CN114480328A - 一种Taq DNA聚合酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能进行快速PCR的Taq DNA聚合酶突变体。本发明中筛选获得的突变体，在PCR和qPCR中均表现出快速PCR活性，尤其在qPCR中极低量的模板条件下也具有快速PCR的活性。基于这些优势，该突变体可以在低拷贝模板的条件下进行快速PCR，从而在临床诊断和科学研究中可以更快和更加灵敏地获得结果。

Description

一种Taq DNA聚合酶突变体
技术领域
本发明涉及生物领域，并具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种应用十分广泛的体外扩增DNA技术。PCR自1985年问世以来，逐渐扩展到各个领域。除了在实验室分子生物学中运用，在临床疾病诊断和法医鉴定上也有着十分重要的作用。比如检测基因突变和微生物或病毒感染因子等，还比如可以进一步检测抗生素耐药基因和生物威胁剂。PCR的最早的诊断用途之一是用于镰状细胞贫血的产前诊断试验。使用PCR检测镰状细胞突变比以前的方法更快速和敏感。随后进行了更多基于PCR的诊断，包括检测低拷贝数病毒靶点(如HIV)；通过检测结核分枝杆菌诊断肺结核的试验；以及用于检测胃肠道幽门螺杆菌的不同分离物。
1992年，Higuchi等人开发了实时PCR(qPCR)。这种增强的PCR方法通过荧光染料(如SYBR Green I)或荧光共振能量转移(FRET)探针实时检测反应过程中形成的产物量。有三种主要的FRET探针：5'核酸外切酶探针(TaqMan)、分子信标和FRET杂交探针。SYBR GreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时发出荧光，而当它从DNA分子释放时荧光减弱。实时PCR使得反应中DNA的起始量和整个过程中DNA的产生量实现可视化。与传统的培养方法相比，基于PCR的检测方法具有速度快、特异性强、灵敏度高等优点。
PCR反应主要依赖于DNA聚合酶。最初PCR技术中扩增DNA的酶来源于大肠杆菌聚合酶的Klenow片段。PCR扩增可以在短短几小时内就产生数十亿个拷贝的分子。随后在一些嗜热细菌中分离出了几种非常耐热的DNA聚合酶，包括Thermus aquaticus(Taq)、Thermusthermophilus(Tth)和Pyrococcus furiosus(Pfu)。它们在95℃的高温下依旧不会失去活性。其中，Taq DNA聚合酶是第一种应用于PCR的酶。它既有聚合酶活性又有外切酶活性。由于Taq DNA聚合酶高稳定性和高效性以及简单和经济的生产过程，这种聚合酶是大多数PCR应用中最受欢迎和最广泛使用的酶。
聚合酶链反应(PCR)的基因检测被广泛应用于疾病诊断和个性化医疗。但是，随着科学技术和社会的发展进步，临床诊断和科学研究中对于Taq DNA聚合酶的要求越来越高。这就暴露出它存在许多局限，包括DNA产量低、延伸DNA的长度短、聚合酶的速度慢、过程的保真度低和耐受性差等。
为了提高PCR的速度，科学家们已经通过调整PCR的配方和改造仪器来满足在短时间内扩增大量DNA产物的需要。目前，缩短qPCR运行时间的方法是减少变性、退火和延伸步骤的时间，或者通过将退火和延伸步骤组合的两步法来实现。虽然这样可以将运行时间缩短50％，但是当应用一系列模板引物组合时，Taq DNA聚合酶的检测灵敏度会大大降低。另外通过改变PCR的体系和减少反应体积或使用薄壁PCR管来改善传热可以进一步提高PCR的速率。然而，PCR的运行时间主要是受到PCR酶的动力学特性的限制。最具有说服力的例子就是校正家族B DNA聚合酶的加工性与PCR循环时间直接相关。另外通过融合一个双链DNA结合蛋白(Sso7d)可以将Pfu DNA聚合酶的加工性提高9倍，当扩增5kb DNA时，延伸和退火时间可以从2min缩短到30s。不幸的是，Pfu DNA聚合酶没有5’->3’的核酸外切酶活性，不能应用于一些探针检测中，而将Sso7d与Taq DNA聚合酶融合时，会使得蛋白不稳定。
因此，本领域存在对能够消除上述限制的Taq DNA聚合酶的需求。
为了解决上述需求，可以从Taq DNA聚合酶本身着手去减小这些限制。其中一种就是在Taq DNA聚合酶突变体中筛选获得在某一方面具有优越性能的个体。而最有效、最快速的方法就是对Taq DNA聚合酶进行区域性自我复制筛选(即CSR高通量筛选)。
CSR主要基于一个反馈回路，每个聚合酶突变体都只能复制自己的编码基因。在利用易错PCR随机突变建立文库后，通过形成油包水乳剂在隔室中分离出聚合酶突变体。每个小室通常包含一个含有聚合酶突变体的表达型大肠杆菌细胞，这就提供了表型和基因型之间的联系，而这正是这一过程的关键。
当热循环导致细胞裂解时，PCR试剂也包含在隔室内并与表达的聚合酶结合。如果聚合酶突变体以活性酶的形式表达，或在压力条件下是有活性的，那么它将复制自己的基因，从而在热循环过程中增加编码活性聚合酶的基因的拷贝数。不能自我复制的不活跃的聚合酶将从基因库中逐渐减少最终消失。
以这种方式进行几轮甚至十几轮的筛选和富集最终获得想要的突变体聚合酶。
这个筛选过程中可以设置各种各样的压力来筛选不同突出性能的个体来满足不同的实验要求。比如1)在CSR过程中，通过逐步降低循环数和延伸时间，来筛选能够在短时间内即可扩增出大量产物的突变体，或者2)在CSR过程中，逐轮增加PCR抑制剂浓度如SYBRGreen I、肝素和SDS等，来筛选耐抑制剂的突变体，或者3)在CSR过程中，添加易形成二聚体的引物来筛选具有热启动活性的个体，或者4)在CSR过程中，加入能够阻断聚合进程的修饰引物筛选具有高外切酶活性的个体，从而应用于qPCR中高效切除探针，以提高检测的灵敏度。
在这些研究的过程中，许多不同突变的Taq DNA聚合酶被创造和研究，以一种或另一种方式改善这种酶的性质，包括提高酶的保真度，改变5'-3'核酸外切酶活性，提高酶分子与DNA的结合性，增强酶“冷敏感性”或增加酶对不同PCR抑制剂的耐受性。这些Taq DNA聚合酶突变体可用于qPCR、DNA测序、扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。例如，在qPCR中使用的SYBR Green I染料，它可以抑制Taq DNA聚合酶活性，降低PCR的效率和灵敏度。聚合酶对SYBR Green I的耐受性增加可能与血液和土壤中对其他PCR抑制剂的酶耐药性增加有关。另外科学家们也已经筛选获得一些具有快速PCR活性的Taq DNA聚合酶突变体，如G59W、V155I、L245M、L375V、E507K、K508R、E734G、F749I、E189K、E230K、E507K、H28R、L30R、G38R、F73V、H75R、E76A、E76G、E76K、E90K、K206R、E315K、A348V、L351F、A439T、D452N、G504S、E507A、D551N、L552R、I553V、D578N、H676R、Q68OR、D732G、E734G、E734K、F749V。但是这些突变体目前还存在或多或少的问题，例如需要的模板量高，或者快速PCR的效果不能达到理想状态。而其中E507K是公认具有快速PCR活性的突变体，可以利用E507K作为对照，来验证所获得的突变体是否具有快速PCR的效果。
发明内容
基于上述问题，本发明人建立了Taq DNA聚合酶定向进化和高通量筛选系统并确认了该系统的可行性。目前本发明人利用该系统定向进化出了具有快速扩增活性的TaqDNA聚合酶突变体。经过几轮CSR的筛选，本发明人获得了一些活性较好的突变体，其中本发明人筛选获得Taq 03DNA聚合酶突变体其突变位点为F27S/D144G/I823M。
Taq DNA聚合酶的基因序列信息如下：
ATGGCGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCCACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGAGCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGACGGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCCTACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCAGAGGACTTTCCCCGGCAACTCGCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCTACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTACGAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCACGTCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGCCTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAACCTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTCCTGGAGGAGTGGGGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACCTGGCCAAGGTGCGCACCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTGGAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGCCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCAGGCGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGGCTCTCCGCCAAGGAGTAA(SEQ ID NO：1)
Taq DNA聚合酶的蛋白序列信息如下：
MAGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO：2)
Taq 03DNA聚合酶突变体基因突变位点为T79C/A431G/A2469G，相应的蛋白序列突变位点为F27S/D144G/I823M。
如本发明所定义的，普通Taq DNA聚合酶的延伸速度为1kb/min，快速PCR是指在相同条件下，Taq DNA聚合酶突变体的延伸速度高于1kb/min。即在相同条件下，突变体可以在更短的时间，扩增相同长度的DNA片段。
在本发明中，本发明人通过PCR三步法、qPCR两步法验证了这个突变体的性能。本发明证明了该突变体可以在短时间内即可获得大量的DNA产物，该突变体能够应用于临床诊断和试剂盒的开发。
因此，在一方面，本发明提供了一种Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少一个突变：F27S、D114G和I823M。
在一个实施方案中，本发明的Taq DNA聚合酶包含选自以下位点中至少两个突变：F27S、D114G和I823M。
在另一个实施方案中，本发明的Taq DNA聚合酶包含F27S、D114G和I823M的突变。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明的Taq DNA聚合酶。
在一个实施方案中，本发明的分离的核酸包含选自以下位点中至少一个突变：T79C、A431G和A2469G。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸包含选自以下位点中至少两个突变：T79C、A431G和A2469G。
在又一个实施方案中，本发明的分离的核酸包含T79C、A431G和A2469G的突变。
在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的Taq DNA聚合酶或分离的核酸。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。
在另一方面，本发明提供了一种PCR方法，其使用本发明的Taq DNA聚合酶进行PCR。
在一个实施方案中，本发明的PCR方法是快速PCR。
在另一个实施方案中，本发明的PCR方法是实时PCR。
在又一方面，本发明提供了本发明的Taq DNA聚合酶在用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行PCR方法。
在一个实施方案中，本发明的PCR方法是快速PCR。
在另一个实施方案中，本发明的PCR方法是实时PCR。
在又一个实施方案中，本发明的试剂盒是诊断试剂盒。
在进一步的方面，本发明提供了本发明的Taq DNA聚合酶或试剂盒的用途，其用于PCR、qPCR、DNA测序或扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。
本发明的有益效果至少在于以下两点：
(1)本发明的Taq 03DNA聚合酶突变体，通过PCR三步法，鉴定出其具有快速PCR效果，该突变体可以在短时间内扩增出大量DNA产物；
(2)本发明的Taq 03DNA聚合酶突变体，通过qPCR两步法，鉴定出在Evagreen条件下能够进行快速PCR，该突变体比WT的CT值提前2-4个，并且也小于E507K。
附图简要说明
图1为CSR高通量筛选原理图及筛选过程。
图2为CSR第四轮突变体库粗酶检测结果。
图3为通过PCR三步法检测突变体是否具有快速PCR活性的结果图。从结果图中可以看出当延伸时间降低到1秒时，只有E507K和Taq 03有明显的PCR产物，而WT无明显的PCR产物；并且Taq 03的产物量明显多于E507K。
图4和图5为当用Evagreen作为染料时，通过qPCR检测突变体是否具有快速PCR活性的结果图和定量分析结果。结果显示，当延伸时间为1分钟时可以看出CT值由小到大为Taq 03<E507K<WT，但是CT值相差较小在1个左右。当延伸时间降低到15秒时，CT值由小到大为Taq03<E507K<WT，并且CT值相差较大在2-4个。当延伸时间降低到1秒时，CT值由小到大为Taq 03<E507K<WT，并且CT值相差较大在2-3个。由此可以看出Taq 03的扩增速度不仅快于WT，甚至高于E507K；并且这种快速PCR的效果在低模板量的条件下更加突出。
图6是为qPCR-SYBR Green I两步法对比试剂盒中Taq-DNA聚合酶和Taq03 DNA聚合酶突变体活性的检测结果比较。
具体实施方式
本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。本发明的实施例仅为示例性而非限制性的。
实施例
实施例1-Taq 03 DNA聚合酶突变体的获得
本实施例首先建立了CSR高通量筛选系统，并通过易错PCR获得突变体文库，然后将突变体文库进行乳化PCR并且在PCR过程中降低延伸时间和循环数(见图1)。
在第四轮文库中随机挑出8个克隆，通过诱导细菌产生粗酶来检测其活性并通过测序鉴定突变情况，结果发现在这种情况下野生型细菌无法扩增出2500bp的条带而其中Taq 01和03能扩增出条带且Taq 03的DNA产量较高具有优异的活性(见图2)。因此，将其与WT和E507K一起纯化并检测活性。
实施例2-PCR三步法检测快速PCR
在PCR三步法检测中以小鼠基因组为模板，并设计了可以扩增1kb DNA的引物。引物序列为F：gcagatagggaaatggggctcctga(SEQ ID NO：3)，R：tcagcaagacctgcgtaggcaacgg(SEQ ID NO：4)。随后设计了检测快速PCR的实验，即保持循环数不变，逐步降低延伸时间分别为60秒、30秒、10秒、5秒、1秒。
结果发现延伸时间降低到1秒前WT、E507K和Taq 03突变体均能扩增出PCR产物，但条带会逐渐减弱，而当延伸时间为1秒时，只有Taq 03和E507K有明显的PCR产物(见图3)。这说明Taq 03突变体有着与E507K相同的快速PCR能力。
PCR体系：
组分 25μL反应混合物
双蒸水 添加至25μL
10×Taq缓冲液 2.5μL
2.5mM dNTP 2.5μL
10μM正向引物 0.5μL
10μM反向引物 0.5μL
小鼠基因组DNA 20ng
Taq DNA聚合酶 0.5μL
PCR扩增程序：
Figure BDA0002742592930000101
实施例3-qPCR两步法检测快速PCR
在qPCR两步法检测中以人细胞基因组为模板，并设计了可以扩增148bp DNA的引物。引物序列为F：aaagccgctcaactacatgg(SEQ ID NO：5)，R：tgctttgaatgcgtcccagag(SEQID NO：6)。
首先利用Evagreen染料检测qPCR过程中产物的生成。在qPCR两步法过程中设置了不同退火时间和模板量。
首先检测了延伸时间为1分钟时这些DNA聚合酶的活性，结果可以看出CT值由小到大为Taq 03<E507K<WT，但是CT值相差较小在1个左右。
随后将延伸时间降低到15秒时，CT值由小到大为Taq 03<E507K<WT，并且CT值相差较大在2-4个。
最后将延伸时间降低到1秒时，CT值由小到大为Taq 03<E507K<WT，并且CT值相差较大在2-3个(见图4和5)。
由此看出Taq 03的扩增速度不仅快于WT，甚至高于E507K；并且这种快速PCR的效果在低模板量的条件下更加突出，因此这就说明本发明筛选获得的Taq 03具有快速PCR的活性且在低模板量条件下更加突出。
qPCR体系：
组分 20μL反应混合物
双蒸水 添加至20μL
10×Taq缓冲液 2μL
2.5mM dNTP 2μL
10μM正向引物 0.4μL
10μM反向引物 0.4μL
人基因组DNA 10ng/1ng/0.1ng
Taq DNA聚合酶 0.5μL
20×Evagreen 1μL
qPCR扩增程序：
Figure BDA0002742592930000111
实施例4-示例性诊断试剂盒
乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内分布，估计有2.4亿人慢性感染，其中每年约有68.6万人死于乙型肝炎感染及其后果。目前已经开发出许多诊断试剂盒，为了验证本发明筛选获得的Taq 03DNA聚合酶能够更好的应用于该类试剂盒检测中，将试剂盒中的TaqDNA聚合酶和Taq 03DNA聚合酶突变体进行对比。参考Elisabeth Lampe在Usefulness ofin-house real time PCR for HBV DNA quantification in serum and oral fluidsamples中设计的用于扩增HBV前S/S区的引物来检测HBV病毒DNA。
正向引物：5′-GAATCCTCACAATACCGCAGAGT-3′(SEQ ID NO：7)；
反向引物：5′-GCCAAGACACACGGGTGAT-3′(SEQ ID NO：8)。
在qPCR两步法过程中设置了不同退火时间。
首先检测了延伸时间为1分钟时DNA聚合酶的活性，结果可以看出CT值由小到大为Taq 03DNA聚合酶<Taq DNA聚合酶，但是CT值相差较小在1个左右。
随后将延伸时间降低到15秒时，CT值由小到大为Taq 03DNA聚合酶<Taq DNA聚合酶，并且CT值相差2个左右。
最后将延伸时间降低到1秒时，CT值由小到大为Taq 03DNA聚合酶<Taq DNA聚合酶，并且CT值相差较大在3个左右(见图6)。
从结果可以看出，在检测过程中，本发明的Taq 03DNA聚合酶的扩增速度快于试剂盒中的Taq DNA聚合酶，因此这就说明本发明筛选获得的Taq 03DNA聚合酶能够应用于试剂盒检测中。
qPCR体系及程序如下：
组分 20μL反应混合物
双蒸水 添加至20μL
10×Taq缓冲液 2μL
2.5mM dNTP 2μL
10μM正向引物 0.4μL
10μM反向引物 0.4μL
HBV DNA 1ng
Taq DNA聚合酶 0.5μL
20×Evagreen 1μL
qPCR扩增程序：
Figure BDA0002742592930000131
本发明包括以下实施方案：
1.一种Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少一个突变：F27S、D114G和I823M。
2.根据实施方案1所述的Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少两个突变：F27S、D114G和I823M。
3.根据实施方案1或2所述的Taq DNA聚合酶，其包含F27S、D114G和I823M的突变。
4.一种分离的核酸，其编码根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶。
5.根据实施方案4所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自以下位点中至少一个突变：T79C、A431G和A2469G。
6.根据实施方案5所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自以下位点中至少两个突变：T79C、A431G和A2469G。
7.根据实施方案6所述的分离的核酸，其中所述核酸包含T79C、A431G和A2469G的突变。
8.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶或根据实施方案4-7中任一项所述的分离的核酸。
9.根据实施方案8所述的试剂盒，其为诊断试剂盒。
10.一种PCR方法，其使用根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶进行PCR。
11.根据实施方案10所述的PCR方法，其中所述PCR方法是快速PCR。
12.根据实施方案10或11所述的PCR方法，其中所述PCR方法是实时PCR。
13.根据实施方案1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶在用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行PCR方法。
14.根据实施方案13所述的用途，其中所述PCR方法是快速PCR。
15.根据实施方案13或14所述的用途，其中所述PCR方法是实时PCR。
16.根据实施方案13-15中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是诊断试剂盒。
17.根据前述实施方案的Taq DNA聚合酶或试剂盒的用途，其用于PCR、qPCR、DNA测序或扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种Taq DNA聚合酶突变体
<130> IDC200375
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2499
<212> DNA
<213> Taq DNA聚合酶
<400> 1
atggcgggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120
gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180
gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240
tacaaggcgg gccgggcccc cacgccagag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300
gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360
gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420
gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480
tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540
gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600
gagaagacgg cgaggaagct cctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660
ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720
ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780
aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840
ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900
ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960
cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020
gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080
ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140
gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200
gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260
gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320
ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380
ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440
cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500
cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560
gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620
ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680
cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740
ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tcaggcgggc cttcatcgcc 1800
gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860
cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920
gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg 1980
gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040
gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100
cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160
gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220
cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280
atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340
cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400
cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460
gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtaa 2499
<210> 2
<211> 831
<212> PRT
<213> Taq DNA聚合酶
<400> 2
Met Ala Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp
770 775 780
Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg
785 790 795 800
Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu
805 810 815
Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠基因组正向引物
<400> 3
gcagataggg aaatggggct cctga 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠基因组反向引物
<400> 4
tcagcaagac ctgcgtaggc aacgg 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人细胞基因组正向引物
<400> 5
aaagccgctc aactacatgg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人细胞基因组反向引物
<400> 6
tgctttgaat gcgtcccaga g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> HBV正向引物
<400> 7
gaatcctcac aataccgcag agt 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> HBV反向引物
<400> 8
gccaagacac acgggtgat 19

Claims (12)

1.一种Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少一个突变、任选地至少两个突变或者全部突变：F27S、D114G和I823M。
2.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自以下位点中至少一个突变、任选地至少两个突变或者全部突变：T79C、A431G和A2469G。
4.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶或根据权利要求2-3中任一项所述的分离的核酸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其为诊断试剂盒。
6.一种PCR方法，其使用根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶进行PCR。
7.根据权利要求6所述的PCR方法，其中所述PCR方法是快速PCR。
8.根据权利要求6或7所述的PCR方法，其中所述PCR方法是实时PCR。
9.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶在用于制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行PCR方法。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述PCR方法是快速PCR。
11.根据权利要求9或10所述的用途，其中所述PCR方法是实时PCR。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是诊断试剂盒。
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