CN108265039A - 一种突变TaqDNA聚合酶及其纯化方法 - Google Patents

一种突变TaqDNA聚合酶及其纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变Taq DNA聚合酶及其在大肠杆菌中的纯化方法。本发明采用现代基因工程技术，将天然Taq DNA聚合酶进行突变，去除了其5‘‑3’的DNA外切酶活性，并且引入E507R,E742A和A743H（氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定）突变。和野生型Taq DNA聚合酶相比，此突变型Taq DNA聚合酶具有更高的热稳定性和抗生物样品中不纯成分对聚合酶的抑制作用，使其更加适应科研及临床应用需求。其纯化工艺采取简便、快速、高产率的特异性亲和柱，获得的突变型Taq酶质量高、成本低、十分适合工业放大生产。

Description

一种突变TaqDNA聚合酶及其纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种突变型Taq DNA聚合酶及其纯化方法。
背景技术
Taq DNA聚合酶是A. Chien从一种水生栖热菌(Thermus aquaticus) YTI株分离提取的。所述yT1株是一种嗜熟真细菌于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的，适合生长在70-75 ℃生长，。Taq DNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94 KDa, 80 ℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70 ℃延伸率大于60 个核苷酸/秒。TaqDNA聚合酶在95℃酶活性可以持续40分钟，而97.5℃加热5-6分钟可以保持大约50%的酶活。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的自动连续循环的前提条件，也是PCR反应能在生物技术领域迅速发展和广泛应用的原因。
DNA聚合酶作为分子生物学的工具酶，在生物技术和医学临床上的应用十分广泛，具有较高的市场价值。然而随着医药科技的发展，新领域的应用对DNA聚合酶的性能不断提高，原有的野生型Taq DNA聚合酶已经不能满足新的应用要求，如Taq DNA聚合酶容易被血液、粪便中的化学成分所抑制，导致实验或检测的失败。因此需要对野生型Taq DNA聚合酶进行改造和筛选，得到新的突变体来适应科研、医学应用和工业生产的需求。
传统的野生型Taq DNA聚合酶纯化步骤较多，生产过程中所需多步柱上层析，费时长且产率低。1993年Frances c. Lawyer等人采用肝素柱对Taq DNA聚合酶进行亲和纯化，肝素柱虽然特异性比较高，但是载量比较低，不利于放大生产。1994年Harrell和Hart报导的Taq DNA聚合酶纯化方法中提到了用离子交换的方法，1995年Edith Grim报道Taq DNA聚合酶纯化方法中也包含了离子交换的方法。在此以后的大多数关于Taq DNA聚合酶纯化方法的文章中也都采用了离子交换的工艺. 离子交换的工艺虽然能提高载量，但是由于他本身的非特异性洗脱会导致杂蛋白的含量会增多，如果达到一定的纯度要求还需进行其他步骤的纯化，这会增加工艺的复杂度以及提高成本。鉴于此，开发简便、快速、高效、低成本的工业化可行的Taq DNA聚合酶纯化方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法。和野生型Taq DNA聚合酶，对样品中不纯的化学成分具有更强的抗抑制作用。
根据上述目的，本发明提供一种突变型Taq DNA聚合酶，其核苷酸和氨基酸序列为SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。突变的氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定，野生型Taq DNA聚合酶为SEQ ID NO. 3所示。
本发明提供了一种蛋白表达载体，该载体包含了可编码此突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列；此载体可由大肠杆菌表达载体，如pET15b等表达载体经重组得到。
本发明提供了一种大肠杆菌蛋白表达菌株，该菌株包含上述的一种蛋白表达载体可编码上述突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
上述表达菌株可以为BL21(DE3)等。
本发明还提供了一种上述突变型Taq DNA聚合酶的制备方法, 其包括：
（1）破菌：将含突变型Taq DNA聚合酶表达菌株用超声或高压均质的方法裂解菌体；
（2）热处理：加热裂解液使不耐热蛋白变性析出；
（3）盐析：40%的硫酸铵盐析浓度可保留突变型Taq DNA聚合酶在上清而去除大部分杂质蛋白；
（4）Ni离子金属螯合亲和层析：特异性吸附和特异性洗脱实现了快速制备大量的突变型Taq DNA聚合酶；
（5）制剂分装：测量纯化的突变型Taq DNA聚合酶的酶活并根据活性酶量进行分装。
本发明公开了该突变型Taq DNA聚合酶在PCR中的应用。
本发明具有以下有益效果：它可以比野生型Taq DNA聚合酶具有更高的热稳定性，而且对血液或者粪便等生物样品中的不纯物质，具有更强的抗抑制作用。本发明提供的突变型Taq DNA聚合酶可满足各种不断提高的科研、临床和工业应用需求。
附图说明
图1为突变型Taq DNA聚合酶纯化结果。1. 野生型Taq DNA聚合酶，2. 突变型TaqDNA聚合酶。
图2 为检测粪便DNA中的16s rRNA 基因时突变型Taq DNA聚合酶和野生型TaqDNA聚合酶的对比图。1，2野生型Taq DNA聚合酶（NEB）；3，4野生型Taq DNA聚合酶（强微特）；5,6突变型Taq DNA聚合酶（强微特）。
图3为检测血液DNA中的b-actin基因时突变型Taq DNA聚合酶和野生型Taq DNA聚合酶的对比图。图中上曲线：突变型Taq,下曲线：野生型Taq。
具体实施方式
本发明采用分子生物学技术，将天然Taq DNA聚合酶的5‘- 3’外切酶活性部分去除，并进行多个位点的氨基酸进行突变，经过测序确认突变型后重组到表达载体中，该突变型Taq DNA聚合酶可以比野生型Taq DNA聚合酶具有更高的热稳定性，而且对血液或者粪便等生物样品中的不纯物质，具有更强的抗抑制作用。该突变型Taq DNA聚合酶可满足各种不断提高的科研、临床和工业应用需求。
本发明中，上述突变具体涉及野生型Taq DNA聚合酶的C端281-氨基酸，并且在天然Taq DNA聚合酶氨基酸序列中引入E507R, E742A和A743H突变。在本发明的一种实施方式中，其突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，包括了去除具有5‘- 3’外切酶活性部分的1-280氨基酸，第507位由谷氨酸突变为精氨酸，第742位由谷氨酸突变为丙氨酸，第743位由丙氨酸变为组氨酸。
本发明中还进一步提供了可编码上述突变型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1 所示。本领域技术人员可以运用分子生物学的方法，进行克隆或者点突变而得到此突变型Taq DNA聚合酶。上述SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列，并不是唯一得到上述突变型Taq DNA聚合酶的序列。本领域技术人员可以利用密码子的同义突变核苷酸序列，得到具有相同氨基酸序列而不同核苷酸序列的DNA 片段。
我们为了简化纯化、提高产率，针对含有6个组氨酸标签的突变型Taq DNA聚合酶，开发了一种简便、高效的纯化方法，纯化的突变型Taq DNA收率高、生产成本低，有利于工业化生产的特点。
纯化采用以下的技术方案：
破菌：离心获得表达突变型Taq DNA聚合酶的重组大肠杆菌菌体，以1：10比例加入破菌缓冲液，搅拌20 min使之混合均匀，通过高压均质的方法裂解菌体，使之破碎；其中破菌缓冲液为50 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.5 mM EDTA, 0.5 M KCI,1％Tween, 1％ NP-40，溶菌酶2 mg/ml, 新鲜 PMSF至0.02 mM。将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机中，在4℃、工作压力为500 bar时均质3遍。
热处理: 先将水浴锅加热到70 ℃，将破菌离心上清液装入一玻璃容器中一并放入预先加热好的水浴锅中。热处理时间是60 min, 热处理后会有很多不耐热蛋白变性析出。离心力控制在10000g, 时间20 min, 温度4 ℃。
盐析: 硫酸铵盐析浓度为40％左右，导致目的蛋白收率轻微下降，对后续纯化纯度没有影响。具体操作为：事先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中一次性加入，搅拌至完全溶解，确保不会出现局部浓度过高，100 ml破菌上清液加入 36.1 ～ 45.1 g硫酸铵，沉淀温度控制在10 ℃以下，沉淀时间为大于2 h，10000g 离心，离心时间为10～20min，离心温度控制在0～10 ℃，离心沉淀按金属螯合层析每批处理量分装并冷冻保存。
金属螯合层析：金属螯合层析用缓冲液I平衡色谱柱，上样后冲洗约5～10 CV。从缓冲液I到缓冲液II梯度洗脱目的蛋白, 收集UV280大于100 mAu组分。其中缓冲液I为50mM Tris-HCI, pH7.5，0.5M NaCl，5~10mM 咪唑；缓冲液Il为50 mM Tris-HCl, pH7.5,0.5M NaCl, 300 ~ 600mM咪唑。通过优化缓冲液成分和洗脱方法，实现了目的蛋白与杂质最大程度的分离。
质检、制剂及分装金属螫合层析收集样品，加入等体积甘油一20 ℃暂时保存，Bradford法检测蛋白浓度，利用NEB公司的DNA聚合酶活测定方法检测蛋白活性，计算比活，按照NEB公司的DNA聚合酶的DNA内切酶检测方法对我们的终产品进行检测。
实施SDS-PAGE检测突变型Taq DNA聚合酶蛋白纯度。将野生型Taq DNA聚合酶和突变型Taq DNA聚合酶进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，确认Taq DNA聚合酶的大小和纯度。
方法：取纯化好的Taq DNA聚合酶样品，加入5XLoading Buffer 10微升， 100摄氏度加热5分钟后上样50微克/泳道。电泳后用考马氏亮蓝染色。
SDS-PAGE蛋白电泳检测结果:参考图1，野生型和突变型Taq DNA聚合酶纯度均达95%以上。
比较野生型Taq DNA聚合酶和突变型Taq DNA聚合酶的性能，特别是受粪便DNA中的PCR抑制剂的影响。
研究粪便中PCR抑制剂对野生型Taq DNA聚合酶和突变型Taq DNA聚合酶的影响：在加入同等酶活的同一实验条件下，以人粪便提取的DNA为PCR模板，16s rRNA基因的引物来PCR扩增。具体的，将等活力的不同TaqDNA聚合酶在相同的DNA模板，相同的PCR反应试剂，相同的PCR引物浓度，相同的PCR反应温度变化下，各自进行2次重复检测。
上述人粪便DNA提取：新鲜人的粪便由天根公司试剂盒粪便基因组DNA提取试剂盒提取，测OD值定量并跑胶确认。
16s rRNA基因PCR 结果：如图2 所示，两种不同来源的野生型Taq DNA聚合酶，均无法扩增16s rRNA基因，而突变型Taq DNA聚合酶得到清晰的扩增产物。
血液样品PCR直扩：一般的血液PCR工作流程包括DNA的纯化，以去除血液中的PCR抑制剂，如血红素分子和常用在血液中的抗凝剂（EDTA和肝素）。DNA提取过程有可能引入样品污染、样品混淆等人工误差，而且浪费时间和资源。本发明所述的突变型Taq DNA聚合酶可以直接以血液进行PCR扩增，加快流程并减少实验错误。
人b-actin 基因实时荧光PCR:以含EDTA血液样品为模板，模板约占反应体系的20%体积比. 如图3所示，图中每一个曲线代表一个PCR反应在不同时间段的荧光值，横坐标代表PCR的循环次数，纵坐标为荧光值，荧光曲线越早出现表示此时PCR反应产物越多。由图3可知，突变型Taq DNA聚合酶不受血液中的抑制剂影响，而野生型Taq DNA聚合酶显示明显的抑制。
以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津市强微特生物科技有限公司
<120> 一种突变型Taq DNA聚合酶及其纯化方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1656
<212> DNA
<213> Thermus aquaticus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1656)
<400> 1
ctc ctc cac gag ttc ggc ctt ctg gaa agc ccc aag gcc ctg gag gag 48
Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu
1 5 10 15
gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tcc 96
Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser
20 25 30
cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg 144
Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg
35 40 45
ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc ccc gag cct tat aaa gcc ctc agg gac 192
Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp
50 55 60
ctg aag gag gcg cgg ggg ctt ctc gcc aaa gac ctg agc gtt ctg gcc 240
Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala
65 70 75 80
ctg agg gaa ggc ctt ggc ctc ccg ccc ggc gac gac ccc atg ctc ctc 288
Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu
85 90 95
gcc tac ctc ctg gac cct tcc aac acc acc ccc gag ggg gtg gcc cgg 336
Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg
100 105 110
cgc tac ggc ggg gag tgg acg gag gag gcg ggg gag cgg gcc gcc ctt 384
Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu
115 120 125
tcc gag agg ctc ttc gcc aac ctg tgg ggg agg ctt gag ggg gag gag 432
Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu
130 135 140
agg ctc ctt tgg ctt tac cgg gag gtg gag agg ccc ctt tcc gct gtc 480
Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val
145 150 155 160
ctg gcc cac atg gag gcc acg ggg gtg cgc ctg gac gtg gcc tat ctc 528
Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu
165 170 175
agg gcc ttg tcc ctg gag gtg gcc gag gag atc gcc cgc ctc gag gcc 576
Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala
180 185 190
gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc cac ccc ttc aac ctc aac tcc cgg gac 624
Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp
195 200 205
cag ctg gaa agg gtc ctc ttt gac gag cta ggg ctt ccc gcc atc ggc 672
Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly
210 215 220
aag acg cgc aag acc ggc aag cgc tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag 720
Lys Thr Arg Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu
225 230 235 240
gcc ctc cgc gag gcc cac ccc atc gtg gag aag atc ctg cag tac cgg 768
Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg
245 250 255
gag ctc acc aag ctg aag agc acc tac att gac ccc ttg ccg gac ctc 816
Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu
260 265 270
atc cac ccc agg acg ggc cgc ctc cac acc cgc ttc aac cag acg gcc 864
Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala
275 280 285
acg gcc acg ggc agg cta agt agc tcc gat ccc aac ctc cag aac atc 912
Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile
290 295 300
ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc 960
Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala
305 310 315 320
gag gag ggg tgg cta ttg gtg gcc ctg gac tat agc cag ata gag ctc 1008
Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu
325 330 335
agg gtg ctg gcc cac ctc tcc ggc gac gag aac ctg atc cgg gtc ttc 1056
Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe
340 345 350
cag gag ggg cgg gac atc cac acg gag acc gcc agc tgg atg ttc ggc 1104
Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly
355 360 365
gtc ccc cgg gag gcc gtg gac ccc ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acc 1152
Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr
370 375 380
atc aac ttc ggg gtc ctc tac ggc atg tcg gcc cac cgc ctc tcc cag 1200
Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln
385 390 395 400
gag cta gcc atc cct tac gag gag gcc cag gcc ttc att gag cgc tac 1248
Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr
405 410 415
ttt cag agc ttc ccc aag gtg cgg gcc tgg att gag aag acc ctg gag 1296
Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu
420 425 430
gag ggc agg agg cgg ggg tac gtg gag acc ctc ttc ggc cgc cgc cgc 1344
Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg
435 440 445
tac gtg cca gac cta gag gcc cgg gtg aag agc gtg gcg cac gcc gag 1392
Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Ala His Ala Glu
450 455 460
cgc atg gcc ttc aac atg ccc gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg 1440
Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met
465 470 475 480
aag ctg gct atg gtg aag ctc ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc 1488
Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala
485 490 495
agg atg ctc ctt cag gtc cac gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa 1536
Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys
500 505 510
gag agg gcg gag gcc gtg gcc cgg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg 1584
Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly
515 520 525
gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag 1632
Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu
530 535 540
gac tgg ctc tcc gcc aag gag tga 1656
Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
545 550
<210> 2
<211> 551
<212> PRT
<213> Thermus aquaticus
<400> 2
Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser
20 25 30
Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg
35 40 45
Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp
50 55 60
Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala
65 70 75 80
Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu
85 90 95
Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg
100 105 110
Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu
115 120 125
Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu
130 135 140
Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val
145 150 155 160
Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu
165 170 175
Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala
180 185 190
Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp
195 200 205
Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly
210 215 220
Lys Thr Arg Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu
225 230 235 240
Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg
245 250 255
Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu
260 265 270
Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala
275 280 285
Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile
290 295 300
Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala
305 310 315 320
Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu
325 330 335
Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe
340 345 350
Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly
355 360 365
Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr
370 375 380
Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln
385 390 395 400
Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr
405 410 415
Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu
420 425 430
Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg
435 440 445
Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Ala His Ala Glu
450 455 460
Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met
465 470 475 480
Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala
485 490 495
Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys
500 505 510
Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly
515 520 525
Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu
530 535 540
Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
545 550
<210> 3
<211> 2499
<212> DNA
<213> Thermus aquaticus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2499)
<400> 3
atg agg ggg atg ctg ccc ctc ttt gag ccc aag ggc cgg gtc ctc ctg 48
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
gtg gac ggc cac cac ctg gcc tac cgc acc ttc cac gcc ctg aag ggc 96
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
ctc acc acc agc cgg ggg gag ccg gtg cag gcg gtc tac ggc ttc gcc 144
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
aag agc ctc ctc aag gcc ctc aag gag gac ggg gac gcg gtg atc gtg 192
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
gtc ttt gac gcc aag gcc ccc tcc ttc cgc cac gag gcc tac ggg ggg 240
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
tac aag gcg ggc cgg gcc ccc acg ccg gag gac ttt ccc cgg caa ctc 288
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
gcc ctc atc aag gag ctg gtg gac ctc ctg ggg ctg gcg cgc ctc gag 336
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
gtc ccg ggc tac gag gcg gac gac gtc ctg gcc agc ctg gcc aag aag 384
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
gcg gaa aag gag ggc tac gag gtc cgc atc ctc acc gcc gac aaa gac 432
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
ctt tac cag ctc ctt tcc gac cgc atc cac gcc ctc cac ccc gag ggg 480
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Ala Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
tac ctc atc acc ccg gcc tgg ctt tgg gaa aag tac ggc ctg agg ccc 528
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
gac cag tgg gcc gac tac cgg gcc ctg acc ggg gac gag tcc gac aac 576
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
ctt ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag aag acg gcg agg aag ctt ctg 624
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
gag gag tgg ggg agc ctg gaa gcc ctc ctc aag aac ctg gac cgg ctg 672
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
aag ccc gcc atc cgg gag aag atc ctg gcc cac atg gac gat ctg aag 720
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
ctc tcc tgg gac ctg gcc aag gtg cgc acc gac ctg ccc ctg gag gtg 768
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
gac ttc gcc aaa agg cgg gag ccc gac cgg gag agg ctt agg gcc ttt 816
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
ctg gag agg ctt gag ttt ggc agc ctc ctc cac gag ttc ggc ctt ctg 864
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
gaa agc ccc aag gcc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg 912
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tcc cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat 960
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc ccc 1008
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
gag cct tat aaa gcc ctc agg gac ctg aag gag gcg cgg ggg ctt ctc 1056
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
gcc aaa gac ctg agc gtt ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc ctc ccg 1104
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
ccc ggc gac gac ccc atg ctc ctc gcc tac ctc ctg gac cct tcc aac 1152
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
acc acc ccc gag ggg gtg gcc cgg cgc tac ggc ggg gag tgg acg gag 1200
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
gag gcg ggg gag cgg gcc gcc ctt tcc gag agg ctc ttc gcc aac ctg 1248
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
tgg ggg agg ctt gag ggg gag gag agg ctc ctt tgg ctt tac cgg gag 1296
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
gtg gag agg ccc ctt tcc gct gtc ctg gcc cac atg gag gcc acg ggg 1344
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
gtg cgc ctg gac gtg gcc tat ctc agg gcc ttg tcc ctg gag gtg gcc 1392
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
gag gag atc gcc cgc ctc gag gcc gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc cac 1440
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
ccc ttc aac ctc aac tcc cgg gac cag ctg gaa agg gtc ctc ttt gac 1488
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
gag cta ggg ctt ccc gcc atc ggc aag acg gag aag acc ggc aag cgc 1536
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag gcc ctc cgc gag gcc cac ccc atc 1584
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
gtg gag aag atc ctg cag tac cgg gag ctc acc aag ctg aag agc acc 1632
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
tac att gac ccc ttg ccg gac ctc atc cac ccc agg acg ggc cgc ctc 1680
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc acg ggc agg cta agt agc 1728
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
tcc gat ccc aac ctc cag aac atc ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag 1776
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc gag gag ggg tgg cta ttg gtg gcc 1824
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
ctg gac tat agc cag ata gag ctc agg gtg ctg gcc cac ctc tcc ggc 1872
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
gac gag aac ctg atc cgg gtc ttc cag gag ggg cgg gac atc cac acg 1920
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
gag acc gcc agc tgg atg ttc ggc gtc ccc cgg gag gcc gtg gac ccc 1968
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acc atc aac ttc ggg gtc ctc tac ggc 2016
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
atg tcg gcc cac cgc ctc tcc cag gag cta gcc atc cct tac gag gag 2064
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
gcc cag gcc ttc att gag cgc tac ttt cag agc ttc ccc aag gtg cgg 2112
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
gcc tgg att gag aag acc ctg gag gag ggc agg agg cgg ggg tac gtg 2160
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
gag acc ctc ttc ggc cgc cgc cgc tac gtg cca gac cta gag gcc cgg 2208
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
gtg aag agc gtg cgg gag gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg ccc 2256
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg aag ctg gct atg gtg aag ctc 2304
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc agg atg ctc ctt cag gtc cac 2352
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc 2400
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
cgg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc 2448
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag gac tgg ctc tcc gcc aag gag 2496
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
tga 2499

Claims (9)

1.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于所述突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列为SEQ. ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的TaqDNA聚合酶氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列为SEQ. ID NO.2；或与SEQ. ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽。
3.所述核苷酸序列为SEQ. ID NO. 1所示序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
4.一种载体，其特征在于所述载体含有权利要求2或者权利要求3所列出的核苷酸序列或者重组可以得到权利要求2或3的核苷酸序列。
5.一种原核生物外缘蛋白表达载体，其特征在于可用IPTG诱导表达如权利要求3或4的突变型Taq DNA聚合酶，如pET15b。
6.一种重组细菌，其特征在于包含权利要求2或3所述的核苷酸序列；或权利要求4或5所述的载体, 如大肠杆菌BL21（DE3）。
7.制备权利要求1所述的突变型TaqDNA聚合酶的方法，所述方法包括： (1)破菌；（2）热处理；（3）盐析；（4）Ni离子金属螯合亲和层析；（5）制剂分装。
8.一种聚合酶试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的突变型Taq酶。
9.权利要求 1 所述的突变型Taq DNA聚合酶在PCR中的应用，如对血液和粪便中的DNA样品检测。
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GR01 Patent grant
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