KR101241769B1 - 써모코커스 씰러리크레센스 균주 유래의 ｄｎａ 중합효소 및 돌연변이 써모코커스 씰러리크레센스 ａ７５２ｋ/ｎ２１３ｄ ｄｎａ 중합효소와 이들의 이용 - Google Patents

써모코커스 씰러리크레센스 균주 유래의 ｄｎａ 중합효소 및 돌연변이 써모코커스 씰러리크레센스 ａ７５２ｋ/ｎ２１３ｄ ｄｎａ 중합효소와 이들의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA 중합 활성(DNA polymerization activity) 및 교정 활성 (proofreading activity)을 모두 가지는 써모코커스 씰러리크레센스 유래의 DNA 중합효소(Thermococcus celericrescens DNA polymerase, Tcel DNA polymerase, 이하 ‘Tcel DNA 중합효소’라고 함) 및 상기 Tcel DNA 중합효소에서 점 돌연변이에 의하여 752번째 아미노산인 알라닌이 라이신으로, 213번째 아미노산인 아스파라진이 아스팔틱산으로 이중 치환된 돌연변이 써모코커스 씰러리크레센스 A752K/N213D DNA 중합효소 (Thermococcus celericrescens A752K/N213D DNA polymerase, TcelA752K/N213D DNA polymerase, 이하 ‘TcelA752K/N213D DNA 중합효소’라고 함)에 관한 것이다.

Description

써모코커스 씰러리크레센스 균주 유래의 ＤＮＡ 중합효소 및 돌연변이 써모코커스 씰러리크레센스 Ａ７５２Ｋ/Ｎ２１３Ｄ ＤＮＡ 중합효소와 이들의 이용{THERMOCOCCUS CELERICRESCENS DNA POLYMERASE AND THERMOCOCCUS CELERICRESCENSE A752K/N213D DNA POLYMERASE AND THEIR USE}
본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaeum) 써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens) 균주 유래의 DNA 중합효소 및 돌연변이 DNA 중합효소와 이들의 이용에 관한 것이다.
DNA 중합효소 (deoxyribonucleic acid polymerase, DNA polymerase, E.C. number 2.7.7.7)는 주형 DNA (template DNA)에 의존하여 5′→3′ 방향으로 DNA를 합성하는 효소로서, 생명체에 있어 DNA 복제 (DNA replication)나 수리 (DNA repair)시에 가장 중요한 역할을 하는 효소이다 (참조: Lehninger, A. L. et al., 1993, Principles of biochemistry, 2 nd ed., Worth Publishers). DNA 중합효소는 1957년 콘버그 (Kornberg)등에 의해 대장균에서 최초로 발견되었으며, 현재의 대장균 DNA 중합효소Ⅰ이다(참조: Konberg, A. and Baker, T., 1992, DNA replication, 2nd ed., Freeman Company). 이 대장균 DNA 중합효소Ⅰ (Escherichia coli DNA polymeraseⅠ, E. coli DNA polymeraseⅠ)은 5′→3′ 핵산말단 가수분해효소 활성 (5′→3′ exonuclease activity), 교정 활성 (proofreading activity)이라 불리는 3′→5′ 핵산말단 가수분해효소 활성 (3′→5′ exonuclease activity) 및 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)인 5′→3′ 중합효소 활성 (5′→3′ polymerase activity)을 함께 갖고 있다. 내열성 DNA 중합효소는 1976년 치엔 (Chien) 등에 의해 고온균인 써머스 아쿠아티커스 와이티-1 (Thermus aquaticus YT-1)에서 최초로 분리된 이후, 같은 써머스 속 (genus)에 속하는 써머스 플라버스 (Thermus flavus), 써머스 써모필러스 에이치비8 (Thermus thermophilus HB8)등에서 분리되어 그 특성들이 밝혀졌으나, 그다지 주목을 받지 못했다 (참조: Chien, A. et al ., 1976, J. Bacteriol . 127, 1550-1557; Kaledin, A. S. et al., 1981, Biokhimiya 46, 1576-1584; Ruettimann, C. et al ., 1985, Eur . J. Biochem. 149, 41-46). 그러나 1988년 사이키 (Saiki)등에 의해 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR 기술이 개발 (참조: Saiki, R. K. et al., 1988, Science 239, 487-491)되면서 내열성 DNA 중합효소가 주목을 받기 시작하여, 현재까지 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus), 나노아케움 이퀴탄스 (Nanoarchaeum equitans), 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilus GK24), 써머스 필리포미스 (Thermus filiformis) 및 파이로코커스 워세이 (Pyrococcus woesei) 등의 여러 고온균 및 초고온성 고세균들로부터 내열성 DNA 중합효소가 경쟁적으로 연구 개발되었다 (참조: Kong, H. et al., 1993, The Journal of Biological Chemistry 168(3) 1965-1975; Lundberg, K. S. et al ., 1991, Gene 108, 1-6; Choi, J. J. et al., 2008, Appl . Environ . Microbiol. 74, 6563-6569; Park, J. H. et al ., 1993, Eur . J. Biochem . 214, 135-140; Jung, S. E. et al ., 1997, Mol . Cells 7, 769-776; Dabrowski, S. and Kur, J., 1998, Protein Expres . Purif . 14, 131-138). 특히, 고세균 써모코커스와 파이로코커스 속 균주 유래 DNA 중합효소들은 써머스 속 균주 유래 DNA 중합효소들과는 달리 교정 활성을 갖는 내열성 DNA 중합효소들이라는 점에서 더욱 주목을 받아왔으며, 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 사용되고 있다.
PCR은 DNA 중합효소와 프라이머 (primer)를 이용하여 극미량의 주형 DNA를 대량 증폭시키는 기술로서, DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 40-65℃) 및 DNA 합성 (DNA extension, 72℃)의 3단계 과정을 연속적으로 20-30회 반복하게 된다. 따라서 반응 특성상 고온을 필요로 하기 때문에, 다양한 PCR 기술의 개발과 발전을 위해 PCR에 있어 가장 중요한 요소인 내열성 DNA 중합효소의 개발이 반드시 이뤄져야 한다 (참조: Erlich H. A. et al., 1989, Stockton Press 193208). 내열성 DNA 중합효소는 PCR에 의한 유전자의 확인 및 증폭, DNA 염기서열 결정, 임상진단 등에 있어 매우 유용한 효소로서, 분자생물학 및 유전공학연구를 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 사용되고 있으며, 그 수요가 날로 증가하고 있다.
현재까지 초고온성 고세균인 써모코커스 씰러리크레센스로부터 DNA 중합효소 유전자의 염기서열이나 전기 유전자가 암호화하는 내열성 DNA 중합효소에 대한 특성과 이 효소의 이용에 대하여 밝혀진 것이 없다. 따라서 본 발명자들은 초고온성 고세균 써모코커스 씰러리크레센스로부터 내열성 DNA 중합효소 유전자를 분리하고, 전기 유전자가 암호화하고 있는 효소를 대장균 내에서 발현시켜 정제한 다음, 효소 특성을 밝히고 PCR에 이용하였다. 또한 써모코커스 씰러리크레센스로부터 DNA 중합효소 유전자에 점 돌연변이를 일으켜 752번째 아미노산인 알라닌이 라이신으로, 213번째 아미노산인 아스파라진이아스팔틱산으로 치환된 이중돌연변이 (double mutation) 써모코커스 씰러리크레센스 A752K/N213D DNA 중합효소 유전자를 대장균 내에서 발현시켜 정제한 다음, PCR에 이용하였다.
이에, 본 발명자들은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaea)의 일종인 써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens , 이하 ‘Tcel DNA 중합효소’라고 함) ) 유래의 DNA 중합효소의 특성을 밝히고 산업적으로 이용하고자, 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA (genomic DNA)로부터 써모코커스 씰러리크레센스 DNA 중합효소 유전자를 선별하고, 상기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였다. 아미노산 서열 비교로부터 Tcel DNA 중합효소가 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소(family B type DNA polymerase)들과 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 B 계열 DNA 중합효소임을 확인하였다. 다음, 상기 유전자의 발현벡터 (expression vector)를 제작하고, 대장균 (Escherichia coli)에 클로닝하여 발현시킨 후, 열처리와 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정을 통하여 단백질을 정제하였다. 이어, 정제된 Tcel DNA 중합효소의 다양한 효소 특성들을 조사하여 최적 활성 조건을 확인하였으며, DNA 중합 시에 정확성을 높여주는 교정활성 (proofreading activity)을 가지고 있음을 확인하였다. 마지막으로, Tcel DNA 중합효소를 사용하여 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함)을 수행함으로써, 정제된 Tcel DNA 중합효소를 PCR에 이용할 수 있음을 확인하였다. 그러나 Tcel DNA 중합효소의 내열성에 관한 특성을 조사한 결과 다른 써모코커스 균주 유래의 DNA 중합효소보다 내열성이 낮다는 것을 확인하였다. 따라서 Tcel DNA 중합효소의 내열성을 높이기 위한 다양한 돌연변이체 제조과정에서 PCR 증폭 및 내열성이 증가된 이중돌연변이체 써모코커스 씰러리크레센스 A752K/N213D DNA 중합효소 (Thermococcus celericrescens A752K/N213D DNA polymerase, TcelA752K/N213D DNA polymerase, 이하 ‘TcelA752K/N213D DNA 중합효소’라고 함)를 개발하게 되었다.
즉, Tcel DNA 중합효소의 알라닌(Alanine)752 (A752)과 아스파라진(Asparagine)213 (N213)을 점 돌연변이를 일으키는 (site-directed mutagenesis) 방법을 통하여 다른 잔기로 치환된 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 유전자를 대장균 (Escherichia coli)에서 발현시킨 후, 열처리와 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정을 통하여 단백질을 정제하였다. 정제된 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 사용하여 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 수행함으로써, 야생형의 Tcel DNA 중합효소와 PCR efficiency를 비교하였다. 여기에서 TcelA752K/N213D DNA 중합효소가 Tcel DNA 중합효소 보다 내열성과 PCR 증폭속도 및 증폭율에서 우수하다는 것을 확인하였다. 또한 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 경우 기존에 상품으로 판매되고 있는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소보다 PCR 증폭속도 및 증폭율에서 우수하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 목적은 우수한 DNA 중합 활성 및 교정 활성을 가지는 써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens) 균주 유래 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소와 이들을 이용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 써모코커스 씰러리크레센스 균주로부터 분리된 Tcel DNA 중합효소를 암호화하는 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Tcel DNA 중합효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pTCEL)와 이러한 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 (transformant)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Tcel DNA 중합효소를 제조하는 방법과 상기 방법에 의하여 생산된 Tcel DNA 중합효소 및 그것의 효소 특성을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌연변이 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pTCELM) 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 (transformant)를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 돌연변이 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 제조하는 방법과 상기 방법에 의하여 생산된 돌연변이 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 초고온성 고세균의 일종인 써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens)로부터 분리한 Tcel DNA 중합효소에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 써모코커스 씰러리크레센스로부터 분리된 Tcel DNA 중합효소에 관한 것이다. 또한 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 써모코커스 씰러리크레센스호부터 분리된 Tcel DNA 중합효소에서 점 돌연변이를 일으킨, 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 TcelA752K/N213D DNA 중합효소에 관한 것이다.
상기 본 발명의 Tcel DNA는 B 계열 DNA 중합효소 (family B type DNA polymerase)로, DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)인 5′→3′ 중합효소 활성 (5′→3′ polymerase activity) 뿐만 아니라, 교정 활성 (proofreading activity)이라 불리는 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 (3′→5′ exonuclease activity)을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 Tcel DNA 중합효소는 종지코돈 (stop codon)을 포함하여 2,328 bp로 이루어져 있고 (서열번호 13), 775개의 아미노산으로 구성된다(서열번호 14).
구체적으로, 30 mM Tris-HCl (pH 8.4) / 1.5 mM MgCl2 / 60 mM KCl / 0.0025% BSA로 구성된 반응 완충용액 하에서 본 발명의 Tcel DNA 중합효소와 주형으로 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과 효율적으로 DNA 증폭이 일어났다. TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 경우, 30 mM Tris-HCl (pH 8.4) / 1.5 mM MgCl2 / 80 mM KCl / 0.0025% BSA로 구성된 반응 완충용액 하에서 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 DNA 합성이 효율적으로 증폭되었다. 또한, 상기 PCR 완충용액들 하에서 Tcel DNA 중합효소와 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용하여 PCR을 수행해 본 결과, Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소에 비교하여 월등히 짧은 시간내에 2kb의 DNA를 증폭하였다. Tcel DNA 중합효소는 2kb의 DNA를 10초에서, TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 2kb의 DNA를 5초에서도 증폭 가능하였다 (도 13). 또한, PCR시 상당히 낮은 에러율로 높은 정확성을 나타내었다 (표 3).
본 발명의 Tcel DNA 중합효소는 pH 8.0의 pH, 70℃의 온도, 100 mM의 KCl 농도 및 2 mM의 Mg2 + 농도에서 최적의 활성을 나타내는 물리, 화학적 특징을 가진다. 이는 activated calf thymus DNA를 주형으로 하여 방사성동위원소 [methyl-3H]thymidine 5′-triphosphate)을 하나의 기질로 이용하여 효소활성을 측정한 것으로 PCR에 의한 DNA 증폭방법과는 구별된다. 따라서 효소자체의 최적활성 조건과 PCR의 최적조건은 약간의 차이가 존재한다.
본 발명은 하나 이상의 위치에서 일부 서열의 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 부가 또는 이들의 조합에 의하여 야생형의 Tcel DNA 중합효소의 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지는 단백질 변이체를 본 발명의 범주에 포함한다. 또한, 본 발명의 Tcel DNA 중합효소는 인산화, 황화, 아크릴화, 당화, 메틸화, 파네실화등으로 수식된 형태를 본 발명의 범주에 포함한다.
상기 변이체 또는 수식체는 야생형 단백질과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물이거나 물리 화학적 성질이 증가 또는 감소된 형태일 수 있다. 예를 들어, 효소활성이 증대된 변이체이다. 또는, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다.
또한, 본 발명은 상기 Tcel DNA 중합효소를 암호화하는 염기 서열에 대한 정보도 제공한다. 구체적으로는 상기 Tcel DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 Tcel DNA 중합효소는 바람직하게는 서열번호 13의 핵산 서열을 가진다. 그리고 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 celA752K/N213D DNA 중합효소는 서열번호 15의 핵산 서열을 가진다.
본 발명은 상기 핵산 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 야생형 DNA 중합효소와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열도 본 발명의 범주에 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 Tcel DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터와 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 “벡터”란 핵산분자의 일종으로, 또 다른 핵산과 결합하여 숙주세포로 이송되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터이다. 본 발명에서는 발현벡터로 플라스미드 벡터의 일종인 pET-20b(+)를 이용하여, 재조합 플라스미드 pTCEL (도 2 참조)과 pTCELM을 제작하였다
구체적으로, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 Tcel DNA 중합효소를 발현하는 pTCEL인 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 Tcel DNA 중합효소에서 이중 점 돌연변이를 일으킨 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 발현하는 pTCELM인 벡터를 제공한다.
또한, 상기 벡터들로 형질전환 된 미생물에 관한 것이다.
형질전환 될 수 있는 숙주세포로 사용가능한 미생물은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli), 로도코커스 (rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 시폴러버스 (Syfolobus), 써모플라즈마 (Thermoplasma), 써모프로테우스 (Thermoproteus) 등의 다양한 미생물을 포함한다. 바람직하게는 대장균으로, 대장균 XL1-blue, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101 등을 예로 들 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 pTCEL 벡터로 형질전환된 미생물인 대장균 Rosetta(DE3)pLysS/pTCEL을 제공한다. 또한 pTCELM 벡터로 형질전환된 미생물인 대장균 Rosetta(DE3)pLysS/pTCELM을 제공한다. 대장균 Rosetta(DE3)pLysS/pTCELM은 KACC (Korean Agricultural Culture Collection, 수원시 권선구 서둔동 88-20)에 2010년 12월 20일자로 수탁번호 KACC91614P로 기탁하였다.
숙주세포로의 벡터 도입은 전기충격유전자전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, PEG, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 써모코커스 씰러리크레센스로부터 분리된 Tcel DNA 중합효소 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 Tcel DNA 중합효소에서 이중 점 돌연변이를 일으킨 서열번호 16의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 핵산 증폭 반응의 키트 성분으로 사용될 수 있다. 이런 핵산 증폭 반응에는 PCR(polymerase chain reation), LCR(ligase chain reaction), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), 3SR(self-sustained sequence replication), SDA(strand displacement amplification), 브랜치드 DNA 시그널 증폭(branched DNA signal amplification), 네스티드 PCR(nested PCR), 멀터플렉스 PCR(multiplex PCR) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 반응용 키트는, 상기 Tcel DNA 중합효소 및/또는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 외에도 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 키트는 검출 프라이머를 포함하는 용기, 증폭반응 튜브 또는 컨테이너, 반응 완충액, dNTPs, RNase 및 멸균수 등에서 선택되는 1 이상의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전공학 및 분자생물학 실험, 임상진단, 법의학적 연구 등의 다양한 분야에서 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 천연 기원의 공급원으로부터 분리하는 방법, 화학적 합성하는 방법 또는 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 코딩하는 벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 발현시킨 후 이로부터 분리하는 방법 등으로 제조 가능하다.
Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 효율적으로 발현할 수 있는 발현 벡터를 제조하고 이를 미생물에서 발현시키는 시스템은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 다양하게 변형/응용하여 구현할 수 있다. 이런 구현의 한 예는 하기와 같다.
Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 (i) Tcel DNA 중합효소 또는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 발현하는 벡터를 제조하는 단계; (ii) 상기 벡터를 미생물로 형질전환 시키는 단계; (iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (iv) 상기 형질전환체부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다.
단계 (i)에서 벡터 종류, 단계 (ii)에서 벡터를 형질전환 시키는 방법 및 숙주 세포로 사용되는 미생물의 종류는 상기에서 살펴본 바와 같다.
단계 (iii)의 배양 과정은 형질전환체로 사용되는 미생물의 종류에 널리 공지된 방법에 따라 수행되고 배지성분, 배양온도 및 배양시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다. 구체적으로, 배양 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등과 같은 미생물의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함한다. 배지의 pH를 적절히 조정할 수 있고, 항생제 등의 성분을 포함할 수 있다.
또한, 이소프로필 싸이오갈락토피라노사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 이하 ‘IPTG’라고 함)등의 유도제 (inducer)를 처리하여 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 처리되는 유도제의 종류는 벡터 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 유도제 투여시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.
단계 (iv)에서 단백질은 통상의 방법으로 회수 및 정제된다. 예를 들어, 원심분리 방법으로 회수한 세포를, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등을 이용하여 파쇄 한다. 배양액으로 단백질이 분비되는 경우에는 배양 상등액을 수집한다. 과발현에 의해 응집되는 경우, 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다. 글루타티온, 디티오트레이톨, β -머캅토에탄올, β -머캅토메탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템을 사용하고 요소, 구아니딘, 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용한다. 재폴딩제와 함께 염의 일부를 사용할 수 있다.
이 때, 70 내지 85℃에서 10분 내지 60분간 열처리하는 공정을 추가할 수 있다.
형질전환체를 배양하여 수득한 단백질은 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들면 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피에는 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등이 있다.
상기 단백질의 제조 공정상의 스케일은 목적에 맞도록 조절할 수 있다. 또한, 각 공정 사이에는 추가 및 부과 공정을 둘 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 단백질이 유리체로 얻어진 경우에는 공지된 방법에 의해 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 공지된 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시에서는 배양한 세포를 원심 분리하여 균체를 회수한 다음, 초음파로 파쇄하고 열처리 후 HisTrapTM HP 컬럼 (GE Healthcare)과 HiTrapTM SP HP 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 공정으로 획득하였다.
상기 공정으로 획득한 단백질은 자연적으로 발생한 환경과 구별되는 물리적 환경에 다른 단백질로부터 충분히 분리된 “실질적으로 순수한” 상태로 존재한다. 상기 방법으로 제조된 단백질은 분자생물학 및 유전공학 실험을 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 우수한 DNA 중합 활성을 가지는 내열성 효소로 사용될 수 있다.
본 발명의 Tcel DNA 중합효소는 우수한 DNA 중합활성과 높은 교정 활성을 가지므로 PCR 등 다양한 핵산 중합 반응에 널리 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 기존의 Tcel DNA 중합효소와 비교하여 PCR efficiency와 내열성이 향상되었다.
도 1(a 및 b)은 Tcel DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 Tcel DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pTCEL의 구축 과정을 나타낸 것이다. 플라스미드 pET-20b(+)에 Tcel DNA 중합효소 전체 유전자가 삽입된 것이다.
도 3은 대장균 내에서 발현된 Tcel DNA 중합효소 (도 3a) 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 (도 3b)의 정제 단계에 따른 SDS 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다. 재조합 플라스미드 pTCEL 및 pTCELM 유래의 발현산물로부터 정제 단계별로 나타낸 것이다.
도 4는 Tcel DNA 중합효소의 pH에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 Tcel DNA 중합효소의 온도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 Tcel DNA 중합효소의 MgCl2 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 Tcel DNA 중합효소의 KCl 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 열안정성을 94℃에서 각각 상대적으로 나타낸 그래프이다
도 9는 Tcel DNA 중합효소의 3‘-5’ 핵산말단가수분해 효소활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 Tcel DNA 중합효소 (도 10a) 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 (도 10b)를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 있어 pH에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 11는 Tcel DNA 중합효소(도 11a) 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 (도 11b)를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 있어 MgCl2 농도에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 Tcel DNA 중합효소(도 12a) 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 (도 12b)를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 있어 KCl 농도에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 람다 파아지 게노믹 DNA 2kb를 주형으로 최적 PCR 완충용액 하에서 Tcel DNA 중합효소, TcelA752K/N213D DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 여러 가지의 증폭시간에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 최적 PCR 완충용액 하에서 Tcel DNA 중합효소와 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용하여 PCR의 증폭 가능 길이를 조사하고자 2분의 증폭시간으로 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 써모코커스 씰러리크레센스 균주의 배양
써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens) 균주 (DSM 17994)는 DSMZ 760 배지에서 배양하였다. DSMZ 760 배지 (1 ℓ당 펩톤 (peptone) 5.0 g, 효모추출물 (yeast extract) 1.0 g, elemental sulphur 5 g, Fe(III) citrate 0.1 g, NaCl 19.45 g, MgCl2 5.9 g, Na2SO4 3.24 g, CaCl2 1.8 g, KCl 0.55 g, Na2CO3 0.16 g, KBr 0.08 g, SrCl2 34 mg, H3BO3 22 mg, Na-silicate 4 mg, NaF 2.4 mg, (NH4)NO3 1.6 mg, Na2HPO4 8 mg, Resazurin 0.1 mg)를 준비한 다음, 5 N 황산으로 pH 7.0을 맞췄다. 이 때 펩톤 및 효모추출물 (10% stock으로 준비)과 elemental sulphur는 함께 첨가하지 않고 별도로 각각 준비한다. 이 용액을 100 ℃ 배양기(incubator)에서 하룻밤 (8시간 정도) 가열하여 멸균과 동시에 용액내의 산소를 제거하였다. 가열 후에 생긴 약간의 침전물들을 신속히 여과한 후 다시 100℃ 배양기에서 3시간정도 가열하였다. 120 ㎖ 혈청 바틀 (serum bottle) (Wheaton Co., USA)에 0.5 g의 엘리멘탈 설퍼(Elemental sulphur)를 넣고 가열된 전기 배지 용액 100 ㎖을 첨가하여, 질소가스로 배지 용액을 포함한 혈청 바틀 내부의 가스를 30분간 교환한 다음, 고무병마개와 알루미늄 링으로 혈청 바틀의 입구를 막은 후, 95℃에서 24시간 멸균하였다. 이렇게 준비된 배지에 멸균된 주사기를 이용하여 멸균된 펩톤 및 효모추출물을 첨가한 후, 5% Na2S9H2O 용액을 소량 주입하고, 써모코커스 씰러리크레센스 균주를 1% 접종한 후, 80℃에서 24시간 배양하였다.
실시예 2: 게노믹 DNA 의 분리
혐기적 조건 하에서 배양된 배양액을 여과하여 황을 제거하고, 원심분리를 통해 균체를 회수한 하였다. 여기에 SET (150 mM NaCl / 1 mM EDTA / 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 완충용액을 첨가하고, SDS와 RNase를 첨가하여 55℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 프로테이나아제 K (proteinase K)를 첨가하여 37℃에서 1시간, 55℃에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 클로로포름 / 이소아밀알코올 (chloroform / isoamylalcohol)(24 : 1) 동량을 첨가하여 흔들어주면서 하룻밤 반응시킨 후, 2배 부피의 100% 에탄올 (ethanol)과 1/10배 부피의 3 M 쇼듐 아세테이트(sodium acetate) (pH 5.2)를 첨가하여 게노믹 DNA를 침전시킨 다음, 70% 에탄올로 세척하여 진공건조 시키고, TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.6) / 1 mM EDTA) 완충용액에 녹였다. 상기와 같이 분리된 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA는 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
실시예 3: DNA 중합효소 유전자의 선별
써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA로부터 Tcel DNA 중합효소 유전자를 선별하기 위해 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA를 주형으로 하고 기존에 보고된 써모코커스 코다카렌시스 코드원 (Thermococcus kodakaraensis KOD1)(참조: Takagi M. et al., 1997, Appl . Environ . Microbiol . 63(11), 4504-4510), 써모코커스 스피시스 엔에이원 (Thermococcus sp. NA1)(참조: Kim YJ et al., 2007, J Microbiol Biotechnol . 17(7). 1090-7), 및 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus)(참조: Lundberg, K.S. et al., 1991, Gene 108(1), 1-6)의 DNA 중합효소 유전자 중에서 잘 보존 된 부위의 아미노산 서열 2곳을 참조하여 서열번호 1 및 2의 혼합 프라이머 (mix primer)를 제작하였다. 서열번호 1 프라이머는 아미노산 서열 EYDIPFA을 코딩하는 염기서열이다. 서열번호 2 프라이머는 아미노산 서열 YYIENQV을 코딩하는 염기서열의 상보적인 서열이다. 이들 프라미머들을 이용하여 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA를 주형 (template)으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 조건은 94℃에서 3분간 반응 후, 94℃에서 1분, 45℃에서 1분 및 72℃에서 5분간 반응과정을 7회 반응 후 94℃에서 1분 50℃에서 1분 및 72℃에서 5분간 반응 과정을 23회 반복 수행하였고, 72℃에서 10분간 연장반응 후 반응 산물을 0.8% 아가로스 젤에 전기영동하여 약 1.8 kb의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다. 또한, MEGAquick-spinTM PCR & Agarose Gel DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 상기 0.8% 아가로스 젤에서 이 PCR 반응 산물들을 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 (주)솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 결정한 후 기존에 알려진 다른 종의 DNA 중합효소 염기서열과 유사성을 비교한 결과 높은 상동성을 보임을 확인하였다. 따라서 정제된 1.8 kb의 DNA 단편이 써모코커스 씰러리크레센스의 Tcel DNA 중합효소 유전자의 일부분임을 확인할 수 있었다. 이를 써모코커스 씰러리크레센스의 Tcel DNA 중합효소 유전자를 선별하기 위한 중심부위로 사용하였다.
서열번호 1 프라이머 (T-111N) : 5'-GARTACGACATACCCTTYGC-3'
서열번호 2 프라이머 (T-CR) : 5'-AACCTGGTTCTCRATKTAGTA-3'
(상기에서 R은 A 또는 G염기이고, Y는 C 또는 T 염기이며, K는 G또는 T의 염기이다.)
실시예 4: 프라이머 워킹 ( primer walking ) 방법을 이용한 Tcel DNA 중합효소 유전자의 중심부위로부터 미지의 인접한 DNA 부위 (N 말단과 C 말단)의 탐색
상기 실시예 3에서 이미 확보된 Tcel DNA 중합효소 유전자 1.8 kb의 DNA 염기서열을 기본으로 4개의 인터널 프라이머 (internal primer)를 제작하였다 (서열번호 3, 4, 5 및 6 프라이머). 미지의 인접한 염기서열을 찾기 위해서 Walking SpeedUp TM Premix Kit (seegene, Korea)를 이용하였다. Tcel DNA 중합효소 유전자의 5‘ 상류방향 (N 말단 영역)에 해당하는 유전자 부위를 클로닝하기 위해서 Walking SpeedUp TM Premix Kit 내의 4가지 랜덤 (random) 프라이머와 서열번호 3 프라이머 (Tcel-N1) 및 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA를 이용하여 첫 번째의 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물의 일부를 주형으로 서열번호 4 프라이머 (Tcel-N2)와 키트 내의 두 번째 PCR 프라이머를 이용하여 두 번째 PCR을 수행한 결과, 약 1,400 bp의 DNA 절편을 특이적으로 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편들을 아가로스 겔에 전기영동한 후, MEGAquick-spinTM PCR & Agarose Gel DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 추출, 정제하여 (주)솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 이들 절편들의 염기서열을 결정한 결과, 시작코돈을 포함하는 5’ 상류방향 (N말단 부분)의 염기서열을 확보하였다.
또 보존된 중심부위의 염기서열에 인접한 미지의 3’ 하류방향 (C 말단 영역)에 해당하는 유전자 부위를 클로닝하기 위해서 Walking SpeedUp TM Premix Kit 내의 4가지 랜덤 프라이머와 서열번호 5 프라이머 (Tcel-C1) 및 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA를 이용하여 첫 번째의 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 주형으로 서열번호 6 프라이머 (Tcel-C2)와 Kit 내의 두 번째 PCR 프라이머를 이용하여, 약 800 bp의 DNA 절편을 특이적으로 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편들을 아가로스 겔에 전기영동한 후, MEGAquick-spinTM PCR & Agarose Gel DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 추출, 정제하여 (주) 솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 이들 절편들의 염기서열을 결정한 결과, 종지코돈을 포함하는 3’ 상류방향 (C말단 부분)의 염기서열을 확보하였다. 이렇게 Tcel DNA 중합효소 유전자를 코딩하는 전체 염기서열을 결정하였다 (서열번호 13).
인터널 프라이머 서열
서열번호 3 프라이머 (Tcel-N1): 5'-CTCGTTTTCATCGGCGTAGCTTA-3'
서열번호 4 프라이머 (Tcel-N2): 5'-GAACTCCTCGCCCTCGTGGTA-3'
서열번호 5 프라이머 (Tcel-C1): 5'-AGAGGCGTGAAGATACGGCCG -3'
서열번호 6 프라이머 (Tcel-C2): 5'-GAAGGACTACAAGGCCACAGGCC-3'
DNASTAR (DNASTAR Inc., USA) 프로그램을 이용하여 Tcel DNA 중합효소 유전자 염기서열을 분석하였으며, 써모코커스 씰러 (Thermococcus celer), 써모코커스 코다카렌시스 코드1 (Thermococcus kodakaraensis KOD1), 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus) DNA 중합효소 유전자의 염기서열과 유사성을 비교하였다 (도 1 참조).
그 결과, 상기 써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens) 균주로부터 분리된 DNA 중합효소 유전자의 전체 염기서열은 개시코돈 (ATG)에서 정지코돈 (TGA)을 포함하여 총 2,328 bp로 이루어져 있었으며 (서열번호 13), 총 아미노산은 775개로 이루어져 있었고 (서열번호 14), 상기 아미노산의 서열로 본 발명의 Tcel DNA 중합효소 효소의 분자량이 약 90,134 Da인 것을 추정할 수 있었다. 또한, 써모코커스 씰러리크레센스 (Thermococcus celericrescens) 균주로부터 분리된 DNA 중합효소의 아미노산 서열과 다른 DNA 중합효소들의 아미노산서열을 비교한 결과, 써모코커스 씰러 (Thermococcus celer)(참조: Kim K.P. and Bae HJ. et al., 2010, Biotechnol . Lett .)의 DNA 중합효소와 86%의 서열 상동성을 보였고, 파이로코커스 코다카렌시스 코드1 (Pyrococcus kodakaraensis KOD1)(참조: Takagi M. et al., 1997, Appl. Environ . Microbiol ., 63(11), 4504-4510)의 DNA 중합효소와 92%의 서열 상동성을 보였다. 또한 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus)(참조: Lundberg, K.S. et al., 1991, Gene 108(1), 1-6)의 DNA 중합효소와 79%의 서열 상동성을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 5: Tcel DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 발현벡터 pTCEL 의 구축 및 Tcel A752K / N213D DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 발현벡터 pTCELM 의 구축
Tcel DNA 중합효소 유전자를 발현벡터에 삽입한 재조합 플라스미드 (pTCEL)를 하기와 같이 구축하였다 (도 2 참조).
먼저 Tcel DNA 중합효소 유전자를 얻기 위해 실시예 4에서 결정된 Tcel DNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 N-말단 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 7 프라이머 (TcelN) (5‘ 말단 프라이머)와 C-말단 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 염기에 상보적인 서열번호 8 프라이머 (TcelC) (3’ 말단 프라이머)을 각각 제작한 후, PCR을 통해 Tcel DNA 중합효소 전구체 유전자를 증폭시켰다. 서열번호 7 프라이머는 Tcel DNA 중합효소 유전자의 개시코돈 (ATG)을 포함하는 제한효소 NdeI 절단부위와 서열번호 8 프라이머는 종지코돈과 제한효소 SalI 절단부위를 각각 포함하도록 합성하였다. 써모코커스 씰러리크레센스 게놈 DNA를 서열번호 7 및 8 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 0.2 ㎍ 써모코커스 씰러리크레센스 게노믹 DNA와 20 pmole의 5′말단 프라이머 및 3′말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 이루어진 혼합 조성액을 94℃에서 3분간 반응시킨 후 94℃ 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 3분의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막 72℃에서 10분간 반응시켰다. DNA 사이즈 마커 (size marker)와 함께 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 2.3 kb 위치에 밴드가 존재하는 것을 확인하였다. PCR이 끝난 반응 혼합물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여, PCR을 통해 증폭된 약 2.3 kb의 DNA 산물을 MEGAquick-spinTM PCR & Agarose Gel DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)을 사용하여 정제하여 회수하였다. 회수된 DNA를 제한효소 NdeI 및 SalI으로 절단한 다음, 0.8% 아가로스 겔에 다시 전기영동 하여 약 2.3 kb 위치에 해당하는 겔 단편을 전기의 Kit를 사용하여 Tcel DNA 중합효소 유전자 절편을 정제하여 회수하였다. 정제된 Tcel DNA 중합효소 유전자 절편을 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pET-20b(+) (Novagen, USA)에 삽입하여 T4 DNA 연결효소를 사용하여 16℃에서 하룻밤 동안 연결반응을 시켜 연결시킨 후, 대장균 Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS (Stratagene, USA)에 형질전환 시켰다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 형질전환체들로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NdeI 및 SalI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 Tcel DNA 중합효소 유전자가 발현벡터 내에 정확히 삽입되어 있음을 재확인하였다. 상기와 같이 구축된 Tcel DNA 중합효소 유전자의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 pTCEL로 명명하였다 (도 2).
서열번호 7 프라이머 (TcelN) :
5‘-NNNNNNN CATATG ATACTCGATACCGATTACATCACC-3’
NdeI
서열번호 8 프라이머 (TcelC) :
5'-NNNNNN GTCGAC CTTCTTCCCCTTCGGCTGCAAC-3'
SalI
다음은 퀵체인지 점 돌연변이 유발방법(QuikChange site-directed mutagenesis method)을 이용하여, 야생형 Tcel DNA 중합효소 유전자에 점 돌연변이(point mutation)를 유발하였다 (참조: Stratagene사의 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit의 제품사용 매뉴얼). 결과적으로 752번 위치의 알라닌(Ala)에 해당하는 유전자가 라이신(Lys)으로, 213번째 아미노산인 아스파라진(Asn)이아스팔틱산(Asp)를 암호화하는 서열을 갖게 되었다. Tcel DNA 중합효소 유전자로부터 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 유전자를 얻기 위해 실시예 4에서 결정된 Tcel DNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 서열번호 9 프라이머 (TcelA752K-F), 서열번호 10 프라이머 (TcelA752K-R), 서열번호 11 프라이머(TcelN213D-F) 및 서열번호 12 프라이머(TcelN213D-R)을 각각 제작한 후, PCR을 통해 TcelA752K 돌연변이체 DNA 중합효소 유전자를 제조한 후, 이 TcelA752K 돌연변체 DNA 중합효소 유전자의 213번의 아미노산을 돌연변이 일으켜 이중 돌연변이체 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 유전자를 제조하는 순서로 수행하였다. 먼저, TcelA752K 돌연변이체 DNA 중합효소 유전자를 확보하기 위해 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR은 0.2 ㎍ pTCEL와 20 pmole의 5′말단 프라이머 (서열번호 9) 및 3′말단 프라이머 (서열번호 10), 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 이루어진 혼합 조성액을 95℃에서 30초간 반응시킨 후 94℃ 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 7분의 조건으로 12회 반복한 후, 마지막 68℃에서 10분간 반응시켰다. 원래의 주형 DNA를 제거하기 위해 메틸레이티드 DNA (methylated DNA)만 특이적으로 절단하는 제한효소 Dpn I을 37℃ 1시간 처리한 후, 절단되지 않은 PCR 증폭된 돌연변이 DNA (PCR 산물은 메틸레이티드 되지 않음)를 대장균에 형질전환시켰다. DNA 시퀀싱에 의해 재조합 벡터에 클로닝된 Tcel DNA 중합효소 유전자의 752알라닌이 라이신으로 정확하게 치환된 것을 확인하였다. 다음은 TcelA752K 돌연변이체 DNA 중합효소 유전자가 구축되어 있는 플라스미드 (pTCEL1)를 이용하여 213번째 아미노산인 아스파라진(Asn)이아스팔틱산(Asp)로 치환된TcelA752K/N213D DNA 중합효소 유전자를 확보하기 위해 다음과 같이 PCR를 수행하였다. PCR은 상기에 752번잔기가 치환된 pTCEL1 0.2 ng을 주형으로 20 pmole의 5′말단 프라이머 (서열번호 11) 및 3′말단 프라이머 (서열번호 12), 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 이루어진 혼합 조성액을 95℃에서 30초간 반응시킨 후 94℃ 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 7분의 조건으로 12회 반복한 후, 마지막 68℃에서 10분간 반응시켰다. 상기와 같이 원래의 주형 DNA를 제거하기 위해 제한효소 Dpn I을 37℃ 1시간 처리한 후 처리한 후, 절단되지 않은 PCR 증폭된 돌연변이 DNA를 대장균에 형질전환시켰다. DNA 시퀀싱에 의해 재조합 벡터에 클로닝된 TcelA752K 돌연변이체 유전자의 213아스파라진이아스팔틱산으로 정확하게 치환된 것을 확인하였다. 이와 같이 이중 돌연변이체TcelA752K/N213D DNA 중합효소 유전자를 확보하였다(서열번호 15 및 16). 이것을 대장균 Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS (Stratagene, USA)에 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 형질전환체들로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NdeI 및 SalI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 Tcel A752K/N213D DNA 중합효소 유전자가 발현벡터 내에 정확히 삽입되어 있음을 재확인하였다. 상기와 같이 구축된 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 유전자의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 pTCELM로 명명하였다. 상기 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 전구체 유전자 및 유전자를 포함하는 발현벡터 및 발현벡터를 포함한 대장균을 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물자원센터에 2010년 12월 20일에 기탁유전자명은 Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM, 기탁번호 KACC91614P로 기탁하였다.
서열번호 9 프라이머 (TcelA752K-F) :
5‘- CTTCGGCTACCGGAAGGAGGATTTGC -3’
서열번호 10 프라이머 (TcelA752K-R) :
5'- GCAAATCCTCCTTCCGGTAGCCGAAG -3'
서열번호 11 프라이머 (TcelN213D-F) :
5‘- CCTACAACGGCGACGACTTCGACTTCGC -3’
서열번호 12 프라이머 (TcelN213D-R) :
5'- GCGAAGTCGAAGTCGTCGCCGTTGTAGG -3'
실시예 6: 재조합 Tcel DNA 중합효소 유전자 및 Tcel A752K / N213D DNA 중합효소의 발현과 정제
상기 실시예 5의 방법에 의해 대장균에 형질전환시킨 재조합 균주 Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS / pTCEL로부터 Tcel DNA 중합효소 단백질 및 Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM으로부터 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 단백질로 각각 발현시킨 후, 발현된 단백질을 아래와 같이 정제하였다. 상기 실시예 5에서 각각 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균 Rosetta(DE3)pLysS를 100 ug/ul 암피실린이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음 5 ml을 같은 배지 500 ml에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.6정도가 되었을 때, IPTG (isopropyl β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.2 mM이 되도록 첨가한 이후 하룻밤 동안 배양하였다. 6,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 균체 (1.9 g/ wet weight)를 회수한 다음 1 mM PMSF가 포함된 25 ml의 초음파처리 완충액(sonication buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM NaCl)에 현탁 하여 초음파로 파쇄한 후 18,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 대장균 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 다음으로 80℃에서 30분간 열처리한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수함으로써 대장균 유래의 단백질들을 대부분 제거하였다. 상기 상층액을 HisTrapTM HP 컬럼 (GE Healthcare)과 HiTrapTM SP HP 컬럼 (GE Healthcare)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 통해 최종적으로 정제하였다. 상기와 같이 정제된 Tcel DNA 중합효소와 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 저장 완충용액 (storage buffer)(20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50 mM KCl, 1mM DTT, 50% Glycerol)에 투석한 다음, -20℃에 보관하면서 효소 특성을 조사할 때와 PCR을 수행할 때 사용되었다. 재조합 플라스미드 pTCEL를 가지는 대장균 Rosetta(DE3)pLysS로부터 DNA 중합효소를 정제하는 데 있어, 각각 정제 단계별 결과는 하기 표 1과 같았다.
대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCEL 유래의 Tcel DNA 중합효소의 정제
　 전체 단백질
(mg)		 전체 활성
(U)		 비활성도
(Specific activity)
(U/mg)		 복구율
(%)
Crude extract 167.23 752.71 4.50 100
Heat treatment 29.78 243.90 8.19 32.4
HisTrapTM HP 13.89 127.22 9.16 16.9
HiTrapTM SP HP 12.95 121.08 9.35 16.1
재조합 플라스미드 pTCELM를 가지는 대장균 Rosetta(DE3)pLysS로부터 DNA 중합효소를 정제하는 데 있어, 각각 정제 단계별 결과는 하기 표 2과 같았다.
대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM 유래의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 정제
　 전체 단백질
(mg)		 전체 활성
(U)		 비활성도
(U/mg)		 복구율
(%)
Crude extract 151.38 801.09 5.29 100
Heat treatment 21.56 172.33 8.00 21.51
HisTrapTM HP 13.44 163.01 12.13 20.35
HiTrapTM SP HP 13.08 157.96 12.08 19.72
특히 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCEL 유래의 Tcel DNA 중합효소의 발현율은 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM 유래의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 발현율보다 높았다.
정제 단계별 단백질의 양은 브래드포드 분석(Bradford Assay)을 사용하여 결정하였다 (참조: Bradford M.M., 1976, Anal . Biochem . 72, 248-54). 또한, 변성 겔 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하여 Tcel DNA 중합효소와 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 정제 단계에 따른 정제 정도를 확인하였다(도 3 참조). 도 3a는 Tcel DNA 중합효소의 정제과정으로 lane 1은 IPTG 유도 (induction)를 하지 않고 배양한 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCEL 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 2는 IPTG 유도를 하여 배양한 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCEL 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 3은 80℃에서 30분간 열처리한 후의 시료, lane 4는 HisTrapTM HP 컬럼 HisTrapTM HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 5는 HiTrapTM SP HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료이다. 도 3b는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 정제과정으로 lane 1은 IPTG 유도 (induction)를 하지 않고 배양한 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 2는 IPTG 유도를 하여 배양한 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 3은 80℃에서 30분간 열처리한 후의 시료, lane 4는 HisTrapTM HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 5는 HiTrapTM SP HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료이다. 정제과정을 통해 Tcel DNA 중합효소 (분자량: 90,134) 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 (분자량: 90,200) 단백질은 80℃에서 30분간 열처리 (도 3a와 도3b의 lane 3 참조)에 의해 분자량이 거의 유사한 약 90,00Da으로 확인되었다. Lane M은 단백질 저분자량 마커 (low molecular weight marker)를 나타낸다. 정제된 효소의 비활성도(specific activity)는 각각 9.35 U/mg 및 12.08 U/mg 이다. 이 때 1유닛(U)은 75℃에서 30분간 10nmol의 dNTP가 산불용성 형태로 삽입되기 위해 요구되어 지는 DNA 중합효소의 양으로 정의하였다.
실시예 7: Tcel DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성 조사
Tcel DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성은 다음과 같은 DNA 중합 활성 측정 방법을 기본으로 하여 조사되었다 (참조: Choi, J. J. et al ., 1999, Biotechnol . Appl . Biochem . 30, 19-25). 반응 혼합물 (상기 실시예 6에서 정제된 Tcel DNA 중합효소, 1.25 ㎍ activated calf thymus DNA, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 mM KCl, 14 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 μM dATP, dCTP 및 dGTP, 10 μM dTTP, 0.5 μCi [methyl-3H]thymidine 5′-triphosphate)을 75℃에서 10분간 반응시킨 후, 얼음에서 급랭시켰다. 상기 반응액을 DE-81 필터 페이퍼 디스크(filter paper disk) (23 ㎜, Whatman Co., USA)에 점적하여 65℃에서 건조시킨 후, 0.5 M 쇼듐 포스페이트 (sodium phosphate) (pH 7.0) 완충용액에 10분, 70% 에탄올에 5분간 순서대로 세척한 다음, 다시 65℃에서 건조시켰다. 상기와 같이 준비된 DE-81 필터 페이퍼 디스크를 LS 6500 신틸레이션 시스템(scintillation system) (Beckman Co., USA)을 이용하여 DNA 중합 활성을 측정하는데 사용하였다. DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성을 조사할 때에는 상기 방법에서 반응 혼합물의 pH 또는 각 성분의 농도를 다르게 하거나 반응 온도를 다르게 하여 수행하였다.
상기 실시예 6에서 정제한 Tcel DNA 중합효소의 효소활성에 대한 pH의 영향을 관찰하기 위해 pH 6.0-7.0 범위에서는 50 mM MOPS 완충용액, pH 7.0-9.0 범위에서는 50 mM Tris-HCl 완충용액, pH 9.0-10.0 범위에서는 50mM Glycine-NaOH을 각각 사용하여 효소활성을 조사하였다 (도 4 참조). 도 4는 Tcel DNA 중합효소의 pH에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다. 50 mM Tris-HCl 완충용액 pH 8.0에서 최적 DNA 중합활성을 나타내었다.
상기 실시예 6에서 각각 정제한 Tcel DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 온도의 영향을 45-90℃에서 조사한 결과, 70℃에서 최대 DNA 중합 활성을 각각 나타냈다 (도 5 참조). 도 5는 Tcel DNA 중합효소의 온도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
상기 실시예 6에서 정제한 Tcel DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 2가 양이온 (divalent cation)인 Mg2 + 영향을 조사한 결과, 최적 MgCl2 농도는 2 mM 이었다(도 6 참조). 도 6은 Tcel DNA 중합효소의 MgCl2 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
상기 실시예 6에서 정제한 Tcel DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 1가 양이온 (monovalent cation)의 영향을 조사한 결과, 최적 KCl 농도는 100 mM 이었다 (도 7 참조). 도 7은 Tcel DNA 중합효소의 KCl 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.
상기 실시예 6에서 정제한 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 각각 94℃ 에서 45분 동안 보관하면서 5분 간격으로 시료를 채취한 후, 상기와 같이 DNA 중합활성을 측정함으로써 열안정성을 조사해본 결과, Tcel DNA 중합효소는 94℃에서 약 6분 동안 50%의 DNA 중합 활성을 유지하였고 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 94℃에서 약 19분 동안 50%의 DNA 중합 활성을 유지하였다 (도 8 참조). Tcel DNA 중합효소와 비교하여 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 내열성이 약 3배정도 향상되었다. 도 8은 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소의 열안정성을 나타낸 그래프로서, 도 8에서 ●는 Tcel DNA 중합효소, ○는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 결과를 나타낸다.
실시예 8: Tcel DNA 중합효소의 3'→5' 핵산말단가수분해효소 활성 측정
Tcel DNA 중합효소의 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성은 다음과 같이 측정하였다. 먼저, 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 (3′→5′ exonuclease activity)을 측정하기 위한 기질로는 pBluescript SK-벡터를 제한효소 NotI으로 절단시킨 다음, 방사선 동위원소 [α-32P]dCTP와 클레나우 단편 (Klenow fragment)을 사용하여 전기 제한효소로 절단된 pBluescript SK-벡터의 3′ 말단을 표식하였다. 다음으로, 반응혼합물 (Tcel DNA 중합효소, 상기 3′ 말단에 방사선 동위원소 표식된 기질, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM MgCl2, 0.01% BSA)을 각각 dNTP 존재 또는 부재 하에서 75℃에서 30분 동안 보관하면서 5분 간격으로 시료를 채취하여 얼음에서 급랭시킨 후, 5% 트리클로로아세트산 (trichloroacetic acid) 용액을 첨가하여 원심분리를 한 다음, 상층액을 회수하여 LS 6500 scintillation system을 이용해서 핵산말단가수분해효소 활성을 측정하였다. 그 결과, Tcel DNA 중합효소는 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성은 가지고 있음이 확인되었다 (도 9 참조). 특히 dNTP과 존재하지 않을 때 효소활성이 더 높다는 것을 볼 수 있다. Tcel DNA 중합효소의 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성은 아미노산 서열 비교분석에서 이미 추정되었으며 실험적인 결과와 일치했다. 이 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성은 교정 활성이라고도 불리며 DNA 중합 시에 정확성을 높여주는 역할을 한다. 도 9는 써모코커스 씰러리크레센스 DNA 중합효소의 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성을 나타낸 그래프로서, 도 9에서 ○는 dNTP 존재 및 ●는 dNTP 부재 하에서의 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 측정의 결과를 각각 나타낸다.
실시예 9: Tcel DNA 중합효소 및 Tcel A752K / N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR 의 최적 조건 결정
내열성 DNA 중합효소가 가장 중요하게 이용되어지는 PCR에 있어 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D의 이용 가능성을 살펴보고, 또한 이들 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성을 결정하기 위해, 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 우선, 상기 실시예 8에서 Tcel DNA 중합효소의 특성 조사를 통해 결정된 효소의 최적활성 조건을 바탕으로 Tcel DNA 중합효소의 기본 PCR 완충용액 (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2)으로 가정하였다. Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 최적 PCR 완충용액의 조성을 결정할 때에는 기본 PCR 완충용액의 pH 또는 각 성분의 농도를 다르게 하여 수행하였다. PCR 수행시에는 기본 PCR 완충용액에 주형으로 20 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA와 10 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 각각의 프라이머, 250 μM dNTPs 및 0.25 유닛의 정제된 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소(상기 실시예 6 참조)가 공통으로 첨가하고, 이 반응 혼합물을 94℃에서 30초 반응시킨 후, 94℃ 30초, 72℃에서 2분의 조건으로 20회 반복한 후, 마지막 72℃에서 10분간 반응시켰다. 그 후 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과를 확인하였다.
Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 pH의 영향을 조사한 결과, PCR 반응 완충용액의 최적 pH는 8.4로서 동일한 결과를 보였다 (도 10 참조). 도 10a는 Tcel DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 pH에 따른 결과를 나타낸 것이고, 도 10b는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 pH에 따른 결과를 나타낸 것이다. 도 10에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 pH를 나타낸 것이다. PCR 증폭 크기는 2kb이다.
Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 2가 양이온 Mg2 +의 영향을 조사한 결과, 최적 농도는 각각 1.5 mM로서 동일하였다 (도 11 참조). 도 11a는 Tcel DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 MgCl2 농도에 따른 결과를 나타낸 것이고, 도 11b는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 MgCl2 농도에 따른 결과를 나타낸 것이다. 도 11에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 MgCl2 농도를 나타낸 것이다.
Tcel DNA 중합효소와 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 1가 양이온의 영향을 조사한 결과, 최적 KCl 농도는 각각 60 mM과 80mM 이었다 (도 12 참조). 도 12a는 Tcel DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 KCl 농도에 따른 결과를 나타낸 것이고, 도 12b는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 KCl 농도에 따른 결과를 나타낸 것이다. 도 12에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 KCl 농도를 나타낸 것이다.
상기 결과들을 통해 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소가 PCR에 이용 가능함을 알 수 있었으며, Tcel DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성은 안정제인 BSA를 포함시켜 30 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl2 , 60 mM KCl, 0.0025% BSA로 결정하였다. 또한 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성은 안정제인 BSA를 포함시켜 30 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl2, 80 mM KCl, 0.0025% BSA로 결정하였다.
실시예 10: Tcel DNA 중합효소 및 Tcel A752K / N213D DNA 중합효소를 이용한 최단 증폭 시간에서의 PCR
20 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 각각 10 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 프라이머, 250 μM dNTPs, 각각의 중합효소의 최적 PCR 완충용액 및 각각의 중합효소를 반응 혼합물로 하여 Tcel, TcelA752K/N213D, Taq 및 Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR의 최단 증폭 시간을 조사하고자 증폭 시간에 따라 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 94℃에서 30초 반응시킨 후, 94℃에서 30초, 72℃에서 5, 10, 30, 60 및 90초로 반응시켰다. PCR 반응이 끝난 다음, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 하여 PCR 결과를 확인한 결과, Taq 및 Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR의 경우 60초 이상일때부터 2 kb 합성이 가능한 것에 비해 Tcel DNA 중합효소는 10초에 2 kb 합성이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 13 참조). 또한 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 5초에 2 kb 합성이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 13 참조). 도 13은 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 최적 PCR 완충용액 하에서 Taq DNA 중합효소 (Taq), Pfu DNA 중합효소(Pfu), Tcel DNA 중합효소 (Tcel) 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소 (TcelA752K/N213D)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이며, 각 lane의 표시는 72℃에서의 증폭 시간을 의미한다. M은 GeneRuler™ 1kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다.
실시예 11: Tcel DNA 중합효소 및 Tcel A752K / N213D DNA 중합효소를 이용한 최장 길이 증폭 PCR
20 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 각각 10 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 프라이머, 250 μM dNTPs, 상기 실시예 9에서 결정된 1X Tcel DNA 중합효소 최적 PCR 완충용액과 상기 실시예 6에서 정제된 Tcel DNA 중합효소를 이용한 PCR의 증폭 가능 길이를 조사하였다. 또한 상기 실시예 9에서 결정된 1X TcelA752K/N213D DNA 중합효소 최적 PCR 완충용액과 상기 실시예 6에서 정제된 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용하여 PCR의 증폭 가능 길이를 조사하고자 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 반응액을 94℃에서 30초 DNA 변성 반응시킨 다음, 94℃에서 30초, 65℃ 30초, 72℃에서 2분으로 반응시켰다. PCR 반응이 끝난 다음, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 하여 PCR 결과를 확인한 결과, Tcel DNA 중합효소는 최적 PCR 완충용액 하에서 람다 파아지의 게노믹 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 증폭 시간 2분 동안 4 kb까지 합성이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 14 참조). 또한 TcelA752K/N213D DNA 중합효소는 최적 반응 완충용액 하에서 람다 파아지의 게노믹 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 증폭 시간 2분 동안 10 kb까지 합성이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 14 참조). 도 14은 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 최적 PCR 완충용액 하에서 반응 혼합물로 하여 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로서, 도 14에서 lane은 증폭사이즈 (kb)를 나타내고, M은 GeneRuler™ 1kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다.
실시예 12: Tcel DNA 중합효소 및 Tcel A752K / N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR 에 있어서의 정확성 조사
Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 PCR 정확성 (PCR fidelity)은 룬드버그 (Lundberg)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Lundberg et al., 1991, Gene 108(1), 1-6). 실제, 실험에서는 Song 등과 Choi 등의 사용한 방법과 동일한 방법으로 측정하였으며, 동일한 발현벡터 pJR-lacZ (5.7 Kb)와 primers를 사용하였다 (참조: Song J. M. et al., 2007, Enzyme Microbe . Technol. 40, 1475-1483; Choi J. J. et al., 2008, Appl . Environ . Microbiol. 74, 6563-6569). 먼저, lacZ 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pJR-lacZ의 5' 부분의 835 bp 단편을 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용하여 각각의 효소의 최적 PCR 완충용액에서 증폭시켰다. 이 때, 이미 상품으로 나와 있는 DNA 중합효소들을 사용하여 동일하게 PCR을 수행함으로써 나중에 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과와 비교할 수 있도록 하였다. 다음으로, 상기 PCR 증폭산물들을 제한효소 BamHI과 ClaI으로 각각 절단한 다음, 동일한 제한효소들로 절단된 상기 발현벡터에 재 삽입 시킨 후, 전기충격유전자전달법으로 대장균에 형질전환 시키고, 선별을 위한 항생제 암피실린 및 IPTG와 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)이 포함된 아가 플레이트 배지에 고르게 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 아가 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 보관한 후, 파란색 콜로니 (blue colony)와 흰색 콜로니 (white colony)의 수를 센 다음, 이를 바탕으로 돌연변이 빈도 (mutation frequency)와 에러율을 계산하였다. 그 결과는 하기의 표 3과 같으며, Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 PCR 정확성은 Pfu DNA 중합효소에 비해서는 비슷하였으나, 일반적인 PCR에 주로 이용되어지는 Taq DNA 중합효소에 비해서는 훨씬 높아 Tcel DNA 중합효소 및 TcelA752K/N213D DNA 중합효소가 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 이용되어질 수 있음을 확인하였다.
Tcel, TcelA752K/N213D, Taq 및 Pfu DNA 중합효소와의 PCR 산물의 에러율 (error rate) 비교
콜로니 개수 돌연변이
빈도		 주형 더블링
(Template doublings)		 에러 발생율
(x 10-6)
Blue White
Tcel 5512 112 0.020 7.14 3.37
TcelA752K/N213D 6009 197 0.022 8.41 3.15
Pfu 5732 85 0.014 7.33 2.30
Taq 5283 372 0.060 8.87 8.13
본 발명은 야생형 Tcel DNA 중합효소를 제공한다. 또한 종래 야생형보다 PCR 신장 속도와 증폭가능 길이가 월등히 향상되었지만 PCR 정확성에서는 야생형과 비슷한 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 제공한다. 그러므로 본 발명은 유전공학연구, 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단, GMO 및 법의학적 연구에 이르는 광범위한 분야에서, 응용이 기대된다.
농업유전자원센터 KACC91614 20101220
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Thermococcus celericrescens DNA polymerase and Thermococcus celericrescens A752K/N213D DNA polymerase and their use <130> P11-0005/SKK <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer T-111N <400> 1 gartacgaca tacccttygc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer T-CR <400> 2 aacctggttc tcratktagt a 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Tcel-N1 <400> 3 ctcgttttca tcggcgtagc tta 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Tcel-N2 <400> 4 gaactcctcg ccctcgtggt a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Tcel-C1 <400> 5 agaggcgtga agatacggcc g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Tcel-C2 <400> 6 gaaggactac aaggccacag gcc 23 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TcelN <400> 7 nnnnnnncat atgatactcg ataccgatta catcacc 37 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TcelC <400> 8 nnnnnngtcg accttcttcc ccttcggctg caac 34 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TcelA752K-F <400> 9 cttcggctac cggaaggagg atttgc 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TcelA752K-R <400> 10 gcaaatcctc cttccggtag ccgaag 26 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TcelN213D-F <400> 11 cctacaacgg cgacgacttc gacttcgc 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TcelN213D-R <400> 12 gcgaagtcga agtcgtcgcc gttgtagg 28 <210> 13 <211> 2328 <212> DNA <213> Thermococcus celericrescens <400> 13 atgatactcg ataccgatta catcaccgaa gatgggaagc ccgtcataag gatattcaag 60 aaggataacg gcgagttcaa gatagaatat gacaggaact ttgagcccta catctacgct 120 ctcctgaggg acgattctgc catagaggac gtcaagaaga taaccgccga gcgccacggc 180 agggtcgtta aggtgaagcg cgccgagaag gttaagaaga agttcctcgg caggccggtg 240 gaggtctgga agctctattt cacccgcccc caggacgtcc cggctataag ggacaggata 300 cgtgcccatc ctgccgtcgt tgacatctac gagtacgaca tcccatttgc caagcgctac 360 ctcatagaca agggcataat cccgatggaa ggcgacgagg agctcaagat gctggcattt 420 gacatcgaga cgctctacca cgagggcgag gagttcgctg aggggcccat tttgatgata 480 agctacgccg atgaaaacga ggcacgcgtt atcacgtgga agaaaattga cctgcccttc 540 gttgacgttg tctccaccga gaaggagatg ataaagcgct ttctgaaggt catcaaagaa 600 aaagaccccg acgtgctcat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctcaaa 660 aagcgctgcg aaaagttcgg gataaagttc acccttggca gggacggctc ggatccaaaa 720 atccagcgca tgggggacag atttgcggtc gaggtgaagg ggaggattca cttcgacctc 780 taccccgtca tactgcgcac cgtcaacctg cccacataca cgcttgaagc tgtctacgag 840 gcaattttcg gcacccctaa ggagaaggtc taccccgagg agataaccac cgcctgggag 900 accggcgagg ggcttgaaag ggtcgcgcgc tattccatgg aggacgctaa agtcaccttc 960 gagcttggaa gggagttctt cccgatggag gcccaacttt cgcggttggt aggtcaaagc 1020 ttctgggacg tctcccgttc aagcaccggc aacctcgtgg agtggttttt gcttagaaag 1080 gcctacgaga ggaacgagct cgctccaaac aagccagatg agagggagct agtgaggaga 1140 aggaacagtt acaccggcgg ctacgttaag gaaccagaac ggggattatg ggacaatatt 1200 gtgtacctgg actttcgtag tctctaccct tcaatcatca tcacccacaa cgtctcacca 1260 gatacgctga accgcgaggg ctgtaaggag tatgacgagg ccccgcaggt tggccacaag 1320 ttttgtaagg acttccccgg cttcatcccg agcctcctcg gaaacctgct cgacgagaga 1380 cagaagataa agaagcgcat gaaggccacg atagacccgc tggagaagaa gctcctcgat 1440 tacaggcagc gggccattaa gatactggcc aactcttatt atgggtacta tgcctacgcc 1500 cgcgctcgct ggtactgcaa ggagtgcgcc gagagcgtta cggcatgggg aagggagtat 1560 attgaaatga gcatacggga gatagaggag aaatacggct ttaaagtcct ctacgcggac 1620 acggatgggt tccatgcgac aattccagga gctgacgccg aaactgtcaa aaagaaggcg 1680 atggagttcc ttaagtacat caacgccaaa ctccccggtg cgcttgagct cgagtacgag 1740 ggcttttaca agaggggttt cttcgtcacc aagaaaaagt acgcggtaat agacgaagag 1800 ggcaagataa ccacgcgcgg acttgagatt gtgaggcgtg actggagcga gatagccaag 1860 gagacgcagg cgagggttct ggaggcgctg ttgaaggacg gtaacgtcga ggaagccgtg 1920 agcatagtta aggaagtgac ggaaaagttg ggcaagtacg aggttccgcc tgagaagctt 1980 gtaatccatg agcagataac gcgcgagctg aaggactaca aggccacagg cccgcacgtg 2040 gcgatagcga agcgtctggc cgcgagaggc gtgaagatac ggccgggaac tgtcatcagc 2100 tacatcgtgc tcaagggctc cgggaggata ggcgacaggg cgattccctt tgacgagttc 2160 gaccccacga agcacaggta cgatgctgag tactacatcg agaaccaggt tctcccggcc 2220 gtcgagagga ttctgaaggc cttcggctac cgggcggagg atttgcgcta ccagaagacg 2280 aggcaggttg ggctgggggt gtggttgcag ccgaagggga agaagtga 2328 <210> 14 <211> 775 <212> PRT <213> Thermococcus celericrescens <400> 14 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Asp Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asn Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Arg Val Val Lys 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr Arg Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Ile Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Phe Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Val Ile Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Phe Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Asp Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Leu Arg Thr Val Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Thr Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Pro Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Val Gly Gln Ser Phe Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Val Arg Arg Arg Asn Ser Tyr 370 375 380 Thr Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Glu Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Arg Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Ala Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Ser Ile Arg Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asn Val Glu Glu Ala Val 625 630 635 640 Ser Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Ala 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Val Trp 755 760 765 Leu Gln Pro Lys Gly Lys Lys 770 775 <210> 15 <211> 2328 <212> DNA <213> Thermococcus celericrescens <400> 15 atgatactcg ataccgatta catcaccgaa gatgggaagc ccgtcataag gatattcaag 60 aaggataacg gcgagttcaa gatagaatat gacaggaact ttgagcccta catctacgct 120 ctcctgaggg acgattctgc catagaggac gtcaagaaga taaccgccga gcgccacggc 180 agggtcgtta aggtgaagcg cgccgagaag gttaagaaga agttcctcgg caggccggtg 240 gaggtctgga agctctattt cacccgcccc caggacgtcc cggctataag ggacaggata 300 cgtgcccatc ctgccgtcgt tgacatctac gagtacgaca tcccatttgc caagcgctac 360 ctcatagaca agggcataat cccgatggaa ggcgacgagg agctcaagat gctggcattt 420 gacatcgaga cgctctacca cgagggcgag gagttcgctg aggggcccat tttgatgata 480 agctacgccg atgaaaacga ggcacgcgtt atcacgtgga agaaaattga cctgcccttc 540 gttgacgttg tctccaccga gaaggagatg ataaagcgct ttctgaaggt catcaaagaa 600 aaagaccccg acgtgctcat aacctacaac ggcgacgact tcgacttcgc ctacctcaaa 660 aagcgctgcg aaaagttcgg gataaagttc acccttggca gggacggctc ggatccaaaa 720 atccagcgca tgggggacag atttgcggtc gaggtgaagg ggaggattca cttcgacctc 780 taccccgtca tactgcgcac cgtcaacctg cccacataca cgcttgaagc tgtctacgag 840 gcaattttcg gcacccctaa ggagaaggtc taccccgagg agataaccac cgcctgggag 900 accggcgagg ggcttgaaag ggtcgcgcgc tattccatgg aggacgctaa agtcaccttc 960 gagcttggaa gggagttctt cccgatggag gcccaacttt cgcggttggt aggtcaaagc 1020 ttctgggacg tctcccgttc aagcaccggc aacctcgtgg agtggttttt gcttagaaag 1080 gcctacgaga ggaacgagct cgctccaaac aagccagatg agagggagct agtgaggaga 1140 aggaacagtt acaccggcgg ctacgttaag gaaccagaac ggggattatg ggacaatatt 1200 gtgtacctgg actttcgtag tctctaccct tcaatcatca tcacccacaa cgtctcacca 1260 gatacgctga accgcgaggg ctgtaaggag tatgacgagg ccccgcaggt tggccacaag 1320 ttttgtaagg acttccccgg cttcatcccg agcctcctcg gaaacctgct cgacgagaga 1380 cagaagataa agaagcgcat gaaggccacg atagacccgc tggagaagaa gctcctcgat 1440 tacaggcagc gggccattaa gatactggcc aactcttatt atgggtacta tgcctacgcc 1500 cgcgctcgct ggtactgcaa ggagtgcgcc gagagcgtta cggcatgggg aagggagtat 1560 attgaaatga gcatacggga gatagaggag aaatacggct ttaaagtcct ctacgcggac 1620 acggatgggt tccatgcgac aattccagga gctgacgccg aaactgtcaa aaagaaggcg 1680 atggagttcc ttaagtacat caacgccaaa ctccccggtg cgcttgagct cgagtacgag 1740 ggcttttaca agaggggttt cttcgtcacc aagaaaaagt acgcggtaat agacgaagag 1800 ggcaagataa ccacgcgcgg acttgagatt gtgaggcgtg actggagcga gatagccaag 1860 gagacgcagg cgagggttct ggaggcgctg ttgaaggacg gtaacgtcga ggaagccgtg 1920 agcatagtta aggaagtgac ggaaaagttg ggcaagtacg aggttccgcc tgagaagctt 1980 gtaatccatg agcagataac gcgcgagctg aaggactaca aggccacagg cccgcacgtg 2040 gcgatagcga agcgtctggc cgcgagaggc gtgaagatac ggccgggaac tgtcatcagc 2100 tacatcgtgc tcaagggctc cgggaggata ggcgacaggg cgattccctt tgacgagttc 2160 gaccccacga agcacaggta cgatgctgag tactacatcg agaaccaggt tctcccggcc 2220 gtcgagagga ttctgaaggc cttcggctac cggaaggagg atttgcgcta ccagaagacg 2280 aggcaggttg ggctgggggt gtggttgcag ccgaagggga agaagtga 2328 <210> 16 <211> 775 <212> PRT <213> Thermococcus celericrescens <400> 16 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Asp Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asn Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Arg Val Val Lys 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Lys Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr Arg Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Ile Ile Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Phe Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Val Ile Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asp Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Phe Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Asp Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Leu Arg Thr Val Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Thr Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Pro Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Val Gly Gln Ser Phe Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Val Arg Arg Arg Asn Ser Tyr 370 375 380 Thr Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Glu Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asn Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Arg Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Ala Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Ser Ile Arg Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asn Val Glu Glu Ala Val 625 630 635 640 Ser Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Val Trp 755 760 765 Leu Gln Pro Lys Gly Lys Lys 770 775

Claims (12)

  1. 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 써모코커스 씰러리크레센스로부터 분리된 Tcel DNA 중합효소.
  2. 제1항의 Tcel DNA 중합효소를 코딩하는, 서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 핵산 분자.
  3. 제1항의 Tcel DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터인 pTCEL인 벡터
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 미생물.
  5. 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 써모코커스 씰러리크레센스로부터 분리된 Tcel DNA 중합효소에서 점 돌연변이에 의하여 752번째 아미노산인 알라닌이 라이신으로, 213번째 아미노산인 아스파라진이 아스팔틱산으로 치환된, 서열번호 16의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Tcel DNA 중합효소는 pH 8.0의 pH, 70℃의 온도, 100 mM의 KCl 농도 및 2 mM의 Mg2+ 농도에서 최적의 활성을 나타내는 것임을 특징으로 하는 TcelA752K/N213D DNA 중합효소.
  7. 제5항의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 코딩하는, 서열번호 15의 염기서열로 이루어지는 핵산 분자.
  8. 제5항의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터인 pTCELM인 벡터.
  9. 제8항의 벡터로 형질전환된 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미생물이 pTCELM벡터로 형질전환된 대장균 Rosetta(DE3)pLysS / pTCELM (수탁번호 KACC91614P)인 미생물.
  11. 제1항의 Tcel DNA 중합효소 또는 제5항의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 포함하는 핵산 증폭 반응용 키트.
  12. 제1항의 Tcel DNA 중합효소 또는 제5항의 TcelA752K/N213D DNA 중합효소를 이용한, 중합효소 연쇄반응(PCR) 수행 방법.
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