U*C* c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU
3:18s *C*G*A*C*G*A*A*G*C*U*C*A U C c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU
4:18s *C*G*A*C G A G C U C A U C c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU
ノーザンプローブ:ATCTCTAGTTACC
L:Ambion decadeマーカー
9s:トリエチレングリコールスペーサー
18s:ヘキサエチレングリコールスペーサー
C3:C3スペーサー
idT:逆位dT
*:ホスホロチオエート結合。
A.図3a中の強調された領域C、「化学的改変のスクリーニングのための領域」が、以下の特徴の1つ以上を有する、センサー鎖の使用:
a.骨格結合の50%以下が、ホスホロチオエート(PS)結合である
b.塩基の50%以上が、ヌクレアーゼ分解に抵抗するように、又は二重鎖の融解温度(Tm)を増加させるように、化学的に改変されている
c.塩基の100%が、ヌクレアーゼ分解に抵抗しかつTmを増加させるように、化学的に改変されている
d.塩基の約10%〜50%が、ロック核酸(LNA)、又はTmを実質的に上昇させる2’−4’架橋を有する他の化学的に改変された塩基である。
B.コア鎖の5’及び3’末端が、以下の特徴の1つ以上を有する:
a.5’上の末端塩基が、2'-F、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である
b.3’上の末端塩基が、2'-F、2'-O-メチル、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である
c.5’上の3つの末端塩基が、パターンMRMを有し、式中、Mが、改変された塩基(2'-O-メチル、2'-F)であり、Rが、RNA塩基である
d.3’上の3つの末端塩基が、パターンMRMを有し、式中、Mが、改変された塩基(2'-O-メチル、2'-F)であり、Rが、RNA塩基である
e.3’及び5’上の3つの末端塩基が、連続したPS骨格改変を有さない
f.センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の部分が、交互の化学的改変パターン(MR)nを有する
g.Mが、等価なRNA塩基と比較した場合に二重鎖のTmを減少させない化学的に改変された塩基である、上記の特徴
h.コア鎖の5’末端及び3’末端が、a〜gの特徴の少なくとも1つを有する、任意の組合せ
i.センサー鎖と塩基対形成するコア鎖の3’及び5’領域が、以下である:
(a)パターン(M)nで完全にできており、式中、Mが、2'-O-メチル又は2'-F改変された塩基である、あるいは
(b)この領域中の塩基の少なくとも50%が、2'-O-メチル又は2'-Fであり、かつ
骨格結合の30%、50%、80%又は100%以下が、ホスホロチオエートではない。
C.ガイド鎖の3’末端と塩基対形成した3つの塩基が、以下の特徴の1つ以上を有する、コア鎖:
a.M*+*Mパターンであって、式中、Mが、2’改変された塩基(例えば2'-O-メチル又は2'-F)であり、*が、PS結合であり、+が、LNA塩基又は他の2’−4’架橋した塩基である、パターン
b.上で定義したとおりの、M*+*+パターン
c.+*+*+パターン
d.R*+*Mパターンであって、式中、Rが、RNA塩基である、パターン
e.R*+*+パターン
f.+*M*Mパターン
g.a〜fのパターンであって、式中、*が、PS結合又は未改変の(ホスホジエステル)結合のいずれかであることができる、パターン。
D.以下の特徴の1つ以上を有するガイド鎖:
a.塩基の30%〜95%が、化学的に改変された塩基(2'-O-メチル、2'-F、LNA、2’−4’架橋した塩基)である
b.5’上の2つの末端塩基が、化学的に改変されている
c.5’上の2つの末端塩基が、少なくとも1つのLNAを有する
d.5’上の2つの末端塩基が、PS結合している
e.3’上の2つの末端塩基が共に、化学的に改変されている
f.骨格結合の約5%〜50%が、PSである
g.Dicer切断部位に隣接する塩基が、化学的に改変されていない。
インプット鎖及び標的に対して特異的な塩基対を形成するためのCond-siRNAを、反復プロトコールにより設計した。以前に確認されたsiRNA、文献又はsiRNA設計ツールから、RNAiドメインとして適切な21ntのガイド鎖配列を得た。前記ガイド鎖の5’に4つのG/Cリッチ塩基を付加することによって、23bpのDicer基質を創出した。1nMのガイド(アンチセンス)鎖及びセンス鎖において、RNAi二重鎖が95%を超える確率で形成することを、Nupack(RNA鎖、Mathews59が開示したパラメーター、ある程度のダングル処理)を使用して確認した。
LNA塩基を有する鎖は、Exiqon Inc(現在はQiagenの一部門)が合成した。LNAのない鎖は、GE Life Sciences Dharmacon(現在はHorizon Discovery Groupの一部門)が合成した。全ての鎖は、製造業者による薦めに従って、PAGE又はHPLCによる精製も行うよう発注した。
1×リン酸緩衝食塩水(PBS)中での熱的アニーリングにより、Cond-siRNAをアセンブルした。構築物は、精製を行っても、行わなくてもよい。1×TBE、10%〜15%PAGEを用いる4℃での非変性ゲル電気泳動により、構築物の品質を評価することができる。
・蓋を105℃に加熱する
・85℃で30秒間維持し、鎖を変性する
・0.1℃/秒で50℃まで冷却する
・50℃で45分間維持する
・0.02℃/秒で37℃まで冷却する
・4℃まで急速に冷却し、維持する。
構築物を50nMの設定濃度で調製し、PBS緩衝液中37℃で50nMのオリゴヌクレオチドアクチベーター(又は対照としてのPBS)と1:1で合わせて、25nMのインプットシグナル及び構築物を有する混合物を得た。次いで、構築物−インプット鎖の組合せを、PCRサーモサイクラー中、37℃で4時間インキュベートした。サンプルを回収し、直ちに1×ネイティブPAGEローディング色素中で−80℃に凍結した。実験の最後に、全てのサンプルを迅速に解凍し、非変性PAGEで分析した。
標準的な分子生物学のプロトコールを使用して、特定の挿入物のためにDNAオリゴをアニーリングし、次いで、親ベクターの指定された部位にライゲーションさせることによって、全てのクローンを製造した。DNAの配列決定により、全ての構築物の正確さを検証した。
以下に示すDNAオリゴをアニーリングし、psiCHECK 2(Promega)二重ルシフェラーゼレポーターのXhoI及びNotI部位にライゲーションした。太字のヌクレオチドはセンス標的配列である。小文字のヌクレオチドは、制限部位5’オーバーハングを示す。
アクチベーター配列をキメラtRNA転写物の一部として発現した。第1の部分は、以下にその全体を示す成熟配列、3’末端にCCAを有する改変された5 tRNALys3からなる。CCAはpre−tRNAプロセシング酵素tRNAse Zによるエンドヌクレアーゼ様切断を防止する。tRNA Pol IIIプロモーターは内部プロモーターで、tRNAmpDNAのコード配列内に含まれた。
HCT 116結腸直腸癌細胞を利用して全ての分析を行った。抗生物質を添加せず、10%胎仔ウシ血清(FBS)、1.5mM L-グルタミン(Irvine Scientific, USA)及び10mMピルベート(Irvine Scientific, USA)を添加したMcCoyの5A基本培地(Irvine Scientific, USA)を用い、加湿した5%CO2インキュベーター中37℃で細胞を維持した。
アクチベーター発現の分析を、250μLのOptiMEM及び250μLの1:50希釈Lipofectamine 2000に2μgのプラスミドDNAを加え、6ウェルプレートを用いて行った。製造業者の指示に従ってリポソームを形成し、2mLの新鮮な完全培地と共に細胞に加えた。18時間後、その後は毎日少なくとも1回、及びRNA回収の6時間前に、培地を交換した。オフ状態のcond-siRNA及び予め活性化された(オン)状態のcond-siRNAの分析を、同様に行った;示された量のRNAi複合体を、250μLのOptiMEM中の2μgのpBluescriptプラスミド(担体)に添加した。
二重ルシフェラーゼアッセイを、製造業者の指示に従ってPromega Dual-Luciferase Reporter Assay Systemを使用して実施した。RNAi標的配列を、psiCHECK-2(Promega)ベクター上のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3’UTR中にクローニングし、ホタルルシフェラーゼを対照として使用した。
各実験について、Opti−MEM(Thermo Fisher Scientific)中のpsiCHECK(Promega Corporation)レポータープラスミドのマスターミックスを調製した。このマスターミックスを分割し、pBluescript(Agilent)対照又はアクチベータープラスミドのいずれかを添加した。次いで、新たな混合物を、変動する濃度でのCond-siRNA複合体の添加のために、さらにもう一度分割した。最後に、1:50希釈のLipofectamine 2000(L2K)をプラスミド+Cond-siRNA混合物に1:1の体積比で添加して製造業者が推奨する1:100希釈のL2Kを達成し、製造業者の推奨に従って室温でインキュベートした。
このプロトコールを使用して、図5i〜5k及び図9aのデータを得た。
標的及びアクチベータープラスミドによるトランスフェクション1、時間 − 8時間。
トランスフェクション1の8時間後に、Cond-siRNAを、RNAiMAX試薬(ThermoFisher)を使用する実験において、特定したとおりの変動する濃度でトランスフェクトした。各実験条件について、PBS中の各標的/アクチベーターの組合せの実験を3回行うために、十分な量の各濃度のCond-siRNAを調製した。各Cond-siRNA希釈を、1:50のOptiMEM中RNAiMAXの等しい体積と混合し、室温でインキュベートして、製造業者の指示に従ってリポプレックスを形成させた。具体的には、48ウェルプレート中の各ウェルに、10×最終濃度の20μLのCond-siRNA(8μLのPBS+12μLのOpti−MEM)及び20μLの1:50希釈RNAiMAXからなる40μLのトランスフェクション混合物を加えた。
単一工程プロトコールでは、細胞にコトランスフェクション混合物を添加する時点を時間0とし、二工程プロトコールでは、Cond-siRNA複合体を添加(トランスフェクション番号2)する時点を時間0とする。トランスフェクションの18時間後、その後は毎日少なくとも1回、そして、溶解物調製の6時間前に、培地を交換した。
各実験について、指定された時点で48ウェルプレートを取り出した。培地を各ウェルから注意深く吸引した。次いで、ウェルを1×PBSで1回洗浄し、吸引して乾燥した。100μLの1×Promega Passive Lysis Bufferを各ウェルに添加した。次いで、プレートをアルミホイルで覆い、−80℃で凍結させたか、又は室温で約30分間の穏やかな撹拌(約70rpm)のためにシェーカー上に配置した。凍結させた場合、二重ルシフェラーゼアッセイの前に、少なくとも30分間の穏やかな撹拌によりシェーカー上で細胞を解凍した。ウェルの目視検査により細胞が十分に溶解したことを、アッセイ前に確認した。
Dual-Luciferase Reporter Assay Kit(Promega)を使用して製造業者の指示に従い、細胞溶解物をアッセイした。ウミシイタケルシフェラーゼ値を、各技術的複製物(各ウェル)において、ホタルルシフェラーゼに対して標準化した。3回の実験を平均して単一の生物学的複製物の値を得た。全てのグラフは、少なくとも3つの独立した生物学的複製物の実験の結果を示す。
Cond-siRNAの原子モデルを、Nucleic Acid Builder49及びカスタムスクリプトを使用して構築し、Accelrys(現在のBIOVIA、Dassault Systemsの一部門)Cerius45パッケージで編集して、適切な化学的改変を行った。
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配列(5’−>3’)
ガイド鎖A:mCmG CGUCUGAGGGAUCUCUAGU UACCUU(配列番号76)
ガイド鎖B:mCmG+CGUCUGAGGGAUCUCUAGU+TACCUU(配列番号77)
3’パッセンジャーセグメント:cccucagacg mc*mg* 9s idT(配列番号78)
5’パッセンジャーセグメント
0(対照):c3 mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU(配列番号79)
1:C G A C G A G C U C A U C A c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU(配列番号80)
2:18s *C*G*A*C*G*A*A*G*C*U*C*A*U*C* c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU(配列番号81)
3:18s *C*G*A*C*G*A*A*G*C*U*C*A U C c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU(配列番号82)
4:18s *C*G*A*C G A G C U C A U C c3mG*mG*mU AACUmAGAmGAmU(配列番号83)
ノーザンプローブ:ATCTCTAGTTACC(配列番号84)
L:Ambion decadeマーカー
Claims (12)
- センサー鎖、コア鎖及びガイド鎖を含む、プログラム可能な、条件的に活性化可能なsiRNA(Cond-siRNA)構築物であって、
(i)前記センサー鎖及び前記コア鎖が、センサー二重鎖を形成し、
(ii)前記ガイド鎖及び前記コア鎖が、RNAi二重鎖を形成し、かつ、
(iii)前記センサー二重鎖が、前記RNAi二重鎖に連結して、単一構造を形成する、
Cond-siRNA構築物。 - 前記センサー鎖は前記コア鎖に対して相補的でないオーバーハングを有し、前記センサー鎖のオーバーハングは、インプット鎖と相補的に結合して足掛かりを形成し、それによって、前記センサー鎖の前記コア鎖からの置換を引き起こすことが可能である、請求項1に記載のCond-siRNA構築物。
- 以下のA〜Dの化学的改変の1つ以上:
A.強調した領域Aが以下のa〜dの特徴の1つ以上を有するセンサー鎖の使用:
a.骨格結合の50%以下がホスホロチオエート(PS)結合である;
b.塩基の50%以上が、ヌクレアーゼ分解に抵抗するように又は二重鎖の融解温度(Tm)が上昇するように、化学的に改変されている;
c.塩基の100%が、ヌクレアーゼ分解に抵抗し、かつTmが上昇するように、化学的に改変されている;
d.塩基の約10%〜50%が、ロック核酸(LNA)、又は前記Tmを実質的に上昇させる2’−4’架橋を有する他の化学的に改変された塩基である;
B.前記コア鎖の5’末端及び3’末端が以下のa〜iの特徴の1つ以上を有する:
a.5’上の末端塩基が、2'-F塩基、2'-O-メチル塩基、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である;
b.3’上の末端塩基が、2'-F塩基、2'-O-メチル塩基、又はヌクレアーゼ切断に抵抗する他の改変された塩基である;
c.5’上の3つの末端塩基が、パターンMRMであり、ここで、Mは改変された塩基(2'-O-メチル塩基、2'-F塩基)で、RはRNA塩基である;
d.3’上の3つの末端塩基が、パターンMRMであり、ここで、Mは改変された塩基(2'-O-メチル塩基、2'-F塩基)で、RはRNA塩基である;
e.3’及び5’上の3つの末端塩基が、連続したPS骨格改変を有さない;
f.前記センサー鎖と塩基対形成する前記コア鎖の部分が、交互の化学的改変パターン(MR)nである;
g.上記の特徴であって、Mが、等価なRNA塩基と比較した場合に二重鎖のTmを低下させない化学的に改変された塩基である特徴;
h.前記コア鎖の5’末端及び3’末端が、a〜gの特徴の少なくとも1つを有する、任意の組合せである;
i.前記センサー鎖と塩基対形成する前記コア鎖の3’及び5’領域が、
(a)パターン(M)nであり、Mは2'-O-メチル塩基若しくは2'-F塩基である、又は
(b)この領域中の塩基の少なくとも50%が、2'-O-メチル塩基若しくは2'-F塩基であり、かつ
骨格結合の30%、50%、80%又は100%以下が、ホスホロチオエートではない;
C.前記ガイド鎖の3’末端と塩基対形成した3つの塩基が以下のa〜gの特徴の1つ以上を有するコア鎖:
a.M*+*Mパターンであって、Mは2’改変された塩基(例えば2'-O-メチル塩基又は2'-F塩基)、*はPS結合、+はLNA塩基又は他の2’−4’架橋した塩基である、パターン;
b.M*+*+パターンであって、M、*及び+はaで定義したとおりである、パターン;
c.+*+*+パターン;
d.R*+*Mパターンであって、RはRNA塩基である、パターン;
e.R*+*+パターン;
f.+*M*Mパターン;
g.a〜fのパターンであって、*はPS結合又は未改変の(ホスホジエステル)結合のいずれかであってもよい、パターン;
D.以下のa〜gの特徴の1つ以上を有するガイド鎖:
a.塩基の30%〜95%が化学的に改変された塩基(2'-O-メチル塩基、2'-F塩基、LNA、2’−4’架橋した塩基)である;
b.5’上の2つの末端塩基が化学的に改変されている;
c.5’上の2つの末端塩基が少なくとも1つのLNAを有する
d.5’上の2つの末端塩基がPS結合している;
e.3’上の2つの末端塩基が共に化学的に改変されている;
f.骨格結合の約5%〜50%がPSである;
g.Dicer切断部位に隣接する塩基が化学的に改変されていない
を含む、請求項1又は2に記載のCond-siRNA構築物。 - 前記センサー鎖の二重鎖ドメインが、LNA改変、2'-O-メチル改変、又はそれら両者を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物。
- 前記センサー鎖の二重鎖ドメインが、ホスホロチオエート(PS)改変を有さない、請求項1〜4のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物。
- 前記コア鎖のいずれかの末端又は両方の末端が、PS改変又は2'-O-メチル塩基のいずれかを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物。
- LNA改変、2'-O-メチル改変、PS改変、又はそれらの組合せを含む前記化学的改変が、足掛かりドメイン中にある、請求項2〜6のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物。
- 前記センサー二重鎖が23bpで、前記RNAi二重鎖が23bpである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物。
- 合成RNAiを活性化する方法であって、請求項1〜8のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物を対象に投与することを含み、インプット鎖が前記センサー鎖に結合して、前記センサー鎖の前記Cond-siRNAからの置換を引き起こし、それによって、前記Cond-siRNA構築物中のRNAiを活性化する、方法。
- 前記インプット鎖が細胞内のRNA転写物である、請求項9に記載の方法。
- 疾患又は状態を処置する方法であって、請求項1〜8のいずれか一項に記載のCond-siRNA構築物を、それを必要とする対象に投与することを含み、インプット鎖が前記センサー鎖に結合して、前記Cond-siRNAからの前記センサー鎖の置換を引き起こし、それによって、前記Cond-siRNA構築物中のRNAiを活性化し、前記RNAiが前記疾患又は状態を標的化する、方法。
- 前記インプット鎖が細胞内のRNA転写物である、請求項11に記載の方法。
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