KR101303990B1 - 써모코커스 파시피쿠스 균주 유래의 ｄｎａ 중합효소 유전자 변이체들 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaeon) 써모코커스 파시피쿠스 (Thermococcus pacificus) 균주 유래의 돌연변이 DNA 중합효소들과 이들의 이용에 관한 것으로, 특히 돌연변이체 Tpa -S N213D, Tpa -S K501R, Tpa -S N213D/K501R DNA 중합효소의 PCR 응용에 관한 것이다. 본 발명은 Tpa -S DNA 중합효소의 특정 부위에 돌연변이 시킨 Tpa -S N213D, Tpa -S K501R, Tpa -S N213D/K501R DNA 중합효소, 제조방법, 이를 포함하는 키트, 재조합 벡터 및 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 Tpa-S N213D DNA 중합효소, Tpa-S K501R DNA 중합효소 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 기존의 Tpa DNA 중합효소 및 Tpa-S DNA 중합효소와 비교하여 PCR 증폭효율이 월등히 향상된 효과를 보였으며, PCR에서 높은 DNA 증폭량과 증폭속도를 가지므로 유전자 진단 등의 다양한 PCR 반응에 널리 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

써모코커스 파시피쿠스 균주 유래의 ＤＮＡ 중합효소 유전자 변이체들 및 이의 이용 {Thermococcus pacificus DNA polymerase variant, and uses thereof}
본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaeon) 써모코커스 파시피쿠스 (Thermococcus pacificus) 균주 유래의 돌연변이 DNA 중합효소들 및 이들의 이용에 관한 것으로, 특히 돌연변이체 Tpa -S N213D, Tpa -S K501R 및 Tpa -S N213D/K501R DNA 중합효소의 PCR 응용에 관한 것이다.
DNA 중합효소 (deoxyribonucleic acid polymerase, DNA polymerase, E.C. number 2.7.7.7)는 주형 DNA (template DNA)에 의존하여 5′→3′ 방향으로 DNA를 합성하는 효소로서, 생명체에 있어 DNA 복제 (DNA replication)나 수리 (DNA repair)시에 가장 중요한 역할을 하는 효소이다 (참조: Lehninger, A. L. et al., 1993, Principles of biochemistry, 2 nd ed., Worth Publishers). DNA 중합효소는 1957년 콘버그 (Kornberg)등에 의해 대장균에서 최초로 발견되었으며, 현재의 대장균 DNA 중합효소Ι이다 (참조: Kornberg, A. and Baker, T., 1992, DNA replication, 2 nd ed., Freeman Company). 이 대장균 DNA 중합효소 Ι(Escherichia coli DNA polymerase Ι, E. coli DNA polymeraseΙ)은 5′→3′핵산말단 가수분해효소 활성 (5′→3′exonuclease activity), 교정 활성 (proofreading activity)이라 불리는 3′→ 5′핵산말단 가수분해효소 활성 (3′→ 5′exonuclease activity) 및 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)인 5′→3′ 중합효소 활성 (5′→3′polymerase activity)을 함께 갖고 있다.
내열성 DNA 중합효소는 1976년 치엔 (Chien) 등에 의해 고온균인 써머스 아쿠아티커스 와이티-1 (Thermus aquaticus YT-1)에서 최초로 분리된 이후, 같은 써머스 속 (genus)에 속하는 써머스 플라버스 (Thermus flavus), 써머스 써모필러스 에이치비8 (Thermus thermophilus HB8)등에서 분리되어 그 특성들이 밝혀졌으나, 그 당시에는 그다지 주목을 받지 못했다 (참조: Chien, A. et al ., 1976, J. Bacteriol . 127, 1550-1557; Kaledin, A. S. et al., 1981, Biokhimiya 46, 1576-1584; Ruettimann, C. et al ., 1985, Eur . J. Biochem. 149, 41-46). 그러나 1988년 사이키 (Saiki)등에 의해 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR 기술이 개발 (참조: Saiki, R. K. et al., 1988, Science 239, 487-491)되면서 내열성 DNA 중합효소가 주목을 받기 시작하여, 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilus GK24), 써머스 필리포미스 (Thermus filiformis) 등의 고온성 세균외에도 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 써모코커스 마리너스 (Thermococcus marinus), 써모코커스 구아이마센시스 (Thermococcus guaymasensis), 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus), 나노아케움 이퀴탄스 (Nanoarchaeum equitans) 및 파이로코커스 워세이 (Pyrococcus woesei) 등의 초고온성 고세균들로부터 내열성 DNA 중합효소가 경쟁적으로 연구 개발되었다 (참조: Park, J. H. et al ., 1993, Eur . J. Biochem . 214, 135-140; Jung, S. E. et al ., 1997, Mol . Cells 7, 769-776; Kong, H. et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 168(3) 1965-1975; Bae, H. et al., 2009, Extremophiles 13, 657-667; Lee, J. I. et al., 2009, Enzyme and Microbial Technology 45, 103-111; Lundberg, K. S. et al ., 1991, Gene 108, 1-6; Choi, J. J. et al., 2008, Appl . Environ . Microbiol. 74, 6563-6569; Dabrowski, S. and Kur, J., 1998, Protein Expres . Purif . 14, 131-138). 특히, 고세균 써모코커스와 파이로코커스 속 균주 유래 DNA 중합효소들은 써머스 속 균주 유래 DNA 중합효소들과는 달리 교정 활성을 갖는 내열성 DNA 중합효소들이라는 점에서 더욱 주목을 받아왔으며, 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 사용되고 있다.
PCR은 DNA 중합효소와 프라이머 (primer)를 이용하여 극미량의 주형 DNA를 대량 증폭시키는 기술로서, DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 40-65℃) 및 DNA 합성 (DNA extension, 72℃)의 3단계 과정을 연속적으로 20-30회 반복하게 된다. 따라서 PCR 반응 특성상 고온을 필요로 하기 때문에 가장 중요한 요소가 내열성 DNA 중합효소이다 (참조: Erlich H. A. et al ., 1989, Stockton Press 193-208). 내열성 DNA 중합효소는 PCR에 의한 유전자의 확인 및 증폭, DNA 염기서열 결정, 임상진단 등에 있어 매우 유용한 효소로서, 분자생물학 및 유전공학연구를 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 사용되고 있으며, 그 수요가 날로 증가하고 있다.
본 발명자는 고세균인 써모코커스 파시피쿠스 유래의 DNA 중합효소 (Tpa DNA 중합효소)와 이 Tpa DNA 중합효소의 C-말단에 설포로버스 솔파타리커스 유래의 DNA 결합 단백질(Sulfolobus solfataricus DNA binding protein, Sso7d)을 결합시킨 Tpa -S DNA 중합효소의 특성과 PCR 응용에 대한 연구 결과를 최근에 발표하였다 (Lee, J. I. et al., 2010, Enzyme and Microbial Technology 47, 147-152). PCR 반응에서 Tpa -S DNA 중합효소는 야생형인 Tpa DNA 중합효소 보다 DNA 증폭 속도면에서 월등히 우수하지만 상업용 DNA 중합효소들 보다 DNA 증폭량이 낮다는 단점이 있다. 따라서 증폭 속도를 우수하게 유지시키면서 DNA 증폭량을 높이는 DNA 중합효소의 개발이 요구되었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위한 것으로, Tpa-S DNA 중합효소의 특정 부위에 돌연변이 시킨 Tpa-S N213D DNA 중합효소, Tpa-S K501R DNA 중합효소 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소, 이의 제조방법, 이를 포함하는 키트, 재조합 벡터 및 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, DNA 중합효소를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터가 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는, 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 숙주세포가 대장균 (Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는, 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는, PCR(Polymerase chain reaction) 수행방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 DNA 중합효소 제조방법을 제공한다.
1) 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합벡터를 숙주세포로 형질전환 시키는 단계;
3) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
4) 상기 형질전환체부터 단백질을 회수하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 방법에서 회수한 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는, DNA 중합효소 제조방법을 제공한다.
본 발명의 Tpa-S N213D DNA 중합효소, Tpa-S K501R DNA 중합효소 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 기존의 Tpa DNA 중합효소 및 Tpa-S DNA 중합효소와 비교하여 PCR 증폭효율이 월등히 향상된 효과를 보였다. 따라서 본 발명의 Tpa-S N213D DNA 중합효소, Tpa-S K501R DNA 중합효소 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 PCR에서 높은 DNA 증폭량과 증폭속도를 가지므로 유전자 진단 등의 다양한 PCR 반응에 널리 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pTPAS/213D/501R의 구축 과정을 나타낸 것이다.
도 2에서 도 2-A는 대장균 내에서 발현된 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 정제 단계에 따른 SDS 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이며, 도 2-B는 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 정제 방법과 동일하게 정제하여 총 5가지의 Tpa DNA 중합효소의 정제정도를 비교한 것이다. [lane 1은 야생형 Tpa DNA 중합효소, lane 2는 Tpa-S DNA 중합효소, lane 3은 Tpa-S N213D DNA 중합효소, lane 4는 Tpa-S K501R DNA 중합효소, lane 5는 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소이다.]
도 3은 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 있어 pH, MgCl2, KCl에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소들을 이용하여 최적 PCR 완충용액 하에서 중합효소 연쇄반응 (PCR)에서 증폭 가능 길이를 조사하고자 10, 30, 60초의 증폭시간으로 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 도4의 전기영동 아가로스 겔을 바탕으로 각 증폭길이에서의 PCR 증폭량의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6는 Pfu DNA 중합효소(Pfu), Vent DNA 중합효소(Vent), Tpa-S, Tpa-S N213D, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소들를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 Tpa-S DNA 중합효소의 DNA 증폭량을 향상시킨 DNA 중합효소를 개발하기 위하여 노력한 결과, 특정부위에 돌연변이 시킨 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소가 PCR 반응에서 DNA 증폭효율이 가장 우수하고 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 Tpa-S N213D DNA 중합효소는 Tpa-S DNA 중합효소의 213번째 아스파라진(Asn)를 아스파틱산으로 돌연변이를 일으킨 것이며, Tpa-S K501R DNA 중합효소는 Tpa-S DNA 중합효소의 501번째 라이신(Lys)을 알지닌(Arg)으로 돌연변이를 일으킨 것이며, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 Tpa-S DNA 중합효소의 213번째 아스파라진(Asn)를 아스파틱산 및 501번째 라이신(Lys)을 알지닌(Arg)으로 각각 이중 돌연변이 (double mutation)를 일으킨 것이다.
본 발명에 사용되는 DNA 중합효소의 유전자 및 아미노산 서열을 서열목록으로 첨부하였다. 구체적인 서열은 하기의 표1에 나타내었다.
서열번호 서열
1 야생형 Tpa DNA 중합효소 유전자 서열
2 Tpa-S DNA 중합효소 유전자 서열
3 Tpa-S N213D DNA 중합효소 유전자 서열
4 Tpa-S K501R DNA 중합효소 유전자 서열
5 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소 유전자 서열
6 Sso 7d DNA 결합단백질 유전자 서열
7 야생형 Tpa DNA 중합효소 아미노산 서열
8 Tpa-S DNA 중합효소 아미노산 서열
9 Tpa-S N213D DNA 중합효소 아미노산 서열
10 Tpa-S K501R DNA 중합효소 아미노산 서열
11 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소 아미노산 서열
12 Sso 7d DNA 결합단백질 아미노산 서열
구체적으로, 50 mM Tris-HCl (pH 8.8) / 2.0 mM MgCl2 / 140 mM KCl 로 구성된 PCR 반응 완충용액 하에서 본 발명의 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소와 주형으로 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과 효율적으로 DNA 증폭이 일어났다. 또한, 상기 PCR 완충용액들 하에서 Tpa-S DNA 중합효소와 이들 돌연변이체들을 이용하여 PCR을 수행해 본 결과, 돌연변이체인 Tpa -S N213D/K501R DNA 중합효소는 Tpa -S DNA 중합효소보다 PCR 효율이 월등히 우수하여 2kb의 DNA를 10초에서도 증폭이 가능하였고, 증폭량도 월등히 증가하였다 (도 4 및 도 6). 특히 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 상업화된 Pfu DNA 중합효소와 Vent DNA 중합효소에 비교하여 짧은 시간내에 2kb의 DNA를 효율적으로 증폭하였다 (도 6). 또한, PCR시 시중에 판매되고 있는 Pfu DNA 중합효소와 동등한 에러율을 갖는 높은 충실도 (fidelity)를 나타내었다 (표 3).
본 발명은 하나 이상의 위치에서 일부 서열의 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 부가 또는 이들의 조합에 의하여 돌연변이형의 Tpa-S DNA 중합효소의 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지는 단백질 변이체를 본 발명의 범주에 포함한다. 또한, 본 발명의 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 인산화, 황화, 아크릴화, 당화, 메틸화, 파네실화 등으로 수식된 형태를 본 발명의 범주에 포함한다.
상기 변이체 또는 수식체는 야생형 단백질과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물이거나 물리 화학적 성질이 증가 또는 감소된 형태일 수 있다. 예를 들어, 효소활성이 증대된 변이체이다. 또는, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로테아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다.
본 발명은 상기 핵산 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열도 본 발명의 범주에 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터란 핵산분자의 일종으로, 또 다른 핵산과 결합하여 숙주세포로 이송되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터이다. 본 발명은 Tpa-S DNA 중합효소의 213번째 아스파라진(Asn)를 아스파틱산으로, 501번째 라이신(Lys)을 알지닌(Arg)으로 이중 돌연변이 (double mutation)를 일으킨 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 발현하는 pTPAS/213D/501R인 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터들로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 형질전환 될 수 있는 숙주세포로 사용가능한 미생물은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli), 로도코커스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 시폴러버스 (Syfolobus), 써모플라즈마 (Thermoplasma), 써모프로테우스 (Thermoproteus) 등의 다양한 미생물을 포함한다. 바람직하게는 대장균으로, 대장균 XL1-blue, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101 등을 예로 들 수 있다.
구체적으로 본 발명은, pTPAS/213D/501R로 형질전환된 미생물인 대장균(Escherichia coli ) BL21-CodonPlus(DE3)-RIL /pTPAS/213D/501R를 포함한다. (Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL /pTPAS/213D/501R은 국립농업과학원 농업유전자원센터의 KACC(Korean Agricultural Culture Collection, 수원시 권선구 서둔동 88-20)에 2012년 1월 27일자로 기탁되었다.)
숙주세포로의 벡터 도입은 전기충격유전자전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, PEG, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 핵산 증폭 반응의 키트 성분으로 사용될 수 있다. 이런 핵산 증폭 반응에는 PCR(polymerase chain reation), LCR(ligase chain reaction), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), 3SR(self-sustained sequence replication), SDA(strand displacement amplification), 브랜치드 DNA 시그널 증폭(branched DNA signal amplification), 네스티드 PCR(nested PCR), 멀터플렉스 PCR (multiplex PCR) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 반응용 키트는, 상기 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소 외에도 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 키트는 검출 프라이머를 포함하는 용기, 증폭반응 튜브 또는 컨테이너, 반응 완충액, dNTPs, RNase 및 멸균수 등에서 선택되는 1 이상의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 Tpa-S N213D, Tpa-s K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전공학 및 분자생물학 실험, 임상진단, 법의학적 연구 등의 다양한 분야에서 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 Tpa-S N213D, Tpa-s K501R 및Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 Tpa-S N213D, Tpa-s K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 천연 기원의 공급원으로부터 분리하여 제조하는 방법, 화학적 합성하는 방법 또는 Tpa-S N213D, Tpa-s K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 코딩하는 벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 발현시킨 후 이로부터 분리하는 방법 등으로 제조 가능하다.
Tpa-S N213D, Tpa-s K501R 및 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 효율적으로 발현할 수 있는 발현 벡터를 제조하고 이를 미생물에서 발현시키는 시스템은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 다양하게 변형/응용하여 구현할 수 있다. 이런 구현의 한 예는 하기와 같다.
Tpa-S N213D/K501R 중합효소는 (i) Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 발현하는 벡터를 제조하는 단계; (ii) 상기 벡터를 미생물로 형질전환 시키는 단계; (iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (iv) 상기 형질전환체부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다.
단계 (i)에서 벡터 종류, 단계 (ii)에서 벡터를 형질전환 시키는 방법 및 숙주 세포로 사용되는 미생물의 종류는 상기에서 살펴본 바와 같다.
단계 (iii)의 배양 과정은 형질전환체로 사용되는 미생물의 종류에 널리 공지된 방법에 따라 수행되고 배지성분, 배양온도 및 배양시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다. 구체적으로, 배양 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등과 같은 미생물의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함한다. 배지의 pH를 적절히 조정할 수 있고, 항생제 등의 성분을 포함할 수 있다.
또한, 이소프로필 베타 디 티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 이하 IPTG라고 함)등의 유도제 (inducer)를 처리하여 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 처리되는 유도제의 종류는 벡터 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 유도제 투여시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.
단계 (iv)에서 단백질은 통상의 방법으로 회수 및 정제된다. 예를 들어, 원심분리 방법으로 회수한 세포를, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등을 이용하여 파쇄 한다. 배양액으로 단백질이 분비되는 경우에는 배양 상등액을 수집한다. 과발현에 의해 응집되는 경우, 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다. 글루타티온, 디티오트레이톨, β-머캅토에탄올, β-머캅토메탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템을 사용하고 요소, 구아니딘, 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용한다. 재폴딩제와 함께 염의 일부를 사용할 수 있다.
이 때, 70℃ 내지 85℃에서 10분 내지 60분간 열처리하는 공정을 추가할 수 있다.
형질전환체를 배양하여 수득한 단백질은 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들면 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피에는 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등이 있다.
상기 단백질의 제조 공정상의 스케일은 목적에 맞도록 조절할 수 있다. 또한, 각 공정 사이에는 추가 및 부과 공정을 둘 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 단백질이 유리체로 얻어진 경우에는 공지된 방법에 의해 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 공지된 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시에서는 배양한 세포를 원심 분리하여 균체를 회수한 다음, 초음파로 파쇄하고 열처리 후 HiTrapTM Heparin HP column 컬럼 (GE Healthcare)과 HisTrapTM HP 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 공정으로 획득하였다.
상기 공정으로 획득한 단백질은 자연적으로 발생한 환경과 구별되는 물리적 환경에 다른 단백질로부터 충분히 분리된 실질적으로 순수한 상태로 존재한다. 상기 방법으로 제조된 단백질은 분자생물학 및 유전공학 실험을 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 우수한 DNA 중합 활성을 가지는 내열성 효소로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 돌연변이 Tpa DNA 중합효소 유전자들의 제조
본 발명자들은 Tpa DNA 중합효소와 Tpa -S DNA 중합효소의 특성과 PCR 응용에 대한 연구 결과를 최근에 발표하였으며, Tpa DNA 중합효소 유전자가 pET-20b(+)에 삽입된 발현벡터의 명칭은 pEPAPOL이고, Tpa-S DNA 중합효소 유전자가 pET-20b(+)에 삽입된 발현벡터의 명칭은 pEAPS이다 (Lee, J. I. et al., 2010, Enzyme and Microbial Technology 47, 147-152). 퀵체인지 점 돌연변이 유발방법 (QuikChange® site-directed mutagenesis method)을 이용하여, pEAPS plasmid내에 삽입되어 있는 Tpa -S DNA 중합효소 유전자에 아래와 같이 점 돌연변이 (point mutation)를 유발하였다 (참조: Stratagene사의 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit의 제품사용 매뉴얼). 결과적으로 Tpa-S DNA 중합효소의 213번째 아미노산인 아스파라진을 아스파틱산으로 변이된 Tpa-S N213D, 501번째 아미노산인 라이신이 알지닌으로 변이된 Tpa-S K501R 그리고 213번 아스파틱산과 501번 알지닌이 동시에 변이된 Tpa-S N213D/K501R 서열을 각각 갖는 Tpa DNA 중합효소의 돌연변이체등이 될 것이다. Tpa-S DNA 중합효소 유전자로부터 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R 돌연변이 중합효소 유전자를 얻기 위한 프라이머들은 표 1에 나타냈다. PCR은 0.05 ㎍ pEAPS와 20 pmole의 5´말단 프라이머 및 3´말단 프라이머 (표 1), 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 이루어진 혼합 조성액을 95℃에서 30초간 반응시킨 후 94℃ 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 7분의 조건으로 12회 반복한 후, 마지막 68℃에서 10분간 반응시켰다. 원래의 주형 DNA를 제거하기 위해 메틸레이티드 DNA (methylated DNA)만 특이적으로 절단하는 제한효소 DpnI을 37℃ 1시간 처리한 후, 절단되지 않은 PCR에 의해 증폭된 돌연변이 DNA (PCR 산물은 메틸레이티드 되지 않음)를 대장균에 형질전환시켰다. DNA 시퀀싱에 의해 재조합 벡터에 클로닝 된 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들이 정확하게 치환된 것을 확인하였다. 이것을 대장균 Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Stratagene, USA)에 각각 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 상기와 같이 구축된 Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 및 Tpa-S N213D/K501R 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 pTPAS/213D, pTPAS/501R, pTPAS/213D/501R로 각각 명명하였다. 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 각각 형질전환 시킨 후 돌연변이체 중합효소들을 발현시켜 정제한 후, PCR을 수행한 결과 이들 돌연변이체중 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소가 매우 효과적으로 타캣 DNA를 증폭하였다. 따라서 pTPAS/213D/501R 유전자를 포함하는 발현벡터 및 발현벡터를 포함한 대장균을 국립농업과학원 농업유전자원센터에 (2012년 1월 27일에 기탁유전자명은 Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL /pTPAS/213D/501R, 기탁번호 KACC95115P)로 기탁하였다.
본 발명에서 돌연변이체 제조에 사용된 프라이머 서열
돌연변이체
이름		 아미노산
치환위치		 돌연변이 프라이머 서열 서열번호
N213D
 Asn→Asp
 Forward : 5'-CCTACAACGGCGACGACTTCGACTTCGC-3' 13
Reverse : 5'-GCGAAGTCGAAGTCGTCGCCGTTGTAGG-3' 14
K501R
 Lys→Arg
 Forward : 5'-CTACGGCTACGCACGTGCCCGCTGG-3' 15
Reverse : 5'-CCAGCGGGCACGTGCGTAGCCGTAG-3' 16
실시예 2: 재조합 Tpa -S N213D / K501R DNA 중합효소 유전자 및 다른 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들의 발현 및 정제
상기 실시 예 1의 방법에 의해 대장균에 형질전환시킨 재조합 균주 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pTPAS/213D/501R, E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pTPAS/213D, E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/ pTPAS/501R를 이용하여 아래와 같은 방법으로 발현시킨 후, 동일한 방법으로 각각 정제하였다. 상기 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL를 100 ug/ul 암피실린과 34ug/ul 클로람페니콜이 첨가된 LB 액체 배지에 각각 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음 5 ml을 같은 배지 500 ml에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.6정도가 되었을 때, IPTG (isopropyl β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 첨가한 이후 하룻밤 동안 배양하였다. 6,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 균체 ( 2.0 g/ wet weight)를 회수한 다음 1 mM PMSF가 포함된 20 ml의 초음파처리 완충액(sonication buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 mM NaCl)에 현탁 하여 초음파로 파쇄한 후 18,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 대장균 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 다음으로 80℃에서 30분간 열처리한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수함으로써 대장균 유래의 단백질들을 대부분 제거하였다. 상기 상층액을 HeparinTM HP 컬럼과 HisTrapTM HP 컬럼 (GE Healthcare)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 최종적으로 정제하였다. 상기와 같이 정제된 DNA 중합효소들은 저장 완충용액 (storage buffer)(20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50 mM KCl, 1mM DTT, 50% Glycerol)에 투석한 다음, -20℃에 보관하면서 효소 특성을 조사할 때와 PCR을 수행할 때 사용되었다. 이중에서 재조합 플라스미드 pTPAS/213D/501R을 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL로부터 DNA 중합효소를 예로들어 각각 정제 단계별로 표 2 와같이 상세히 작성하였다.
대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pTPAS/213D/501R 유래의 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 정제
Total protein
(mg)		 Total activity
(U)		 Specific activity
(U/mg)		 Recovery
(%)
Crude extract 235.64 65497 277.95 100
Heat treatment 132.60 83033 626.19 56.2
HeparinTM HP 39.39 36495 926.5 16.7
HisTrapTM SP HP 31.3 50000 1597.44 13.2
pTPAS/213D/501R 유래의 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 정제 비활성도(specific activity)는 1597.44 U/mg 였다.
pTPAS/213D 유래의 Tpa-S N213D DNA 중합효소의 정제 비활성도(specific activity)는 1413.53 U/mg 였다.
pTPAS/501R 유래의 Tpa-S K501R DNA 중합효소의 정제 비활성도(specific activity)는 1329.14 U/mg 였다.
이 때 1유닛(U)은 75℃에서 30분간 10 nmol의 dNTP가 산불용성 형태로 삽입되기 위해 요구되어 지는 DNA 중합효소의 양으로 정의하였다.
정제 단계별 단백질의 양은 브래드포드 분석(Bradford Assay)을 사용하여 결정하였다 (참조: Bradford M.M., 1976, Anal . Biochem . 72, 248-54). 또한, 변성 겔 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하여 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 정제 단계에 따른 정제 정도 (도 2A 참조)를 확인한 것이다. 도 2A는 pTPAS/213D/501R 유래의 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 DNA 중합효소의 정제과정으로 lane 1은 IPTG 유도 (induction)를 하지 않고 배양한 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pTPAS/213D/501R 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 2는 IPTG 유도를 하여 배양한 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pTPAS/213D/501R 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 3은 80℃에서 30분간 열처리한 후의 시료, lane 4는 HeparinTM HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 5는 HisTrapTM HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료이다. 정제과정을 통해 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 DNA 염기서열로부터 환산된 분자량 (MW: 97,550.037 Da)과 유사한 약 97,000Da으로 확인되었다.
도 2B는 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 정제 방법과 동일하게 정제한 야생형 Tpa DNA 중합효소, Tpa -S DNA 중합효소, Tpa-S N213D DNA 중합효소, Tpa-S K501R DNA 중합효소, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 총 5가지의 Tpa DNA 중합효소의 정제정도를 확인한 것이다. 1번 lane은 야생형 Tpa DNA 중합효소, 2번 lane은 DNA 결합 단백질을 fusion 시킨 Tpa -S DNA 중합효소, 3번 lane은 Tpa-S N213D DNA 중합효소, 4번 lane은 Tpa-S K501R DNA 중합효소, 5번 lane은 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소이다.
실시예 3: Tpa -S N213D / K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR 의 최적 조건 결정
내열성 DNA 중합효소의 PCR의 이용을 위해서는 가장 중요한 것이 최적 PCR 완충액 (PCR buffer)의 조성을 결정하는 것이다. PCR 완충용액의 조성을 결정하기 위해 완충용액의 최적 pH, 최적 MgCl2 농도, 최적 KCl 농도를 우선적으로 결정하는 것이 가장 중요하다. 이들 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성을 결정하기 위해, 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR에 있어서의 각각의 효소들의 최적 PCR 완충용액의 조성을 결정할 때에는 기본 PCR 완충용액의 pH 또는 각 성분의 농도를 다르게 하여 수행하였다. PCR 수행시에는 기본 PCR 완충용액에 주형으로 25 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA와 20 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 각각의 프라이머, 200 μM dNTPs 및 0.5 유닛의 정제된 DNA 중합효소(상기 실시 예 2 참조)를 공통으로 첨가하고, 이 반응 혼합물을 94℃에서 50초 반응시킨 후, 94℃ 10초, 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막 72℃에서 1분간 반응시켰다. 그 후 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과를 확인하였다.
Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 pH에 따른 DNA 증폭량을 조사한 결과 50 mM Tris-HCl, pH 8.8에서 최적 DNA 증폭량을 보였다. Tpa-S N213D DNA 중합효소의 경우, 50 mM Tris-HCl, pH 8.4에서 최적 DNA 증폭량을 보였다. Tpa-S K501R DNA 중합효소의 경우, 50 mM Tris-HCl, pH 8.6에서 최적 DNA 증폭량을 보였다. 도 3에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 pH를 나타낸 것이다. PCR 증폭 크기는 2kb이다.
Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 2가 양이온 Mg2 +의 영향을 조사한 결과, 최적 농도는 2.0 mM이었다 (도 3 참조). Tpa-S N213D DNA 중합효소의 최적 Mg2 + 농도는 1.5 mM이었다. Tpa-S K501R DNA 중합효소의 최적 Mg2 + 농도는 1.5 mM이었다. 도 3에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 MgCl2 농도를 나타낸 것이다.
Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 KCl의 영향을 조사한 결과, 최적 KCl 농도는 140 mM 이었다 (도 3 참조). Tpa-S N213D DNA 중합효소의 최적 KCl 농도는 100 mM 이었다. Tpa-S K501R DNA 중합효소의 최적 KCl 농도는 70 mM 이었다. 도 3에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 KCl 농도를 나타낸 것이다.
상기 결과들을 통해 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 반응 혼합액의 조성은 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 140 mM KCl, 2.0 mM MgCl2로 결정하였다. Tpa-S N213D DNA 중합효소의 최적 PCR 반응 혼합액의 조성은 50 mM Tris-HCl (pH 8.4), 100 mM KCl, 1.5 mM MgCl2로 결정하였다. Tpa-S K501R DNA 중합효소의 최적 PCR 반응 혼합액의 조성은 50 mM Tris-HCl (pH 8.6), 70 mM KCl, 1.5 mM MgCl2로 결정하였다.
실시예 4: Tpa -S N213D / K501R DNA 중합효소를 이용한 최단 증폭 시간에서의 PCR 효율 비교
25 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 각각 20 pmole의 5´ 말단 및 3´ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 각각의 중합효소의 최적 PCR 완충용액 및 정제한 중합효소를 각각 첨가한 반응 혼합물을 이용하여 PCR의 최단 증폭 시간을 조사하고자 증폭 시간에 따라 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 94℃에서 50초 반응시킨 후, 94℃에서 10초, 72℃에서 10, 30 및 60초로 반응시켰다. PCR 반응이 끝난 다음, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 하여 PCR 결과를 확인한 결과, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 10초부터 10kb 합성이 뚜렷하게 가능하였다. PCR에 있어서 타겟 DNA의 증폭범위는 Tpa-S, Tpa-S N213D, Tpa-S K501R 와 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소가 거의 비슷하지만 전 범위의(1kb-12kb) 타겟 DNA 증폭량은 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소가 월등히 향상되었다 (도 4 참조). 도 4에서 lane은 증폭사이즈 (Kb)를 나타내고, M은 GeneRuler™ 1kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다. PCR에 사용된 primer는 아래의 표3에 나타내었다.
Forward Primers ( Anchors )
Target Size ( kb ) Primer Name Primer Sequence λ DNA Sequence ( bp ) 서열번호
2 - 15 λ-F1 5' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGCAGTGC - 3' 30352-30377 17
Reverse Primers
Target Size ( kb ) Primer Name Primer Sequence DNA Sequence ( bp ) 서열번호
2 λ-2R 5' - CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG - 3' 32326-32349 18
4 λ-4R 5' - CCAGGACTATCCGTATGACTACG - 3' 34286-34315 19
6 λ-6R 5' - GAGATGGCATATTGCTACGCAAGA - 3' 36339-36363 20
8 λ-8R 5' - GCCTCGTTGCGTTTGTTTGCACG- 3 38374-38397 21
10 λ-10R 5' - GCACAGAAGCTATTATCCCTCCCCAGG - 3' 40316-40343 22
12 λ-12R 5' - TCTTCCTCGTGCATCGAGCTATTCGG - 3' 42409-42434 23
또 DNA 증폭량을 측정하기 위해 도 4의 전기영동을 바탕으로 Quantity one DNA 량 측정 프로그램 (Bio-rad)를 이용하여 측정한 결과를 도 5에 그래프로 도시하였다. 도 5에서도 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소의 타겟 DNA 증폭량 (1kb-12kb)이 다른 변이체 DNA 중합효소들 보다 월등히 향상되었음을 알 수있다.
또한 야생형 Tpa DNA 중합효소 및 돌연변이형 Tpa-S 유래 DNA 중합효소들과 상업화된 Pfu, 및 Vent DNA 중합효소을 이용하여 PCR의 최단 증폭 시간을 조사하고자 증폭 시간에 따라 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 25 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 각각 20 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 각각의 중합효소 및 최적 PCR 완충용액을 첨가한 반응 혼합물을 이용하여 94℃에서 50초 가열시킨 후, 94℃에서 10초, 72℃에서 10, 30, 60초로 반응시켰다. PCR 반응이 끝난 다음, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 하여 PCR 결과를 확인한 결과, Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR의 경우 60초 이상일때부터 2 kb 합성이 가능한 것에 비해 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소는 10초에 2 kb 합성이 가능함을 확인할 수 있었고, Tpa-S, Pfu와 Vent DNA 중합효소보다 증폭량이 월등히 많은 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조). M은 GeneRuler™ 1kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다.
실시예 5: Tpa -S N213D / K501RDNA 중합효소를 이용한 PCR 에 있어서의 정확성 조사
Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 PCR 정확성 (PCR fidelity)은 룬드버그 (Lundberg)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Lundberg et al., 1991, Gene 108(1), 1-6). 실제, 실험에서는 Song 등과 Choi 등의 사용한 방법과 동일한 방법으로 측정하였으며, 동일한 발현벡터 pJR2-lacZ (5.7 Kb)와 primers를 사용하였다 (참조: Song J. M. et al., 2007, Enzyme Microbe . Technol. 40, 1475-1483; Choi J. J. et al., 2008, Appl . Environ . Microbiol. 74, 6563-6569). 먼저, lacZ 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pJR2-lacZ의 5' 부분의 832 bp 단편을 야생형 Tpa DNA 중합효소 및 돌연변이형 Tpa-S 유래 DNA 중합효소들를 이용하여 효소의 최적 PCR 완충용액에서 각각 증폭시켰다. 이 때, 이미 상품으로 나와 있는 DNA 중합효소들을 사용하여 동일하게 PCR을 수행함으로써 나중에 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR의 변이빈도의 결과와 비교할 수 있도록 하였다. 다음으로, 상기 PCR 증폭산물들을 제한효소 BamHI과 ClaI으로 각각 절단한 다음, 동일한 제한효소들로 절단된 상기 발현벡터에 재삽입 시킨 후, 전기충격유전자전달법 (electroporation)으로 대장균에 형질전환 시키고, 선별을 위한 항생제 암피실린 및 IPTG와 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)이 포함된 아가 플레이트 배지에 고르게 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 아가 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 보관한 후, 파란색 콜로니 (blue colony)와 흰색 콜로니 (white colony)의 수를 센 다음, 이를 바탕으로 돌연변이 빈도 (mutation frequency)와 에러율을 계산하였다. 그 결과는 하기의 표 4와 같으며, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 PCR 정확성은 Pfu DNA 중합효소에 비해서는 거의 동일 하였으며, 일반적인 PCR에 주로 이용되어지는 Taq DNA 중합효소에 비해서는 월등히 높으며 Tpa-S DNA 중합효소 보다도 향상된 효과를 확인할 수 있었다. 따라서 Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소가 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 이용되어질 수 있음을 확인하였다.
야생형 Tpa , Tpa-S, Tpa-S N213D, Tpa-S K501R, Tpa-S N213D/K501R DNA 중합효소와 Taq 및 Pfu DNA 중합효소와의 PCR 산물의 에러율 (error rate) 비교
The number of colonies Mutation frequencya Template doublingb Error ratec
(x 10-5)		 Fold improvement over Taq
White Blue
Tpa 293 2544 0.103 3.91 3.16 2.50
Tpa-S 441 3675 0.107 4.19 3.07 2.57
Tpa-S N213D 777 4218 0.155 5.55 3.36 2.35
Tpa-S K501R 560 4480 0.111 4.80 2.78 2.84
Tpa-S N213D/K501R 791 5650 0.122 5.28 2.79 2.83
Pfu 627 5643 0.100 4.45 2.70 2.92
Taq 2204 3116 0.414 6.03 7.90 1
a Mutation frequency(돌연변이 빈도)는 파란색 콜로니 / (파란색 콜로니+하얀색 콜로니)로 계산 되었다.
b Template doublings는 2 d = PCR 산물 양 / 초기 타켓 양 으로 계산되었다.
c Error rate는 ER = mf / (bp x d)로 계산되었다. 여기서 mf는 mutation frequency이고, bp는 lacZ 타켓 사이즈(=832bp)이고, d는 template이 두배로 늘어난 횟수이다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC95115P 20120127
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, DNA 중합효소.
  2. 제 1항의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  4. 제 2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는, 숙주세포(미생물 수탁번호 : KACC95115P).
  6. 제 1항의 DNA 중합효소를 포함하는 키트.
  7. 제 1항의 DNA 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는, PCR(Polymerase chain reaction) 수행방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, 제 1항의 DNA 중합효소 제조방법:
    1) 제 1항의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 재조합벡터를 숙주세포로 형질전환 시키는 단계;
    3) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    4) 상기 형질전환체부터 단백질을 회수하는 단계.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 방법은 회수한 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는, 제 1항의 DNA 중합효소 제조방법.
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