发明内容
基于此,有必要提供一种酶活性高、耐受性高的突变型TaqDNA聚合酶,以及其制备方法和应用。
一种突变型TaqDNA聚合酶,包括:
(a)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽;
(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸编码得到的多肽;或
(c)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸,其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
一种突变型TaqDNA聚合酶,包括:
(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽;
(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽;或
(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽,其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。
一种突变型TaqDNA聚合酶的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、提供用于表达突变型TaqDNA聚合酶的基因表达序列,所述突变型TaqDNA聚合酶包括:(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽;(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽;或(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽,其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽;
步骤二、将所述基因表达序列连接到基因表达载体中;
步骤三、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中,得到重组细胞;
步骤四、对所述重组细胞进行诱导表达,收集菌体;
步骤五、将所述菌体裂解,收集裂解粗产物;以及
步骤六、利用Ni-亲和柱纯化所述裂解粗产物,得到所述突变型TaqDNA聚合酶。
在一个实施例中,所述基因表达序列包括:
(a)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列;
(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列;或
(c)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列,其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施例中,所述基因表达载体为pET-28a。
在一个实施例中,所述宿主细胞为原核细胞。
在一个实施例中,所述原核细胞为BL21。
一种酶制剂,包括权利要求上述的突变型TaqDNA聚合酶。
在一个实施例中,所述酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。
上述的突变型TaqDNA聚合酶在制备PCR反应试剂领域中的应用。
这种突变型TaqDNA聚合酶,将野生型TaqDNA聚合酶的第605位由亮氨酸突变为精氨酸,第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸,第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸,并将T3DNA聚合酶的TBD区即262~337位氨基酸替代TaqDNA聚合酶拇指区的480~485位氨基酸。上述定点突变使得突变型TaqDNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。这种突变型TaqDNA聚合酶,由于具有较高的酶活性和耐受性,可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对突变型TaqDNA聚合酶及其制备方法和应用做进一步的解释说明。
由于野生型TaqDNA聚合酶结构上的缺陷,使得其热稳定性和特异性较差,活性和耐受性较低,在许多应用领域受到限制。
因此,本发明提供一种突变型TaqDNA聚合酶,通过对野生型TaqDNA聚合酶定点突变,使得突变型TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性和特异性,并且活性、耐受性均有明显的提高。
一个实施方式的突变型TaqDNA聚合酶包括:
(a)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽;
(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸编码得到的多肽;或
(c)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸,其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
特别的,野生型TaqDNA聚合酶包括与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少99%同源性的多核苷酸编码得到的多肽。
另一实施方式的突变型TaqDNA聚合酶包括:
(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽;
(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽;或
(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽,其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。
特别的,野生型TaqDNA聚合酶包括与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少99%同源性的多肽。
由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定,故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列。因此本申请中的突变型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列,包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序列,除可由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列所编码,也可由SEQIDNO.1所示核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的突变型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列,根据现有分子生物学技术,采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的突变型TaqDNA聚合酶,因此,编码上述突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列并不仅限于SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。如果编码得到的蛋白与突变型TaqDNA聚合酶没有明显的功能差异,也包括在本发明的范围内。
此外,由于蛋白编码序列的多态性及变异,天然存在的蛋白质会出现基因突变,编码序列中碱基被缺失、替代或增加,或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异,从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此,存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质,但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子,从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体,但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
一般的,功能等同变异体的编码序列是同源的,因此,由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性,因此,由上述核苷酸序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽,如果编码得到的蛋白与突变型TaqDNA聚合酶没有明显的功能差异,也包括在本发明的范围内。
这种突变型TaqDNA聚合酶,包括由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽,或者由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。将野生型TaqDNA聚合酶氨基酸序列突变,具体的为将野生型TaqDNA聚合酶的第605位由亮氨酸突变为精氨酸,第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸,第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸,并将T3DNA聚合酶的TBD区(262~337位氨基酸)替代TaqDNA聚合酶拇指区的480~485位氨基酸。
具体的,野生型TaqDNA聚合酶编码序列如SEQIDNo.3所示,野生型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。
TaqDNA聚合酶包括5’核酸外切酶区、3’核酸外切酶区和聚合酶区。其中聚合酶区执行酶的催化聚合功能。聚合酶区的形状就像人的右手一样,由拇指区、掌心区和手指区组成。掌心区的功能是催化磷酰基转移反应,手指区的功能则是促进三磷酸核苷酸碱基与模板配对反应,拇指区控制双链DNA的位置移动和子链延伸。第605位氨基酸和第617位氨基酸均位于TaqDNA聚合酶的掌心区,第605位由亮氨酸突变为精氨酸、第617位由精氨酸突变为苯丙氨酸有助于催化磷酰基转移反应并提高TaqDNA聚合酶的活性。第667位氨基酸位于TaqDNA聚合酶的手指区,第667位由苯丙氨酸突变为亮氨酸,有助于提高TaqDNA聚合酶的忠实性,促进三磷酸核苷酸碱基与模板配对反应,降低碱基与模板的错误配对,从而提高TaqDNA聚合酶的特异性。同时,将T3DNA聚合酶的TBD区(262~337位氨基酸)替代TaqDNA聚合酶拇指区的480~485位氨基酸,克服了野生型酶的结构上的缺陷,可以提高TaqDNA聚合酶的活性和耐受性,降低生物样本中各种PCR抑制剂的干扰。上述定点突变使得突变型TaqDNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。这种突变型TaqDNA聚合酶具有较高的酶活性和耐受性,特别是在低浓度的模板检测中,突变型TaqDNA聚合酶比野生型的TaqDNA聚合酶灵敏度检出率高,且可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中,极大程度缩短生物样本的核酸检测时间,满足不断提高的工业及研究应用需求。
此外,本发明还提供如图1所示的上述突变型TaqDNA聚合酶的制备方法,包括如下步骤:
S110、提供用于表达突变型TaqDNA聚合酶的基因表达序列。
一般的,基因表达序列可根据需要表达的突变型TaqDNA聚合酶,从基因库(GeneBank)中选取相应的基因序列,并根据需要设计突变引物,点突变其中的某个或某段碱基序列。
在一个实施方式中,基因表达序列包括:
(a)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列;
(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列;或
(c)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列,其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中,突变型TaqDNA聚合酶包括:
(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽;
(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽;或
(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽,其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。
本实施方式中,基因表达序列具体为将野生型TaqDNA聚合酶的第1438位~1455位碱基序列替换为T3DNA聚合酶的TBD区的碱基序列,并将1813~1815位的cta突变为cga、将1849~1851位的agg突变为uuc、将1999~2001位的ttc突变为ttg。
在一个实施方式中,基因表达序列采用如下操作制得:
将含有野生型TaqDNA聚合酶基因(GenBank:D32013.1)的质粒模板、突变引物和/或拼接序列加入PCR反应体系中,进行PCR扩增,得到突变型TaqDNA聚合酶基因表达序列。
具体的,突变引物设计规则如下:引物中必须包含突变的位点,其它序列和原基因序列完全互补,且设计时引物长度控制在25bp~45bp,退火温度≥78℃,使得引物可以很好的和TaqDNA聚合酶基因结合,并且可以减少引物二聚体的形成。拼接引物设计规则如下:引物序列必须与拼接片段的序列完全互补,引物长度控制在30bp~45bp,相邻的上下游引物间必须有重叠碱基,且重叠碱基的数量控制在15bp~20bp,重叠碱基区段的退火温度差值一般小于2℃,引物自身不形成发卡结构。
具体的,PCR反应体系为50μL,PCR反应体系包括10×buffer(100mMKCl,100Mm(NH4)2SO4,200mMTris-HClpH8.8,20mMMgSO4,1%TritonX-100,1mg/mLBSA)5μL,10mMdNTP0.5μL,突变引物(拼接引物)各125ng,1Upfu酶,含50ng质粒模板1μL,加ddH2O至50μL。
具体的,PCR扩增的条件为95℃变性30s,循环周期为95℃,30s,55℃,1min,68℃,14min,25个循环。
一般的,PCR反应结束后可将反应管放在冰上使其温度≤37℃。然后加入1μL的限制性内切酶DpnI放置在37℃的恒温箱中酶解1小时,消化掉原来未突变的模板。
由于合成的寡核苷酸即突变引物和拼接序列,包含了需要突变的位点及需要插入位点的序列,且已经替换了所需要突变的碱基。扩增后,利用酶消化原来的母板,即消化作为初始模板的未突变的TaqDNA聚合酶基因模板。得到的用于表达突变型TaqDNA聚合酶的基因序列。
S120、将S110得到的基因表达序列连接到基因表达载体中。
一般的,将基因表达序列酶切后接到用相应的酶切处理之后的表达载体中,得到可表达突变型TaqDNA聚合酶的基因表达载体。
一般的,酶切处理可采用BamHI/EcoRI双酶切。
一般的,可根据突变型TaqDNA聚合酶的基因表达序列的特点及常规的分子克隆实验指南,选用各种常规标准表达载体。
在一个实施方式中,基因表达载体为pET-28a。
S130、将S120中的基因表达载体转化到宿主细胞中,得到重组细胞。
一般的,基因表达载体转化操作参见试剂盒生产厂家推荐的方法实现,宿主细胞为感受态细胞,例如大肠杆菌感受态细胞,将构建好的基因表达载体加入感受态细胞,热激处理,使感受态细胞的细胞膜结构扰动,细胞膜上出现空隙以便基因表达载体进入细胞,之后恒温培养,使宿主细胞复苏。
宿主细胞一般选择原核细胞,例如:大肠杆菌。
在一个实施方式中,宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞BL21。
一般的,基因表达载体转化到宿主细胞后,还需要对转化后的宿主细胞进行抗性筛选,如在培养基中加入氨苄西林钠或卡那霉素。
S140、对S130得到的重组细胞进行诱导表达,收集菌体。
一般的,可在一定温度条件下,培养重组细胞至对数期,然后加入诱导剂对重组细胞进行诱导表达,诱导剂可以为一定浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
本实施例中,诱导条件为50mM的IPTG,培养过夜,之后离心收集菌体。
S150、将S140得到的菌体裂解,收集裂解粗产物。
一般的,裂解操作为将菌体溶解,加入溶菌酶和去污剂,振荡混匀后离心收集裂解粗产物。
本实施例中,按每100mL培养物收集的菌体中加入5mLBindingbuffer(50mMNaH2PO4,300mMNaCl,pH8.0)的比例将菌体溶解,加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置1h,4℃振荡10min,加入TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)至终浓度为1%,剧烈振荡混匀,4℃振荡10min,之后5,000rpm离心30min,收集上清,将收集的上清置于75℃水浴1h,不时振荡,再5,000rpm离心30min,收集上清,得到裂解粗产物。
S160、利用Ni-亲和柱纯化S150得到的裂解粗产物,得到突变型TaqDNA聚合酶。
一般的,纯化裂解粗产物的操作如下:先用平衡缓冲液平衡Ni-亲和柱,将裂解粗产物加入Ni-和柱中,粗产物中的蛋白与Ni-亲和柱中的金属离子Ni2+结合,留在Ni-亲和柱中,之后再加入一定洗脱缓冲液冲洗Ni-亲和柱,使蛋白液流出,收集纯化了的突变型TaqDNA聚合酶。
一般的,洗脱缓冲液为不同浓度的咪唑缓冲溶液。
本实施例中,采用Ni-凝胶纯化粗产物,将Ni-凝胶轻轻混匀,取1mL至柱中,1mLddH2O洗涤两次,用1mLBindingbuffer(50mMNaH2PO4、300mMNaCl、pH8.0)平衡柱子,将多余的Bindingbuffer除去,将平衡好的Ni-凝胶加入到粗酶液中,于4℃轻摇1h,上柱,收集的流出液重复上柱2次,收集流出液。洗脱缓冲液(Washingbuffer)的配方为:50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪唑,pH8.0。用1mL洗脱缓冲液洗涤5~10次。之后再加入Elutionbuffer洗涤,配方为:50mMNaH2PO4、300mMNaCl、250mM咪唑,分管收集流出液。
Bindingbuffer的作用是为了增强洗脱柱对酶蛋白的结合能力,Washsolution的作用是洗掉柱子里除目的酶蛋白以外的杂质,Elutionbuffer的作用是把目的酶蛋白从柱子上洗脱下来。
一般的,可在分管收集流出液加入两倍体积的饱和硫酸铵,4℃振荡15min,5,000rpm,4℃离心30min,使的流出液中的突变型TaqDNA聚合酶沉淀,收集沉淀。加入1mL酶溶解液溶解,透析后得到突变型TaqDNA聚合酶。
该方法制备的突变型TaqDNA聚合酶,通过对野生型TaqDNA聚合酶氨基酸序列突变,改变野生型TaqDNA聚合酶的分子结构,制备得到的上TaqDNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高,可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中。
本发明还提供一种包括上述突变型TaqDNA聚合酶的酶制剂。
特别的,上述酶制剂中还包括用于提高酶活性的金属阳离子,如Mg2+、Ba2+和Ca2+等。
上述突变型TaqDNA聚合酶还可以应用于制备PCR反应试剂领域。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中,如无特别说明,未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁,黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京:科学出版社,1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程,所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。