KR20020093748A - 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법 - Google Patents

에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020093748A
KR20020093748A KR1020020073380A KR20020073380A KR20020093748A KR 20020093748 A KR20020093748 A KR 20020093748A KR 1020020073380 A KR1020020073380 A KR 1020020073380A KR 20020073380 A KR20020073380 A KR 20020073380A KR 20020093748 A KR20020093748 A KR 20020093748A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna polymerase
apn
dna
pcr
aeropyrum
Prior art date
Application number
KR1020020073380A
Other languages
English (en)
Inventor
엄수현
장건희
김묘정
진미영
정은주
길지영
Original Assignee
삼성정밀화학 주식회사
애니젠 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성정밀화학 주식회사, 애니젠 주식회사 filed Critical 삼성정밀화학 주식회사
Priority to KR1020020073380A priority Critical patent/KR20020093748A/ko
Publication of KR20020093748A publication Critical patent/KR20020093748A/ko
Priority to AU2003284764A priority patent/AU2003284764A1/en
Priority to PCT/KR2003/002564 priority patent/WO2004048563A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 에어로파이룸 퍼닉스(Apn)에서 분리한 신규한 내열성 DNA 중합효소 유전자 및 그로부터 발현되는 DNA 중합효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 열안정성(thermostability) 및 연속성(processivity)이 향상된 DNA 중합효소 및 이를 발현시키기 위한 유전자 및 그 유전자를 함유하는 발현벡터를 대장균에서 발현시켜 DNA 중합효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및 그의 제조방법{DNA polymerase isolated from Aeropyrum pernix and its preparation method}
본 발명은 에어로파이룸 퍼닉스(Apn)에서 분리한 신규한 내열성 DNA 중합효소 유전자 및 그로부터 발현되는 DNA 중합효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 열안정성(thermostability) 및 연속성(processivity)이 향상된 DNA 중합효소 및 이를 발현시키기 위한 유전자 및 그 유전자를 함유하는 발현벡터를 대장균에서 발현시켜 DNA 중합효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
내열성 DNA 중합효소는 1987년에 이를 이용한 PCR(Polymerase chain reaction) 기술이 개발되면서 주목을 받기 시작했으며, 대표적인 내열성 DNA 중합효소로 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)에서 분리한 Taq DNA 중합효소를 들 수 있다.
내열성 DNA 중합효소는 주로 두 종류의 발현균주 즉, 고도고온균(extreme thermophile)과 초고온균(hyper thermophile)에서 분리되어 연구되어 왔다. 고도고온균은 생육 적온이 70∼85℃로 미국 및 일본의 온천지대에서 분리한 써무스속의 균주이고, 초고온균은 생육 적온이 85℃ 이상인 해저 열수공 근처에서 분리한 알키박테리아(Archaebacteria) 등이다.
내열성 DNA 중합효소는 1976년 치엔(Chien) 등이 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq)YT-1로부터, 1980년 칼레인(Kalein) 등이 써무스 루버(Thermus ruber)로부터 각각 분리 정제하여 일반적인 특성을 밝혔으나,그다지 주목을 받지 못하였다. 그러나, 1987년에 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR 기술이 소개되면서, 내열성 DNA 중합효소가 주목을 받기 시작하였으며(참조: Saikiet al.,Science, 239:487-491, 1988), 상기TaqDNA 중합효소에 이어서 써모플라스마 액시도필럼(Thermoplasma acidophilum)의 DNA 중합효소(참조: Hamalet al.,Eur. J. Biochem., 190:517-521, 1990), 써무스 칼도필러스(Thermus caldophilus, Tca) GK24의 DNA 중합효소(참조: Parket al.,Eur. J. Biochem., 214:135-140, 1993) 등이 분리 정제되어 그 효소 특성이 상세히 밝혀졌다.
특히, 로이어(Lawyer) 등은TaqDNA 중합효소 유전자를 클로닝하여, DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 완전히 밝혔다(참조: Lawyeret al., J.Biol. Chem., 264:6427-6437, 1989).TaqDNA 중합효소 유전자의 전사해독프레임(open reading frame)은 총 2499개의 염기쌍으로 구성되어 있고,Taqpol I의 경우 대장균 DNA 중합효소의 아미노산 서열과 38%의 상동성을 보이며, 분자량은 94 kDa으로 대장균 DNA 중합효소와 비교하여, 3′→5′엑소뉴클라아제 활성을 가지는 영역이 존재하지 않는 것이 특징으로, 대장균 DNA 중합효소에 비하여 푸루프 리딩(proof reading) 효율이 낮은 것으로 판명되었다.
한편, 초고온균의 내열성 DNA 중합효소는 써모코쿠스 리토리스(Thermococcus litoralis,참조: Mattilaet al.,Nucleic Acids Res., 19:4967-4973, 1991), 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus,참조: Uemoriet al., Nucleic AcidsRes., 21:259-265, 1993),설포로버스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus,참조: Pisaniet al.,Nucleic Acids Res., 20:2711-2716, 1992) 등에서 연구되었다. 특히,TliDNA 중합효소는 3'→5′엑소뉴클라아제 활성을 소유하고 있으므로, 푸루프 리딩 기능이 있는 내열성 효소로서 주목을 받고 있다.
그러나 상기 균주에서 분리된 DNA 중합효소는 열안정성 및 연속성면에서 충분치 못하여 새로운 균주를 통해 분리한 DNA 중합효소가 최근 주목받기 시작했다.
에어로파이룸 퍼닉스(Aeropyrum pernix)는 1996년에 일본의 한 온천에서 발견되었으며(참조 : Sakoet al.,International Journal of Systematic Bacteriology,46pp1070-1077(1996)), 아이작 등에 의해 이 균주 내에 두 종류의 DNA 중합효소가 존재한다는 것과 이들의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열이 밝혀졌다(Isaacet al.,Journal of Bacteriology,181pp5984-5992(1996)).
그러나, 이는 초고온균(hyper thermophile) 하위그룹 내에서의 에어로파이룸 퍼닉스의 분류학적 체계와 유전자 수준의 상동성에 초점을 두고, 자체 세포추출물에서 두 종류의 중합효소를 분리하여 내열성과 저해제(Aphidicolin)를 이용한 효소활성만을 개시하였다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소 Ⅱ의 뉴클레오타이드 서열을 참고로 하여 프라이머의 서열을 결정, 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소 유전자를 PCR을 통하여 대량 복제하고 이를 발현벡터에 클로닝한 후 뉴클레오타이드 서열을 분석한 후, 이 발현된 DNA 중합효소를 사용하여 PCR함으로서 신규한 중합효소의 효과를 실험하였다. 이를 통해 열안정성 및 연속성이 현저히 향상된 DNA 중합효소임을 확인하고, 이를 분리 제조한 것이다.
도 1은 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소 유전자 단편을 포함한 플라스미드 pGEX-Apn의 구성을 나타내는 도면이다.
도 2는 TA 클로닝 벡터(pGEM-T Easy)에 2.3Kb의 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소 유전자 단편을 붙여 DNA 중합효소 유전자 단편의 클로닝 및 발현 벡터(pGEX-Apn)(5.3Kb) 제조한 후, 제한효소 SmaI-NotI으로 처리하여 발현 벡터(pGEX-4T-3)의 MCS(SmaI-NotI) 부위에 에어로파이룸 퍼닉스 DNA 중합효소 유전자 단편을 삽입하여 Tac 프로모터의 조절하에서 중합효소를 발현하기 위한 벡터(pGEX-Apn)(7.2Kb)를 조립하는 방법을 나타내는 도면이다.
도 3은 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소 유전자 단편의 발현 정도를 시간별로 측정하기 위한 10% 변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소의 각 단계 별 정제 정도를 측정하기 위한 10% 변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 중합효소의 열안정성을 비교한 사진이다. 도 5a는 jp-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 5b는 kj-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 5c는 프로메가사의 Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이다.
도 6은 중합효소의 연속성을 비교한 사진이다. 도 6a는 jp-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 6b는 kj-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 6c는 프로메가사의 Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 지니는 열안정성 및 연속성이 우수한 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리한 DNA 중합효소를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 DNA 중합효소를 코딩시키는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 cDNA 유전자를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 서열번호 2의 cDNA 유전자를 함유한 발현벡터(pGEX-Apn)(7.2Kb)를 조립한 후, 상기 발현벡터를 대장균에 삽입하여 형질전환 대장균을 제조하고, 이를 발현시켜 상기 DNA 중합효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 제공하는 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소의 아미노산 서열은 종래의 아이작 등이 분리한 에어로파이룸 퍼닉스 DNA 중합효소와 비교할 때, 306번 위치에서 아르기닌이 라이신으로 치환되었고, 306번과 307번 사이에 13개의 아미노산이 추가 삽입되어 있으며, 339번의 페닐알라닌이 352번의 세린으로, 342번의 글루타민이 355번의 글루타메이트로 또한 C-말단에 8개 정도의 서열이 상이한 새로운ApnDNA 중합효소임을 확인하였다.
다음은 본 발명자에 의해 밝혀진ApnDNA 중합효소의 아미노산 서열 (mj-Apn 으로 표시)과 일본의 아이작 등에 의해 밝혀진ApnDNA 중합효소의 아미노산 서열(jp-Apn 으로 표시)을 비교하여 서로 다른 부분을 *로 표기한 것이다.
본 발명은 고온성 균주인 알키박테리아 (Archaebacteria)속 균주의 일종인 에어로파이룸 퍼닉스(Aeropyrum pernix)로부터 내열성 DNA 중합효소 (ApnDNA polymerase)의 유전자 단편을 대장균에서 재조합 및 발현시킨 후, 간단히 정제하여 제조하는 방법을 더욱 제공한다.
따라서, 본 발명의ApnDNA 중합효소 유전자를 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 조립한 후, 대장균(BL21-CodonPlus(DE3)-RIL)에서 발현시키고 이를 정제함을 특징으로 하는ApnDNA 중합효소의 제조 방법을 제공하는 것이다. 이때ApnDNA 중합효소 유전자는 에어로파이룸 퍼닉스(Aeropyrum pernix) 균주의 게놈 DNA를 주형으로 제한효소부위 SmaI을 포함하는 N-말단을 코딩하는 프라이머 Apn-N 과 제한효소부위 NotI을 포함하는 C-말단을 코딩하는 프라이머 Apn-C를 가지고 PCR에 의해 수득됨을 특징으로 하고, 발현된 중합효소의 정제는 배양한 세포를 모아서 완충액 A [50mM 트리즈마베이스 (pH 8.0), 0.1mM EDTA]에 현탁하여 파쇄한 후, 친화성 크로마토그래피를 통과함을 특징으로 한다.
한편, 친화성 크로마토그래피 통과 후, 열처리 과정에 의해 내열성이 없거나 약한 단백질들을 변성시켜 원하는 단백질만을 정제함을 특징으로 한다. 또한 상기 방법에 따라 제조된ApnDNA 중합효소를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 대장균에서 발현된 에어로파이룸 퍼닉스(Aeropyrum pernix, 약칭Apn)DNA 중합효소를 발현시키고, 발현된 효소를 제조하는 방법이다. 본 발명자는 1996년에 일본의 한 온천에서 분리되었고, 생육조건이 호기성이며 90℃에서 잘 자라는 에어로파이룸 퍼닉스로부터 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하였다.
뉴클레오타이드 서열이 이미 알려진ApnDNA 중합효소 유전자를 클로닝하기 위해 에어로파이룸 퍼닉스 균주의 게놈 DNA를 주형으로 제한효소부위 SmaI을 포함하는 N-말단을 코딩하는 프라이머 Apn-N과 제한효소부위 NotI을 포함하는 C-말단을 코딩하는 프라이머 Apn-C를 가지고 PCR에 의해 수득하였고, 이를 발현벡터에 클로닝한 후, 대장균에 형질전환하여ApnDNA 중합효소를 발현시켰다.
본 발명의 대상인ApnDNA 중합효소는 90℃에서 사는 고온성 미생물인 에어로파이룸 퍼닉스에 있는 효소로서 90℃ 이상의 고온에서도 수시간 안정하므로 중합효소 연쇄반응(PCR)에 주로 사용하고자 한다. 본 발명에 의한 내열성 DNA 중합효소 정제방법은 유전자 재조합 방법으로서 목적 단백질을 대장균에서 발현시킨 후, 대장균 세포의 조 추출물을 친화성 크로마토그래피를 통해 일차 정제하고, 내열성이 없거나 낮은 단백질을 열변성시켜 내열성이 강한 단백질만을 얻는 방법에 의해 간단히 정제하는 방법이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1) 에어로파이룸 퍼닉스의 게놈 DNA 분리
에어로파이룸 퍼닉스를 배지 2L에 접종하여 90℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 배양이 끝난 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하여 증류수로 씻어 염을 제거한 후 DNeasy Tissue Kit(Qiagen 사)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다.
(실시예 2)ApnDNA 중합효소 유전자의 증폭
에어로파이룸 퍼닉스 균주의 게놈에서ApnDNA 중합효소의 유전자 부분만을 증폭시키기 위해 에어로파이룸 퍼닉스 균주의 게놈 DNA를 주형으로 제한효소부위 SmaI을 포함하는 N-말단을 코딩하는 프라이머 Apn-N(GAAGGGTTCCCGGGACGCTACACTCCTC
TCC : 서열번호 3)와 제한효소부위 NotI을 포함하는 C-말단을 코딩하는 프라이머 Apn-C(GATGCGGCCGCATAAGGTACTTCATCCTCCTACACACCC : 서열번호 4)를 가지고 PCR 방법에 의해 2.3Kb DNA 단편을 증폭하였다.
PCR 반응혼합물은 주형으로 에어로파이룸 퍼닉스 균주의 게놈 DNA를 포함한 50㎕의 반응혼합액에서 실시하였다. 이 PCR에서는 Takara사의 LA Taq DNA 중합효소를 사용하였으며, 반응혼합물의 조성은 1㎕의 게놈 DNA, 0.4μM 프라이머 Apn-N 및 Apn-C, 2.5mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 2.5mM MgCl2및 LA Taq DNA 중합효소 완충액을 첨가하여 반응하였다. 반응조건은 94℃에서 DNA 변성 1분, 55℃에서 프라이머 어닐링 45초, 72℃에서 효소 중합반응 2분 30초로 30회 반복하여 수행하였다. 반응 후 아가로오스 겔에서 PCR 생성물의 크기와 양을 확인하였다.
프라이머
Apn-N :5'GAAGGGTT CCCGGG ACGCTACACTCCTCTCC3
SmaI
Apn-C :5'GAT GCGGCCGC ATAAGGTACTTCATCCTCCTACACACCC3
NotI
(실시예 3)ApnDNA 중합효소유전자의 TA 클로닝 및 형질전환
Taq DNA 중합효소는 PCR 산물의 양쪽 끝에 염기서열 A를 붙여주므로, 이를 이용하여 DNA 양쪽 끝이 염기서열 T로 되어있는 클로닝 벡터 pGEM-T Easy 벡터 (Promega 사)를 실시예 1에서의 PCR 생성물과 동량 비율로 T4 DNA 연결효소를 이용하여 연결반응하였다 (pGEM-Apn). 이를 대장균 JM109에 형질전환하여 White/Blue 콜로니 선별법으로 클로닝된 플라스미드를 발현하는 콜로니를 선택하였다.
(실시예 4) 저융점 아가로오스 겔로부터ApnDNA 중합효소 유전자의 회수
플라스미드 pGEM-Apn을 함유한 대장균 JM109를 배지 1㎖당 100㎍의 엠피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 하룻밤 동안 키운 후 플라스미드 pGEM-Apn을 분리하였다. 이 플라스미드를 제한효소 SmaI 및 NotI으로 절단하여 1 퍼센트 농도로 만들어진 아가로오스 겔에 전기영동하여 양쪽 끝에 제한효소 부위가 삽입된ApnDNA 중합효소 유전자를 분리, 그 부위의 겔을 절단하여 회수하였다. 이렇게 얻은 겔 조각에 완충액 QG(Qiagen사)를 겔 조각 무게 만큼의 양를 넣고 50℃에서 10분 동안 방치하여 완전히 녹인 후, DNA만을 정제할 수 있는 QIAquick spin 컬럼 (Qiagen사)을 사용하여ApnDNA 중합효소 유전자만을 정제하였다.
(실시예 5)ApnDNA 중합효소 유전자를 발현 벡터로의 서브클로닝
ApnDNA 중합효소 유전자를 발현시키기 위한 벡터인 pGEX-4T-3(4.9Kb)를 실시예 3과 같은 방법으로 절단, 분리 및 정제하여ApnDNA 중합효소 유전자와 T4 DNA 연결효소를 이용하여 16℃에서 12시간 동안 연결 반응하였다(pGEX-Apn). 이렇게 제조된 플라스미드를 대장균 균주 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환하여ApnDNA 중합효소 유전자가 발현되는 콜로니만을 선별하였다.
(실시예 6)ApnDNA 중합효소 유전자의 대량 발현
완전한 재조합 플라스미드 pGEX-Apn을 발현시키기 위한 대장균으로는 20개의 아미노산 중 아르기닌, 류신, 이소류신을 코딩하는 tRNA가 추가되어 있는 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 사용하였다. 에어로파이룸 퍼닉스와 대장균의 DNA 코돈 사용율이 각각 달라 tRNA 추가가 없는 대장균(예, BL21(DE3) 등)에서는ApnDNA 중합효소의 발현율이 대단히 낮았다. pGEX-4T-3에 삽입된ApnDNA 중합효소 (84kDa)는 글루타티온 에스-트랜스퍼레이스(28kDa)와 연결되어 발현된다. 이는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 간단히 정제하기 위함이며 발현되는 단백질의 크기는 112kDa가 된다.
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환된 pGEX-Apn을 발현시키기 위해, 항생제인 엠피실린(Ampicillin 50㎍/㎖)과 클로람페니콜(Chloramphenicol 37㎍/㎖)이 첨가된 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% NaCl)에 접종하였다. 37℃에서 600nm의 UV에서 흡광도 값이 0.5가 될 때 1.0mM IPTG (isopropyl-thio-D-
galactopyranoside)를 넣고 25℃로 온도를 낮추어 발현을 유도하였다. IPTG를 넣은 후, 온도를 낮춘 이유는 37℃로 계속하여 발현을 유도할 경우 목적 단백질인ApnDNA 중합효소가 대부분 활성이 없는 불용성 단백질로 발현되기 때문이다. 25℃로 온도를 낮추어 발현을 유도하면 약 30%정도의 활성이 있는 수용성 단백질로 발현되었다.
제 3도의 제 1열은 표준 분자량 단백질(킬로 달톤 단위), 제 2열은ApnDNA 중합효소 유전자가 클로닝 되어있지 않은 pGEX-4T-3 만으로 형질전환된 대장균의 전체 단백질, 제 3열은 플라스미드 pGEX-Apn을 함유하는 대장균의 발현을 유도하지 않은 전체 단백질, 제 4열은 플라스미드 pGEX-Apn을 함유하는 대장균의 발현 유도 후 1시간 된 전체 단백질, 제 5열은 플라스미드 pGEX-Apn을 함유하는 대장균의 발현 유도 후 3시간 된 전체 단백질, 제 6열은 플라스미드 pGEX-Apn을 함유하는 대장균의 발현 유도 후 5시간 된 전체 단백질을 각각 나타낸다. 제 4열에서 보듯이 IPTG로 발현 유도 후 1시간만에 많은 양의ApnDNA 중합효소가 발현되었다.
(실시예 7)ApnDNA 중합효소 정제
실시예 6의ApnDNA 중합효소가 발현된 배양액을 원심분리 (400x g, 4℃, 30분간)하여 세포를 모아 완충액 A [50mM 트리즈마베이스 (pH 8.0), 0.1mM EDTA]에 현탁하고, 0.2 mM 페닐메틸썰포닐플루오르(PMSF)를 첨가하였다. 위의 세포 현탁액을 가압기(French Press)로 파쇄한 후, 다시 원심분리 (1600x g, 4℃, 1시간)하여 파쇄되지 않은 균체를 제거하여ApnDNA 중합효소를 포함한 조 추출물을 확보하였다. 조 추출물을 친화성 크로마토그래피의 일종인 글루타티온 세파로스 4B 비드 (bead)와 4℃에서 1시간 동안 반응시켜 글루타티온 에스-트랜스퍼레이스(GST)와 연결되어 발현된ApnDNA 중합효소를 비드와 결합시켰다.
나머지 대장균의 단백질들은 완충액 A로 충분히 씻어내었다. 글루타티온 에스-트랜스퍼레이스를ApnDNA 중합효소로부터 제거하기 위해서 트롬빈(Thrombin)을 첨가하여 다시 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 용액을 모았다. 이처럼 일차 정제한 용액을 75℃에서 20분, 혹은 80℃에서 20분간 가열하고 이를 얼음물에 10분간 방치한 후, 원심분리 (1600x g, 4℃, 1시간)하여 내열성이 없거나 낮은 변성된 단백질을 제거하였다.
제 4도의 제 1열은 표준 단백질 크기를 나타내며, 제 2열은 파쇄한 대장균 용액을 원심분리 후 상등액에 존재하는 단백질이며, 제 3열은 원심분리후 침전물에 남아있는 단백질, 제 4열은 일차 정제된 단백질, 제 5열은 일차 정제된 단백질을 70℃에서 20분 열처리한 후 상등액, 제 6열은 일차 정제된 단백질을 80℃에서 20분 열처리한 후 상등액, 제 7열은 일차 정제된 단백질을 90℃에서 20분 열처리한 상등액을 나타낸다.
(실시예 8) 정제된ApnDNA 중합효소를 이용한 연쇄반응(PCR)
정제된ApnDNA 중합효소의 연쇄반응(PCR)을 실험하기 위해 1.5Kb 크기의 유전자가 삽입된 벡터를 포함한 50㎕의 반응혼합액에서 실시하였다. 반응혼합물의 조성은 1㎍ 주형 DNA, 1μM 프라이머, 250μM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 5mMMgCl2,25mM KCl, 20mM 트리즈마베이스(pH 8.5) 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 혼합물에 정제된ApnDNA 중합효소를 첨가하여 반응하였고, 92℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 55℃에서 프라이머를 결합시켜 75℃에서 2분 동안 중합반응 시키는 것을 25회 반복하였다.
(실시예 9)ApnDNA 중합효소의 열 안정성 비교시험
실시예 7을 통해 정제된 본 발명의ApnDNA 중합효소의 열안정성을 비교측정하기 위해 3종류의 중합효소를 사용하여 비교시험을 행하였다.
첫 번째로 사용된 중합효소는 본 발명의 선행기술로 인용된 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 중합효소 jp-Apn DNA 중합효소를 사용하였고, 두 번째로 사용된 중합효소는 본 발명의 실시예 7에서 정제된 중합효소인 kj-DNA 중합효소를 사용하였으며, 마지막으로 프로메가사에서 상용화되고 있는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
열안정성(Thermostability)을 비교하고자 실제 PCR조건과 동일한 온도증감이 있는 상황에서 즉 70℃에서 95℃로 승온시키고, 다시 50℃로 냉각시키는 열처리를 한 사이클로하여 완충액과 효소만을 넣은 상태에서 상기 3종류의 DNA 중합효소(jp-Apn DNA 중합효소, kj-DNA 중합효소 및 Taq DNA 중합효소(Promega사))를 25, 50, 75, 100 더미(dummy) 사이클링시킨 후, 이러한 사이클링 열처리 후 나머지 조성물(주형, 프라이머, dNTP 등)을 투입하여 통상의 PCR 방법을 통해 30 사이클의 PCR 반응 후 중합효소의 활성을 측정함으로서 중합효소의 열안정성을 확인하였다.
도 5a는 jp-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 5b는 kj-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 5c는 프로메가사의 Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이다.
도 5에 있어서, 제 1열은 표준크기의 DNA를 나타내는 것이고, 제 2열은 대조군(더미 사이클링없이 수행한) 30 사이클 후 PCR 생성물의 밴드를 나타낸 것이고, 제 3열은 25 더미 사이클 수행 후 30 사이클 후 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이며, 제 4열은 50 더미 사이클 수행 후 30 사이클 후 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이고, 제 5열은 75 더미 사이클 수행 후 30 사이클 후 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이고, 제 6열은 100 더미 사이클 수행 후 30 사이클 후 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이다.
도 5a의 경우 제 6열의 PCR 생성물의 밴드는 발견되지 않았다. 즉, jp-Apn DNA 중합효소의 경우 100 더미 사이클 수행 후에는 열에 의한 효소 파괴로 인해 PCR 반응을 수행할 수 없음을 나타낸다.
도 5b의 경우 모든 열에서 PCR 생성물 밴드가 나타났다. 즉, 본 발명의 실시예에서 제조된 kj-Apn DNA 중합효소는 어떠한 더미 사이클 수행 후에도 효소의 파괴없이 충분한 PCR 반응을 수행함을 나타내는 것이다.
도 5c의 경우 제 5열 및 제 6열의 PCR 생성물의 밴드는 발견되지 않았다. 즉, Taq DNA 중합효소의 경우 75 더미 사이클 수행 후에는 열에 의한 효소 파괴로인해 PCR 반응을 수행할 수 없음을 나타낸다.
상기한 실험을 통해 본 발명에서 제조된 kj-Apn DNA 중합효소가 가장 우수한 열안정성을 지니는 것으로 판명되었다.
(실시예 10)ApnDNA 중합효소의 연속성 비교시험
연속성(Processivity)비교를 위하여 jp-Apn DNA 중합효소, kj-Apn DNA 중합효소 및 Taq DNA 중합효소(promega사)를 사용하여 서로 다른 크기의 플라스미드 DNA를 주형으로 한 PCR 중합반응을 실시하였다.
이 반응에 사용한 DNA주형들은 2.7Kb 크기의 플라스미드 pUC18과 접합효소 유전자가 삽입되어 있는 4.2Kb 크기의 pGEM-lig, 5.4Kb 크기의 pET21b, 7.3Kb 크기의 pET43.1a, 중합효소I 부분에 해당되는 유전자가 포함되어 있는 8.4Kb 크기의 pET15b-pol I등을 제작하거나 선별하였다.
반응혼합물조성은 1㎍ 주형 DNA, 1μM 프라이머, 250μM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 5mM MgCl2, 25mM KCl, 20mM 트리즈마베이스(pH 8.5) 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 혼합물에 각각의 중합효소를 첨가하여 반응하였고, 94℃ 에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 58℃ 에서 45초동안 프라이머를 결합시킨 다음, 효소중합반응단계인 72℃ 에서는 크기에 따라 2Kb이상은 3분, 4Kb이상은 5분, 7Kb이상은 8분 동안 30회 반복하였다.
도 6a는 jp-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 6b는 kj-Apn DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이고, 도 6c는 프로메가사의 Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR 생성물의 전기영동 사진이다.
도 6에 있어서, 제 1열은 표준크기의 DNA를 나타내는 것이고, 제 2열은 2.7Kb 크기의 pUC18을 주형으로 한 PCR 생성물의 밴드를 나타낸 것이고, 제 3열은 4.2Kb 크기의 pGEM-lig를 주형으로 한 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이며, 제 4열은 5.4Kb 크기의 pET21b를 주형으로 한 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이고, 제 5열은 7.3Kb 크기의 pET43.1a을 주형으로 한 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이고, 제 6열은 8.4Kb 크기의 pET15b-pol I을 주형으로 한 PCR 생성물의 밴드를 나타내는 것이다.
도 6a의 경우 제 3열 이후의 PCR 생성물의 밴드는 발견되지 않았다. 즉, jp-Apn DNA 중합효소의 경우 4.2Kb 이상의 PCR 생성물은 PCR 반응으로 증폭할 수 없음을 나타낸다.
도 6b의 경우 모든 열에서 PCR 생성물 밴드가 나타났다. 즉, 본 발명의 실시예에서 제조된 kj-Apn DNA 중합효소는 최대 8.4Kb까지의 PCR 생성물을 증폭할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 6c의 경우 제 5열 및 제 6열의 PCR 생성물의 밴드는 발견되지 않았다. 즉, Taq DNA 중합효소의 경우 7.3Kb 이상의 PCR 생성물은 PCR 반응으로 증폭할 수 없음을 나타낸다.
상기한 실험을 통해 본 발명에서 제조된 kj-Apn DNA 중합효소가 가장 우수한 연속성을 지니는 것으로 판명되었다.
본 발명의 효과는 에어로파이룸 퍼닉스(Apn) DNA 중합효소 유전자를 PCR을 통하여 대량 복제하고 이를 발현벡터에 클로닝한 후 뉴클레오타이드 서열을 분석한 후, 이 발현된 DNA 중합효소를 사용하여 PCR함으로서 신규한 중합효소를 제공하는 것이다. 이 효소는 열안정성 및 연속성이 현저히 향상된 DNA 중합효소임을 확인하였다.

Claims (4)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 지니는 열안정성 및 연속성이 우수한 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리한 DNA 중합효소
  2. 제 1항의 DNA 중합효소를 코딩시키는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 지닌 cDNA 유전자
  3. 서열번호 2의 cDNA 유전자를 함유한 발현벡터를 조립한 후, 상기 발현벡터를 대장균에 삽입하여 형질전환 대장균을 제조하고, 이를 발현시켜 제 1항의 DNA 중합효소를 제조하는 방법
  4. 제 3항에 있어서, 상기 발현벡터는 pGEX-Apn(7.2kb)임을 특징으로 하는 DNA 중합효소의 제조 방법
KR1020020073380A 2002-11-25 2002-11-25 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법 KR20020093748A (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020020073380A KR20020093748A (ko) 2002-11-25 2002-11-25 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법
AU2003284764A AU2003284764A1 (en) 2002-11-25 2003-11-25 Dna polymerase isolated from aeropyrum pernix and its preparation method
PCT/KR2003/002564 WO2004048563A1 (en) 2002-11-25 2003-11-25 Dna polymerase isolated from aeropyrum pernix and its preparation method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020020073380A KR20020093748A (ko) 2002-11-25 2002-11-25 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020093748A true KR20020093748A (ko) 2002-12-16

Family

ID=27729488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020020073380A KR20020093748A (ko) 2002-11-25 2002-11-25 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20020093748A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725300A (zh) * 2021-03-01 2021-04-30 上海交通大学 一种DNA聚合酶γ及其编码基因、制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000197488A (ja) * 1999-01-06 2000-07-18 Seibutsu Bunshi Kogaku Kenkyusho:Kk 新規ｄｎａポリメラ―ゼ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000197488A (ja) * 1999-01-06 2000-07-18 Seibutsu Bunshi Kogaku Kenkyusho:Kk 新規ｄｎａポリメラ―ゼ

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA Res. 1999 Apr 30;6(2):83-101, 145-52., Aeropyrum pernix K1의 염기 서열] *
Int J Syst Bacteriol. 1996 Oct;46(4):1070-7., *
J Bacteriol. 1999 Oct;181(19):5984-92 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725300A (zh) * 2021-03-01 2021-04-30 上海交通大学 一种DNA聚合酶γ及其编码基因、制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7045328B2 (en) Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5489523A (en) Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5545552A (en) Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US20050282171A1 (en) Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
JPH1189588A (ja) 変性キメラｄｎａポリメラーゼ
US5866395A (en) Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
CN114561372B (zh) Bst DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌
US8183023B2 (en) Thermus egertssonii DNA polymerases
US20110104761A1 (en) Thermostable dna polymerase from palaeococcus helgesonii
US7981653B2 (en) Highly efficient hyperthermophilic DNA ligase
KR101303990B1 (ko) 써모코커스 파시피쿠스 균주 유래의 ｄｎａ 중합효소 유전자 변이체들 및 이의 이용
KR100777230B1 (ko) 써모코커스 유래 돌연변이 ｄｎａ 중합효소들 및 그의유전자들
KR20020093748A (ko) 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 디엔에이 중합효소 및그의 제조방법
KR100562688B1 (ko) 에어로파이룸 퍼닉스에서 분리된 변이 디엔에이 중합효소 및 그의 제조방법
US20090209005A1 (en) Chimeric dna polymerase
JP5324083B2 (ja) 高反応性耐熱性ｄｎａリガーゼ
US20110020896A1 (en) Mutant dna polymerases and their genes
KR100969477B1 (ko) 써모코커스 구아이마센시스 균주 유래 내열성 ｄｎａ중합효소 및 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 방법
KR101241769B1 (ko) 써모코커스 씰러리크레센스 균주 유래의 ｄｎａ 중합효소 및 돌연변이 써모코커스 씰러리크레센스 ａ７５２ｋ/ｎ２１３ｄ ｄｎａ 중합효소와 이들의 이용
JP4714848B2 (ja) Ｄｎａポリメラーゼ変異体
KR101296882B1 (ko) 써모코커스 와이오타푸엔시스 균주 유래의 ｄｎａ 중합효소 변이체들 및 이의 이용
WO2004048563A1 (en) Dna polymerase isolated from aeropyrum pernix and its preparation method
KR101142950B1 (ko) 써모코커스 마리너스 균주 유래의 내열성 ｄｎａ 중합효소 및 이의 이용
KR100586623B1 (ko) 초고온성 고세균 스태필로써머스 마리너스 유래의 신규한내열성 디엔에이 중합효소
KR100372777B1 (ko) 아퀴펙스 파이로필러스로부터 분리된 내열성 디엔에이중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application