JP2000197488A - 新規ｄｎａポリメラ―ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 耐熱性の新規ＤＮＡポリメラーゼ及び該ポリ
メラーゼをコードする遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明の課題は、１）配列番号１若しく
は２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
２）配列番号１若しくは２で示されるアミノ酸配列にお
いて１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質、及び該タ
ンパク質をコードする遺伝子により解決される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子操作用試薬と
して有用な、ＤＮＡ合成酵素をコードする遺伝子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】鋳型ＤＮＡの塩基配列に従って、その相
補的な配列を有するＤＮＡ鎖を合成することができるＤ
ＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ チェイン
リアクション）、ＤＮＡの塩基配列決定、部位特異的変
異導入法などをはじめとする、遺伝子操作実験に必要不
可欠の試薬として、日常的に利用されている。分子医
学、分子生物学、生化学の発展のために果たしてきたこ
の酵素の貢献度は、計り知れないものがある。ＤＮＡポ
リメラーゼと称されるこの酵素について詳細にみると、
各酵素によって生化学的性質は異なり、現在までに多く
の種類のＤＮＡポリメラーゼが商品として市場に出回っ
ている。それぞれの酵素は、熱安定性や、合成鎖伸長
能、ミス合成の校正能、鋳型ＤＮＡの好みなどの性質が
異なり、実験目的によって使い分けられている。しかし
ながら、既存のこれらの酵素で、全ての実験目的が十分
に満足に達成されることはなく、さらに、各目的に、よ
り優れた新規ＤＮＡポリメラーゼの開発が期待されてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、新たな生化学的性
質を有する可能性のある新規ＤＮＡポリメラーゼを遺伝
子操作用試薬として提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、超好熱性古細菌 アエロピルム ペルニクス（Aero
pyrum pernix）から新規ＤＮＡポリメラーゼ活性を発見
し、該酵素をコードする遺伝子をクローニングすること
に成功した。また、該酵素遺伝子を大腸菌細胞で発現さ
せ、ＤＮＡ合成活性を有する蛋白質を産生させることに
成功した。

【０００５】本発明は先ず、１）配列番号１若しくは２
で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は２）
配列番号１若しくは２で示されるアミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を有するタンパク質に関する。耐熱
性であるＤＮＡポリメラーゼも本発明に含まれる。本発
明はまた、上記タンパク質をコードする遺伝子にも関す
る。一態様によれば、該遺伝子は配列番号５又は６の塩
基配列を有する。

【０００６】本発明は更に、配列番号５又は６の塩基配
列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズ可能で、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子にも関する。

【０００７】ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズ可能か否かは以下のようにして調べることができる。
先ず、ナイロン膜にハイブリダイズの対象となるＤＮＡ
を固定化する。次にこの膜を、６×ＳＳＣ、０.０１Ｍ
ＥＤＴＡ、５×Ｄenhardt's溶液、０.５％ＳＤＳ、１０
０μｇ／ml変性サケＤＮＡを含むプレハイブリダイゼー
ション溶液に６８℃で２時間浸漬する。上記組成のプレ
ハイブリダイゼーション溶液に、標識した配列番号５ま
たは６に記載の遺伝子または該遺伝子の転写産物である
対応するＲＮＡを加えた溶液（ハイブリダイゼーション
溶液）を調製する。この溶液に上で得られたナイロン膜
を浸漬し、６８℃で３〜１６時間ハイブリダイズさせ
る。その後、２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳを含む溶液中
に一度浸して洗浄し、さらに２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ溶液中で室温で約１５分洗浄する。そしてさらに０.
５％または０.１％ＳＤＳ溶液中で６８℃で２時間洗浄
する。その後標識に応じ適宜な手段で検出操作を行う。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明者
らは、遺伝子工学用試薬として優れた性質を有するＤＮ
Ａ合成酵素の単離を目指し、特に熱安定性を期待して、
超好熱性古細菌をスクリーニングしてきた。超好熱性好
気性古細菌として単離同定された、アエロピルム ペル
ニクス（Aeropyrum pernix）K１株は最適増殖温度が９
０〜９５℃であり、１００℃においても増殖がみとめら
れる。この菌株の細胞抽出液を陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーにかけて分画し、ＤＮＡ鎖合成活性を測
定したところ、２つの活性画分が検出された（図１）。
画分１（＃１８）、２（＃２３）について、SDS-PAGE
による活性ゲル分析を行うと、それぞれ、８５,００
０、１００,０００ダルトンの位置に活性のあるタンパ
ク質のバンドが検出された（図２）。各々の画分につい
て、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤の一種であるアフィデ
ィコリンを加えて活性測定すると、画分１と２とで感受
性は大きく異なっていた。

【０００９】また熱安定性についても、はっきりとした
違いが見られた（図３）。これらのことから、アエロピ
ルム ペルニクス細胞抽出液には、少なくとも２種類の
ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在すると推定した。これら
のＤＮＡポリメラーゼ活性に対応する蛋白質をコードす
る遺伝子を同定すべく、アエロピルム ペルニクスゲノ
ムＤＮＡから、目的の遺伝子をクローニングすることを
試みた。ファミリーB型ＤＮＡポリメラーゼによく保存
された配列のうち、モチーフA とモチーフCを用いて、
そのアミノ酸配列に対応するミックスプライマー（配列
表の配列番号３、４）を調製した。このプライマーを用
いてＰＣＲを行ったところ、予想される約４００塩基対
のＤＮＡ断片が増幅された。増幅断片をクローニングし
たのち、塩基配列を解析したところ、アミノ酸に翻訳し
たときに、ＤＮＡポリメラーゼと予想される配列が２種
類検出された。

【００１０】そこで得られた２種類の断片をプローブに
して、アエロピルム ペルニクスのゲノムＤＮＡを用い
てサザンブロットハイブリダイゼーションを行った結
果、図４に示すようにどちらのプローブとも、各制限酵
素断片中に特異的にハイブリダイズするＤＮＡが存在す
ることがわかり、これらのＰＣＲ増幅断片がどちらもア
エロピルム ペルニクスのゲノムＤＮＡから増幅された
ものであると結論した。

【００１１】次に、上記２種類のＤＮＡポリメラーゼの
全構造遺伝子領域をクローニングすべく、ゲノミックサ
ザンで検出されたポジティブシグナルの部分のＤＮＡを
アガロースゲルより回収して、クローニングすることを
試みたが、欠失変異体が出来てしまい、的確にクローニ
ングができなかった。そこで、ゲノミックウォーキング
ＰＣＲ法により、目的の領域をクローニングして、数種
のクローンについて塩基配列を解読し、それらを比較す
ることによって、２種のポリメラーゼ遺伝子の塩基配列
を決定した。

【００１２】その塩基配列から配列表の配列番号５、６
に示すように、各々１０５,４０６ダルトン、８７,９０
５ダルトンの分子量を持つタンパク質をコードしうるオ
ープンリーディングフレームが検出された。そこでこれ
らの遺伝子をコードするタンパク質をそれぞれPol I 、
Pol IIと名付けた。

【００１３】Pol Iをコードする遺伝子を大腸菌での発
現ベクターpET15b（Novagenn社）に組込んだプラスミド
pAPE１を大腸菌BL21(DE3)に導入して得られた組換え体
はEschericia coli BL21(DE3)/pAPE1と命名、表示さ
れ、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM
P-17076として寄託されている。またPol IIをコードす
る遺伝子は、同じく大腸菌での発現ベクターpMAL-p2X
（New England Biolabs社）に組込んでpMLAPE2とし、大
腸菌BL21(DE3)に導入して得られた組換え体はEscherich
ia coli BL21(DE3)/pMLAPE2と命名、表示され、同じく
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-1
7077として寄託されている。

【００１４】Eschericia coli BL21(DE3)/pAPE1を培養
して、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパ
ク質(Pol I)が得られること、またEscherichia coli BL
21(DE3)/pMLAPE2を培養して、耐熱性のＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を有するタンパク質（Pol II）が得られること
を確認した。

【００１５】

【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

【００１６】実施例１ （１）アエロピルム ペルニクスの培養、粗抽出液の調
製 鹿児島県トカラ列島小宝島の硫気孔から採取した底泥よ
り単離した、好気性超好熱性古細菌アエロピルム ペル
ニクス（Aeropyrum pernix）K１株はインターナショナ
ル ジャーナル オブ システマティック バクテリオロジ
ー（International Journal of Systematic Bacteriolo
gy）第４６巻１０７０−１０７７頁（１９９６）に記載
されている。この菌を文献に記載した条件で培養した。
得られた菌体１０gをバッファーＡ（５０mM Tris-HCl
（pH ８.０）、０.１mM ＥＤＴＡ、１０％グリセロー
ル、０.５mMジチオスレイトール）で４０mlになるよう
に懸濁した。この懸濁液をフレンチプレスに供し、細胞
を破砕した。４８,３８４ x gで３０分遠心分離し、上
清を分画して、バッファーＡで一晩透析した。

【００１７】（２）イオン交換クロマトグラフィーによ
る分画 （１）で得た細胞粗抽出液から２.５mlを陰イオン交換
カラム（HiTrap Q ５ml、ファルマシア社）に供し、バ
ッファーＡを基にした溶出液で０−１M NaClの直線濃度
勾配（５０ml）により分離した。２８０nmのＵＶ吸収で
モニターしながら、１.５mlずつ分画した（図１）。

【００１８】（３）ＤＮＡポリメラーゼの活性測定 （２）で得た各フラクションについて、デオキシヌクレ
オチドの取り込み活性を測定した。反応溶液（２０mM T
ris-HCl（pH ８.０）、２mM MgCl₂、２mM ２-メルカプ
トエタノール、０.２mg/ml 仔牛胸腺ＤＮＡ（ＤＮaseに
より活性化したもの）、各４０μM dATP、dGTP、dCTP、
６０nM[methyl ³H]dTTP）４５μlに対して、フラクショ
ン溶液５μlを加え、７０℃５分静置した後、その一部
をＤＥ８１ペーパーにスポットし、次いでこれを５％Na
₂HPO₄溶液で５回洗浄した。そして、ＤＥ８１ペーパー
フィルター上に残存する放射活性を液体シンチレーショ
ンカウンターで測定した（図１）。

【００１９】（４）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出 活性化した仔牛胸腺ＤＮＡを０.２mg/mlの濃度で含む
７.５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用
のゲルを用意し、（２）、（３）で得た活性のピーク画
分を泳動した。泳動後、ゲルからＳＤＳを除去するため
に、５０mM Tris-HCl（pH ８.８）溶液中で１０分間の
振とうを５回行なった。その後再生用バッファー（５０
mM Tris-HCl（pH ８.８）、５mM MgCl₂、５０mM KCl、
０.４mg/mlＢＳＡ、１６％グリセロール、１０mM ２-メ
ルカプトエタノール）に浸し、４℃で１２時間ゆっくり
振とうした。溶液を７０℃に上げ、各々２mMになるよう
にdATP、dGTP、dTTPを加え、同時に［α³²P]dCTPを加え
て反応をスタートさせた。７０℃３０分の反応の後、５
％TCA、１％ Na₂HPO₄溶液に置換して、３０分３回振と
うした後、ゲルを乾燥して、オートラジオグラフィーを
とった。図２に示すように、得られた活性タンパク質の
大きさは、後述する遺伝子配列から予想されるＤＮＡポ
リメラーゼタンパク質の大きさとよく一致した。

【００２０】（５）活性画分のアフィディコリン感受性
及び、熱安定性 （３）で示したＤＮＡ ポリメラーゼ活性測定用反応液
を用い、（２）の２種類のピーク画分と種々の濃度のア
フィディコリンを加え、７０℃５分静値した後、（３）
の操作に従って、ＤＥ８１フィルター上の放射活性を測
定した。また、（３）と同様の反応液で、各ピーク画分
を加え、各温度で３０分間静置した後、ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を測定した。それぞれについて相対活性を図３
のグラフに示した。

【００２１】（６）ＰＣＲによるＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子領域の増幅 アエロピルム ペルニクス菌体からのゲノムＤＮＡの調
製は（１）に示した文献に記載されている方法により行
った。ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼによく保存さ
れているモチーフとして、Var-Ile-Tyr-Gly-The-Asp、
およびSer-Leu-Tyr-Pro-Ser-Ile-Ileという配列があ
る。そこでこれらの配列を利用して、配列表の配列番号
３、４に記載のミックスプライマーを調製した。２０ng
のゲノムＤＮＡを含む５０mlの反応液を、９４℃３０
秒、４５℃５０秒、７２℃５０秒の３０サイクルで増幅
反応を行った。その結果４００塩基対の大きさのＤＮＡ
断片が増幅されたので、それをpT７Blueベクター（Nova
gen社）を用いてクローニングして、４０個の独立した
クローンについて塩基配列を解読した。得られた塩基配
列をアミノ酸に翻訳すると、２種類の異なるＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子と思われる配列が得られていることが分
かり、それぞれのＤＮＡポリメラーゼをPol I、PolIIと
命名した。

【００２２】（７）ゲノミックサザンブロッティング （６）で得られた、２種類のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
と思われる断片を各々プローブとして、サザンブロッテ
ィング解析を行った。アエロピルム ペルニクスＤＮＡ
をBamHI、HindIII、PstI、XbaI、ScaIの５種類の制限酵
素で切断し、０.７％アガロースゲル電気泳動で分離し
た後、アルカリ法によりナイロン膜に転写して、ハイブ
リダイゼーションに供した。プローブＤＮＡをアマシャ
ム社製のケミルミネッセンスによる標識、検出キット
（Gene Images^TM）を用いて標識し、モレキュラークロ
ーニング ア ラボラトリマニュアル（Molecular clonin
g alaboratory manual）に記載の方法でハイブリダイゼ
ーションを行い、上記のキットでポジティブシクナルを
検出した（図４）。

【００２３】（８）ゲノムウォーキングによる全構造遺
伝子領域のクローニング クローンテック社のゲノムウォーキングキット（Univer
sal Genome Walker^TMkit）を用いて、アエロピルム ペ
ルニクスＤＮＡからゲノムウォーキングライブラリーを
作製した。制限酵素としてはEcoRV、PvuII、DraI、Sca
I、StuIの５種類の平滑末端化酵素を用い、各々切断
後、共通のアダプターと連結させた。ライゲーション反
応を７０℃５分で止め、直接一部をとり、ＰＣＲの鋳型
ＤＮＡとして用いた。（６）で増幅された領域の上流部
分、下流部分を得るために、Pol Iの場合、プライマー
として、配列表の配列番号７、８ に示すオリゴヌクレ
オチドを用意し、各々を、共通のアダプタープライマー
と組み合わせて、ＰＣＲを行った。またPol IIの場合
は、配列表の配列番号９、１０、及び１１に示すオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて、同じく共通の
アダプタープライマーと組み合わせて、ＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲの条件は９５℃３０秒、５８℃６０秒、７２
℃１２０秒の３０サイクルで増幅反応を行った。増幅断
片はpT７Blueベクターを用いてクローニングして、各々
数個の独立したクローンについて塩基配列を決定した。
以上の操作により、Pol I、Pol IIそれぞれの構造遺伝
子を推定した。

【００２４】（９）Pol I及びPol II遺伝子の発現 Pol I遺伝子を発現させるために、配列表の配列番号１
２、１３に示すプライマーを用い構造遺伝子部分をＰＣ
Ｒによって増幅し、発現ベクターpET15b（Novagen社）
のNcoI-NdeI部位に挿入した。塩基配列を確認した後pAP
E1と名付け、大腸菌BL21(DE3)に導入して、目的蛋白質
の生産菌Escherichia coli BL21(DE3)/pAPE1とした。ま
たPol II遺伝子を発現させるために、配列表の配列番号
１４、１５に示すプライマーを用いて、構造遺伝子部分
をＰＣＲによって増幅し、発現ベクターpMAL-p2X（New
England Biolabs社）のEcoRI-PstI部位に挿入した。pLM
AL-p2Xベクターは、目的タンパク質をマルトース結合タ
ンパク質との融合タンパク質として発現させるためのベ
クターで、マルトース結合タンパク質と目的タンパク質
の融合部分にIle-Glu-Gly-Argという、配列特異的プロ
テアーゼであるFactor Xaの認識配列が含まれるように
構築されている。従って、産生される融合タンパク質は
Factor Xaで処理することによって、認識配列のArgのＣ
末端で切断され、目的のタンパク質をマルトース結合タ
ンパク質から切り離すことができる。塩基配列を確認し
た後pMLAPE2と名付け、大腸菌BL21(DE3)に導入して、目
的蛋白質の生産菌Escherichia coli BL21(DE3)/pMLAPE2
とした。

【００２５】それぞれの生産菌をアンピシリンが１００
μgの濃度で存在するＬＢ培地[トリプトン１０g/l、酵
母エキス５g/l、NaCl５g/l]５００mlで培養した。培養
液の濁度が０.７Ａ₅₀₀に達した時、発現誘導物質である
イソプロピル-β-D-チオガラクシド(IPTG)を添加し、さ
らに５時間培養を行なった。集菌後、菌体を３０mlのバ
ッファーＡに懸濁して超音波破砕機にかけた。４８,３
８４xgで３０分遠心分離し、分画した粗抽出液を７５℃
１５分の熱処理によって大腸菌由来のほとんどのタンパ
ク質を変成させた。

【００２６】Escherichia coli BL21(DE3)/pAPE1からの
上記熱処理した抽出液のＤＮＡポリメラーゼ活性を調べ
たところ、抽出液に熱安定性のPol IのＤＮＡポリメラ
ーゼ活性が確認された。

【００２７】Escherichia coli BL21(DE3)/pMLAPE2から
の抽出液については、Pol IIをマルトース結合タンパク
質との融合遺伝子から発現させているため、上記のよう
に産生菌を破砕、熱処理した後、アミロースを固定した
アフィニティーカラムに供した。５倍容量のバッファー
Ｍ（２０ｍＭ Ｔris−ＨＣl）（pＨ７.４）、０.２ＭＮ
aＣl、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）をカラムに供することにより、非特異的な吸着
物を溶出させた後、１０ｍＭ マルトースを含むバッフ
ァーＭを用いて、カラム中のマルトース特異的に吸着し
ているタンパク質を溶出させた。この操作によりマルト
ース結合タンパク質−Pol IIの融合タンパク質が高純度
に精製された。両タンパク質を切り離すためFactor Xa
で処理し、反応液を再度新しいアミロースカラムに供し
た。以上の結果、マルトース結合タンパク質はカラムに
吸着し、Pol IIはそのまま溶出され、高純度のPol II画
分が得られた。この精製画分から耐熱性のＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を確認した。

【００２８】

【配列表】

Sequence Listing <110> Biomolecular Engineering Research Institute <120> New DNA Polymerase <130> 163959 <160> 15

【００２９】 <210> 1 <211> 923 <212> PRT <400> 1 Met Ala Gly Pro Ala lys Pro Lys Lys Pro Glu Pro Pro Pro Thr 1 5 10 15 Leu His Arg Glu Arg Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Gln Asn Thr Leu 20 25 30 Pro Glu Thr Thr Gly Lys Glu Pro Ala Ser Met Ser Leu Arg Arg 35 40 45 Asn Gln Pro Ser Ser Lys His Glu Glu Tyr Asn Ser Glu Ser Gly 50 55 60 Asp Val Alg Gly Leu Thr Leu Glu Pro Ser Pro Gln Ser Glu Leu 65 70 75 Ser Asp Asp Asp Val Ile Leu Glu Leu Val Alg Glu Pro Trp Val 80 85 90 Glu Ser Val Alg Gly Tyr Leu Leu Asp Val Alg Tyr Asp Gly Ser 95 100 105 Leu Gly Lys Ala Val Leu Met Leu Tyr Asp Pro Ser Ser Gly Ser 110 115 120 Leu Val Lys Trp Ala Asp Arg Thr Gly His Lys Pro Tyr Phe Leu 125 130 135 Thr Asp Ala Arg Pro Glu Asp Leu Arg Ala Ala Gly Val Asp Val 140 145 150 Ser His Asp Glu Ser Phe His Gln tye Asp Leu Val Glu Lys Phe 155 160 165 His Pro Ile Asp Arg Lys Leu Val Lys Leu Thr Lys Ile Val Val 170 175 180 Ser Asp Pro Leu aal Val Alg Arg Leu Arg Glu Lys Val Ser Ser 185 190 195 Ala Gly Phe Ser Val Trp Glu Ala Asp Ile lys Tyr His His Asn 200 205 210 tye Ile Phe Asp Arg Gln Leu Ile Pro Gly Ile Leu Tyr Glu Val 215 220 225 Gly Gly Val Alg Ile Val His Thr Leu Pro Leu Glu Met Asp Asp 230 235 240 Ala Thr Arg Ile Val Asp Glu Ile Phe Arg Glu Glu Pro Arg Glu 245 250 255 Val Alg Glu Arg Ala Arg Glu Trp Leu Arg Ile Phe Glu Ala Pro 260 265 270 Pro Pro Lys Leu Pro Leu Ile Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser 275 280 285 Pro Ile Ala Thr Arg Leu Pro Asp Pro Ser Thr Ala Pro Tyr Pro 290 295 300 Val Ile Ser Ala Ala Thr Ala Asp Ser Ser Gly Arg Ser Arg Val 305 310 315 Val Leu Leu tye Pro Gly Gly Ser Arg Phe Tyr Glu Gly Ala Leu 320 325 330 Pro Glu Gly Thr Glu Val Glu Ile Tyr Asp Ser Glu Arg Ala Met 335 340 345 Leu Leu Asp Leu Val Alg Ile Leu Gln Arg Tyr Pro Leu Val Val 350 355 360 Ser Phe Asn Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr Ile Ala Arg Arg 365 370 375 Leu Glu Val Leu Gly Val Pro Arg Glu Phe Ala Pro Ile Glu Leu 380 385 390 Lys Gln Asp Tyr Ala Thr Phe Arg Arg Ser Leu His Ile Asp Leu 395 400 405 His Lys Leu Phe Gly Ile Arg Ala Leu Gln Val Tyr Ala Phe Gly 410 415 420 Asn lys Tyr Arg Glu Leu Ser Leu Glu Ser Ile Ser Arg Ala Leu 425 430 435 Leu Gly Lys Gly Lys Val Glu Leu Lys Ala Pro Val Ser Glu Leu 440 445 450 Asn Leu Asn Lys Leu Ile Glu Tyr Asn Leu Gln Asp Ala Arg Leu 455 460 465 Thr Leu Glu Leu Leu Thr Phe Ser Asn Asn Leu Val Phe Asn Leu 470 475 480 Ile Ile Met Val Met Arg Thr Ser Lys Leu Gly Ile Glu Asp Ile 485 490 495 Thr Arg Ser Gln Ile Ser Asn Trp Ile Arg Gly Leu Met Tyr Trp 500 505 510 Glu His Arg Arg Arg Gly Trp Leu Val Pro Ser Arg Gly Glu Ile 515 520 525 Glu Lys Leu Ser Ser Ala Gly Ala Arg Val Gly Ala Ile Ile Lys 530 535 540 Asp Lys Lys Tyr Arg Gly Ala Ile Val Leu Asp Pro Pro Val Gly 545 550 555 Ile Phe Phe Arg Val Leu Val Leu Asp Phe Ala Ser Leu Tyr Pro 560 565 570 Ser Leu Ile Lys Gln Trp Asn Leu Ser Tyr Glu Thr VAlasn Asn 575 580 585 Pro Asn Cys Arg Asn Thr Ile Glu Val Pro Glu Val Gly His Arg 590 595 600 Val Cys Arg Glu Phe Lys Gly Ile Ser Asn Glu Ile Val Gly Met 605 610 615 Leu Arg Asn Phe Arg Val Alg Leu Tyr Lys Lys Lys Ser Lys Asp 620 625 630 Lys Ser Leu Arg Glu Glu Glu Arg Leu Trp Tyr Asp Val Val Gln 635 640 645 Ser Ala Met Lys Val Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Gly Val Phe Gly 650 655 660 Ser Glu Lys Phe Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Val Ala Glu Ser Val 665 670 675 Thr Ala Leu Gly Arg Ala Val Leu Arg Gly Thr Leu Glu Lys Ser 680 685 690 Arg Glu Leu Asn Leu His Ile Val Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu 695 700 705 Phe Ile Trp Asp Pro Pro Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Val Asp 710 715 720 Tyr Val Glu Arg Thr Tyr Gly Leu Glu Leu Glu Leu Asp Lys Val 725 730 735 Phe Arg Ala Ile Leu Phe Ser Gly Leu Lys Lys Asn Tyr Leu Gly 740 745 750 Ile Thr Glu Glu Gly Asp Ile Val Ile Lys Gly Met Val Ala Lys 755 760 765 Lys Ser Asn Thr Pro Glu Phe Ile Lys Asp Glu Phe Ser Lys Ala 770 775 780 Val Lys Ile Leu Ser Arg Leu Glu Lys Pro Glu Asp Val Glu Ala 785 790 795 Ile Leu Ala Glu Leu Arg Asp His Ile Asn Thr Val Tyr Asn Asn 800 805 810 Val Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Asp Gln Phe Ala Ile Lys Val 815 820 825 Met Leu Ser Lys Asn Pro Arg Glu Tyr Asp Lys Asn Thr Pro Gln 830 835 840 His Val Lys Ala Ala Met Leu Leu Gln Arg Leu Gly Leu Thr Leu 845 850 855 Ser Arg Gly Asp Ile Val Tyr Tyr Val Lys Thr Arg Asp Lys Leu 860 865 870 Gly Val Lys Pro Val Gln Leu Ala Arg Leu Ser Asp Val Asp Pro 875 880 885 Gly Lys Tyr Val Glu His Val Lys Thr Ala Phe Glu Gln Met Leu 890 895 900 Met Ala Phe Gly Ile Ser Trp Asp Asp Ile Ser Gly Val Alg Lys 905 910 915 Leu Asp Arg Leu Leu Phe Asp Ser 920 923

【００３０】 <210> 2 <211> 772 <212> PRT <400> 2 Met Arg Gly Ser Thr Pro Val Ile Ile Leu Trp Gly Arg Gly Ala 1 5 10 15 Asp Gly Ser Arg Val Val Val Phe Tyr Gly Glu Phe Arg Pro Tyr 20 25 30 Phe Tyr Val Leu Pro Asp Gly Ser Val Gly Leu Asp Gln Leu Ala 35 40 45 Ala Met Ile Arg Arg Leu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Ile Leu Ser 50 55 60 Val Glu Arg Val Alg Arg Arg Phe Ile Gly Arg Glu Val Glu Ala 65 70 75 Leu Lys Val Thr Thr Leu Val Pro Ala Ser Val Alg Glu Tyr Arg 80 85 90 Glu Ala Val Alg Arg Leu Gly Gly Val Alg Asp Val Leu Lys Ala 95 100 105 Asp Ile Pro Phe Ala Leu Arg Phe Ile Ile Asp Phe Asn Leu Tyr 110 115 120 Pro Met Arg Trp Tyr Val Ala Glu Val Alg Glu Val Ala Val Pro 125 130 135 His Gly Tyr Ser Val Asp Arg Ala Tyr Thr Leu Ser Gly Asp Ile 140 145 150 Arg Glu Asp Glu Thr Arg Ile Gln Glu Asp Pro Leu Lys Gly Leu 155 160 165 Arg Val Met Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser Lys Met Arg Thr 170 175 180 Pro Asp Pro Lys Lys Asp Pro Val Ile Met Ile Gly Leu Gln Gln 185 190 195 Ala Gly Gly Glu Ile Glu Ile Leu Glu Ala Glu Asp Arg Ser Asp 200 205 210 Lys Lys Val Ile Ala Gly Phe Val Glu Arg Val Lys Ser Ile Asp 215 220 225 Pro Asp Val Ile Val Gly Tyr Asn Gln Asn Arg Phe Asp Trp Pro 230 235 240 Tyr Leu Val Glu Arg Ala Arg Val Leu Gly Val Lys Leu Ala Val 245 250 255 Gly Arg Arg Ser Val Glu Pro Gln Pro Gly Leu Tyr Gly His Tyr 260 265 270 Ser Val Ser Gly Arg Leu Asn Val Asp Leu Leu Asp Phe Ala Glu 275 280 285 Glu Leu His Glu Val Lys Val Lys Thr Leu Glu Glu Val Ala Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Val Val Alg Glu Tyr Trp Asp Asp Pro Ser Lys Arg 305 310 315 Glu Ile Leu Arg Lys Tyr Leu Arg Asp Asp Val Alg Ser Thr Met 320 325 330 Gly Leu Ala Glu Lys Phe Leu Pro Phe Gly Ala Gln Leu Ser Gln 335 340 345 Val Ser Gly Leu Pro Leu Asp Gln Val Met Ala Ala Ser Val Gly 350 355 360 Phe Arg Leu Glu Trp Arg Leu Ile Arg Glu Ala Ala Lys Leu Gly 365 370 375 Glu Leu Val Pro Asn Arg Val Glu Arg Ser Glu Gly Arg Tyr Ala 380 385 390 Gly Ala Ile Val Leu Arg Pro Lys Pro Gly Val His Glu Asp Ile 395 400 405 Ala Val Leu Asp Phe Ala Ser Met Tyr Pro Asn Ile Met Val Lys 410 415 420 Tyr Asn Val Gly Pro Asp Thr Leu Val Alg Pro Gly Glu Glu Tyr 425 430 435 Gly Glu Glu Glu Val Tyr Thr Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe 440 445 450 Arg Lys Ser Pro Pro Gly Phe Phe Lys Lys Ile Leu Glu Arg Phe 455 460 465 Leu Ser Trp Arg Arg Gln Ile Arg Ser Glu Met Lys Lys His Pro 470 475 480 Pro Asp Ser Pro Glu Tyr Lys Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Ala 485 490 495 Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp Pro 500 505 510 His Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Glu Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala 515 520 525 Trp Gly Arg Ser Ile Ile Arg Thr Ala Ile Arg Lys Ala Gly Glu 530 535 540 Leu Gly Leu Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Val 545 550 555 Lys Asn Asp Pro Glu Lys Val Glu Arg Leu Ile Arg Phe Val Glu 560 565 570 Glu Glu Leu Gly Phe Asp Ile Lys Val Asp Lys Val Tyr Arg Arg 575 580 585 Val Phe Phe Thr Glu Ala Lys Lys Arg Tyr Val Gly Leu Thr Val 590 595 600 Asp Gly Lys Ile Asp Val Val Gly Phe Glu Ala Val Arg Gly Asp 605 610 615 Trp Ser Glu Leu Ala Lys Glu Thr Gln Phe Lys Val Ala Glu Ile 620 625 630 Val Leu Lys Thr Gly Ser Val Asp Glu Ala Val Asp Tyr Val Arg 635 640 645 Asn Ile Ile Glu Lys Leu Arg Arg Gly Gln Val Asp Met Arg Lys 650 655 660 Leu Val Ile Trp Lys Thr Leu Thr Arg Pro Pro Ser Met Tyr Glu 665 670 675 Ala Arg Gln Pro His Val Thr Ala Ala Leu Leu Met Glu Arg Ala 680 685 690 Gly Ile Lys Val Glu Pro Gly Ala Lys Ile Gly Tyr Val Val Thr 695 700 705 Lys Gly Ser Gly Pro Leu Tyr Thr Arg Ala Lys Pro Tyr Phe Met 710 715 720 Ala Ser Lys Glu Glu Val Asp Val Glu Tyr Tyr Val Asp Lys Gln 725 730 735 Val Val Pro Ala Ala Ser Ala His Thr Ser Ser Asn Phe Gly Val 740 745 750 Ile Glu Lys Arg Leu Lys Gly Gly Gly Arg Gln Ser Thr Leu Leu 755 760 765 Asp Phe Met Arg Arg Gly Lys 770 772

【００３１】 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 wssytstacc cswssatcat 20

【００３２】 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tcngtrtcnc crtaratnac 20

【００３３】 <210> 5 <211> 2772 <212> DNA <213> aeropyrum pernix K１ <400> 5 atg gct ggt cct gct aag cct aag aaa cct gaa cct cct ccc act 45 Met Ala Gly Pro Ala Lys Pro Lys Lys Pro Glu Pro Pro Pro Thr 1 5 10 15 ctc cac cgg gag aga gaa cct gaa agc aaa tat caa aat aca ctt 90 Leu His Arg Glu Arg Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Gln Asn Thr Leu 20 25 30 cca gaa aca act ggg aaa gaa cca gca tca atg tct ctt cga aga 135 Pro Glu Thr Thr Gly Lys Glu Pro Ala Ser Met Ser Leu Arg Arg 35 40 45 aac caa cca tcc tcg aaa cat gaa gag tac aat tca gaa tct ggg 180 Asn Gln Pro Ser Ser Lys His Glu Glu Tyr Asn Ser Glu Ser Gly 50 55 60 gat gtt cgc ggc ctc act ttg gag cct agc ccg cag tcc gaa ctc 225 Asp Val Arg Gly Leu Thr Leu Glu Pro Ser Pro Gln Ser Glu Leu 65 70 75 tct gac gac gac gtt att tta gag ctt gtt agg gag ccc tgg gtt 270 Ser Asp Asp Asp Val Ile Leu Glu Leu Val Arg Glu Pro Trp Val 80 85 90 gag tcc gtc aga ggc tat ctc tta gat gtg agg tac gac ggc tct 315 Glu Ser Val Alg Gly Tyr Leu Leu Asp Val Alg Tyr Asp Gly Ser 95 100 105 cta ggt aaa gct gtt cta atg ctc tac gac ccc tct agc ggg agc 360 Leu Gly Lys Ala Val Leu Met Leu Tyr Asp Pro Ser Ser Gly Ser 110 115 120 ttg gtt aag tgg gct gac agg aca ggg cac aag ccc tac ttt ctc 405 Leu Val Lys Trp Ala Asp Arg Thr Gly His Lys Pro Tyr Phe Leu 125 130 135 aca gac gct agg ccg gag gac ctg agg gct gct ggt gtt gat gtt 450 Thr Asp Ala Arg Pro Glu Asp Leu Arg Ala Ala Gly Val Asp Val 140 145 150 agc cat gac gag tct ttc cac cag tac gat ctt gtg gag aag ttc 495 Ser His Asp Glu Ser Phe His Gln Tyr Asp Leu Val Glu Lys Phe 155 160 165 cac cca ata gac cgg aag ctg gtg aag ctg act aag att gtg gtg 540 His Pro Ile Asp Arg Lys Leu Val Lys Leu Thr Lys Ile Val Val 170 175 180 tcc gac cct ctg gct gtt agg agg ctt agg gag aag gtc tct tca 585 Ser Asp Pro Leu Ala Val Alg Arg Leu Arg Glu Lys Val Ser Ser 185 190 195 gca ggc ttc tct gtt tgg gag gca gac ata aaa tat cat cac aac 630 Ala Gly Phe Ser Val Trp Glu Ala Asp Ile Lys Tyr His His Asn 200 205 210 tac att ttc gat aga cag ttg att cca ggt ata ctc tac gaa gtc 675 Tyr Ile Phe Asp Arg Gln Leu Ile Pro Gly Ile Leu Tyr Glu Val 215 220 225 ggc ggg gtg aga att gtc cac aca ctt cca ttg gaa atg gat gac 720 Gly Gly Val Alg Ile Val His Thr Leu Pro Leu Glu Met Asp Asp 230 235 240 gcc act aga att gtg gac gag atc ttc agg gag gag cct aga gag 765 Ala Thr Arg Ile Val Asp Glu Ile Phe Arg Glu Glu Pro Arg Glu 245 250 255 gtg agg gag agg gcg aga gag tgg cta aga ata ttc gaa gca ccc 810 Val Alg Glu Arg Ala Arg Glu Trp Leu Arg Ile Phe Glu Ala Pro 260 265 270 cct ccc aag cta cct cta ata gcc ttc gac atc gaa gtc tac agc 855 Pro Pro Lys Leu Pro Leu Ile Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser 275 280 285 ccc atc gca act agg ctt cca gac ccg tct aca gcc ccc tat ccg 900 Pro Ile Ala Thr Arg Leu Pro Asp Pro Ser Thr Ala Pro Tyr Pro 290 295 300 gtg att agc gcg gca aca gca gac agt agt ggg aga agc agg gtg 945 Val Ile Ser Ala Ala Thr Ala Asp Ser Ser Gly Arg Ser Arg Val 305 310 315 gtt ctc ctc tat ccg gga gga agt cgt ttt tat gag gga gcc ttg 990 Val Leu Leu Tyr Pro Gly Gly Ser Arg Phe Tyr Glu Gly Ala Leu 320 325 330 cct gag ggt aca gaa gtt gag ata tat gac agt gag agg gca atg 1035 Pro Glu Gly Thr Glu Val Glu Ile Tyr Asp Ser Glu Arg Ala Met 335 340 345 ctg ctc gat cta gtc agg att ctc cag aga tac ccg ctg gtc gtg 1080 Leu Leu Asp Leu Val Alg Ile Leu Gln Arg Tyr Pro Leu Val Val 350 355 360 agc ttc aac gga gac aac ttc gac cta ccc tac ata gcc aga agg 1125 Ser Phe Asn Gly Asp Asn Phe Asp Leu Pro Tyr Ile Ala Arg Arg 365 370 375 ctg gag gtc ctg ggt gta cct agg gag ttt gcg cct atc gag ctt 1170 Leu Glu Val Leu Gly Val Pro Arg Glu Phe Ala Pro Ile Glu Leu 380 385 390 aag cag gat tac gcg acg ttt agg aga tcg ctt cac atc gat ctc 1215 Lys Gln Asp Tyr Ala Thr Phe Arg Arg Ser Leu His Ile Asp Leu 395 400 405 cac aag ttg ttc ggc att agg gca ctc cag gtc tac gcc ttc ggt 1260 His Lys Leu Phe Gly Ile Arg Ala Leu Gln Val Tyr Ala Phe Gly 410 415 420 aac aag tat agg gag ttg agc ctc gaa tct ata agc agg gca ctc 1305 Asn Lys Tyr Arg Glu Leu Ser Leu Glu Ser Ile Ser Arg Ala Leu 425 430 435 ctc ggc aag ggc aag gtt gag ctg aag gcc cca gtg tcc gag cta 1350 Leu Gly Lys Gly Lys Val Glu Leu Lys Ala Pro Val Ser Glu Leu 440 445 450 aac ctc aac aag cta ata gag tat aac ctc caa gat gca agg ctt 1395 Asn Leu Asn Lys Leu Ile Glu Tyr Asn Leu Gln Asp Ala Arg Leu 455 460 465 acc cta gaa ctc ctc acg ttc agc aat aac ctc gtt ttc aac ctc 1440 Thr Leu Glu Leu Leu Thr Phe Ser Asn Asn Leu Val Phe Asn Leu 470 475 480 ata ata atg gtt atg agg acc agc aag cta ggc atc gaa gac atc 1485 Ile Ile Met Val Met Arg Thr Ser Lys Leu Gly Ile Glu Asp Ile 485 490 495 aca cgc agc caa ata tcc aac tgg ata aga ggc ctc atg tac tgg 1530 Thr Arg Ser Gln Ile Ser Asn Trp Ile Arg Gly Leu Met Tyr Trp 500 505 510 gag cat agg aga aga ggg tgg cta gta ccc tcc aga ggg gag ata 1575 Glu His Arg Arg Arg Gly Trp Leu Val Pro Ser Arg Gly Glu Ile 515 520 525 gaa aag ctc tcc tct gcg gga gca cgg gtc ggc gct ata atc aaa 1620 Glu Lys Leu Ser Ser Ala Gly Ala Arg Val Gly Ala Ile Ile Lys 530 535 540 gac aag aag tat aga ggg gct ata gtt ttg gat cct cct gtg ggt 1665 Asp Lys Lys Tyr Arg Gly Ala Ile Val Leu Asp Pro Pro Val Gly 545 550 555 ata ttc ttc cga gtt cta gtt cta gat ttc gca agc cta tac ccg 1710 Ile Phe Phe Arg Val Leu Val Leu Asp Phe Ala Ser Leu Tyr Pro 560 565 570 agc ctt ata aag caa tgg aac ctg agc tac gag aca gtg aat aac 1755 Ser Leu Ile Lys Gln Trp Asn Leu Ser Tyr Glu Thr VAlasn Asn 575 580 585 cca aac tgc aga gac aca att gag gtg cct gag gtc gga cac agg 1800 Pro Asn Cys Arg Asp Thr Ile Glu Val Pro Glu Val Gly His Arg 590 595 600 gtt tgc cga gag ttc aag ggt ata agc aat gaa atc gtc ggc atg 1845 Val Cys Arg Glu Phe Lys Gly Ile Ser Asn Glu Ile Val Gly Met 605 610 615 ctg aga gac ttc agg gtt agg ctt tac aag aaa aag tct aaa gat 1890 Leu Arg Asp Phe Arg Val Alg Leu Tyr Lys Lys Lys Ser Lys Asp 620 525 630 aag tcc ttg agg gag gag gag agg ctg tgg tac gac gtc gtc caa 1935 Lys Ser Leu Arg Glu Glu Glu Arg Leu Trp Tyr Asp Val Val Gln 635 640 645 tcc gct atg aaa gtg tat att aac gcg agc tac ggt gta ttt ggg 1980 Ser Ala Met Lys Val Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Gly Val Phe Gly 650 655 660 agc gag aag ttc agc ctg tac agc ttg cct gtg gct gag agc gtt 2025 Ser Glu Lys Phe Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Val Ala Glu Ser Val 665 670 675 acg gct ctg gga agg gct gtt ctc agg ggg acg ctt gaa aag tct 2070 Thr Ala Leu Gly Arg Ala Val Leu Arg Gly Thr Leu Glu Lys Ser 680 685 690 aga gaa ctt aac ctt cac ata gtc tac ggc gac acc gac agc ctc 2115 Arg Glu Leu Asn Leu His Ile Val Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu 695 700 705 ttt ata tgg gat ccg ccg aag gat gtt ctc aat gat ctc gtt gac 2160 Phe Ile Trp Asp Pro Pro Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Val Asp 710 715 720 tat gtg gag agg acc tat ggt ctt gag ctg gag ctc gac aag gtt 2205 Tyr Val Glu Arg Thr Tyr Gly Leu Glu Leu Glu Leu Asp Lys Val 725 730 735 ttc aga gca ata ctc ttc agc ggg ctg aag aaa aac tac ctc ggt 2250 Phe Arg Ala Ile Leu Phe Ser Gly Leu Lys Lys Asn Tyr Leu Gly 740 745 750 ata acc gaa gag gga gac atc gtt att aag ggc atg gta gcg aag 2295 Ile Thr Glu Glu Gly Asp Ile Val Ile Lys Gly Met Val Ala Lys 755 760 765 aag agc aac acg ccg gag ttt atc aag gat gaa ttc tcc aag gct 2340 Lys Ser Asn Thr Pro Glu Phe Ile Lys Asp Glu Phe Ser Lys Ala 770 775 780 gtg aag ata ctc agc agg ctt gag aag ccg gag gac gtt gaa gct 2385 Val Lys Ile Leu Ser Arg Leu Glu Lys Pro Glu Asp Val Glu Ala 785 790 795 att ctt gca gag cta agg gat cac ata aac acc gtg tat aac aat 2430 Ile Leu Ala Glu Leu Arg Asp His Ile Asn Thr Val Tyr Asn Asn 800 805 810 gtt aag aag aag gtc tac act ctg gac caa ttc gct ata aaa gtg 2475 Val Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Asp Gln Phe Ala Ile Lys Val 815 820 825 atg ctc agc aag aat cca aga gaa tac gat aaa aac act ccc cag 2520 Met Leu Ser Lys Asn Pro Arg Glu Tyr Asp Lys Asn Thr Pro Gln 830 835 840 cac gtc aaa gcc gcc atg ctg ctt cag aga ctc ggt tta act ctg 2565 His Val Lys Ala Ala Met Leu Leu Gln Arg Leu Gly Leu Thr Leu 845 850 855 agc agg ggc gat ata gtg tat tac gtg aaa acc agg gac aag cta 2610 Ser Arg Gly Asp Ile Val Tyr Tyr Val Lys Thr Arg Asp Lys Leu 860 865 870 ggc gtc aag cca gta cag ctg gca cgg ctc tca gac gta gac cct 2655 Gly Val Lys Pro Val Gln Leu Ala Arg Leu Ser Asp Val Asp Pro 875 880 885 ggc aag tac gtc gag cac gtt aaa acc gcc ttt gaa caa atg ctt 2700 Gly Lys Tyr Val Glu His Val Lys Thr Ala Phe Glu Gln Met Leu 890 895 900 atg gcc ttc gga ata tct tgg gac gac ata tcc ggt gta agg aaa 2745 Met Ala Phe Gly Ile Ser Trp Asp Asp Ile Ser Gly Val Alg Lys 905 910 915 cta gat aga ctc ctt ttc gac tcg tga 2772 Leu Asp Arg Leu Leu Phe Asp Ser 920

【００３４】 <210> 6 <211> 2319 <212> DNA <213> aeropyrum pernix K１ <400> 6 atg agg ggg tca acc ccc gtt atc ata ctc tgg ggg cgg ggg gct 45 Met Arg Gly Ser Thr Pro Val Ile Ile Leu Trp Gly Arg Gly Ala 1 5 10 15 gac ggg tct agg gtt gtc gtg ttc tac ggc gag ttc aga ccc tac 90 Asp Gly Ser Arg Val Val Val Phe Tyr Gly Glu Phe Arg Pro Tyr 20 25 30 ttc tac gtg ctg ccc gac ggg agc gta ggc ctc gac cag ctg gca 135 Phe Tyr Val Leu Pro Asp Gly Ser Val Gly Leu Asp Gln Leu Ala 35 40 45 gct atg ata agg agg ctc tca agg ccg tcc agc cca ata ctc tcg 180 Ala Met Ile Arg Arg Leu Ser Arg Pro Ser Ser Pro Ile Leu Ser 50 55 60 gtt gag agg gtt cga cgc agg ttt ata ggc agg gag gtg gag gct 225 Val Glu Arg Val Alg Arg Arg Phe Ile Gly Arg Glu Val Glu Ala 65 70 75 ctc aag gta acc acc ctc gtc ccc gca agc gtc agg gag tat agg 270 Leu Lys Val Thr Thr Leu Val Pro Ala Ser Val Alg Glu Tyr Arg 80 85 90 gag gct gtg cgt agg ctg ggg ggc gtt agg gat gtc ctg aag gcc 315 Glu Ala Val Alg Arg Leu Gly Gly Val Alg Asp Val Leu Lys Ala 95 100 105 gat ata ccc ttc gcc ctc agg ttc atc ata gac ttt aac cta tac 360 Asp Ile Pro Phe Ala Leu Arg Phe Ile Ile Asp Phe Asn Leu Tyr 110 115 120 cct atg aga tgg tat gtg gcc gag gtt agg gag gtc gcg gtc ccc 405 Pro Met Arg Trp Tyr Val Ala Glu Val Alg Glu Val Ala Val Pro 125 130 135 cac ggc tat agc gtt gac agg gcc tac acg ctc tcc ggc gat ata 450 His Gly Tyr Ser Val Asp Arg Ala Tyr Thr Leu Ser Gly Asp Ile 140 145 150 agg gag gac gag acg agg atc cag gag gac ccc ctg aag ggc ctc 495 Arg Glu Asp Glu Thr Arg Ile Gln Glu Asp Pro Leu Lys Gly Leu 155 160 165 agg gtt atg gct ttc gac ata gag gtc tac agc aag atg agg acg 540 Arg Val Met Ala Phe Asp Ile Glu Val Tyr Ser Lys Met Arg Thr 170 175 180 cca gac ccc aag aag gac ccg gta atc atg ata ggg ttg cag cag 585 Pro Asp Pro Lys Lys Asp Pro Val Ile Met Ile Gly Leu Gln Gln 185 190 195 gcc gga ggg gag atc gag atc ctg gag gcg gag gat agg agt gac 630 Ala Gly Gly Glu Ile Glu Ile Leu Glu Ala Glu Asp Arg Ser Asp 200 205 210 aag aag gtt ata gcc ggc ttc gtc gag cgc gtg aag agt atc gac 675 Lys Lys Val Ile Ala Gly Phe Val Glu Arg Val Lys Ser Ile Asp 215 220 225 cct gac gtg ata gtc ggc tat aac cag aac agg ttc gac tgg cca 720 Pro Asp Val Ile Val Gly Tyr Asn Gln Asn Arg Phe Asp Trp Pro 230 235 240 tac ctg gtt gag agg gcc aga gtt ctc ggc gtg aag ctt gcg gtc 765 Tyr Leu Val Glu Arg Ala Arg Val Leu Gly Val Lys Leu Ala Val 245 250 255 ggg agg agg agc gtg gaa ccc cag ccc ggc ttg tac ggg cac tac 810 Gly Arg Arg Ser Val Glu Pro Gln Pro Gly Leu Tyr Gly His Tyr 260 265 270 tcc gtc tct ggc agg ctc aac gta gac ctc cta gac ttt gcg gag 855 Ser Val Ser Gly Arg Leu Asn Val Asp Leu Leu Asp Phe Ala Glu 275 280 285 gag ctc cac gag gtt aag gtt aag act ctc gag gaa gtc gcg gac 900 Glu Leu His Glu Val Lys Val Lys Thr Leu Glu Glu Val Ala Asp 290 295 300 tac cta ggg gtc gtg agg gag tac tgg gat gac ccg tca aag cgg 945 Tyr Leu Gly Val Val Alg Glu Tyr Trp Asp Asp Pro Ser Lys Arg 305 310 315 gag ata ctc agg aag tac cta agg gac gat gtc aga agc acc atg 990 Glu Ile Leu Arg Lys Tyr Leu Arg Asp Asp Val Alg Ser Thr Met 320 325 330 ggg ctg gca gag aag ttc cta ccc ttc ggg gcg cag ctc tca caa 1035 Gly Leu Ala Glu Lys Phe Leu Pro Phe Gly Ala Gln Leu Ser Gln 335 340 345 gtc tca ggg ctc ccc ctg gac cag gtt atg gcg gcc agc gta ggc 1080 Val Ser Gly Leu Pro Leu Asp Gln Val Met Ala Ala Ser Val Gly 350 355 360 ttc aga ctg gag tgg agg ctc ata cgg gag gcg gct aag ctc ggc 1125 Phe Arg Leu Glu Trp Arg Leu Ile Arg Glu Ala Ala Lys Leu Gly 365 370 375 gag ctg gtg ccc aac agg gtt gag agg agc gag ggc aga tac gct 1170 Glu Leu Val Pro Asn Arg Val Glu Arg Ser Glu Gly Arg Tyr Ala 380 385 390 ggg gcc ata gta ctc agg ccc aag ccg ggg gtt cac gag gat att 1215 Gly Ala Ile Val Leu Arg Pro Lys Pro Gly Val His Glu Asp Ile 395 400 405 gcc gtc ctg gac ttc gca agc atg tac ccg aat atc atg gta aag 1260 Ala Val Leu Asp Phe Ala Ser Met Tyr Pro Asn Ile Met Val Lys 410 415 420 tat aac gtc ggc ccc gac act ctg gtc agg cct ggg gag gag tat 1305 Tyr Asn Val Gly Pro Asp Thr Leu Val Alg Pro Gly Glu Glu Tyr 425 430 435 gga gag gag gag gta tac acg gct ccg gag gtg ggc cac aag ttc 1350 Gly Glu Glu Glu Val Tyr Thr Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe 440 445 450 agg aag agc cct ccc ggc ttc ttc aag aaa ata ctt gag agg ttc 1395 Arg Lys Ser Pro Pro Gly Phe Phe Lys Lys Ile Leu Glu Arg Phe 455 460 465 cta agc tgg agg agg cag att agg agc gag atg aag aag cat ccg 1440 Leu Ser Trp Arg Arg Gln Ile Arg Ser Glu Met Lys Lys His Pro 470 475 480 ccc gac agc ccg gag tac aag ctc ctc gac gag agg cag aag gcg 1485 Pro Asp Ser Pro Glu Tyr Lys Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Ala 485 490 495 ata aag ctc ctg gca aac gcc agc tac ggc tac atg ggc tgg ccc 1530 Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ala Ser Tyr Gly Tyr Met Gly Trp Pro 500 505 510 cat gcc agg tgg tac tgt aga gag tgt gca gag gcg gtt aca gcg 1575 His Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Glu Cys Ala Glu Ala Val Thr Ala 515 520 525 tgg ggt agg agc ata ata agg act gct ata agg aag gct ggc gag 1620 Trp Gly Arg Ser Ile Ile Arg Thr Ala Ile Arg Lys Ala Gly Glu 530 535 540 cta ggg ctg gag gtt ata tat gga gac acg gac agc ctc ttc gtc 1665 Leu Gly Leu Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Val 545 550 555 aag aac gat cct gag aag gtg gaa agg ctg ata agg ttt gtc gag 1710 Lys Asn Asp Pro Glu Lys Val Glu Arg Leu Ile Arg Phe Val Glu 560 565 570 gag gag ctt ggg ttc gac att aag gtg gac aag gtg tac agg cgt 1755 Glu Glu Leu Gly Phe Asp Ile Lys Val Asp Lys Val Tyr Arg Arg 575 580 585 gta ttc ttc acc gag gcc aag aag agg tat gtg ggg ctg acg gtg 1800 Val Phe Phe Thr Glu Ala Lys Lys Arg Tyr Val Gly Leu Thr Val 590 595 600 gac ggc aag ata gat gta gtc ggc ttc gaa gct gtc agg ggc gac 1845 Asp Gly Lys Ile Asp Val Val Gly Phe Glu Ala Val Alg Gly Asp 605 610 615 tgg agc gag ctc gcg aag gag acg cag ttc aag gtg gca gag ata 1890 Trp Ser Glu Leu Ala Lys Glu Thr Gln Phe Lys Val Ala Glu Ile 620 625 630 gtc tta aag acc ggt agc gtg gac gag gct gtc gac tac gtc agg 1935 Val Leu Lys Thr Gly Ser Val Asp Glu Ala Val Asp Tyr Val Alg 635 640 645 aat ata ata gag aag ctt agg agg ggc cag gtg gac atg agg aaa 1980 Asn Ile Ile Glu Lys Leu Arg Arg Gly Gln Val Asp Met Arg Lys 650 655 660 ctg gtc att tgg aag act ctg aca cgg cct cca tca atg tac gag 2025 Leu Val Ile Trp Lys Thr Leu Thr Arg Pro Pro Ser Met Tyr Glu 665 670 675 gcg agg cag ccc cac gtg acc gca gcg cta ctt atg gag agg gct 2070 Ala Arg Gln Pro His Val Thr Ala Ala Leu Leu Met Glu Arg Ala 680 685 690 ggc ata aag gtc gag cca ggg gct aag atc ggc tac gtg gtg acc 2115 Gly Ile Lys Val Glu Pro Gly Ala Lys Ile Gly Tyr Val Val Thr 695 700 705 aag ggg tca ggc ccc ctc tat acg agg gcg aag cct tat ttt atg 2160 Lys Gly Ser Gly Pro Leu Tyr Thr Arg Ala Lys Pro Tyr Phe Met 710 715 720 gct agc aag gag gag gtt gac gtg gag tac tat gtc gac aag cag 2205 Ala Ser Lys Glu Glu Val Asp Val Glu Tyr Tyr Val Asp Lys Gln 725 730 735 gtg gtg cca gcg gct tct gcg cat act tcc agt aac ttc gga gta 2250 Val Val Pro Ala Ala Ser Ala His Thr Ser Ser Asn Phe Gly Val 740 745 750 att gag aag agg ctg aag gga gga gga agg cag agc acg ctc ctc 2295 Ile Glu Lys Arg Leu Lys Gly Gly Gly Arg Gln Ser Thr Leu Leu 755 760 765 gac ttc atg agg cgg ggg aaa taa 2319 Asp Phe Met Arg Arg Gly Lys 770 772

【００３５】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <400> 7 ctgaaggtct ctcagcatgc 20

【００３６】 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tatgaaagtg tatattaacg ccagc 25

【００３７】 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 acctctcaag tattttcttg a 21

【００３８】 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 acagcctccc tatactccc 19

【００３９】 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ttcaggaaga gccctcccgg cttcttcaa 29

【００４０】 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gcgaacgtta ccatggctgg tcctgctaag cctaag 36

【００４１】 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 gcgttgaatc catatgtggt tatcacgagt cgaag 35

【００４２】 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cgtgaattca tgcgcgggtc aacccccgtt atcatactc 39

【００４３】 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 gatgcggccg cataaggtac ttcatcctcc tacacaccc 39

【図面の簡単な説明】

【図１】 陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによ
る、アエロピルムペルニクス細胞粗抽出液中のＤＮＡポ
リメラーゼ活性の分画。タンパク質の溶出パターンは２
８０nmのＵＶ吸収によりモニターした。各フラクション
のヌクレオチドの取り込み活性は白四角マークで表して
いる。

【図２】 活性ゲル分析による、ＤＮＡポリメラーゼ活
性を有するタンパク質の検出。陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーによって得られた、画分１（図１におけ
る＃１８）（レーン２）及び画分２（図１における＃２
３）（レーン３）には、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有す
る、各々約８５,０００、１００,０００ダルトンの分子
量であるタンパク質が含まれることが検出された。レー
ン１、４は各々対照として、Taqポリメラーゼ（９４,０
００）、Pfuポリメラーゼ（９０,０００）を泳動してい
る。

【図３】 陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによ
り分離されたＤＮＡポリメラーゼ活性のアフィディコリ
ン感受性（a）及び熱安定性（b）。

【図４】 ゲノミックサザン分析による２種類のＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の検出。アエロピルム ペルニクス
ＤＮＡを図中に示した各々の制限酵素で切断して、Pol
I断片（a）、Pol II断片（b）とハイブリダイズさせ
た。ケミルミネッセンス法により、ハイブリダイズした
ＤＮＡを検出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 DA06 HA08 4B050 CC03 DD02 FF05E FF11E LL03 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR08 QR23 QR42 QS36 QX07

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １）配列番号１若しくは２で示されるア
   ミノ酸配列を有するタンパク質、又は２）配列番号１若
   しくは２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数
   個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ
   酸配列を有するタンパク質であって、ＤＮＡポリメラー
   ゼ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 耐熱性である請求項１に記載のタンパク
   質。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のタンパク質をコ
   ードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号５又は６の塩基配列を有する請
   求項３に記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項４に記載された遺伝子と、ストリ
   ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で、ＤＮＡポ
   リメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
   子。