JP6249947B2 - アニオン性ポリマーを含む、rt−pcr用組成物及び方法 - Google Patents
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Description
1)2ステップRT−PCRとも呼ばれる、非連結(uncoupled)RT−PCR;
2)単一のポリメラーゼが、RNAからのcDNA生成と、それに続くDNA増幅の両方で用いられる、単一酵素連結(coupled)RT−PCR(1ステップRT−PCR又は連続RT−PCRとも呼ばれる);
3)少なくとも2種の別個のポリメラーゼが、初期のcDNA合成と、それに続く複製で用いられる、2種(又はそれ以上)の酵素連結RT−PCR。この方法は、1ステップRT−PCR、又はワンチューブRT−PCRと呼ばれることもある。
−1つの反応溶液を含み、試薬及び生成物の取り扱いを低減する連結RT−PCRを許容し;
−RNA鋳型の初期試料の少量の使用を許容し;
−さまざまな異なる逆転写酵素の使用を許容し;
−さまざまな異なるDNAポリメラーゼの使用を許容し;
−追加の特異的反応添加剤を含有する緩衝液を含む、さまざまな異なる反応混合物緩衝液及び塩溶液の使用を許容し;
−例えば、tRNA添加剤で観察されるように、特異性及び生成物収量における悪影響を低減し;
−市販され、容易に合成でき、かつ安価な試薬で作動する。
RT−PCRでは、反応混合物を、最初に、RNA鋳型の少なくとも一部と相補的なDNA分子を合成するのに十分な温度で(適切な緩衝化剤中で)インキュベートする。逆転写反応混合物の成分としては、通常は、そこから相補的DNA(cDNA)が転写されるRNA鋳型;逆転写酵素活性を示す核酸ポリメラーゼ;及び核酸合成に必要な適切なヌクレオチド構成要素(building blocks)が挙げられる。本発明の目的のため、cDNAは、その核酸配列がRNA分子に相補的である、任意のDNA分子と定義される。RNA鋳型は、そこからcDNA分子を合成することができる、核酸配列を提供するために用いられる任意のRNA分子と定義される。RNA鋳型からのcDNAの合成は、通常は、逆転写酵素活性を示す核酸ポリメラーゼを利用することにより達成される。本発明の目的のため、逆転写酵素活性とは、RNA鋳型からcDNA分子を重合する酵素の能力を意味し、逆転写酵素は、広く逆転写酵素活性を有する任意の酵素を意味する。逆転写は、通常は、約20℃〜約75℃、好ましくは約35℃〜約70℃の範囲の温度で起こる。
鋳型RNAは、実施者にとって既知又は未知の、目的の任意のリボ核酸であることができる。鋳型RNAは、人工的に合成しても、天然供給源から単離してもよい。ある実施態様では、RNA鋳型は、RNA、mRNA、piRNA、tRNA、rRNA,ncRNA、shRNA、siRNA、snRNA、miRNA、snoRNAおよびウイルスRNA等のリボ核酸であることもできる。好ましくは、RNAはmRNAである。更に好ましくは、RNAは生物活性であるか、生物活性ポリペプチドをコードする。
本発明は、アニオン性ポリマーが、RT−PCRで観察される、逆転写酵素による核酸複製の阻害を抑制又は低減し得る阻害低減剤としての役目を果たすことの発見に関する。
本発明のアニオン性ポリマーは、核酸ではなく、本発明の酵素反応で用いられるpHで少なくとも−1の正味電荷を有し、等量の対陽イオンを含む任意の高分子と定義される。本発明の一実施態様では、酵素反応に用いられるpHにおけるアニオン性ポリマーの正味電化は、−1〜−10,0000の範囲であり、好ましくは−5〜−5,000の範囲であり、更に好ましくは−10〜−1,000の範囲であり、最も好ましくは−20〜−200の範囲である。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。本発明の一実施態様では、アニオン性ポリマーは多糖類である。本発明の他の実施態様では、アニオン性ポリマーはポリペプチドである。本発明の更に他の実施態様では、アニオン性ポリマーは、酸又は無水物である。好ましい実施態様では、アニオン性ポリマーは、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−L−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ(プロピルアクリル酸)、ポリ(メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物)、又は上記アニオン性ポリマーの2種以上の混合物からなる群から選択される。RT−PCRに用いられるアニオン性ポリマーの量は、1pg/mLより多くてもよく、好ましくは1pg/mL〜1mg/mLであり、更に好ましくは10pg/mL〜100μg/mLであり、最も好ましくは1ng/mL〜10μg/mLである。用いられるアニオン性ポリマーに応じて、RT−PCRに用いられるアニオン性ポリマーの濃度を変えてもよい。
本発明で有用な逆転写酵素は、逆転写酵素活性を示す任意のポリメラーゼであることができる。いくつかの逆転写酵素は当該技術分野で既知であり、市販されている。好ましい逆転写酵素としては、OmniScript(QIAGEN)、ニワトリ骨髄芽球腫ウイルス逆転写酵素(AMV−RT)、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV−RT)、ヒト免疫ウイルス逆転写酵素(HIV−RT)、EIAV−RT、RAV2−RT、C.ハイドロゲノフォルマン(C.hydrogenoformans)DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、スーパースクリプトI、スーパースクリプトII、スーパースクリプトIII、並びにその変異体、変種及び誘導体が挙げられる。本発明では、さまざまな逆転写を使用することができ、本発明の範囲又は好ましい実施態様を逸脱しない限り、上記に具体的に記載されていない逆転写酵素が含まれることを理解すべきである。
本発明で有用なDNAポリメラーゼは、DNA分子を複製することができる任意のポリメラーゼであることができる。好ましいDNAポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、これはPCRにとって特に有用である。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・アクティクス(Thermus aquaticus)(Taq)、サーマス・ブロキアナス(Thermus brockianus)(Tbr)、サーマス・フラバス(Thermus flavus)(Tfl)、サーマス・ルベル(Thermus ruber)(Tru)、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)(Tth)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(Tli)、及びサーモコッカス属の他の種、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)(Tac)、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)(Tne)、サーモトガ・マリチメ(Thermotoga maritime)(Tma)、及びサーモトガ属の他の種、ピュロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、ピュロコッカス・ウォエセイ(Pyrococcus woesei)(Pwo)、及びピュロコッカス属の他の種、バキュラス・ステロサーモフィラス(Bacullus sterothermophilus)(Bst)、スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)、スルホロブス・ソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)(Sso)、ピロジクチウム・オクルタム(Pyrodictium occultum)(Poc)、ピロジクチウム・アビシ(Pyrodictium abyssi)(Pab)、及びメタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクス(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)、及びその変異体、変種若しくは誘導体等の様々な好熱性細菌から単離される。
本発明で有用なオリゴヌクレオチドウライマーは、2以上のヌクレオチド長の任意のオリゴヌクレオチドであることができる。好ましくは、PCRプライマーは、約15〜約30塩基長であり、回文構造(自己相補的)又は反応混合物で用いることのできる他のプライマーと相補的ではない。プライマーは、ランダムプライマー、ホモポリマー、又は標的RNA鋳型に特異的なプライマー(例えば、配列特異的プライマー)であることができるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドプライマーは、相補的核酸の重合を促進する、標的核酸の領域とハイブリダイズするために用いられるオリゴヌクレオチドである。好ましいRT−PCR法では、プライマーはRNA鋳型の一部に相補的な第一の核酸分子(例えば、cDNA分子)の逆転写の促進に役立ち、核酸の複製(例えば、DNAのPCR増幅)の促進にも役立つ。任意のプライマーは、当業者により合成することができ、又は任意の多数の供給業者から購入することができる。本発明では、多数のアレイのプライマーを使用することができ、本発明の範囲又は好ましい実施態様を逸脱しない限り、上記に具体的に記載されていないプライマーが含まれることを理解すべきである。
本発明で有用なヌクレオチド塩基は、核酸の重合において有用な任意のヌクレオチドであることができる。ヌクレオチドは、天然に存在する、ありふれていない(unusual)、修飾された、誘導体化された、又は人工的なものであってもよい。ヌクレオチドは、未標識であってもよく、当該技術分野で既知の方法で(例えば、放射性同位体、ビタミン類、蛍光性又は化学発光性部分、ジオキシゲニンを用いて)検出可能に標識してもよい。好ましくは、該ヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド3リン酸、dNTP(例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α−チオ−dNTPs、ビオチン−dUTP、フルオレセイン−dUTP、ジゴキシゲニン−dUTP、7−デアザ−dGTP)である。dNTPは、当該技術分野で周知であり、市販されている。
本発明で有用な緩衝剤及び塩は、核酸合成のため、例えば逆転写酵素及びDNAポリメラーゼ活性のために、適切で安定なpH及びイオン条件をもたらす。本発明で有用な、さまざまな緩衝液及び塩溶液及び修正緩衝液が当該技術分野で既知であり、本明細書に具体的に開示されていない物質も含まれる。好ましい緩衝化剤としては、TRIS、TRICINE、BIS−TRICINE、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES、CAPSが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい塩溶液としては、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムの溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
逆転写、複製、及び/又は両反応の組み合わせを促進し得る他の添加剤(例えば、RT−PCR促進のための物質)、本発明により最初に開示されたもの以外の他のものが、当該技術分野で既知である。本発明の組成物及び方法によれば、RNA鋳型からの核酸の生成及び複製を最適化するため、1種以上の上記添加剤を本発明の組成物に含有させてもよい。添加剤は、有機又は無機の化合物であることができる。本発明で有用な阻害低減剤としては、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン(BSA)、オボアルブミン、アルブマックス、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、グロブリン、リゾチーム、トランスフェリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、α−ラクトアルブミン、フマラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、アミログルコシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、β−ラクトグロブリン、アプロチニン、大豆トリプシン阻害剤、トリプシノーゲン、ホスホリラーゼb、ミオシン、アクチン、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、大豆トリプシン消化物、トリプトース、レクチン、大腸菌(E.coli)一本鎖結合(SSB)タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質等のポリペプチド、又はこれらの断片若しくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。非ポリペプチド添加剤の例としては、ホモポリマー核酸、tRNA、rRNA、硫酸含有化合物、酢酸含有化合物、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)、ポリエチレングリコール(PEG)、Tween20、NP40、エクトイン、及びポリオールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい添加剤としては、ホモポリマー核酸、DMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、TMAC、PEG、Tween20、NP40、エクトイン、ポリオール、大腸菌SSBタンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、及びBSAが挙げられる。
本発明の更なる態様は、少なくとも1種の逆転写酵素、少なくとも1種のDNAポリメラーゼ、及び少なくとも1種の核酸ではないアニオン性ポリマーを含む、連結RT−PCRのための試薬キットである。このような試薬キットでは、上記逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及びアニオン性ポリマーを、1個の容器内で組合せてもよい。また、上記逆転写酵素及びDNAポリメラーゼを1個の容器内で組合せ、上記アニオン性ポリマーを第二の容器内に入れてもよい。また、上記逆転写酵素及び上記アニオン性ポリマーを1個の容器内で組合せ、上記DNAポリメラーゼを第二の容器内に入れてもよい。また、上記DNAポリメラーゼ及び上記アニオン性ポリマーを1個の容器内で組合せ、上記逆転写酵素を第二の容器内に入れてもよい。また、3種全ての成分を別個の容器に入れてもよい。上記試薬キットは、更に2種以上のdATP、dCTP、dGTP、及びdTTPの混合物、並びに/又は1種以上のRT−PCRに有用な添加剤、並びに/又は緩衝化剤を含んでいてもよい。上記の全ての成分を別個の容器に入れるか、2種以上の成分を1個の容器内で組合せてもよい。好ましくは、2種の酵素を1個の容器内で組合せ、アニオン性ポリマーを一緒に入れるか、アニオン性ポリマーを別個の容器内に入れ、存在する場合には、緩衝化剤、dNTP混合物、及び1種以上の有用な添加剤を別個の容器内でキットに提供する。
本発明の更なる態様は、連結RT−PCRのための、上記組成物又は試薬キットの使用である。
核酸ではないアニオン性ポリマー、1種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、1種以上のヌクレオチド又はその誘導体のいずれか、及び2種以上の異なるポリメラーゼを含み、該ポリメラーゼの少なくとも1種が逆転写酵素活性を有し、少なくとも1種が核酸ポリメラーゼ活性を有する、RNA鋳型から核酸を生成するのに適した組成物。
上記組成物は、更に緩衝化剤、塩、及び/又はRT−PCRに有用な添加剤を含む。
上記アニオン性ポリマーが核酸ではなく、RT−PCRで用いられるpHで少なくとも−1の正味電荷を有し、等量の対イオンを含む、上記組成物。
上記アニオン性ポリマーの正味電荷が、−1〜−10,0000の範囲であり、好ましくは−5〜−5,000の範囲であり、更に好ましくは−10〜−1,000の範囲であり、最も好ましくは−20〜−200の範囲である、上記組成物。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。
上記アニオン性ポリマーが、多糖類、ポリペプチド、酸又は無水物である、上記組成物。
上記アニオン性ポリマーは、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−L−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ(プロピルアクリル酸)、ポリ(メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物)、又は上記アニオン性ポリマーの2種以上の混合物からなる群から選択される、上記組成物。
a)上記RNA鋳型を反応混合物に加える工程であって、上記反応混合物が、少なくとも1種の逆転写酵素並びに/又はその変異体、変種及び誘導体と、少なくとも1種の核酸ポリメラーゼ並びに/又はその変異体、変種及び誘導体と、核酸ではないアニオン性ポリマーと、1種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとを含む工程、及び
b)上記RNA鋳型の一部と相補的な核酸分子を重合するのに十分な条件下で上記反応混合物をインキュベートする工程。
上記アニオン性ポリマーが核酸ではなく、RT−PCRで用いられるpHで少なくとも−1の正味電荷を有し、等量の対イオンを含む、上記方法。
上記アニオン性ポリマーの正味電荷が、−1〜−10,0000の範囲であり、好ましくは−5〜−5,000の範囲であり、更に好ましくは−10〜−1,000の範囲であり、最も好ましくは−20〜−200の範囲である、上記方法。全てのケースで、等量の対イオンが存在する。
上記アニオン性ポリマーが、多糖類、ポリペプチド、酸又は無水物である、上記方法。
上記アニオン性ポリマーが、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−L−グルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリ(プロピルアクリル酸)、ポリ(メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物)、又は上記アニオン性ポリマーの2種以上の混合物からなる群から選択される、上記方法。
アニオン性ポリマーを使用することによりRT−PCRの特異性が向上することを証明するために、A型インフルエンザウイルス由来のRNAを含む試料に、硫酸デキストラン8000(Sigma)を、量を少しずつ増やしながら加えた。RT−PCRのためのRNA鋳型として、A型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子を選択した。
A型インフルエンザウイルスのグループに属する、流行性H1N1/09ウイルス由来のウイルスRNAを、鋳型としての5μLのウイルスRNA、逆転写酵素(OmniScript,QIAGEN)、2.5単位のHotStar Fast Taq 1ステップRT−PCR緩衝液(QIAGEN)(最終濃度1倍)、各0.4mMのdNTP混合物、各0.6μMの、A型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子のための順方向プライマー(配列番号:1)及び逆方向プライマー(配列番号:2)、及び3.2ng/mL〜640ng/mLの濃度の硫酸デキストランを含む、最終容量25μL中で反応させた。逆転写反応混合物を50℃で30分間インキュベートし、次いで95℃で5分間加熱した。その後、94℃で30秒、50℃で30秒、及び72℃で1分からなる45サイクルを実施した。
試料(二通り)をアガロースゲルで分析した(図1)。硫酸デキストランを加えることにより、効率及び特異性の向上が観察された。硫酸デキストランの量を増やすことにより、RT−PCR産物の収量が著しく増加した。この実験で、320及び640ng/mLの硫酸デキストリンによって最善の結果が示され(レーン9〜12)、非常に低濃度の硫酸デキストラン(3.2ng/mL、レーン3〜4)でさえ、硫酸デキストランをRT−PCRに加えていない対照の反応(レーン1〜2)と比較して明らかなプラスの影響が示された。
より高濃度の硫酸デキストランがRT−PCRにおいて悪影響を与えるかどうかを判定するため、より高濃度の硫酸デキストランを用いた。硫酸デキストランの濃度を除き、反応条件は実施例1に記載したのと同じである。本実施例における硫酸デキストランの濃度は、0.32μg/mL〜16μg/mLである。この場合も同様に、アガロースゲルで試料を分析した(図2)。この場合も同様に、硫酸デキストランを加えていない対照(レーン1〜2)と比較して、硫酸デキストランを加えることによって、効率及び特異性の明らかな改善が観察された(レーン3〜12)。非常に高濃度(16μg/mL)の硫酸デキストランでのみ(レーン13〜14)、この濃度ではRT−PCRにおけるいずれの産物も得られず、RT−PCRにおける悪影響を検出することができた。しかし、効率及び特異性における硫酸デキストランのプラスの影響は広範囲の濃度(0.32μg/mL〜6.4μg/mL)にわたってプラスの効果が観察され(レーン3〜12)、これにより、RT−PCRにおけるアニオン性ポリマーのプラスの効果が確かであることが証明された。
RT−PCRにおけるアニオン性ポリマーのプラスの影響が、逆転写におけるものか、cDNAの複製におけるものか、又は両者におけるものかを判定するため、逆転写工程で、若しくは複製工程でアニオン性ポリマーを加え、又は全く加えずに2ステップRT−PCRを実施した。
鋳型RNA及び他の全ての反応成分は実施例1と同じである。逆転写反応を50℃で30分間インキュベートで行った。その後、反応物を氷上で冷却することによって逆転写反応を停止した。逆転写反応物の一定量(12.5μL)を、2.5単位のHotStar Taq Plus(QIAGEN)、0.6μMのプライマー(配列番号:1及び2)、0.4mMのdNTPミックス、及び1倍の(1x)1ステップRT−PCR緩衝液(QIAGEN)を含む、12.5μLのPCRマスターミックスと混合した。実施例1に示したサイクル条件でPCRを実施した。硫酸デキストラン8000(Sigma)を、最終濃度が480ng/mLになるように、逆転写反応又はPCR反応のいずれかに加えた。対照反応では、硫酸デキストランを加えなかった。
試料を、二通りアガロースゲルで分析した(図3)。硫酸デキストランを加えなかった反応では、マトリックス遺伝子の産生量は非常に低く、非常に大量の非特異的産物が検出された(レーン1〜2)。PCR反応に硫酸デキストランを加えることにより、マトリックス遺伝子の産生量はわずかに改善されるが、特異性の効果はわずかであるか、又は効果はなかった。一方、逆転写反応に硫酸デキストランを加えることにより、反応の効率及び特異性は著しく高くなった。したがって、硫酸デキストランのプラスの効果は、主として逆転写酵素の際の効果によるものであるが、PCRにおいても、わずかなプラスの効果を検出することができた。
ウイルスRNAだけでなく、mRNAも鋳型としての役割を果たすことができるかを証明するため、RT−PCRの鋳型としてHela細胞からのmRNA(10ng)を用いた。鋳型としてHeLa細胞からのmRNAを用いた以外、反応条件は実施例1と同じであり、ラミンA/C(配列番号:3及び4)及びTNFR1(配列番号:5及び6)の増幅用プライマー対をそれぞれ用い、PCRのアニーリング温度は50℃でなく55℃であった。アニオン性ポリマーとして、640ng/mLの硫酸デキストラン8000を用いた。この場合も同様に、試料を、二通りアガロースゲルで分析した(図4及び図5)。この場合も同様に、本実施例によって、RT−PCRの効率及び特異性においてアニオン性ポリマーのプラスの効果が示される。硫酸デキストランを加えないと、ラミンA/Cの特異的アプリコンに加え、多くの非特異的アンプリコンを検出することができ(図4、レーン−DS)、基本的に硫酸デキストランをRT−PCRに加えたときにのみ、ラミンA/Cの特異的アンプリコンを検出することができた(図4、レーン+DS)。TNFR1を増幅した場合、状況は類似していた。硫酸デキストランを加えないと、TNFR1の特異的アンプリコンに加え、多くの非特異的アンプリコンが検出されたが(図5、レーン−DS)、硫酸デキストランを加えることにより、特異性及び効率において著しい向上を検出することができた(図5、レーン+DS)。
硫酸デキストランに加え、他のアニオン性ポリマーが、特異性及び効率の向上に適していることを証明するために、RT−PCRにおけるアニオン性ポリマーとして、それぞれ1ng、200pg及び100pgのアルギン酸ナトリウムを用いた。アニオン性ポリマーとしてアルギン酸ナトリウムを用い、TNFR1の増幅のためのプライマー対(配列番号:5及び6)を用いたことを除き、反応条件は実施例4に記載したものと同様である。この場合も同様に、試料を、二通りアガロースゲルで分析した(図6)。この結果によって、さまざまな量でアルギン酸ナトリウムを加えることによっても、RT−PCRにおける効率及び特異性の向上がもたらされることがはっきりと証明された。アニオン性ポリマーといてアルギン酸ナトリウムを用いた結果は、アニオン性ポリマーとして硫酸デキストランを用いて得られた結果と同様であった(図5)。
したがって、2種の化学的に異なるアニオン性ポリマーが同様のプラスの効果を示すように、RT−PCRの効率及び特異性の向上は、アニオン性ポリマーの一般的な特徴であることが示された。
配列番号:1:ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG
配列番号:2:TGGACAANCGTCTACGCTGCAG
配列番号:3:CATCCTCGCAAACCACCCACTCA
配列番号:4:CAGCGCCCACAAGCCACAGAG
配列番号:5:CAGCTCTCCGGCCTCCAGAAG
配列番号:6:TCCTCGGGTCCCCCTGTTGGT
Claims (5)
- 1種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、1種以上のヌクレオチド又はその誘導体のいずれか、及び2種以上の異なるポリメラーゼ(該ポリメラーゼの少なくとも1種が逆転写酵素活性を有し、少なくとも1種が核酸ポリメラーゼ活性を有する)を含む組成物において、RT−PCRにおいて観察される、逆転写酵素による核酸複製の阻害を抑制又は低減するための、アニオン性ポリマーの使用であって、このアニオン性ポリマーが、RT−PCRで用いられるpHで、少なくとも−1の正味電荷を有し、前記アニオン性ポリマーが、硫酸デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ヘパリン、カラギーン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリフロレチンリン酸、ポリ−L−グルタメート、ポリアクリル酸、ポリ(プロピルアクリル酸)、ポリ(メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸無水物)からなる群から選択される、アニオン性ポリマーの使用。
- アニオン性ポリマーが、RT−PCRにおける使用のためである、請求項1記載の使用。
- 組成物が、さらに、RT−PCRに有効な、緩衝剤、塩、および/または添加剤を含む、請求項1記載の使用。
- 逆転写酵素活性を示す前記ポリメラーゼが、OMNISCRIPT(登録商標)、AMV−RT、M−MLV−RT、HIV−RT、EIAV−RT、RAV2−RT、C.ハイドロゲノフォルマン(C.hydrogenoformans)DNAポリメラーゼ、SUPERSCRIP(登録商標)I、SUPERSCRIP(登録商標)II、SUPERSCRIP(登録商標)III並びに/又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、請求項1記載の使用。
- 核酸ポリメラーゼ活性を示す前記ポリメラーゼが、Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENT(商標)DNAポリメラーゼ、DEEP VENT(商標)DNAポリメラーゼ、並びに/又はその変異体、変種及び誘導体からなる群から選択される、請求項1記載の使用。
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