KR20080082662A - Ｈｃｖ의 유전자형을 결정하기 위한 방법 및 시약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 축퇴성(degenerate) 증폭 및 시퀀싱(sequencing) 프라이머의 혼합물, 및 이러한 프라이머를 사용하는 방법에 관한 것이며, 상기 프라이머는 다수의 HCV 종에 상보적이며, 각각의 종에 대해 샘플에 존재하는 종의 유형 및/또는 아형(subtype)을 나타내는 HCV의 NS5B의 영역에 대한 뉴클레오티드 서열 정보를 생성시킬 수 있다.

Description

ＨＣＶ의 유전자형을 결정하기 위한 방법 및 시약 {METHODS AND REAGENTS FOR GENOTYPING HCV}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2005년 12월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 60/753,761을 우선권으로 주장하며, 상기 미국 가출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 전반적으로 시험 샘플에서 발견되는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하기 위한 방법 및 물질에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스 (HCV)는 전세계적으로 약 170만명을 감염시키는 것으로 추산되며, 만성 간 질병의 원인이 되고, 간경화 및 간세포 암종의 위험을 증가시킨다. HCV의 치료는 주로 항바이러스 요법으로 제한되는데, 이러한 요법의 효능은 대부분 수 가지의 생물학적 파라미터, 예를 들어 바이러스 유전자형에 의해 영향을 받는다. 따라서, 항바이러스 요법에 대한 반응을 예측하고 치료 기간을 최적화하기 위해 HCV 유전자형결정법(genotyping)이 널리 사용되어 왔다. 또한, HCV 유전자형결정법은 역학적(epidemiological) 연구 및 HCV에 의한 오염원의 추적을 위한 필수적인 도구가 되어왔다.

플러스-가닥(plus-strand) HCV RNA 게놈은 길이가 약 9600개 뉴클레오티드이고, 약 3010개 아미노산을 지닌 하나 이상의 오픈-리딩 프레임을 엔코딩한다. 감염된 세포에서, 이러한 폴리프로테인(polyprotein)은 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 다수의 부위에서 절단되어 구조 및 비구조 (NS) 단백질을 생성시킨다. HCV 단리물은 비구조 5B (NS 5B) 유전자에 의해 엔코딩되는 HCV RNA 의존성 RNA 중합효소의 충실도(fidelity) 부족으로 인한 고도의 유전자 가변성에 의해 특성화된다. 또한, 내인적 돌연변이 또는 다수의 종에 의한 감염의 결과로써, 1명의 환자내에서 HCV의 유전자 가변성 유사종(quasi-species)이 또한 발생한다. 6가지의 주요 HCV 유전자형 및 백가지 이상의 아형(subtype)이 공지되었다.

HCV의 유전자 가변성은 증폭, 시퀀싱(sequencing) 및 유전자형결정 과정을 복잡하게 한다. 전형적으로 이들 과정은 HCV 게놈의 상응하는 핵산 서열에 상보적이고 이러한 서열에 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 (예를 들어, PCR 증폭 프라이머, 시퀀싱 프라이머 및 부위 특이적 프로브)를 사용하는 것에 의존한다. HCV 게놈의 고도의 가변성의 결과로써, HCV의 하나의 종에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 또 다른 종에 상보적이지 않을 수 있다. 따라서, 이러한 프라이머 및 프로브는 고도로 보존된 영역에 대한 특이성을 위해 설계되어야 한다. 대안적으로, 검정은 모든 종에 상보적인 축퇴성(degenerate) 프라이머 및 프로브의 혼합물을 사용하여야 한다.

일부 유전자형결정 방법은 5' 비코딩(noncoding) (5'NC) 영역에 대해 초점이 맞추어졌다. HCV의 5' 비코딩 (NC) 영역은 고도로 보존되지만, 유전자형 간의 구 별을 위해 이용될 수 있는 유형 특이적 다형을 함유한다. 현재까지, 대부분의 상업적으로 이용가능한 5'NC 영역 유전자형결정 검정은 PCR 증폭 및 RFLP에 의한 단편 분석 또는 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 하이브리드화를 기초로 하였다. 이러한 검정 유형은 신속하지만 시퀀싱 기초 검정 만큼 정확하지 않다. 이러한 이유로, NS5B 영역을 포함하는 대안적 게놈 영역을 HCV의 유전자형을 결정하는 데에 사용할 것이 제안되어 왔다.

HCV의 유전자형을 결정하는 가장 정확하고 직접적인 방법은 바이러스 유형 및 아형 간의 구별을 위해 다양한 종 사이에서 충분히 상이한 영역에서 바이러스 게놈을 시퀀싱하는 것이다. 동일하게 중요하게는, 이러한 영역으로부터 생성된 서열을 분석하기 위해 계통 분석을 위한 데이터베이스가 용이하게 이용가능해야 한다.

상업적으로 이용가능한 시퀀싱 기초 HCV 유전자형결정 검정의 예로는 HCV의 5'NC 영역을 이용하는 신속한 시퀀싱 기초 검정인 트루진 HCV 5'NC 제노타이핑 키트 (TRUGENE HCV 5 'NC Genotyping Kit) (Bayer HealthCare)가 있다. 이러한 검정에 의해 생성된 서열 데이터는 계통발생적 5'NC 영역 데이터베이스 (TRUGENE HCV 5 'NC software module v3.1.1)를 이용하여 직접 분석된다. 과거에, 5'NC 데이터베이스는 결코 완전히 검증되지 않았던 다양한 공급원으로부터의 서열을 포함하였고, 일부 경우에는 특정 균주에 대한 아형 배정(assignment)이 5'NC 또는 NS5B 서열이 분석되는 경우 일치하지 않았다.

임상 분석 및 치료적 개입을 위한 HCV 유형 및 아형의 확인을 개선하기 위해 시퀀싱 기초 HCV 검정을 개선할 필요성이 계속 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 전반적으로 시험 샘플에서 발견되는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 샘플에서 HCV 종의 NS5B 영역의 일부를 증폭시키고 시퀀싱하여 이의 유전자형을 결정하는 개선된 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 가지 일면은 다수의 HCV 종 각각에 대해 그러한 종의 유형 및/또는 아형을 나타내는 HCV의 NS5B 영역의 적어도 일부를 시퀀싱함으로써 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법에 관한 것이다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 시험 샘플에 존재하는 HCV 종의 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, 다수의 HCV 종의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형을 나타내는 것인 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 다수의 HCV 종 중 하나의 유전자형과 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 시험 샘플에 존재하는 HCV 종의 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 지닌 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형을 나타내는 것인 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 시험 샘플에 존재하는 HCV 종의 유전자형 및 아형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 지닌 각각의 HCV 종 및 표 1에 기재된 HCV 아형 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형 및 아형을 나타내는 것인 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 상기 HCV 아형 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함한다.

상기 방법의 한 가지 특정 구체에에서, HCV의 NS5b 영역의 일부는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 위치 약 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함한다.

상기 방법의 또 다른 특정 구체예에서, HCV의 NS5b 영역의 일부는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 위치 8344번 내지 8547번의 영역을 필수적으로 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 시험 샘플에 존재하는 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형을 나타내는 것인 단계; (b) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 다수의 HCV 종 중 하나의 유전자형과 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나를 나타내는 것인 단계; (b) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 아형 중 하나를 나타내는 것인 단계; (b) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형 및 아형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 및 아형 (예를 들어, HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 아형 중 하나)과 상호관련시키는 단계를 포함한다.

한 가지 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8256번 내지 약 8278번 (CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5.5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열(complement), 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8611번 내지 약 8633번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다.

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번 (CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5.5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다.

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물은 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다:

본 발명의 또 다른 일면은 다수의 HCV 종 각각에 대해 그러한 종의 유형 및/또는 아형을 나타내는 HCV의 NS5B 영역의 적어도 일부을 증폭시킴으로써 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법에 관한 것이다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8245번 내지 약 8269번 (예를 들어, 정방향 프라이머 FF1 및/또는 FF2)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8616번 내지 약 8641번 (예를 들어, 역방향 프라이머 RR1)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (b) NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5.5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5)의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다.

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물은 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다:

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물은 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다:

도 1은 본 발명의 특정 구체예에서 사용되는 HCV NS5b 도메인 및 관련 영역을 도시하는 개략도이다.

도 2는 젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 M67463로 공표된 HCV의 NS5b 도메인의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 프라이머 영역은 음영으로 나타나 있고, 여백 부분에 표시되어 있다. 도 2는 SEQ ID NO:12에 상응한다.

발명의 상세한 설명

정의

본원에 사용된 용어는 당 분야에서 통상적인 의미를 지니지만, 명료함을 위해 특정 용어에 대해 하기와 같은 정의를 제공한다.

단위, 접두어(prefix) 및 기호는 이들의 SI 허용되는 형태로 표시될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 본원에 열거된 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함하며, 규정된 범위 내의 각각의 정수를 포함하고 뒷받침한다. 아미노산은 본원에서 IUPAC-IUBMB 명명 위원회에 의해 권고된 이들의 통상적으로 알려진 3문자 기호 또는 1문자 기호로 언급될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 이들의 통상적으로 허용되는 1문자 코드에 의해 언급될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 단수 형태의 용어는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 편제를 위한 것이며, 기재된 사항을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 보고서를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 본원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 명백히 포함된다. 본원에서 임의의 아미노산 또는 핵산 서열 불일치가 있는 경우, 도면이 우선한다.

본원에 사용된 용어 "증폭"은 다른 유전자에 대해 반응 혼합물 중의 하나 이상의 특정 유전자 또는 유전자 단편의 상대 존재비를 증가시키는 과정을 의미한다.

특정된 뉴클레오티드 서열을 참조로 하여 본원에서 사용되는 경우 "필수적으로 포함하는"이란 용어는 그러한 특정된 서열, 및 서열의 상보성 및 다수의 HCV 유형 또는 아형에 하이브리드화하는 서열의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 임의의 추가 서열을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "샘플"은 RNA 또는 DNA와 같은 핵산을 함유하거나 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 임의의 물질을 의미하며, 개체(들)로부터 단리된 조직 또는 유체의 샘플을 포함하는데, 이의 예로는 비제한적으로 피부, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 활액(synovial fluid), 소변, 누액, 혈액 세포, 장기, 종양이 있 고, 또한 시험관내 세포 배양 구성분의 샘플 (비제한적으로 세포 배지에서 세포의 성장으로부터 생성된 컨디셔닝된 배지 (conditioned medium), 재조합 세포 및 세포 성분을 포함함)이 있다.

"뉴클레오티드"란 용어는 뉴클레오티드 아데노신, 시토신, 구아닌 및 티민을 의미하며, 이러한 뉴클레오티드는 이들의 1문자 코드인 A, C, G 및 T로 각각 표현된다. 축퇴성 프라이머를 표현하는 경우, 기호 R은 G 또는 A를 의미하고, 기호 Y는 T/U 또는 C를 의미하고, 기호 M은 A 또는 C를 의미하고, 기호 K는 G 또는 T/U를 의미하고, 기호 S는 G 또는 C를 의미하고, 기호 W는 A 또는 T/U를 의미하고, 기호 B는 "A가 아님"을 의미하고, 기호 D는 "C가 아님"을 의미하고, 기호 H는 "G가 아님"을 의미하고, 기호 V는 "T/U가 아님"을 나타내고, 기호 N은 임의의 뉴클레오티드를 의미한다. 기호 I는 이노신을 나타내는데, 이는 일반적으로 임의의 C, T 또는 A와 쌍을 이루는 중성 염기이다. 본원의 명세서 및 청구의 범위에 있어서, 축퇴성 프라이머는 염기 선택의 조합 중 어느 하나 또는 전부를 의미하며, DNA 또는 상응하는 RNA 서열 (즉, T가 U로 대체된 것)을 의미한다. 따라서, 축퇴성 프라이머는 하나의 종, 또는 선택범위에 속하는 2개의 종의 혼합물, 또는 선택범위에 속하는 3가지 선택의 혼합물 등에서부터 모든 가능한 조합을 함유하는 혼합물에 이르는 혼합물을 나타낼 수 있다.

"핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 프라이머, 프로브, 검출하려는 올리고머 단편, 올리고머 대조표준 및 표지되지 않은 블록킹(blocking) 올리고머를 의미하고, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보 오스를 함유함)에 대해, 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보오스를 함유함)에 대해, 그리고 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드, 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 폴리뉴클레오티드의 임의의 다른 유형에 대해 일반적이어야 한다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 간에 의도적인 길이 구별은 없으며, 이러한 용어는 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 단지 분자의 1차 구조를 의미한다. 따라서, 이러한 용어는 이중가닥 및 단일가닥 DNA 뿐만 아니라 이중가닥 및 단일가닥 RNA를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 약 6개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10 내지 12개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 명시된 뉴클레오티드 서열의 영역에 상응하는 약 15개 내지 25개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진다. 기준 뉴클레오티드 서열과 관련하여 핵산 서열을 규정하기 위해 본원에 사용된 "에 상응하는"이란 용어는 기준 서열의 전부 또는 일부와 매칭(matching)되는 뉴클레오티드 서열, 및 기준 서열의 전부 또는 일부의 상보서열인 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

올리고뉴클레오티드는 반드시 임의의 기존 서열 또는 천연 서열으로부터 물리적으로 유래되는 것은 아니며, 화학 합성, DNA 복제, 역전사 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다. "올리고뉴클레오티드" 또는 "핵산"이란 용어는 게놈 DNA 또는 RNA, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의도하는데, 이는 이의 기원 또는 조작에 의해 (1) 이것이 자연계에서 관련되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 관련되어 있지 않고/않거나 (2) 이것이 자연계에서 결합되어 있는 것 이외의 폴리뉴클레오티드에 결합되어 있고, (3) 자연 계에서 발견되지 않는 것이다.

모노뉴클레오티드는 하나의 모노뉴클레오티드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 결합에 의해 하나의 방향으로 이와 이웃하는 고리의 3' 산소에 부착하게 되도록 하는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 생성하므로, 올리고뉴클레오티드의 말단은 이의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토오스 고리의 3' 산소에 결합되어 있지 않는 경우 "5' 말단"으로서 언급되고, 이의 3' 산소가 후속 모노뉴클레오티드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트에 결합되어 있지 않은 경우 "3' 말단"으로서 언급된다. 본원에 사용되는 경우, 핵산 서열은 거대한 올리고뉴클레오티드의 내부에 존재한다고 하더라도 5' 및 3' 말단을 지니는 것으로 여겨질 수 있다.

2개의 상이한 비중첩(non-overlapping) 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형의 상보적 핵산 서열의 다양한 영역에 대해 어닐링(annealing)되고 하나의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 나머지 올리고뉴클레오티드의 5' 말단쪽을 가리키는 경우, 전자는 "업스트림(upstream)" 올리고뉴클레오티드라고 일컬어지며, 후자는 "다운스트림(downstream)" 올리고뉴클레오티드라고 일컬어질 수 있다.

"프라이머"라는 용어는 하나 이상의 프라이머를 의미할 수 있으며, 정제된 제한 분해에서와 같이 천연 발생하든지 합성적으로 생성되든지 간에 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성이 촉진되는 조건하에 놓여지는 경우 상보적 가닥을 따라 일어나는 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 조건은 적절한 완충액 ("완충액"은 보조인자이거나 pH, 이 온 강도 등에 영향을 미치는 치환체(substituent)를 포함함) 중에서 그리고 적절한 온도에서 4가지 상이한 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 유도제, 예를 들어 DNA 중합효소 또는 역전사효소가 존재하는 것을 포함한다.

프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 먼저 이의 가닥들이 분리되도록 처리된 후, 신장 생성물을 제조하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 중합반응을 위한 작용제의 존재하에서 신장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도 및 프라이머 공급원 및 방법의 용도를 포함하는 다수의 인자에 좌우된다. 예를 들어, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15개 내지 25개의 뉴클레오티드를 함유하지만, 이는 보다 많거나 보다 적은 수의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 보다 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하도록 일반적으로 낮은 온도를 필요로 한다.

"신장 프라이머"라는 용어는 주형 서열에 상보적이고 중합효소 연쇄 반응 조건하에서 서열에 하이브리드화하여 이러한 서열을 신장시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

2개의 핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우 "상보서열"이란 용어 및 이의 관련 형용사형인 "상보적"이란 2개의 핵산 서열이 역평행 관계(anti-parallel association)로 (하나의 서열의 5' 말단이 나머지 서열의 3' 말단과 쌍을 이룸) 정 렬되는 경우, 서열의 상응하는 G 및 C 뉴클레오티드 염기가 쌍을 이루고, 상응하는 A 및 T 뉴클레오티드 염기가 쌍을 이룸을 의미한다. 천연 핵산에서 통상적으로 발견되지 않는 특정 염기가 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 이의 예로는 이노신 및 7-데아자구아닌이 있다.

유전자좌에서 뉴클레오티드의 "자리" 또는 "위치"는 일반적으로 유전자의 게놈 서열의 CDNA로부터 취해진 경우 유전자의 뉴클레오티드에 배정되는 번호를 의미한다.

"올리고뉴클레오티드 프라이머"라는 용어는 3개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 분자를 의미한다. 이의 정확한 길이는 어닐링 반응의 온도, 및 프라이머의 공급원 및 조성을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 궁극적인 기능 및 용도에 관한 다수의 인자에 좌우된다. 증폭 프라이머는 중합반응을 위한 작용제의 존재하에서 신장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성을 유도하는 조건하에 놓여지는 경우 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 조건은 적절한 온도 및 pH에서 뉴클레오티드 및 유도제, 예를 들어 DNA 중합효소가 존재하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프라이머는 유도제의 존재하에서 특정 서열로부터 신장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분한 길이를 지닌 단일가닥 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명의 한 가지 일면에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 길이가 약 15개 내지 약 30개 뉴클레오티드이지만, 프라이머는 보다 많거나 적은 수의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 바람직하게는 길이가 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게는, 프라이머는 약 20개 내지 25개의 뉴클레오티드를 함유한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 민감도(sensitivity) 및 특이성은 주어진 주형 핵산 샘플내의 서열의 유일성(uniqueness) 및 프라이머 길이에 의해 결정된다. 예를 들어 너무 짧은 프라이머는 광범위하게 다양한 서열에 대해 비특이적인 결합을 나타낼 수 있다.

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한 당 분야의 기술수준에 속하는 통상적인 분자 생물학 기술, 미생물학 기술, 재조합 DNA 기술, 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 명세에 따라, 또는 당 분야에서 통상적으로 실행되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 상기 기술 및 절치는 일반적으로 당 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 참고문헌 및 보다 특정한 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다 (참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); 및 a series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), 이러한 모든 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함되어 있음).

"역전사"라는 용어는 RNA 분자에 대한 DNA 상보서열을 생성시키는 과정을 의 미하며, 이는 역전사 효소를 사용하여 일반적으로 달성된다. 중합반응을 개시하기 위해 프라이머가 사용될 수 있는데, 이러한 프라이머는 PCR 증폭을 위해 이후에 사용되는 프라이머 쌍 중 하나일 수 있다. 그 후, RNA 분자는 복사된(copied) DNA ("cDNA")로부터 분리되거나 효소의 RNAse H 활성에 의해 분해됨으로써 cDNA의 두 번째 가닥이 주형 의존성 DNA 중합효소에 의해 생성될 수 있게 한다. 이러한 방법은 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, F. M. et al, (John Wiley & Sons; 1995)]의 단원(Unit) 3.7 및 15.4에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.

"시퀀싱"이란 용어는 유전자의 적어도 일부에서 뉴클레오티드의 순서를 결정하는 것을 의미한다.

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한 당 분야의 기술수준에 속하는 통상적인 분자 생물학 기술, 미생물학 기술, 재조합 DNA 기술, 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 명세에 따라, 또는 당 분야에서 통상적으로 실행되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 상기 기술 및 절치는 일반적으로 당 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 참고문헌 및 보다 특정한 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다 (참조: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); 및 a series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), 이러한 모든 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함되어 있음).

DNA 공급원

본 발명의 한 가지 일면에서, 본 발명의 방법은 먼저 환자 샘플로부터 관심있는 돌연변이를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오티드 주형을 수득하는 것을 포함한다. 이중가닥 폴리뉴클레오티드 주형은 최초에 게놈 DNA, 게놈 DNA의 단편, 또는 RNA로부터 역전사된 cDNA를 포함할 수 있다. 이러한 주형은 관심있는 돌연변이를 포함할 뿐만 아니라 다수의 유사종을 생성시키는 길이 다형을 함유하는 영역을 또한 포함할 수 있다.

이중가닥 폴리뉴클레오티드 주형은 샘플 중의 DNA의 일부 또는 전부가 올리고뉴클레오티드 프라이머와의 하이브리드화를 위해 이용될 수 있도록 예를 들어 용해(lysis)에 의해 DNA를 함유하는 환자 샘플을 처리하고, 세포 잔해를 제거하도록 원심분리하고, DNA를 노출시키도록 단백분해시킴으로써 환자 샘플로부터 전형적으로 제조된다. 따라서, DNA 주형은 단지 핵 DNA, 단지 미토콘드리아 DNA, 또는 조직 샘플로부터의 단리에 의해 수득된 핵 또는 미토콘드리아 DNA의 일부 하위분획(sub-fraction)을 함유할 수 있다. 또한, DNA 주형은 전체 mRNA 제조물 또는 RNA 바이러스의 게놈을 cDNA로 전환, 예를 들어 역전사시킴으로써 제조될 수 있고; 플레이트상에서 증식하는 개개의 세균 콜로니로부터 단리되거나 농축된 세균 배양물로부터 단리된 DNA일 수 있고; 실질적으로 전체 바이러스 게놈이 단리되는 바이 러스 DNA 제조물일 수 있다.

DNA는 용해, 세포 잔해를 분리하기 위한 원심분리 및 DNA를 노출시키기 위한 단백분해를 포함하는 다수의 기술 중 어느 하나에 의해 유체 샘플, 예를 들어 혈액 또는 소변 또는 조직 샘플로부터 제조될 수 있으며, 염 침전 또는 표준 SDS-프로테이나아제 K-페놀 추출이 사용될 수 있다. 샘플은 또한 키트, 예를 들어 퓨어 진 DNA 단리 키트 (Pure Gene DNA Isolation Kit) (Gentra)를 이용하여 제조할 수 있다.

핵산의 증폭

본 발명은 후속 시퀀싱용으로 풍부한 DNA원을 제공하기 위해 DNA를 증폭하기 위한 방법 및 시약을 포함한다

전형적으로, 시퀀싱 전에, 먼저 시퀀싱하려는 표적 영역을 포함하는 DNA의 영역을 증폭시킴으로써 시퀀싱 주형이 제조된다. 증폭시키려는 서열은 최초에 순수한 형태로 존재할 필요는 없는데, 이러한 서열은 복잡한 혼합물의 작은 분획 또는 핵산 서열의 일부일 수 있다. 출발 핵산은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 요망되는 특정 핵산 서열을 함유할 수 있다. 따라서, 본 과정은 대량의 하나의 특정 핵산 서열을 생성시키는 데에 유용할 뿐만 아니라 서열 중에 하나 이상의 염기쌍 변이가 존재하는 경우 동일하거나 상이한 핵산 분자상에 위치한 하나 이상의 상이한 특정 핵산 서열을 동시에 증폭시키는 데에 유용하다.

본 발명은 HCV의 유전자형을 결정하기 위해 사용되는 증폭 및 시퀀싱 프라이머를 포함하는 방법 및 시약에 관한 것이다. 본 발명은 중합효소 연쇄 반응 (또는 PCR) 또는 일부 다른 프라이머 신장 기초 방법을 이용하여 특정 핵산 서열을 증폭시키기 위한 널리 공지된 방법을 이용한다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법은 당 분야에 매우 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 4,683,195, 4,683,202 및 4,800,159; 문헌 [K. Mullis, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263-273 (1986)]; 및 문헌 [C. R. Newton & A. Graham, Introduction to Biotechniques: PCR, 2.sup.nd Ed., Springer- Verlag (New York: 1997)]에 기재되어 있고, 상기 언급된 특허 및 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다. PCR은 유전자에서 관심있는 영역의 측면상에 위치한 부위에서 하이브리드화하는 프라이머의 쌍을 사용하는 것을 포함하는데, 하나는 이중체(duplex) DNA의 각각의 상보적 가닥에 대한 것이다 (여기서, 코딩 가닥은 "센스 가닥"으로 일컬어지고, 이의 상보 가닥은 "안티센스 가닥"으로 일컬어짐). 그 후, 연쇄 신장 중합반응이 반복 사이클로 수행되어 관심있는 영역의 복사체 수를 지수적으로 증가시킨다. 요약하면, PCR 반응의 첫 번째 단계에서, 이중가닥 분자를 변성시키기 위해 샘플의 핵산 분자가 일시적으로 가열된 후 냉각된다. 정방향 및 역방향 프라이머는 샘플 표적에 비해 과량의 농도로 증폭 반응 혼합물에 존재한다. 샘플이 하이브리드화 및 중합반응에 유리한 조건하에서 인큐베이션되는 경우, 프라이머는 증폭이 요망되는 서열의 상보서열인 증폭시키려는 요망되는 영역의 서열의 3' 위치에서 핵산 분자의 상보적 가닥에 하이브리드화한다. 하이브리드화시에, 프라이머의 3' 말단은 중합효소에 의해 신장된다. 프라이머의 신장은 요망되는 핵산 샘플 표적의 상보서열의 정확한 서열을 지닌 DNA 분자를 합성시킨다. PCR 반응은 요망되는 핵 산 서열을 지수적으로 증폭시킬 수 있는데, 각각의 사이클에서 요망되는 서열을 지닌 분자의 수는 거의 2배가 된다. 따라서, 하이브리드화, 중합반응 및 변성의 사이클을 적용함으로써, 요망되는 핵산 분자의 농도를 지수적으로 증가시키는 것이 달성될 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드는 시퀀싱 반응을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 겔판드(Gelfand) 등은 이러한 증폭 과정에서 유용한 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 생물체로부터 유래된 열안정성 효소인 "Taq 중합효소"를 발표하였다 (참조: 미국 특허 번호 4,889,818, 5,352,600 및 5,079,352; 이들은 본원에 참조로 포함되어 있음). 대안적 증폭 기술, 예를 들어 NASBA, 3SR, Qb 레플리카아제(Replicase) 및 브랜체드 체인 앰플리피케이션 (Branched Chain Amplification)이 알려져 있으며, 당업자에 의해 이용될 수 있다. "RT-PCR"이란 용어는 RNA 서열의 증폭을 가능하게 하도록 역전사 단계를 포함하는 증폭을 일반적으로 의미한다.

폴리뉴클레오티드 증폭 주형의 제조

본 발명은 HCV 및 이의 변이체 형태의 증폭 및 시퀀싱에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 예를 들어 DNA 또는 메신저 RNA를 포함하는 RNA를 사용할 수 있으며, DNA 또는 RNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 또한, 가닥을 각각 하나씩 함유하는 DNA-RNA 하이브리드가 사용될 수 있다. 이러한 핵산 중 어느 하나의 혼합물이 또한 사용될 수 있거나, 동일하거나 상이한 프라이머를 사용하는 앞서 기재된 증폭 반응으로부터 생성된 핵산이 그렇게 사용될 수 있다. 증폭시키려는 특정 핵산 서열은 단지 거대한 분자의 분획일 수 있거나, 특정 서열이 전체 핵산을 구성하도록 최초에 분리된 분자로서 존재할 수 있다.

증폭시키려는 서열은 최초에 순수한 형태로 존재할 필요는 없는데, 이러한 서열은 복잡한 혼합물의 작은 분획이거나 핵산 서열의 일부일 수 있다. 출발 핵산은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 요망되는 특정 핵산 서열을 함유할 수 있다. 따라서, 본 과정은 대량의 하나의 특정 핵산 서열을 생성시키는 데에 유용할 뿐만 아니라 서열 중에 하나 이상의 염기쌍 변이가 존재하는 경우 동일하거나 상이한 핵산 분자상에 위치한 하나 이상의 상이한 특정 핵산 서열을 동시에 증폭시키는 데에 유용하다.

핵산 주형은 임의의 공급원, 예를 들어 pBR322와 같은 플라스미드, 클로닝된 DNA 또는 RNA, 또는 임의의 공급원으로부터의 천연 DNA 또는 RNA로부터 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA는 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 280-281]에 기재된 기술과 같은 다양한 기술에 의해 혈액, 조직 물질 또는 양막 세포로부터 추출될 수 있다.

세포는 이들이 저장(hypotonic) 완충액 중에 현탁되고 세포 용해 및 세포내 성분의 분산이 일어날 때까지 일반적으로 약 1 내지 15분간 약 90 내지 100℃로 가열된 경우 핵산의 정제없이 직접 사용될 수 있다. 가열 단계 후, 증폭 시약이 용해된 세포에 직접 첨가될 수 있다. 이러한 직접 세포 검출 방법은 말초혈 림프구 및 양수세포(amniocyte)에 대해 사용될 수 있다.

샘플에 함유된 표적 핵산은 최초에 RNA의 형태로 존재하며, 바람직하게는 cDNA로 역전사된 후, 당업자에게 공지된 물리적, 화학적 또는 효소적 수단을 포함 하는 임의의 적절한 변성 방법을 이용하여 변성된다. 가닥 분리를 위한 바람직한 물리적 수단은 핵산이 완전히 (>99%) 변성될 때까지 핵산을 가열하는 것을 포함한다. 전형적인 열 변성은 수 초 내지 수 분의 시간 동안 약 80℃ 내지 약 105℃의 온도을 유지하는 것을 포함한다. 변성에 대한 대안으로서, 표적 핵산은 샘플 중에서 단일 가닥 형태, 예를 들어 단일 가닥 RNA 또는 DNA 바이러스로 존재할 수 있다.

그 후, 변성된 핵산 가닥은 미리 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 임의로 증폭된 서열을 검출하기 위한 표지된 올리고뉴클레오티드 (본원에서 "프로브"로 일컬어짐)와 함께 프라이머 및 프로브가 단일 핵산 가닥에 결합하는 것을 촉진시키는 조건하에서 인큐베이션된다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 프라이머는 이중체 서열에 걸쳐있는 이들의 상대적 위치가 하나의 프라이머로부터 합성되는 신장 생성물이 이의 주형으로부터 분리된 경우 다른 프라이머의 신장을 위한 주형으로서 작용하여 규정된 길이의 복제 사슬을 생성시킬 정도가 되도록 선택된다

HCV의 증폭

본 발명의 한 가지 일면은 다수의 HCV 종 각각에 대해 그러한 종의 유형 및/또는 아형을 나타내는 HCV의 NS5B 영역의 적어도 일부를 증폭시킴으로써 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV)의 유전자형을 결정하기 한 방법에 관한 것이다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8245번 내지 약 8269번 (예를 들어, 정방향 프라이머 FF1 및/또는 FF2)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8616번 내지 약 8641번 (예를 들어, 역방향 프라이머 RR1)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (b) NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5.5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다.

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물은 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다:

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물은 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다:

핵산의 시퀀싱

상기 기재된 바와 같은 DNA의 증폭은 시퀀싱을 위한 풍부한 DNA원을 생성시킨다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 폴리뉴클레오티드 주형은 뉴클레오티드를 시퀀싱하기 위해 당업자에 의해 이용될 수 있고 당업자에게 공지된 다수의 방법 중 어느 하나를 이용하여 시퀀싱된다.

다수의 방법이 뉴클레오티드를 시퀀싱하기 위해 당업자에 의해 이용될 수 있고 당업자에게 공지되어 있는데, 이들 중 어느 하나가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 한 가지 널리 공지된 시퀀싱 방법은 문헌 [Sanger et al., PNAS (USA) 74(12): 5463-5467 (1977)]에 최초로 발표되었고, 시쿼나아제(Sequenase®) 2.0 제품 문헌 (Amersham Life Sciences, Cleveland)에 상세히 기재되고 보다 최근에 유럽 특허 EP-B 1-655506에서 정교화된 "사슬 종결 (chain termination)" 방법이며, 상기 언급된 문헌 및 특허는 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 본 과정에서, 시퀀싱하려는 DNA가 단리되고, 단일 가닥으로 되고, 4개의 용기에 넣어진다. 각각의 용기에는 프라이머 및 시퀀싱하려는 DNA 간의 하이브리드화 및 하이브리드화된 프라이머의 사슬 신장에 유리한 완충액 중에 DNA 가닥을 복제하기 위해 필요한 성분의 존재하는데, 이러한 성분은 주형 의존성 DNA 중합효소, 시퀀싱하려는 DNA의 시퀀싱 개시 부위에 상보적인 보다 짧은 프라이머 분자 및 염기 A, C, G 및 T 각각에 대한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함한다. 또한, 각각의 용기는 소량의 한 가지 유형의 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예를 들어 디데옥시아데노신 트리포스페이트 ("ddA"), 디데옥시구아노신 트리포스페이트 ("ddG"), 디데옥시시토신 트리포스페이트 ("ddC"), 디데옥시티민 트리포스페이트 ("ddT")를 함유한다. 각각의 용기에서, 단리된 DNA의 각각의 조각은 프라이머와 하이브리드화된다. 그 후, 프라이머는 한 번에 하나의 염기씩 신장되어 주형 DNA에 상보적인 새로운 핵산 중합체를 형성한다. 디데옥시뉴클레오티드가 신장 중합체내로 혼입되는 경우, 중합체는 추가 신장이 일어나지 않게 된다. 따라서, 각각의 용기에서, 그러한 용기 중의 디데옥시뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드의 위치를 나타내는 특정 길이를 지닌 신장된 중합체의 세트가 형성된다. 그 후, 이러한 중합체의 세트는 서열을 결정하기 위해 겔 전기영동을 사용하여 평가된다.

폴리뉴클레오티드의 시퀀싱은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 프라이머 신장을 위해 중합효소를 사용하는 것은 단일 가닥 DNA 주형을 필요로 한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 시퀀싱 결과의 확증성 반대쪽 가닥 확인을 위해 이중 가닥 DNA를 사용한다. 이중 가닥 DNA 주형은 두 개의 상보적 DNA 주형을 단일 가닥으로 분리하기 위해 알칼리 변성 또는 열 변성을 사용하여 시퀀싱될 수 있다. 중합반응 동안, DNA 주형의 각각의 분자는 상보적 프라이머 신장된 가닥으로서 1회 복사된다. 열안정성 DNA 중합효소 (예를 들어, Taq, Bst, Tth 또는 Vent DNA 중합효소)를 사용하는 것은 열 변성, 프라이머 어닐링, 신장 및 디데옥시 종결의 교호적 기간을 통해 시퀀싱 반응에서 이중 가닥 DNA 주형의 반복 사이클링(cycling)을 가능하게 한다. 이러한 사이클링 과정은 시퀀싱을 위한 충분한 주형을 생성시키도록 소량의 주입(input) DNA 주형을 효율적으로 증폭시킨다.

또한, 시퀀싱은 PCR 증폭 반응 생성물상에서 직접 수행될 수 있다. 증폭된 DNA의 클로닝이 비교적 간단하다고 하더라도, PCR 생성물의 직접 시퀀싱은 서열 정보의 획득을 용이하게 하고 빠르게 한다. PCR 반응 생성물이 분리된 증폭 생성물을 생성시키는 한, 이는 직접 시퀀싱될 수 있다. PCR 생성물이 클로닝되고 단일 클론이 시퀀싱되는 방법과 대조적으로, PCR 생성물의 서열이 직접 분석되는 방법은 일반적으로 Taq DNA 중합효소의 비교적 높은 오차율에 의해 영향을 받지 않는다. 오차는 분자 전체에 걸쳐 확률론적으로 분포되어 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 증폭된 생성물의 압도적 다수는 올바른 서열로 구성된다. PCR 생성물의 직접 시퀀싱은 (1) 이것이 살아있는 세포의 사용에 의존하는 않는 간단한 효소적 과정이므로 용이하게 표준화되고 (2) 각각의 샘플에 대해 단지 하나의 서열이 결정될 필요가 있다는 점에서 클로닝된 PCR 생성물을 시퀀싱하는 것에 비해 잇점을 지닌다.

또한, 본 발명에서 사용되는 증폭 방법은 시퀀싱과 함께 동시에 사용될 수 있다. 증폭 및 시퀀싱을 동시에 수행하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 커플링된 증폭 및 시퀀싱 (CAS) (문헌 [Ruano and Kidd, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 88(7): 2815-2819 (1991)], 및 미국 특허 번호 5,427,911에 기재되어 있으며, 상기 문헌 및 특허는 본원에 참조로 포함되어 있음), 및 CLIP 증폭 및 시퀀싱 (미국 특허 번호 6,007,983 및 문헌 [J. Clin. Microbiology 41(4); 1586- 1593 (April 2003)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌 및 특허는 본원에 참조로 포함되어 있음)을 포함한다. CLIP 시퀀싱은 앞서 생성된 PCR 증폭 단편을 동시적 PCR 증폭 및 직접 시퀀싱에 적용시킨다. CAS 시퀀싱에서, 샘플은 2개의 프라이머를 사용하여 제 1 반응 스테이지에서 처리되고, 10,000배 내지 100,000배 증폭을 달성하도록 다수의 사이클 동안 증폭된다. 그 후, ddNTP가 증폭 반응의 지수기 동안 첨가되고, 반응물이 추가의 열 사이클 동안 처리되어 사슬 종결된 시퀀싱 단편을 생성시킨다. CAS 과정은 시약 (ddNTP 시약)의 중간 첨가를 필요로 하는데, 이는 오차 또는 오염을 위한 기회를 도입하고 자동화를 위해 사용되는 임의의 장치의 복잡성을 증가시킨다. 따라서, CAS 방법은 바람직하게는 앞서 생성된 PCR 증폭 단편을 동시적 PCR 증폭 및 직접 시퀀싱에 적용시키는 CLIP 시퀀싱과 조합된다. CLIP® 방법을 이용한 동시적 증폭 및 시퀀싱은 예를 들어 시판되는 키트, 예를 들어 트루진 HCV 5'NC 제노타이핑 키트 (TRUGENE HCV 5 'NC Genotyping Kit) (Bayer HealthCare LLC)에 기재된 조건과 유사한 조건하에서 본원에 기재된 시약을 사용하여 달성될 수 있다.

특정 일면에 있어서, 본 발명은 HCV의 시퀀싱에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 이중 가닥 DNA 주형은 예를 들어 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 DNA 또는 메신저 RNA를 포함하는 RNA로부터 유래될 수 있다. 또한, DNA 주형은 하나의 DNA 가닥 및 하나의 RNA 가닥을 함유하는 DNA-RNA 하이브리드 형태로 존재할 수 있다. 또한, 이러한 핵산 중 어느 하나의 혼합물이 사용될 수 있거나, 동일하거나 상이한 프라이머를 사용하는 앞서 기재된 증폭 반응으로부터 생성된 핵산 이 그렇게 사용될 수 있다. 증폭시키려는 특정 핵산 서열은 단지 거대한 분자의 분획일 수 있거나, 특정 서열이 전체 핵산을 구성하도록 최초에 분리된 분자로서 존재할 수 있다.

HCV의 유전자형결정

본 발명은 HCV를 함유할 것으로 추정되거나 HCV를 함유하는 것으로 공지된 샘플에서 HCV의 유전자형을 결정하기 위한 신규한 방법 및 시약을 포함한다.

본 발명은 HCV의 영역을 포함하는 프라이머를 제공함으로써 상기 언급된 문제를 다룬다.

본 발명의 시퀀싱 프라이머는 HCV의 일부를 증폭하고 시퀀싱하는 데에 사용될 수 있는 HCV의 NS5b 영역에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 당업자에게 공지된 방법에 따르면, HCV로 감염된 것으로 추정되는 개체로부터 수득된 샘플을 사용하여 바이러스 RNA를 RNA 또는 DNA의 형태로 회수한다. 샘플로부터 수득된 바이러스 HCV RNA는 cDNA로 역전사된다. 그 후, 중합효소 연쇄 반응 또는 일부 다른 프라이머 신장 기초 방법을 이용하여 cDNA 주형이 증폭된다. 그 후, 생성된 증폭 단편은 사이클 시퀀싱 방법 또는 CLIP™ 양방향 시퀀싱을 이용하여 HCV의 요망되는 NS5b 영역을 포함하는 프라이머의 세트를 사용하여 최초로 시퀀싱된다.

본 발명의 한 가지 특정한 일면은 HCV를 함유할 것으로 추정되는 샘플에서 HCV의 NS5b 영역의 일부을 증폭시키고 이의 유전자형을 결정하기 위한 방법이다.

HCV의 시퀀싱

본 발명은 일반적으로 시험 샘플에서 발견되는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종 의 유전자형을 결정하기 위한 개선된 방법 및 시약에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 일면에서, 본 발명은 샘플 중의 HCV 종의 NS5B 영역의 일부를 시퀀싱하고 이의 유전자형을 결정하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 본 발명은 다수의 HCV 종 각각에 대해 그러한 종의 유형 및/또는 아형을 나타내는 HCV의 NS5B 영역의 적어도 일부를 시퀀싱함으로써 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 HCV의 NS5b 영역 또는 이의 일부의 서열을 결정하기 위한 방법 및 프라이머를 포함한다. 본 발명의 시퀀싱 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 둘 모두를 포함하며, 이러한 프라이머는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 가장 통상적인 시퀀싱 장치의 경우, 형광 표지가 바람직하지만, 착색 표지, 색원체 표지, 플루오로겐(fluorogenic) 표지 (화학발광표지를 포함함)를 포함하는 다른 표지 유형이 또한 사용될 수 있다. 프라이머 조합은 역전사, 증폭 또는 시퀀싱에 적합한 다른 시약을 포함할 수 있고, 물론 분석을 위해 HCV 유전 물질을 포함할 수 있다.

하기 기재되는 본 발명의 시퀀싱 프라이머가 바람직하게는 하기 기재된 동일한 서열을 지닌 프라이머 중에서 선택되지만, 본 발명이 당 분야의 기술수준에 따라 설계되고 구성될 수 있는 동등한 특이성 및 기능을 지닌 축퇴성 서열을 포함한다는 것이 고려된다. 상세하게는, 시퀀싱 프라이머는 15개 이상의 뉴클레오티드를 지닌 상기 프라이머의 단편을 포함한다. 또한, 시퀀싱 프라이머는 16개, 17개, 18 개, 19개 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 지닌 상기 프라이머의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 축퇴성 서열의 설계 및 구성은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

시퀀싱 프라이머는 증폭 프라이머와 반대로 이들이 3' 염기에 대해 동일한 위치를 지니지 않는 경우 함께 혼합될 수 없으므로, 단지 특정한 축퇴성 염기 위치가 하기 예시되어 있지만, 3' 위치는 또한 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 5' 길이는 보다 많은 서열 보존을 지닌 영역을 포함하거나 융점 및 결합 엄격도(stringency)를 변형시키기 위해 변화될 수 있다. 성공율이 주요 프라이머로 충분한 것으로 나타난 경우 비축퇴성(nondegenrate) 프라이머 세트가 바람직하다. 또한, 반응 조건은 성능에 현저히 영향을 미칠 수 있다. 시퀀싱 프라이머의 잠재적 변형이 하기 섹션 및 실시예에 예시되어 있다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 먼저 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것을 포함한다. 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 일부는 다수의 HCV 종 각각의 유전자형을 나타내는 다수의 HCV 종의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 동일한 영역이다. 따라서, 본 발명의 한 가지 일면은 특정 HCV 종의 유형 및/또는 아형을 나타내는 HCV 종간에 공통되는 영역을 확인하는 것이다. 따라서, 임의의 HCV 종의 이러한 영역의 시퀀싱은 상기 단계에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 공지된 서열/유전자형을 지닌 다수의 HCV 종 중 하나의 유전자형과 상호관련시킴으로써 그러한 종의 유형 및 아형을 결정할 수 있게 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) HCV 종의 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 지닌 각각의 HCV 종의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 상기 종의 유전자형을 나타내는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) HCV 종의 유전자형 및 아형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 미 6을 지닌 HCV 종 각각 및 표 1에 기재된 아형 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 상기 종의 유전자형 및 아형을 나타내는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 아형 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함한다.

상기 방법의 한 가지 특정 구체예에서, HCV의 NS5b 영역의 일부는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 위치 약 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함한다.

상기 방법의 또 다른 특정 구체예에서, HCV의 NS5b 영역의 일부는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 위치 8344번 내지 8547번의 영역을 필수적으로 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하 는 뉴클레오티드 서열이 상기 종의 유전자형을 나타내는 단계; (b) 상기 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 다수의 HCV 종 중 하나의 유전자형과 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나를 나타내는 단계; (b) 상기 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 아형 중 하나를 나타내는 단계; (b) 상기 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 및 아형 (예를 들어, HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 아형 중 하나)과 상호관련시키는 단계를 포함한다.

한 가지 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8256번 내지 약 8278번 (CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5.5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 약 8611번 내지 약 8633번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다.

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번 (CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5.5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번 (예를 들어, CLIP 시퀀싱 프라이머 M-NS5b-Cy5)인 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다.

또 다른 특정 구체예에서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물은 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함한다:

다른 HCV 변이체를 검출할 수 있도록 상기 서열의 다른 변이가 이용될 수 있다.

실시예 1 - 시퀀싱에 의한 HCV NS5b 유전자형결정

본 실시예에는 유전자형 및 아형을 결정하기 위해 C형 간염 바이러스의 NS5b 영역에서 204개 염기쌍 단편의 양방향 서열을 생성시키기 위한 실험실 프로토콜이 기재되어 있다.

일반적으로, 바이러스 HCV RNA는 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 키아겐 QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트 (Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit)를 사용하여 혈장 샘플로부터 추출하였다. 요약하면, 추출된 RNA 시료를 랜덤 헥사머(random hexamer)를 사용하여 역전사시켰다.

cDNA 합성 후, 특정 프라이머를 사용하여 10 μL의 cDNA 주형을 증폭시켜서 398개 염기쌍 앰플리콘(amplicon)을 생성시켰다.

PCR 증폭 후, 염료-프라이머 CLIP 시퀀싱 반응을 수행하였다. CLIP 반응은 상이한 형광 염료 (Cy 5.5, Cy 5; 사슬-신장 시약)으로 각각 표지된 정방향 (센스) 및 역방향 (안티센스) 프라이머 및 4개의 사슬-종결 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (ddNTP)인 디데옥시아데노신 (ddATP), 디데옥시시티딘 (ddCTP), 디데옥시구아노신 (ddGTP) 또는 디데옥시티미딘 (ddTTP) 트리포스페이트 중 하나를 사용함으로써 DNA의 둘 모두의 가닥을 동시에 시퀀싱하였다. 반응을 샘플 및 ddNTP에 대해 높은 친화성을 지닌 열안정성 DNA 중합효소를 첨가하여 개시시켰다. 반응 혼합물이 열 사이클링됨에 따라, 프라이머가 주형 DNA에 하이브리드화하고 신장된 후, 표적 DNA 서열의 어느 위치에서 종결되었다. 4개의 CLIP 반응은 2개의 CLIP 프라 이머 사이에 표적의 정방향 서열 및 역방향 서열 둘 모두를 생성시켰다. 반응은 40회 사이클을 통해 진행하여 각각의 프라이머로부터 높은 수준의 사슬 종결된 반응 생성물을 생성시켰다. 사이클링 프로그램의 완료시에, 스톱 로딩 다이 (Stop Loading Dye) 용액을 각각의 반응 튜브에 첨가하고, 반응물을 가열하여 이중 가닥 DNA 단편을 분리하였다. 그 후, 각각의 반응물의 단편을 특정 포어 크기의 성형된 매트릭스를 지닌 초박형(ultra thin) 수직 중합된(vertical polymerized) 폴리아크릴아미드 겔을 함유하는 마이크로셀(MicroCel™) 500 카세트의 상단부상으로 로딩시켰다. 폴리아크릴아미드 겔은 DNA 단편을 단일 가닥 변성된 상태로 유지하기 위해 높은 우레아 농도를 함유하였다. 완충 용액은 초박형 겔의 상단부 및 하단부 둘 모두와 접촉하였다. 고전압 전기장을 적용하여, DNA의 음 하전된 단편이 겔을 통해 양극쪽으로 이동하게 하였다. DNA 단편의 이동 속도는 폴리아크릴아미드 매트릭스에 의해 형성된 포어 크기 및 DNA 단편 크기와 관련되며, 단편이 작을 수록 빠르게 이동하였다. 폴리아크릴아미드 겔의 하단부 근처에서, 레이저 빔이 레이저를 지나 이동하는 DNA 단편에 결합된 형광 염료를 여기시키고, 검출기가 형광 염료에 의해 생성된 파장 및 광량을 측정하였다. 그 후, 이러한 광 측정치를 시퀀서(sequencer)에 의해 수집하고, 데이터를 저장하는 워크스테이션(workstation)으로 전달하였다. 각각의 시퀀싱 반응은 4개의 레인(lane)을 필요로 하였고, 이는 4개의 사슬 종결 디데옥시뉴클레오티드 (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) 각각에 대해 하나씩이다. 정방향 및 역방향 CLIP 서열을 합치고, "가장 잘 매칭된 (best matched)" 기준 서열 (W)의 서열과 비교하였다. 오퍼레이터(operator)는 플래깅 된(flagged) 위치에서 정렬을 검토하고, 필요에 따라 염기를 편집하였다. 소프트웨어는 각각의 샘플에 대한 HCV NS5b 보고서를 준비하였다.

역전사 (cDNA 합성)

cDNA를 하기 프로토콜에 따라 샘플로부터 유래된 게놈 RNA로부터 합성하였다.

하기 기재된 RT 시약 (수퍼스크립트(Superscript) 및 RNase 억제제는 제외)을 볼텍싱(vortexing)시키고, 미세원심분리하여 시약을 회수하였다. 하기 포뮬러(formula)에 따라 계산된 부피를 사용하여 HCV NS5b RT 마스터 믹스 (HCV NS5b RT Master Mix)를 제조하였다:

HCV NS5b RT 마스터 믹스

RT 시약	최종 농도	부피/샘플
뉴클레아제 비함유 물		3.90 μL
10X PCR 완충액 II	1X	2.50 μL
MgCl2 용액 (25 mM)	5 mM	5.00 μL
dNTP's (100 mM)	8 mM	2.00 μL
랜덤 헥사머	60 pg/μL	1.00 μL
RNase 억제제 (20 U/μL)	0.4 U/μL	0.50 μL
수퍼스크립트(SuperScript) III 역전사효소 (200 U/μL)	0.8 U/μL	0.10 μL
전체 RT 시약		15.00 μL

RT 시약 (15 μL)을 각각의 표지된 PCR 튜브내로 분취하였다. 튜브를 증폭후 영역 데드 에어 후드 (dead air hood)로 이동시켰다. 샘플 및 대조 RNA 추출물을 냉동고로부터 꺼내어 실온에서 해동시켰다. 해동된 RNA 추출물 (10 μL)을 RT 시약을 함유하는 적절한 튜브에 첨가하였다. 트레이를 부드럽게 두드림으로써 시약 및 RNA를 혼합하였다.

튜브를 하기 단계를 수행하도록 프로그래밍된 써모사이클러(thermocycler)에 넣었다:

HCV NS5b RT 프로그램

# 사이클	분	온도 ℃	프로세스
1	10	25	랜덤 헥사머 어닐링
1	30	50	역전사
1	15	75	수퍼스크립트 비활성화
1	무한정	4	대기(Hold)

RT 샘플을 써모사이클러로부터 꺼내어 4℃에서 저장하였다.

PCR 증폭

중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭을 다음과 같이 수행하였다. PCR 튜브를 준비하고, 샘플에 대해 표지하였다. 하기 기재된 PCR 시약 (앰플리태크 골드 효소 (AmpliTaq Gold enzyme)는 제외)을 볼텍싱하고, 미세원심분리하여 시약을 회수하였다. 하기 뉴클레오티드 서열을 지니며 다수의 임상적으로 관련된 HCV 종을 증폭시키도록 설계된 축퇴성 프라이머의 혼합물을 제조하였다:

PCR 마스터 믹스는 시약 부피에 대한 워크시트(worksheet)를 사용하여 제조하였다. 부피는 하기 포뮬러에 따라 계산하였다:

HCV NS5b PCR 마스터믹스

PCR 시약	최종 농도	샘플 당 부피
뉴클레아제 비함유 물		23.25 μL
10X PCR 완충액 II	0.8X	4.00 μL
25 mM MgCL2 용액	1 mM	2.00 μL
M-NS5B-FF1 (10 μM)	0.3 μM	1.50 μL
M-NS5B-FF2 (10 μM)	0.6 um	3.00 μL
M-NS5B-RR1 (10 μM)	1.2 μM	6.00 μL
앰플리태크 골드 (5 U/μL)	0.025 U/μL	0.25 μL
전체 PCR 시약		40.00 μL

PCR 마스터 믹스 (40 μL)를 각각의 표지된 PCR 튜브내로 분취하였다. RT cDNA (10 μL)를 PCR 시약을 함유하는 적절히 표지된 튜브에 첨가하고, 튜브를 하기 단계를 수행하도록 프로그래밍된 써모사이클러에 넣었다:

HCV NS5b PCR 프로그램

# 사이클	시간	온도 ℃	프로세스
1	10분	95	앰플리태크 활성화
45	30초	94	변성
	30초	48	어닐링
	1분	68	신장
1	10분	68	최종 신장
1	무한정	4	대기

PCR 샘플을 써모사이클러로부터 꺼내어, 2주 이하 동안 4℃에서 저장하거나 하기 기재된 바와 같이 CLIP 시퀀싱에 적용할 수 있다.

CLIP 시퀀싱

하기 뉴클레오티드 서열을 지니며 다수의 임상적으로 관련된 HCV 종을 시퀀싱하도록 설계된 축퇴성 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제조하였다:

필요한 수의 PCR 스트립(strip) 튜브 및 캡을 트레이에서 조립하고, 콜드 블록 (cold block)에 넣었다. 0.5 mL 튜브를 각각의 샘플 및 대조표준에 대해 표지 하고, 콜드 블록에 넣었다. CLIP 시약 (써모 시쿼나아제 효소 (Thermo Sequenase enzyme)를 제외)을 냉동고로부터 꺼내어 실온에서 해동시켰다. 각각의 성분 (써모 시쿼나아제 효소를 제외)을 볼텍싱하고, 빠르게 회전시켜서 성분을 회수하였다. 10 μL 조정 피펫을 사용하여 3 μL의 적절한 CLIP 종결 믹스를 각각의 PCR 튜브 내의 웰의 각각의 컬럼의 하단부에 직접 이동시켰다.

써모 시쿼나아제 희석 완충액 중의 써모 시쿼나아제 효소의 1:10 희석액을 제조하였다. 하기 포뮬러에 따라 계산된 시약 부피를 사용하여 CLIP 마스터 믹스를 제조하였다.

HCV NS5b CLIP 마스터 믹스

CLIP 시약	최종 농도	샘플 당 부피
뉴클레아제 비함유 물		6.50 μL
7-데아자-dGTP Cy5/Cy5.5 다이 프라이머 사이클 시퀀싱 키트(Dye Primer Cycle Sequencing Kit) (100회 시험) 써모 시쿼나아제 희석 완충액 (520 μL) 써모 시쿼나아제 효소 (57 μL) 시퀀싱 완충액 (320 μL) A 종결 믹스 (375 μL) C 종결 믹스 (375 μL) G 종결 믹스 (375 μL) T 종결 믹스 (375 μL) 스톱 로딩 다이 (2750 μL)	1X	2.50 μL
M-NS5B 정방향 CLIP 프라이머	0.4 μM	2.50 μL
M-NS5B 역방향 CLIP 프라이머	0.1 μM	2.50 μL
DMSO	8%	2.00 μL
써모 시쿼나아제 효소 1:10 희석액	0.512 U/μL	4.00 μL
전체 CLIP 시약		20.00 μL

20 μL CLIP 마스터 믹스를 각각의 표지된 튜브내로 분취하고, CLIP 시약을 함유하는 튜브로 이동시켰다. PCR 앰플리콘 (2 μL)을 CLIP 마스터 믹스를 함유하는 적절한 튜브에 첨가하고, 짧게 볼텍싱하고, 미세원심분리하여, 튜브의 하단부에서 이를 회수하였다. CLIP 믹스 (5 μL)를 콜드 블록내의 4개의 종결 튜브 각각에 첨가하였다.

CLIP 증폭/시퀀싱 반응을 하기 프로토콜에 따라 써모사이클러로 수행하였다:

HCV NS5b CLIP

# 사이클	시간	온도 ℃	프로세스
1	2분	94	최초 변성
25	20초	94	변성
	45초	45	어닐링
	1분	68	신장
15	25초	94	변성
	2분	70	어닐링 및 신장
1	2분	72	최종 신장
1	무한정	4	대기

튜브를 써모사이클러로부터 꺼내고, 스톱 로딩 다이 (6 μL)를 각각의 튜브에 첨가하고, 볼텍싱하여 혼합시켰다. 튜브를 써모사이클러로 복귀시키고, 다음과 같이 변성 조건에 적용시켰다:

HCV NS5b 변성

# 사이클	시간	온도 ℃	프로세스
1	2분	80	변성
1	무한정	4	대기

튜브를 써모사이클러로부터 꺼내어, 저장하거나 하기 기재된 바와 같이 겔 전기영동시켰다.

겔 전기영동은 하기 시퀀서 제어 세팅을 이용하여 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 롱-리드 타워 시퀀서(Long-Read Tower Sequencer)를 사용하여 수행하였다:

겔 온도 (℃) 60℃

겔 전압 (V) 1800 V

레이저 파워 (%) 50 %

실행 클록(Run Clock) (샘플링 간격) 0.5초

실행 클록 (실행 기간) 50분

검정에 샘플 및 대조표준 정보를 배정하였다.

실시예 2 - 시퀀싱에 의한 HCV NS5b 유전자형결정법의 성능 특성의 평가

HCV NS5b 유전자형결정 검정의 성능 특성을 하기 시약을 사용하여 실질적으로 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 유전자형결정 검정을 기초로 하여 평가하였다.

HCV NS5b 특이적 시약

범용 시약(General Purpose Reagent's)

하기 샘플을 사용하였다:

샘플

분석 정확도 분석

본 발명의 방법 및 시약의 분석 정확도를 결정하기 위해, 유전자형 1-5를 포함하는 25원 패널 (25 member panel), 유전자형 1-6을 포함하는 6원 패널, 유전자형 4-10을 포함하는 12원 패널을 사용하여 분석을 수행하였고, 유전자형 1-6을 포함하는 15개의 추가의 임상 샘플을 분석하고, 결과를 이전의 유전자형과 비교하였다.

상기 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 샘플의 유전자형을 결정하고, 이를 샘플 섹션에 상세히 설명된 LiPA 또는 TruGene 5 'NC 유전자형결정법 또는 또 다른 NS5b 방법에 의해 이미 특성화된 동일한 샘플의 유전자형과 비교함으로써 분석 정확도를 결정하였다. 이러한 분석의 결과를 하기 표에 요약하였다:

분석 정확도 데이터

분석된 전체 58개의 정확도 샘플은 51 NS5b 유전자형 결과를 생성하였다. NS5b로 유전자형결정될 수 있는 샘플 51개 중 51개 또는 100%가 유형 수준에서 이미 결정된 유전자형과 일치하는 유전자형을 나타내었다. 51개 샘플 중 48개가 유형 및 아형 수준 둘 모두에서 일치하였고, 51개 샘플 중 3개가 유형 수준에서만 일치하였다 (3개 모두 LiPA에 의해 Ib였고, NS5b에 의해 Ia였음). 7개 샘플 (5개는 유전자형 6a였고, 2개는 유전자형 7c였음)은 증폭을 일으키지 못하여, NS5b에 의해 유전자형을 결정할 수 없었다.

상기 데이터는 본 발명의 유전자형결정 검정의 정확도가 다른 상업적으로 이용가능한 검정 보다 우수함을 나타낸다. 검정은 NS5b로 유전자형결정될 수 있는 51개 샘플에 대해 유형 수준에서 이전의 유전자형 결과와 100% 일치함을 나타내었다. NS5b로 유전자형결정될 수 없는 7개의 샘플을 이러한 평가 시기로부터 제외시켰다. 모든 7개의 유전자형결정될 수 없는 샘플을 이러한 평가의 2기 (Phase 2)에서 반복하였다.

후속하여 유전자형 6a 및 7c를 증폭하기 위해 개발중인 대안적인 RT-PCR 프라이머의 세트를 2기 분석과 관련하여 하기 설명된 바와 같이 설계하고 분석하였 다.

재현성 분석

본 발명의 HCV NS5b 유전자형결정 검정 및 시약의 재현성을 결정하기 위해, 유전자형 1-10을 포함하는 전체 22개의 샘플을 2회의 별도의 실행으로 2명의 오퍼레이터에 의해 분석하고, 결과를 유형 및 아형 수준에서 일치하는 지에 대해 비교하였다. 8회의 실행 각각에 대한 포지티브 대조표준의 결과를 또한 비교하였다.

오퍼레이터 대 오퍼레이터 재현성 데이터

실행 대 실행 재현성 데이터

22개의 샘플을 2명의 오퍼레이터에 의해 개별적으로 분석하여, 16개의 NS5b 유전자형을 산출하였다. 상기 데이터는 NS5b 유전자형결정 검정이 2명의 오퍼레이터 사이에서 뿐만 아니라 2회의 실행 사이에서도 유형 및 아형 수준 둘 모두에서 NS5b 유전자형의 16/16 또는 100% 일치를 생성시킴을 나타낸다.

6개의 샘플 (4개는 유전자형 6a였고, 2개는 유전자형 7c였음)은 둘 모두의 오퍼레이터에 의해 증폭되거나 유전자형결정될 수 없었다. 실행 대 실행 재현성: 8회의 실행으로부터의 포지티브 대조표준의 8개의 레플리케이트(replicate) 사이에서 100% 일치.

민감도 분석

유전자형결정 검정의 민감도 수준을 결정하기 위해, 유전자형 1-10의 희석 패널(dilution panel)을 또한 하기 상세히 설명된 바와 같이 제조하였다

HCV NS5b 민감도 희석 패널

* 민감도 패널 희석은 공급원에 의해 제공된 분석 증명 값(Certificate of Analysis values)을 기초로 하여 이루어졌다. bDNA에 의해 결정된 후속 바이러스 로드를 사용하여 이러한 민감도 패널 구성원에 대한 공칭 값을 다시 계산하였다.

** 이러한 샘플은 LiPA 및 HCV 5'NC TruGene 유전자형결정법에 의해 2b로서 그리고 NS5b 유전자형결정법에 의해 Ib로서 유전자형이 확인되었다. 이는 유전자형 불일치를 해결하기 위한 추가의 시험을 위해 레퍼런스 랩(reference lab)으로 보내졌다.

상기 데이터는 HCV NS5b 유전자형결정 검정이 유전자형 1-5에 대해 허용되는 민감도을 위한 기준을 충족시킴을 나타내는데, 이는 HCV 유전자형 1-5 샘플이 1,000 c/mL (192 IU/mL)에서 정확하고 재현가능하게 유전자형결정되었기 때문이다.

그러나, HCV NS5b 유전자형결정 검정은 HCV 유전자형 6에 대해 샘플을 일관되게 유전자형결정하지 못했다. HCV 유전자형 6 샘플은 1,000 c/mL (192 IU/mL)에서 일관되게 유전자형결정될 수 없었다. 따라서, 유전자형 6-10에 대한 민감도 희석을 준비하는 데에 있어서의 문제로 인해, 1,000 c/mL에서의 민감도는 이러한 데이터로부터 결정될 수 없다. 따라서, NS5b 유전자형결정 검정은 가변적 일관성을 지니며 유전자형 1-5에 대해 1,000 c/mL에서 정확하다.

실시예 3 - 시퀀싱에 의한 HCV NS5b 유전자형결정법의 성능 특성의 평가

분석 정확도 분석

유전자형 1-6을 포함하는 6원 패널, 유전자형 4-10을 포함하는 12원 패널 및 유전자형 4, 5 및 6을 포함하는 4개의 추가 임상 샘플로 구성된 1기 (phase 1) 검증 정확도 샘플의 서브셋(subset)을 분석하고, 결과를 이전 유전자형과 비교한다. 샘플은 샘플 섹션에 상세히 설명된 바와 같이 LiPA 또는 TruGene 5'NC 유전자형결정법 또는 또 다른 NS5b 방법에 의해 이미 특성화하였다.

분석 정확도 데이터

상기 데이터는 HCV NS5b 유전자형결정 검정의 정확도가 이미 실패한 2개의 7c 샘플 및 4개의 6a 샘플을 포함하는 모든 샘플에 대해 유형 수준에서 100% 일치함을 나타낸다.

재현성 분석

4회 실행 각각에 대한 포지티브 대조표준의 결과를 다음과 같이 비교하였다:

재현성 데이터

상기 데이터는 4회 실행으로부터 포지티브 대조표준의 4개 레플리케이트 사이에서 100% 일치를 나타낸다.

민감도 분석

유전자형 1-6의 희석 패널을 하기 상세히 설명된 바와 같이 제조하였다:

민감도 데이터

* 이러한 샘플은 LiPA 및 HCV 5'NC TruGene 유전자형결정법에 의해 2b로서 그리고 NS5b에 의해 Ib로서 유전자형이 확인되었다. 이는 유전자형 불일치를 해결하기 위한 추가의 시험을 위해 레퍼런스 랩(reference lab)으로 보내졌다.

이러한 검정은 유전자형 1-5에 대해 1,000 c/mL (192 IU/mL)에서 정확하고 재현가능한 유전자형을 생성시켰을 뿐만 아니라 유전자형 6에 대해 5,000 c/mL (962 IU/mL)에서 정확하고 재현가능한 유전자형을 생성시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> BAYER HEALTHCARE LLC HNATYSZYN, James BELD, Marcellinus Gualbertus Hubertus Maria GUETTOUCHE, Toumy GOUW, Remko van der MEER, Carola Beatrijs Maria <120> METHODS AND REAGENTS FOR GENOTYPING HCV <130> 49493-326 <140> Not yet assigned <141> 2006-12-22 <150> US 60/753,761 <151> 2005-12-23 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 1 tatgayaccc gctgyttyga ytc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 vgtcatrgcn tcygtraagg ctc 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 3 tggggttckc gtatgayacc cgctg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 tggggttckc ntatgayacy mgntg 25 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 gartayctvg tcatrgcntc ygtraa 26 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 tggsbttykc ntaygayacy mgntg 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 7 tggggttckc gtatgayacc cgctg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 tggggttckc ntatgayacy mgntg 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 gartayctvg tcatrgcntc ygtraa 26 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 10 tatgayaccc gctgyttyga ytc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> i <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 vgtcatrgcn tcygtraagg ctc 23 <210> 12 <211> 1944 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 12 cccgactccg acgttgagtc ctattcttcc atgccccccc tggaggggga gcctggggat 60 ccggatctca gcgacgggtc atggtcgacg gtcagtagtg gggccgacac ggaagatgtc 120 gtgtgctgct caatgtctta ttcctggaca ggcgcactcg tcaccccgtg cgctgcggag 180 gaacaaaaac tgcccatcaa cgcactgagc aactcgttgc tacgccatca caatctggtg 240 tattccacca cttcacgcag tgcttgccaa aggaagaaga aagtcacatt tgacagactg 300 caagttctgg acagccatta ccaggacgtg ctcaaggagg tcaaagcagc ggcgtcaaaa 360 gtgaaggcta acttgctatc cgtagaggaa gcttgcagcc tggcgccccc acattcagcc 420 aaatccaagt ttggctatgg ggcaaaagac gtccgttgcc atgccagaaa ggccgtagcc 480 cacatcaact ccgtgtggaa agaccttctg gaagacagtg taacaccaat agacactacc 540 atcatggcca agaacgaggt tttctgcgtt cagcctgaga aggggggtcg taagccagct 600 cgtctcatcg tgttccccga cctgggcgtg cgcgtgtgcg agaagatggc cctgtacgac 660 gtggttagca agctcccctt ggccgtgatg ggaagctcct acggattcca atactcacca 720 ggacagcggg ttgaattcct cgtgcaagcg tggaagtcca agaagacccc gatggggctc 780 tcgtatgata cccgctgttt tgactccaca gtcactgaga gcgacatccg tacggaggag 840 gcaatttacc aatgttgtga cctggacccc caagcccgcg tggccatcaa gtccctcact 900 gagaggcttt atgttggggg ccctcttact aattcaaggg gggaaaactg cggctaccgc 960 aggtgccgcg cgagcagagt actgacaact agctgtggta acaccctcac tcgctacatc 1020 aaggcccggg cagcctgtcg agccgcaggg ctccaggact gcaccatgct cgtgtgtggc 1080 gacgacttag tcgttatctg tgaaagtgcg ggggtccagg aggacgcggc gagcctgaga 1140 gccttcacgg aggctatgac caggtactcc gccccccccg gggacccccc acaaccagaa 1200 tacgacttgg agcttataac atcatgctcc tccaacgtgt cagtcgccca cgacggcgct 1260 ggaaagaggg tctactacct tacccgtgac cctacaaccc ccctcgcgag agccgcgtgg 1320 gagacagcaa gacacactcc agtcaattcc tggctaggca acataatcat gtttgccccc 1380 acactgtggg cgaggatgat actgatgacc cacttcttta gcgtcctcat agccagggat 1440 cagcttgaac aggctctcaa ctgcgagatc tacggagcct gctactccat agaaccactg 1500 gatctacctc caatcattca aagactccat ggcctcagcg cattttcact ccacagttac 1560 tctccaggtg aaattaatag ggtggccgca tgcctcagaa aacttggggt cccgcccttg 1620 cgagcttgga gacaccgggc ctggagcgtc cgcgctaggc ttctggccag aggaggcaag 1680 gctgccatat gtggcaagta cctcttcaac tgggcagtaa gaacaaagct caaactcact 1740 ccgataacgg ccgctggccg gctggacttg tccggctggt tcacggctgg ctacagcggg 1800 ggagacattt atcacagcgt gtctcatgcc cggccccgct ggttctggtt ttgcctactc 1860 ctgcttgctg caggggtagg catctacctc ctccccaacc gatgaagatt gggctaacca 1920 ctccaggcca ataggccatt ccct 1944

Claims (32)

1. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법으로서,

   (a) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, 다수의 HCV 종의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형을 나타내는 단계; 및

   (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 다수의 HCV 종 중 하나의 유전자형과 상호관련시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, HCV의 NS5b 영역의 일부가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 위치 약 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함하는 것인 방법.
3. 제 1항에 있어서, HCV의 NS5b 영역의 일부가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 위치 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함하는 것인 방법.
4. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법으로서,

   (a) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 지닌 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형을 나타내는 단계; 및

   (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, HCV의 NS5b 영역의 일부가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 위치 약 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함하는 것인 방법.
6. 제 4항에 있어서, HCV의 NS5b 영역의 일부가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 위치 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함하는 것인 방법.
7. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형 및 아형(subtype)을 결정하는 방법으로서,

   (a) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형 및 아형을 나타내는 HCV의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 지닌 다수의 HCV 종 각각 및 표 1에 기재된 HCV 아형 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형 및 아형을 나타내는 단계; 및

   (b) 단계 (a)에서 결정된 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 표 1에 기재된 상기 아형 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형 및 아형을 결정하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, HCV의 NS5b 영역의 일부가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 위치 약 8344번 내지 약 8547번의 영역을 필수적으로 포함하는 것인 방법.
9. 제 7항에 있어서, HCV의 NS5b 영역의 일부가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 위치 8344번 내지 8547번의 영역을 필수적으로 포함하는 것인 방법.
10. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하기 위한 방법으로서,

    (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성(degenerate) 올리고뉴클레오티드 시퀀싱(sequencing) 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드가 그러한 HCV 종의 독특한 유전자형을 나타내는 단계;

    (b) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및

    (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 상기 다수의 HCV 종 중 하나의 유전자형과 상호관련시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하기 위한 방법.
11. 제 10항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8256번 내지 약 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8611번 내지 약 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법.
12. 제 10항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법.
13. 제 10항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 하기 식에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법:

    
14. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법으로서,

    (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나를 나타내는 단계;

    (b) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및

    (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나와 상호관련시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8256번 내지 약 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8611번 내지 약 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법.
16. 제 14항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법.
17. 제 14항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 하기 식에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법:

    
18. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법으로서,

    (a) 다수의 HCV 종의 NS5b 영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수 있는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계로서, 상기 다수의 HCV 종 각각의 상응하는 뉴클레오티드 서열이 HCV 유전자형 1, 2, 3, 4, 5 및 6 중 하나 및 아형 중 하나를 나타내는 단계;

    (b) 시험 샘플에 존재하는 상기 HCV 종의 유전자형 및 아형을 나타내는 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및

    (c) 단계 (b)에서 결정된 상기 HCV 종의 NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 HCV 유전자형 및 아형과 상호관련시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 유전자형을 결정하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8256번 내지 약 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8611번 내지 약 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법.
20. 제 18항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열, 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법.
21. 제 18항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물이 하기 식에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법:

    
22. 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 NS5b 영역의 일부를 증폭시키는 방법으로서,

    (a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8245번 내지 약 8269번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열; 및

    SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 약 8616번 내지 약 8641번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물을 제공하는 단계; 및

    (b) NS5b 영역의 상기 일부의 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계를 포함하여 시험 샘플에 존재하는 C형 간염 바이러스 (HCV) 종의 NS5b 영역의 일부를 증폭시키는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8256번 내지 8278번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열; 및

    SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 8611번 내지 8633번의 다수의 HCV 종의 NS5b 영역에 상보적인 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방 법.
24. 제 22항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물이 하기 식에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법:

    
25. 제 22항에 있어서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물이 하기 식에 의해 규정되는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보서열을 포함하는 것인 방법:

    
26. 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 포함하는, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물:

    
27. 제 26항에 있어서, 상기 혼합물이 하기 식에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 포함하는 것인 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물:

    
28. 제 26항에 있어서, 상기 혼합물이 하기 식에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 포함하는 것인 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물:

    
29. 제 26항에 있어서, 상기 혼합물이 하기 식에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 포함하는 것인 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머의 혼합물:

    
30. 하기 식 중 하나 이상에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머를 포함하는, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물:

    
31. 제 30항에 있어서, 상기 혼합물이 하기 식에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머를 포함하는 것인 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물:

    
32. 제 30항에 있어서, 상기 혼합물이 하기 식에 의해 규정된 다수의 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머를 포함하는 것인 축퇴성 올리고뉴클레오티드 시퀀싱 프라이머의 혼합물:

    

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