JPH1189588A - 変性キメラｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

変性キメラｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number
JPH1189588A
JPH1189588A JP10208533A JP20853398A JPH1189588A JP H1189588 A JPH1189588 A JP H1189588A JP 10208533 A JP10208533 A JP 10208533A JP 20853398 A JP20853398 A JP 20853398A JP H1189588 A JPH1189588 A JP H1189588A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna polymerase
leu
glu
ala
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP10208533A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4350815B2 (ja
Inventor
Haaro Gerufuando Debitsudo
ハーロウ ゲルファンド デビッド
Roorensu Reichiyaato Furetsudo
ローレンス レイチャート フレッド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPH1189588A publication Critical patent/JPH1189588A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4350815B2 publication Critical patent/JP4350815B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 配列決定するため使用される従来のＤＮＡポ
リメラーゼは、種々の要素に対して影響を受け、配列決
定の精度を低める。 【解決手段】 サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラー
ゼからのＮ−末端領域、及びＴｍａ ＤＮＡポリメラー
ゼからのＣ−末端領域から成る熱安定性キメラＤＮＡに
関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、変異キメラ熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼ、それらの合成方法、及びそれら
の使用方法に関する。前記酵素は、多くの組換えＤＮＡ
技法、特に核酸配列決定、及びポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）による核酸増幅において有用である。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡを形成するためにデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の鋳型−指令された
（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）重合を触媒す
る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、種々のインビトロＤ
ＮＡ合成用途、例えばＤＮＡ配列決定及びＤＮＡ増幅に
使用される。典型的には、天然に存在するＤＮＡポリメ
ラーゼは、ヌクレオチド類似体の組込みに対して強く識
別する。この性質が、ＤＮＡ複製及び修復の同一性に寄
与する。しかしながら、ヌクレオチド類似体の組込み
は、多くのＤＮＡ合成用途、特にＤＮＡ配列決定のため
に有用である。
【０００３】引用により本明細書に組込まれるＳａｎｇ
ｅｒなど．，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．７４；５４６３−５４６７により初めに記
載された鎖終結（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ）法を用いるＤＮＡ配列決定反応は、合成の終結のた
めに異例な基質、すなわちジデオキシヌクレオチド三リ
ン酸（ｄｄＮＴＰ）に頼る。この鎖終結方法において
は、ＤＮＡポリメラーゼの従来の基質（ｄＮＴＰ）及び
鎖終結性の異例な基質（ｄｄＮＴＰ又はラベルされたｄ
ｄＮＴＰ）の両者が、反応に存在する。合成は、ｄｄＮ
ＴＰが組込まれるまで進行する。鎖−終結ｄｄＮＴＰが
適切な割合で組込まれることを保証するためには、ｄｄ
ＮＴＰの組込みに対する、これまでに利用されたＤＮＡ
ポリメラーゼの固有の識別能が、過剰のｄｄＮＴＰを供
給することによって克服された。
【０００４】色素−ターミネーター配列決定、すなわち
鎖終結法の変法は、合成を終結し、そして同時に、合成
されたＤＮＡをラベルするために、蛍光色素、たとえば
フルオレセイン又はローダミンによりラベルされたｄｄ
ＮＴＰを使用する。ｄｄＮＴＰ上での色素ラベルの存在
は、異例な基質の導入に対するＤＮＡポリメラーゼによ
る識別性を悪化せしめる。典型的には、鎖終結方法によ
る配列決定は、プライマー延長の反復された段階、続く
プライマー延長生成物−鋳型複合体の熱変性を用いて実
施される。サイクル配列決定として言及されるこの態様
は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて熱サイクラー
において実施される。サイクル配列決定を実施するため
のキットは、たとえばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏ
ｒｗａｌｋ，ＣＴから市販されている。
【０００５】種々の生物に由来する熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼは、文献に多数記載されており、そして当業者
に良く知られている。特定の例としては、サーマス属の
種々の種（アメリカ特許第５，４６６，５９１号を参照
のこと）、特に、アメリカ特許第４，８８９，８１８
号；第５，３５２，６００号；及び第５，０７９，３５
２号に記載されるサーマス・アクアチカスからのＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）；並びにア
メリカ特許第５，３７４，５５３号及び第５，４２０，
０２９号に記載されるサーマトガ・マリチマからのＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ）を挙げ
ることができる（前記特許のすべては、引用により本明
細書に組込まれる）。
【０００６】ＤＮＡポリメラーゼは典型的には、１又は
複数の関連するエキソヌクレオチド分解活性を有する。
たとえば、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮ
Ａの５′−末端（５′→３′エキソヌクレアーゼ活性又
は５′−ヌクレアーゼ活性として言及される）、及び一
本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３′−末端（３′→５′エキソ
ヌクレアーゼ活性として言及される）からのヌクレオチ
ドのエキソヌクレオチド分解除去を触媒する。対照的
に、サーマス属からのＤＮＡポリメラーゼは、５′−ヌ
クレアーゼ活性のみを有する。
【０００７】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びそれらの
関連する活性の総説は、Ａｂｒａｍｓｏｎ，１９９５，
ＰＣＲ Ｓｔｒａｔａｇｉｅｓ（Ｉｎｎｉｓなど．ｅ
ｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に見
出される。ＤＮＡ配列決定への使用のためには、関連す
るエキソヌクレオチド分解活性；すなわち５′−ヌクレ
アーゼ活性又は３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のい
づれかを欠いているＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
５′−ヌクレアーゼ活性を欠いている多くの熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼの変異形が、アメリカ特許第５，４６
６，５９１号（引用により本明細書に組込まれる）に記
載されている。
【０００８】ヨーロッパ特許出願第０６５５５０６号
（引用により本明細書に組込まれる）は、ジデオキシヌ
クレオチドを組込む増強された能力を有する変異誘発さ
れたＤＮＡポリメラーゼを記載する（また、引用により
本明細書に組込まれるアメリカ特許第５，６１４，３６
５号も参照のこと）。その変異は、Ｔ７ ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸５２６に対応する点変異である。その
ような変異の例は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミ
ノ酸６６７における変異を包含する。
【０００９】Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポ
リメラーゼＦＳ、すなわち５′−ヌクレアーゼ活性を実
質的に有さず、そしてＦ６６７Ｙ変異を組込むＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼの変異形は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴによりＤＮＡサイクル配列
決定キットの成分として市販されている。Ｆ６６７Ｙ変
異は、ｄｄＮＴＰに対する識別における有意な低下をも
たらす。この性質は、色素−ターミネーター配列決定反
応から得られた配列決定データを非常に改良し、そして
個々の配列決定反応のために必要とされるｄｄＮＴＰの
量を減じる。
【００１０】しかしながら、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録
商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳの使用は、標準的ローダ
ミン色素ファミリーによりラベルされたｄｄＮＴＰと共
に使用される場合、配列決定トレースにおけるピークの
高さの不均等性に関する問題を排除しない。色素−ター
ミネーターサイクル配列決定反応におけるＡｍｐｌｉＴ
ａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いて得ら
れたピークの高さのパターンの分析が、Ｐａｒｋｅｒな
ど．，１９９６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１
（４）：６９４−６９９（引用により本明細書に組込ま
れる）に記載されている。
【００１１】当業者に知られている、分子生物学及び核
酸化学の従来の技法は、文献に十分に説明されている。
たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａ
ｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａ
ｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ．ｅｄｓ．，１９８
４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）（すべ
ては、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこ
と。そこに引用されるすべての特許、特許出願及び出版
物は、引用により本明細書に組込まれる。
【００１２】
【発明の要約】本発明は、これまで記載された熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼに対して有意に改良された性質を有
する変異キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
前記ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定反応に使用
される場合、実質的な改良点を付与する。特に、本発明
のＤＮＡポリメラーゼは、次の好都合な性質の組合せを
提供する： −ｄｄＮＴＰの改良された組込み； −特に、サイクル配列決定反応において色素−ラベルさ
れたｄｄＮＴＰと共に使用される場合、ＤＮＡ配列決定
トレースにおけるピークの高さの改良された均等性； −色素−ラベルされたｄｄＮＴＰのピロリン酸分解の速
度の抑制；及び −ｄＩＴＰの改良された組込み。
【００１３】さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、組換え発
現系において高いレベルで容易且つ効果的に発現され
得、それにより、酵素の商業的製造を促進する。本発明
のＤＮＡポリメラーゼが有する前記性質の組合せは、文
献においてこれまで記載された熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼよりも有意な利点を表わす。本発明のキメラＤＮＡ
ポリメラーゼは、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラ
ーゼの５′−ヌクレアーゼドメインに由来するＮ−末端
領域、及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エ
キソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインに由来する
Ｃ−末端から成る。
【００１４】前記Ｎ−末端領域は、Ｔｍａ ＤＮＡポリ
メラーゼのアミノ酸１−１３８に対応するサーマス・ス
ペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域を少なくとも含み、
そしてサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの完全
な５′−ヌクレアーゼドメインまでを含むことができ
る。前記Ｃ−末端領域は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ
の３′→５′エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメ
インの他に、Ｎ−末端領域に存在しないサーマス・スペ
ーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメイ
ンの部分に対応するＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの５′
−ヌクレアーゼドメインの部分を含む。
【００１５】従って、本発明のキメラＤＮＡポリメラー
ゼは、Ｎ−末端領域及びＣ−末端領域から成り、ここで
前記Ｎ−末端領域は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリ
メラーゼのアミノ酸１〜ｎから成り、ここでｎはＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１３８−２９１に対応
する、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域
内のアミノ酸位置であり、そして前記Ｃ−末端領域は、
Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸ｍ＋１〜８９３
から成り、ここでＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼにおける
アミノ酸ｍは、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ及びサーマ
ス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼが図におけるように
整列される場合、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラ
ーゼにおけるアミノ酸ｎに対応する。
【００１６】本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、ジ
デオキシヌクレオチドを組込むＤＮＡポリメラーゼの能
力を高める、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼに由来するＤ
ＮＡポリメラーゼにおけるＦ７３０Ｙ変異により修飾さ
れる。１つの態様においては、キメラＤＮＡポリメラー
ゼの５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアー
ゼ活性を実質的に減じ、又は好ましくは不活性化する少
なくとも１つの点変異を含む。その変異は、サーマス・
スペーシスＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼド
メインに由来するＮ−末端に、又は存在するなら、Ｔｍ
ａ ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメイン
に由来するＣ−末端領域の部分に存在することができ
る。
【００１７】適切な変異は、ＤＮＡポリメラーゼにおけ
る５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ、又は好まし
くは不活性化するそれらの変異（単一のアミノ酸置換又
は欠失変異）である。従って、Ｎ−末端領域が、サーマ
ス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼにおける５′−ヌク
レアーゼ活性を実質的に減じるか又は排除する少なくと
も１つのアミノ酸の置換又は欠失により修飾され、又は
前記Ｃ−末端領域が、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼにお
ける５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じるか、又は
排除するＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸ｍ＋１
〜２９１である領域内での少なくとも１つのアミノ酸の
置換又は欠失により修飾される。
【００１８】ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼ
活性に対して決定的であるアミノ酸位置は、本明細書に
記載されるように、良く知られている。１又は複数のそ
れらの決定的位置でのアミノ酸の置換、又は１又は複数
のそれらの決定的位置でのアミノ酸の欠失は典型的に
は、５′−ヌクレアーゼ活性の低下をもたらす。好まし
くは、キメラＤＮＡポリメラーゼは、５′−ヌクレアー
ゼ活性を実質的に減じるか、又は不活性化する変異を含
む。
【００１９】１つの態様において、Ｔｍａ ＤＮＡポリ
メラーゼに由来する３′→５′−エキソヌクレアーゼド
メインを含むＣ−末端領域は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラ
ーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を実質
的に減じるか、又は好ましくは不活性化する少なくとも
１つの点変異を含む。ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′
エキソヌクレアーゼ活性に対して決定的であるアミノ酸
位置は、本明細書に記載されるように良く知られてい
る。１又は複数のそれらの決定的位置でのアミノ酸の置
換、又は１又は複数のそれらの決定的位置でのアミノ酸
の欠失は、典型的には、３′→５′−ヌクレアーゼ活性
の低下をもたらす。好ましい態様においては、Ｃ−末端
領域は、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を不活性化
する、Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異を含む。
【００２０】１つの態様において、Ｎ−末端領域は、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼに由来する。好ましい態様に
おいては、Ｎ−末端領域は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼのアミノ酸１−１９０から成り、そしてＣ−末端領域
はＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−８９
３から成る。Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ＤＮＡポリメラー
ゼと称する特に好ましい態様においては、Ｎ−末端領域
はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０か
ら成り、そしてＧ４６Ｄ変異を含み、そしてＣ−末端領
域は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−
８９３から成り、そしてＤ３２３Ａ，Ｅ３２５Ａ及びＦ
７３０Ｙ変異を含む。
【００２１】本発明のもう１つの観点は、本発明の変異
キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする精製さ
れたＤＮＡ（キメラ遺伝子）、前記ＤＮＡを含む組換え
ＤＮＡベクター、及び前記組換えＤＮＡベクターにより
形質転換された宿主細胞に関する。サイレントヌクレオ
チド変化によってのみ異なる（すなわち、同じアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列は、本発明の範囲内であ
る。
【００２２】本発明の好ましい態様においては、精製さ
れたＤＮＡは、Ｇ４６Ｄ変異をコードするよう修飾され
たＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のヌ
クレオチド１−５７０、及びＤ３２３Ａ，Ｅ３２５Ａ及
びＦ７３０Ｙ変異をコードするよう修飾されたＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド
５７１−２６７９から成る。本発明のもう１つの観点
は、本発明の精製されたＤＮＡを用いて、本発明の変異
キメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを製造するための方
法に関する。組換え発現ベクターは、宿主細胞において
発現され、そしてその発現されたタンパク質は宿主細胞
から精製される。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明は、変異キメラ熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、及び前記酵素を製造するための手段
を提供する。本発明の理解を促進するために、多くの用
語が下記に定義される。用語“細胞”、“細胞系”、及
び“細胞培養物”は、交換可能的に使用され得、そして
すべてのそのような名称は子孫を包含する。従って、用
語“形質転換体”又は“形質転換された細胞”は、形質
転換された一次細胞、及びトランスファーの数に関係な
くその細胞に由来する培養物を包含する。すべての子孫
は、意図的な又は偶然な変異のために、ＤＮＡ含有率に
おいては、正確には同一ではない。初めに形質転換され
た細胞においてスクリーンされる場合、同じ官能性を有
する変異子孫が、形質転換体の定義に包含される。
【００２４】用語“制御配列”とは、特定の宿主生物に
おいての作用可能に連結されたコード配列の発現のため
に必要なＤＮＡ配列を意味する。たとえば、原核生物の
ために適切である制御配列は、プロモーター、任意に
は、オペレーター配列、リボソーム結合部位、正のレト
ロレギュレーション要素（引用により本明細書に組込ま
れるアメリカ特許第４，６６６，８４８号を参照のこ
と）、及びおそらく他の配列を包含する。真核細胞は、
プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサ
ーを利用することが知られている。
【００２５】用語“発現クローン”とは、作用可能な連
鎖で所望のコード配列及び制御配列を含むＤＮＡ配列を
意味し、その結果、それらの配列により形質転換された
宿主は、コードされたタンパク質を生産することができ
る。用語“発現系”とは、発現クローンにより形質転換
された宿主を意味する。形質転換をもたらすためには、
発現クローンがベクター上に含まれ得るが、しかしなが
ら、その対応するＤＮＡはまた、宿主染色体中に組込ま
れてもよい。用語“遺伝子”とは、回収できる生物活性
ポリペプチド又は前駆体の生成のために必要な制御及び
コード配列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。
【００２６】用語“作用可能に連結される”とは、制御
配列がコード配列によりコードされるタンパク質の発現
を誘導するよう機能するであろうようなコード配列の位
置を意味する。従って、配列を制御するために、“作用
可能に連結される”コード配列は、そのコード配列が制
御配列の指令下で発現され得る配置を意味する。
【００２７】用語“オリゴヌクレオチド”とは、本明細
書において使用される場合、複数のデオキシリボヌクレ
オチド又はリボヌクレオチドから構成される分子として
定義される。その正確な大きさは、多くの要因に依存
し、すなわちオリゴヌクレオチドの究極的な機能又は用
途に依存する。オリゴヌクレオチドは、たとえば適切な
配列のクローニング及び制限酵素処理を包含する任意の
適切な方法、及び次の方法による直接的な化学合成によ
り調製され得る：Ｎａｒａｎｇなど．，１９７９，Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリ
エステル方法；Ｂｒｏｗｎなど．，１９７９，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジ
エステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅなど．，１９８１，Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１ ８５９−
１８６２のジエチルホスホラミジット方法；及びアメリ
カ特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法（それ
らの文献は、引用により本明細書に組込まれる）。合成
方法の総説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９０，Ｂｉｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １（３）：
１６５−１８７（引用により本明細書に組込まれる）に
提供される。
【００２８】用語“プライマー”とは、本明細書におい
て使用される場合、プライマー延長が開始される条件下
で配置される場合、合成の開始の点として作用すること
ができるオリゴヌクレオチドを意味する。核酸鎖に対し
て相補的であるプライマー延長生成物の合成は、適切な
温度で、適切な緩衝液において、必要な４種の異なった
ヌクレオシド三リン酸及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
の存在下で開始される。“緩衝液”は、補因子（たとえ
ば二価の金属イオン）、及び所望するpHに調節された塩
（適切なイオン強度を提供するために）を包含する。
【００２９】遺伝子配列の非コード鎖にハイブリダイズ
する（同等には、コード鎖のサブ配列である）プライマ
ーは、本明細書においては、“上流”プライマーとして
言及される。遺伝子配列のコード鎖にハイブリダイズす
るプライマーは、本明細書において、“下流”プライマ
ーとして言及される。用語“制限エンドヌクレアーゼ”
及び“制限酵素”とは、特定のヌクレオチド配列で又は
その近くで二本鎖ＤＮＡを切断する、典型的には細菌起
源の酵素を意味する。
【００３０】用語“熱安定性酵素”とは、本明細書で使
用される場合、熱に対して安定であり、そして高温反応
最適条件を有する酵素を意味する。本発明の熱安定性酵
素は、６０〜９０℃の温度でプライマー延長を最適に触
媒し、そして典型的には、サイクル配列反応及びポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅において使用される温度サイクル条
件下で使用できる（引用により本明細書に組込まれるア
メリカ特許第４，９６５，１８８号に記載される）。本
明細書において使用される場合、アミノ酸配列における
“点変異”とは、単一のアミノ酸の置換又は単一のアミ
ノ酸の欠失のいづれかを意味する。点変異は好ましく
は、コードＤＮＡにおける適切なコドン変化によりアミ
ノ酸配列中に導入される。
【００３１】配列における個々のアミノ酸は、本明細書
においてＡＮとして表わされ、ここでＡは配列における
アミノ酸についての標準の一文字記号であり、そしてＮ
は前記配列における位置である。アミノ酸配列内の変異
は、本明細書においてＡ1 ＮＡ2 として表わされ、ここ
でＡ1 は変異誘発されていないタンパク質配列における
アミノ酸についての標準の一文字記号であり、Ａ2 は変
異誘発されたタンパク質配列におけるアミノ酸について
の標準の一文字記号であり、そしてＮはアミノ酸配列に
おける位置である。
【００３２】たとえば、Ｇ４６Ｄ変異は、アミノ酸位置
４６でのグリシンからアスパラギン酸への変更を表わ
す。そのアミノ酸位置は、変異を包含する領域が由来す
るタンパク質の完全な長の配列に基づいて番号付けされ
る。従って、本発明においては、サーマス・スペーシス
ＤＮＡポリメラーゼに由来するタンパク質の領域におけ
る変異が、完全な長さのサーマス・スペーシスＤＮＡポ
リメラーゼ配列に従って番号付けされ、そしてＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼに由来する領域における変異が完全
な長さのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ配列に従って番号
付けされる。ＤＮＡ配列におけるヌクレオチド及び点変
異の表示は類似する。
【００３３】本明細書において使用される場合、“キメ
ラ”タンパク質とは、そのアミノ酸配列が少なくとも２
つの異なったタンパク質からのアミノ酸配列のサブ配列
の融合生成物を表わすタンパク質を意味する。キメラタ
ンパク質は、好ましくは、アミノ酸配列の直接的な操作
により生成されないが、しかしむしろ、キメラアミノ酸
配列をコードする“キメラ”遺伝子から発現される。本
発明のキメラタンパク質は、サーマス・スペーシスＤＮ
Ａポリメラーゼに由来するアミノ−末端（Ｎ−末端）、
及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼに由来するカルボキシ
−末端（Ｃ−末端）から成る。
【００３４】前記Ｎ−末端領域は、Ｎ−末端（アミノ酸
位置１）から内部アミノ酸に延長する領域を意味する。
同様に、前記Ｃ−末端領域は、内部アミノ酸からＣ−末
端に延長する領域を意味する。本発明のキメラタンパク
質においては、Ｎ−末端領域はＮ−末端（アミノ酸位置
１）からＣ−末端領域の開始点（これは、Ｃ−末端に延
長する）に延長する。従って、一緒に取られる場合、Ｎ
−末端及びＣ−末端領域は、完全なアミノ酸配列を包含
する。
【００３５】ＤＮＡポリメラーゼに関連するエキソヌク
レオチド分解活性（３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
及び５′−ヌクレアーゼ活性、また５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性としても言及される）、及びそれらの活
性を測定する方法は、当業界において知られている。本
明細書において使用される場合、活性は、変異誘発され
ていない酵素に存在する活性の、約２０％以下、好まし
くは、約１０％以下、そしてより好ましくは約１％以下
に減じられる場合、“実質的に減じられる”。活性は、
酵素の典型的な又は好ましい使用のために無視できるレ
ベルに減じられる場合、“不活性化され”、又は“実質
的に不活性化される”。
【００３６】本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ 本発明の典型的な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ−
末端領域がサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの
Ｎ−末端領域から成り、そしてＣ−末端領域がＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端領域から成るキメラＤＮ
Ａポリメラーゼである。サーマス・スペーシスＤＮＡポ
リメラーゼからのＮ−末端領域は、５′−ヌクレアーゼ
ドメインの一部又はすべてを包含する。Ｔｍａ ＤＮＡ
ポリメラーゼからのＣ−末端領域は、５′−ヌクレアー
ゼドメインの一部を含むか、又はおそらく全く含まず、
且つ完全な３′→５′エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポ
リメラーゼドメインを含む。
【００３７】キメラタンパク質のＣ−末端領域により包
含されるＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレア
ーゼドメインの一部は、キメラタンパク質のＮ−末端領
域により包含されないサーマス・スペーシスＤＮＡポリ
メラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのその一部に対
応するであろう。キメラＤＮＡポリメラーゼはさらに、
ＤＮＡポリメラーゼがｄｄＮＴＰを組込む効率を高める
Ｆ７３０Ｙ変異を含む。キメラＤＮＡポリメラーゼは、
好ましくはまた、５′−ヌクレアーゼ活性を有意に減じ
るか又は排除する１又は複数の点変異、及び３′→５′
エキソヌクレアーゼ活性を有意に減じるか又は排除する
１又は複数の点変異を含む。
【００３８】１．キメラタンパク質ドメイン サーマス属の種からのＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼは、全体の構造において類似す
る。それらのＤＮＡポリメラーゼにおいては、エキソヌ
クレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ活性は、タンパク質
の別々の領域（活性ドメイン）に存在する。代表的なサ
ーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ、及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼのお
おまかな活性ドメインは、下記表に示されている（ま
た、アメリカ特許第５，４２０，０２９号を参照のこ
と）。
【００３９】５′−ヌクレアーゼ活性をコードする相同
活性ドメイン、及びＤＮＡポリメラーゼ活性をコードす
るそれらのドメインは、ほぼ同じ長さである（図１及び
２を参照のこと）。Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼにおけ
る３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をコードする領域
と、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおけるその対応する
領域との間の長さの差異は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の欠失に
対応する。
【００４０】
【表１】
【００４１】有意なアミノ酸類似性が、サーマス・スペ
ーシスＤＮＡポリメラーゼとＴｍａＤＮＡポリメラーゼ
との間に存在する。たとえば、欠失パラメーター値を有
するＧＡＰコンピュータープログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）を用いての、代表的なサーマス・スペーシスＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ
ｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列比較は、その
アミノ酸配列がその完全なアミノ酸配列又は５′−ヌク
レアーゼドメインのいづれかに対して約４４％同一であ
り、そして６６％類似する。
【００４２】全体の構造の及び配列の類似性のために、
キメラ酵素はＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼに存在する全
体の構造及び活性ドメインを保存する。実質的な変化
は、キメラ酵素のＮ−末端領域のアミノ酸配列がサーマ
ス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼのその対応する領域
のアミノ酸配列であることである。従って、本発明のキ
メラ酵素は、その５′−ヌクレアーゼドメインがサーマ
ス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのその対応する
ドメインにより置換されている変異誘発されたＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼに対応する。その“対応するドメイ
ン”とは、本明細書において、図に提供されるように、
アミノ酸配列の整合性により定義される。
【００４３】図１及び２は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラー
ゼ、及び７種の代表的なサーマス・スペーシスＤＮＡポ
リメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配
列整合性を提供する。７種の代表的なサーマス・スペー
シスＤＮＡポリメラーゼは、本明細書において使用され
る略語、及び５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配
列のための配列番号と共に下記表に列挙される。
【００４４】
【表２】
【００４５】それらのＤＮＡポリメラーゼ内のアミノ酸
及び領域の対応は、アミノ酸配列整合から得られる。本
明細書で使用される場合、アミノ酸は、それらが図１及
び２の配列整合で配列される場合、“対応する”。従っ
て、対応とは、配列間で同一である（保存される）アミ
ノ酸及び同一ではないが、しかし全体の配列相同性を最
大にするために整合されるアミノ酸の両者を意味する。
【００４６】サーマス属の多くのさらなる種が同定され
ており、そしてＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及びＤｅｕｔ
ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）のような寄託機関から入手
できる。下記で論ぜられるように、ＤＮＡポリメラーゼ
及びコード遺伝子は、寄託された菌株から回収され、そ
して通常の手段で配列決定され得る。たとえばＧＡＰプ
ログラムを用いてのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ配列と
サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ配列とのアミ
ノ酸配列の通常の配列整合は、本発明のキメラＤＮＡポ
リメラーゼへのサーマスＤＮＡポリメラーゼ配列の使用
を可能にするであろう。
【００４７】本発明のキメラタンパク質においては、Ｔ
ｍａ ＤＮＡポリメラーゼからの領域の最初のアミノ酸
が、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ配列の最
後のアミノ酸に対応するアミノ酸に続くアミノ酸により
開始し、そしてＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ配列の残り
（アミノ酸８９３まで）を含むであろう。完全なＴｍａ
ＤＮＡポリメラーゼの配列は、配列番号１０として提
供される。
【００４８】好ましくは、サーマス・スペーシスＤＮＡ
ポリメラーゼからのアミノ酸配列は、２種のアミノ酸配
列が同一であるか又は類似する点で、Ｔｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼからのアミノ酸配列に連結される。たとえ
ば、好ましい態様は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼからの
アミノ酸１−１９０及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの
アミノ酸１９１−８９５から成る。Ｔｍａ ＤＮＡポリ
メラーゼのアミノ酸１９０は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼのアミノ酸１９０に対応し、そしてキメラ酵素のＴ
ｍａ ＤＮＡポリメラーゼ部分は、次のアミノ酸、すな
わちアミノ酸１９１から開始する。
【００４９】２種のＤＮＡポリメラーゼが同一である領
域においては、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラー
ゼからの最後のアミノ酸の同定は、前記領域内で任意で
ある。たとえば、アミノ酸１９１及び１９２はＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼに
おいて同一である（そして、サーマス・スペーシスＤＮ
Ａポリメラーゼ内で保存される）ので、Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸１−１９０を含むキメラタンパ
ク質は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１
９１又は１−１９２を含むキメラタンパク質から区別が
つかない。実施例に記載される本発明の態様は、酵素の
最初の起源の観点から、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの
アミノ酸１−１９０を含むものとして言及される。
【００５０】図１及び２に提供される配列の整合におて
は、１つのアミノ酸の長さのギャップが位置５４〜５５
及び２２５〜２２６でＴｍａ ＤＮＡ配列中に挿入さ
れ、７種のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの
内のそれらの位置で追加のアミノ酸を含む５種との整合
が可能にされた。従って、それらの５種のサーマス・ス
ペーシスに存在するそれらの２個のアミノ酸について
は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼに対応するアミノ酸が
存在しない。当業者は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼに
おけるギャップと整合されるアミノ酸を末端とする、そ
れらの５種のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ
の１つからのＮ−末端領域を含む適切なキメラタンパク
質が、構成され得ることを十分に理解し、ここで前記Ｔ
ｍａ ＤＮＡポリメラーゼ由来の領域は、前記ギャップ
に続く最初のアミノ酸で開始する。
【００５１】キメラＤＮＡポリメラーゼの決定的な観点
は、それが、完全な長さのＴｍａＤＮＡポリメラーゼに
おけるおおよそのコドン１３３−１３７で存在する少な
くとも代替的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）リボソーム結
合部位を通して、そして好ましくは、メチオニン１４０
開始コドンを通して、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ配列
をコードする領域が、サーマス・スペーシスＤＮＡポリ
メラーゼからのその対応する領域をコードする遺伝子配
列により置換されているキメラ遺伝子によりコードされ
ることである。
【００５２】この代替的リボソーム結合部位及び開始コ
ドンの完全な長さのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
における存在は、アミノ酸１４０で開始する切断された
Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼの選択的発現をもたらす。
下記に記載されるように、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子のこの領域の置換は、完全な長さのキメラタンパ
ク質の効果的な発現に対して決定的である。従って、本
発明のキメラＤＮＡポリメラーゼにおいては、サーマス
・スペーシスＤＮＡポリメラーゼからのＮ−末端領域
が、少なくともアミノ酸１３７までの、そして好ましく
はアミノ酸１４０までのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの
領域を置換する。
【００５３】Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１
−１３７に対応する個々のサーマス・スペーシスＤＮＡ
ポリメラーゼの領域が、図に提供されるように、アミノ
酸配列整合から得られる。たとえば、Ｔｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼのアミノ酸１−１３７に対応するＴａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼの領域はアミノ酸１−１４２であり
（図１及び２を参照のこと）、そしてＴｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼのＭ１４０に対応するＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸はＬ１４５である。
【００５４】従って、Ｎ−末端領域がＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼからである態様は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼの少なくともアミノ酸１−１４２、及び好ましくは
アミノ酸１−１４５を含んで成るであろう。同様に、Ｎ
−末端領域が他のサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラ
ーゼからである態様のためには、Ｔｍａ ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸１−１３７及び１４０に対応するサー
マス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼの領域が、図に提
供される配列整合から得られる。
【００５５】当業者は、マイナーな変異、付加又は欠失
が、酵素の機能特性を変更しないＤＮＡポリメラーゼ中
に導入され得、そしてそのような変異誘発された酵素
が、変異誘発されていない酵素に対して事実上、同等で
あることを理解するであろう。たとえば、いくつかのＮ
−末端アミノ酸のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおける
欠失が酵素の機能性を変更しないことは知られている。
同様に、多くのアミノ酸位置での置換変異が実質的に影
響を有さないように思えることは知られている。本発明
のためには、酵素の機能性を変更しないマイナーな変異
を含むＤＮＡポリメラーゼは、変異誘発されていないＤ
ＮＡポリメラーゼに等しいと思われる。
【００５６】２．５′−ヌクレアーゼドメインにおける
点変異 １つの態様において、キメラＤＮＡポリメラーゼの５′
−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌクレアーゼ活性を
減じるか又は排除する１又は複数の点変異（単一アミノ
酸置換又は欠失の変異）を含む。キメラタンパク質の
５′−ヌクレアーゼドメインはサーマス・スペーシスＤ
ＮＡポリメラーゼ及びほとんどの態様においては、Ｔｍ
ａ ＤＮＡポリメラーゼに由来する部分を含むので、
５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ又は排除する変
異は、サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ由来の
部分又はＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ由来の部分中に導
入され得る。
【００５７】アミノ酸配列の整合に基づいて、ＤＮＡポ
リメラーゼは、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ，II及び
III との相同性に従って、Ａ，Ｂ及びＣと称するグルー
プに分類されている（たとえば、Ｉｔｏ ａｎｄ Ｂｒ
ａｉｔｈｗａｉｔｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１９（１５）：４０４５−４０４７（引用により本明細
書に組込まれる）を参照のこと）。Ｔｍａ 及びサーマ
ス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．コリＤＮＡ
ポリメラーゼに関係するＡ ＤＮＡポリメラーゼのメン
バーである。Ａ ＤＮＡポリメラーゼ間に保存され、そ
してＤＮＡポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼのために
必須であるアミノ酸が同定されている（たとえば、Ｇｕ
ｔｍａｎなど．１９９３，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．２１：４４０６−４４０７（引用により本明細書に
組込まれる）を参照のこと）。
【００５８】Ａ ＤＮＡポリメラーゼにおける、５′−
ヌクレアーゼ活性のために必須であるアミノ酸の保存の
ために、１つのＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＥ．コリ
ＤＮＡポリメラーゼＩ又はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
における必須のアミノ酸の同定は、図１及び２に提供さ
れるような配列整合に基づいて他の種類のＡ ＤＮＡポ
リメラーゼにおける必須のアミノ酸の同定を可能にす
る。必須のアミノ酸は、本明細書に提供される配列との
通常の配列整合から追加のサーマス・スペーシスＤＮＡ
ポリメラーゼにおいて同定され得る。
【００５９】５′−ヌクレアーゼ活性のために必須であ
るものとして同定されているアミノ酸は、星印により図
１及び２に示されている。個々のＤＮＡポリメラーゼ内
の必須のアミノ酸の位置は、その整合性からーられる。
たとえば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ配列（配列番号
２）を参照すれば、それらの必須のアミノ酸は次の通り
である：Ｄ１８，Ｒ２５，Ｇ４６，Ｄ６７，Ｆ７３，Ｒ
７４，Ｙ８１，Ｇ１０７，Ｅ１１７，Ｄ１１９，Ｄ１２
０，Ｄ１４２，Ｄ１４４，Ｇ１８７，Ｄ１８８，Ｄ１９
１及びＧ１９５。
【００６０】追加の必須のアミノ酸が未来において同定
されるかどうかは、驚くべきではない。本明細書に記載
されるようなそれらのアミノ酸位置での変異が５′−ヌ
クレアーゼ活性の低下又は排除をもたらすので、そのよ
うな変異は本発明への使用のために適切である。
【００６１】一般的に、５′−ヌクレアーゼ活性を減じ
又は排除するためには、それらのアミノ酸位置の１又は
複数の位置が、欠失され、又は異なった性質を有するア
ミノ酸に変異誘発される。たとえば、酸性アミノ酸、た
とえばＡｓｐ（Ｄ）は、塩基性（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉ
ｓ）、中性（Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒ
ｏ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ）又は極性であるが、しか
し荷電されていないアミノ酸（Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
ｒ，Ｇｙｓ，Ｔｙｒ，Ａｓｎ又はＧｌｎ）に変更される
であろう。好ましいＧ４６Ｄ変異は、極性であるが荷電
されていないＧｌｙの代わりに酸性Ａｓｐを置換する。
一般的に、Ａｌａ又はＧｌｙに対する変異が、タンパク
質構造の変形を最少にするために好ましい。
【００６２】アミノ酸の電荷特性を保存する置換変異は
また、５′−ヌクレアーゼ活性を弱めることができる。
たとえば、アメリカ特許第５，４７４，９２０号（引用
により本明細書に組込まれる）は、５′−ヌクレアーゼ
活性を減じるか又は排除するＴａｑ ＤＮＡ配列におけ
る３種の変異を記載する。１つの変異、すなわちＲ２５
Ｃ（塩基性から、極性であるがしかし荷電されていない
ものへ）は異なった性質を有するアミノ酸への変化をも
たらすけれども、２つの変異、すなわちＦ７３Ｌ（中性
から中性）及びＲ７４Ｈ（塩基性から塩基性）は、性質
の変更をもたらさない。
【００６３】それにもかかわらず、すべての３種の変異
は、５′−ヌクレアーゼ活性を弱める。５′−ヌクレア
ーゼ活性に影響を及ぼす、個々の必須のアミノ酸位置で
の特定の変異は、ＤＮＡポリメラーゼを変異誘発し、そ
してその得られる活性を測定することによって、通常決
定され得る。敏感且つ便利なアッセイが、アメリカ特許
第５，４６６，５９１号（引用により本明細書に組込ま
れる）に記載される。
【００６４】好ましい態様においては、キメラＤＮＡポ
リメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインは、５′−ヌ
クレアーゼ活性を少なくとも１０００倍減じる、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼにおけるＧ４６Ｄ変異に対応する
変異を含む（アメリカ特許第５，４６６，５９１号を参
照のこと）。アミノ酸における変異は、コード遺伝子配
列に適切な変異を組込むことによって達成される。ＤＮ
Ａ配列におけるそのような変異は、下記にさらに記載さ
れるように、当業界において良く知られている技法を用
いて実施される。
【００６５】３．３′→５′エキソヌクレアーゼドメイ
ンにおける点変異 １つの態様においては、キメラＤＮＡポリメラーゼの
３′→５′エキソヌクレアーゼドメインは、３′→５′
エキソヌクレアーゼ活性を減じるか又は排除する１又は
複数の点変異（単一アミノ酸置換又は欠失の変異）を含
む。キメラタンパク質の３′→５′エキソヌクレアーゼ
ドメインは、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ由来の部分内
に含まれる。従って、適切な変異は、Ｔｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼの５′−ヌクレアーゼ活性を実質的に減じ又
は排除する変異である。
【００６６】Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼにおける３′
→５′エキソヌクレアーゼ活性のための必須の３種のア
ミノ酸“モチーフ”、及び個々のモチーフ内の必須のア
ミノ酸が同定されている（アメリカ特許第５，４２０，
０２９号を参照のこと）。前記決定的アミノ酸が下記に
列挙されている。Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼにおける
３′→５′エキソヌクレアーゼを減じる１又は複数のそ
れらのアミノ酸の変異が、本発明のＤＮＡポリメラーゼ
に使用され得る。
【００６７】
【表３】 追加の決定的アミノ酸が未来において同定されるかどう
かは驚くべきではない。本明細書に記載されるようなそ
れらのアミノ酸位置での変異は３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性の低下又は排除をもたらすので、そのような
変異は本発明への使用のために適切である。
【００６８】５′−ヌクレアーゼ活性の低下について上
記に記載されるように、３′→５′エキソヌクレアーゼ
活性の低下又は排除は、１又は複数のそれらの必須のア
ミノ酸位置での置換又は欠失変異、好ましくは異なった
性質を有するアミノ酸への置換変異により達成される。
好ましい態様においは、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼの
３′→５′エキソヌクレアーゼドメインが、３′→５′
エキソヌクレアーゼ活性を、共に実質的に排除するＤ３
２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異により変異誘発される。アミ
ノ酸配列における変異は、コード遺伝子配列に適切な変
異を組込むことによって達成される。ＤＮＡ配列におけ
るそのような変異は、下記にさらに記載されるように、
当業界において良く知られている技法を用いて実施され
る。
【００６９】本発明のＤＮＡポリメラーゼの利点 本発明のキメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、文献に
記載される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも有意な改
良点を示す。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、次
の性質の組合せを提供する： −特に、サイクル配列決定反応において色素−ラベルさ
れたｄｄＮＴＰと共に使用される場合、ＤＮＡ配列決定
トレースにおけるピークの高さの改良された均等性； −色素−ラベルされたｄｄＮＴＰのピロリン酸分解の速
度の低下；及び −ｄＩＴＰの改良された組込み。 −さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、組換え発現系におい
て、容易且つ効果的に、高レベルに発現され得、それに
より、酵素の商業的製造を促進する。
【００７０】本発明のＤＮＡポリメラーゼにより占有さ
れる性質の組合せは、特に色素−ターミネーターサイク
ル配列決定反応において有用であり、そして有意に改良
された結果を提供する。それらの性質の個々は下記に論
ぜられる。
【００７１】１．ｄｄＮＴＰの改良された組込み 本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰの組
込みの効率を高めることが知られているＦ７３０Ｙ変異
を含む。比較すれば、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）
ＤＮＡポリメラーゼＦＳは、類似する変異（Ｆ６６７
Ｙ）を含むＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの変異誘発され
た形である。Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポ
リメラーゼＦＳはまた、ｄｄＮＴＰの組込みの高められ
た効率を示すが、しかし本発明のＤＮＡポリメラーゼに
より示されるいくつかの他の性質を欠いている。
【００７２】２．ＤＮＡ配列決定トレースにおけるピー
クの高さの改良された均等性 本発明のＤＮＡポリメラーゼの好都合な性質は、色素−
ターミネーターサイクル配列決定反応に使用される場
合、それが配列決定トレース（また、クロマトグラム又
はエレクトロフェログラムとしても言及される）におけ
る均等なピークの高さをもたらすことである。不均等な
ピークの高さは、ベース・コーリング（ｂａｓｅ ｃａ
ｌｌｉｎｇ）の精度を低め、そして変異及び多型現象検
出をより困難にする。
【００７３】色素−ターミネーターサイクル配列決定反
応におけるピークの高さの不均等性は、これまで解決さ
れていない問題である。たとえば、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ
（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳは、変異誘発され
ていないＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼよりもより効果的
にｄｄＮＴＰを組込むが、色素−ターミネーター配列決
定反応において得られるピークの高さのパターンは不均
等である（Ｐａｒｋｅｒなど．，１９９６，ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１（４）：６９４−６９９（引用
により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。
【００７４】その不均等性は、配列内容に基づくピーク
の高さの依存性に少なくとも起因する。たとえば、Ａに
続くＧから得られるピークの高さは、非常に小さく、正
確なベース・コールを困難にする。逆に言えば、Ｇに続
くＡから得られるピークの高さは非常に高い。特に問題
のあるパターンは、Ａ又はＣの後のＧ，Ａ又はＣの後の
Ａ、及びＴの後のＴを包含し、これらは非常に低いピー
クの高さをもたらすことがある。非常に高いピーク、た
とえばＧの後のＡからの結果は、単独ではほとんどの問
題はないが、しかし隣接する低いシグナルを判読しにく
くする。
【００７５】実施例に示されるように、サイクル配列決
定反応への本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの使用
は、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼＦＳを用いて得られるよりも有意により均等なピーク
の高さをもたらす。ピークの高さにおける改良された均
等性は、基本コーリングの精度の有意な上昇をもたら
し、そして変異及び多型現象検出を容易にする。
【００７６】３．色素−ラベルされたｄｄＮＴＰのピロ
リン酸分解の速度の低下 ＤＮＡポリメラーゼは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の付
随した開放を伴って、プライマーの３′−ヒドロキシル
末端上へのデオキシヌクレオチドの鋳型−依存的組込み
を触媒する。この重合反応は可逆的である。ＤＮＡポリ
メラーゼはまた、逆反応、すなわちＰＰｉの存在下での
ＤＮＡの分解であるピロリン酸分解を触媒する。その反
応は下記に要約される： ＤＮＡn ＋ｄＮＴＰ←−−→ＤＮＡn+1 ＋ＰＰｉ
【００７７】また、ピロリン酸ホスホヒドロラーゼとし
ても知られている無機ピロホスファターゼ（ＰＰアー
ゼ）は、オルトホスフェートの２つの分子への無機ピロ
ホスフェート（ＰＰｉ）の加水分解を触媒する。ＰＰア
ーゼは、ＲＮＡ及びＤＮＡ合成においてインビボで活性
役割を演じる。ＰＰｉを分解することによって、その酵
素は、合成のために全体の平衡性を変える。
【００７８】ピロリン酸分解は、ＤＮＡ配列決定反応に
対しては有害なものである。ＤＮＡ配列決定反応におけ
る精度は、正確なバンド位置に依存し、わずか１個のヌ
クレオチドのサイズ減少が、ゲル人工産物、たとえば減
じられた又は欠失したバンドをもたらすことがある。ピ
ロリン酸分解は、プライマー延長生成物の３′−末端か
らの塩基の除去をもたらす。さらに、ｄｄＮＴＰ−終結
フラグメントからの組込まれた末端ｄｄＮＴＰ（ジデオ
キシヌクレオシド−リン酸）の除去は、影響される位置
でのシグナル強度の低下、及びエレクトロフェログラム
における減じられた又はミッシングするピークを導びく
続く延長を可能にする。
【００７９】従って、配列決定反応においてピロリン酸
分解反応を最少にすることが所望される。前記反応への
ＰＰアーゼの添加は、ＰＰｉを分解することによって合
成のための全体の平衡性を変える。配列決定反応を改良
するためへのＰＰアーゼの使用は、Ｔａｂｏｒ ａｎｄ
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６５（１４）：８３２２−８３２８；及びＰ
ＣＴ特許出願ＷＯ９０／１２１１１に記載されている
（それらは、引用により本明細書に組込まれる）。Ａｍ
ｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを
含むＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）
からの市販のサイクル配列決定キットは、ピロリン酸分
解を減じるためにＰＰアーゼを含む。
【００８０】驚くべきことには、本発明のＤＮＡポリメ
ラーゼを用いるサイクル配列決定反応は、色素−ラベル
されたｄｄＮＴＰターミネーターのピロリン酸分解によ
りほとんど影響されない。実施例に記載されるように、
０〜２０単位の範囲のＰＰアーゼ濃度で実施されるサイ
クル配列決定反応は、実質的に同一の結果をもたらし
た。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サイクル
配列決定反応におけるＰＰアーゼの必要性を非常に減じ
又は排除するように見える。
【００８１】４．ｄＩＴＰの改良された組込み 典型的なサイクル配列決定反応においては、Ｇ／Ｃに富
む領域における圧縮を軽減するためにｄＩＴＰがｄＧＴ
Ｐの代わりに使用される。ＤＮＡ中へのｄＩＴＰの組込
みは、変性温度を低め、そして二次構造体の変性を促進
する。ＤＮＡポリメラーゼは異例なヌクレオチドである
ｄＩＴＰに対して識別するので、適切な組込みを得るた
めには、ｄＩＴＰの相対的濃度は、反応において実質的
に高められるべきである。
【００８２】たとえば、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳのために最適化される反応
条件においては、ｄＩＴＰは、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及び
ｄＴＴＰの濃度よりも５倍高い濃度で存在する。対照的
に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ｄＩＴＰをより効
果的に組込み、より均等なｄＮＴＰ濃度を伴ってのその
反応の実施を可能にする。実施例に記載されるように、
ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの濃度よりもわずか約
２〜３倍高いｄＩＴＰ濃度が、本発明のＤＮＡポリメラ
ーゼのために最適である。
【００８３】５．発現の効率 上記のように、本発明のキメラ酵素は、変異誘発された
Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼに対応し、ここでその５′
−ヌクレアーゼドメインはサーマス・スペーシスＤＮＡ
ポリメラーゼからのその対応するドメインにより置換さ
れている。前記酵素は変異誘発されたＴｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子に対応するキメラ遺伝子から発現さ
れ、ここで５′−ヌクレアーゼドメインをコードする遺
伝子の領域はサーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子のその対応する領域により置換されている。その
キメラ遺伝子の有意な利点は、それがＴｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子からであるよりもより一層、効果的に
組換え発現系においての完全な長さのＤＮＡポリメラー
ゼの発現を可能にすることである。
【００８４】完全な長さの天然のＴｍａ ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子配列を含む組換え発現系からのその完全な
長さのＤＮＡポリメラーゼの発現は、タンパク質の切断
された形の選択的発現のために問題がある（アメリカ特
許第５，４２０，０２９号を参照のこと）。Ｍｅｔ１４
０Ｔｍａとして言及される切断されたタンパク質は、完
全な長さのタンパク質のアミノ酸１４０−８９３から成
り、そして位置１４０でのメチオニンでの翻訳開始に起
因するように見える。コドン１３３−１３７での推定上
のリボソーム結合部位の存在は、切断されたタンパク質
が内部メチオニンでの翻訳開始に起因することをさらに
示唆する。Ｍｅｔ１４０Ｔｍａ切断タンパク質の選択的
発現は、完全な長さのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼの発
現及び精製における有意な困難性を提供する。
【００８５】キメラＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、完全
な長さのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中のおよそ
コドン１３３−１３７に存在する代替的（ａｌｔｅｒｎ
ａｔｉｖｅ）リボソーム結合部位までに少なくとも対応
する領域、そして好ましくは、内部開始コドン、すなわ
ちコドン１４０までの対応する領域にサーマス・スペー
シスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列を含む。従って、リ
ボソーム結合部位及び好ましくはＭｅｔ１４０Ｔｍａの
翻訳を担当する開始コドンを含む領域までのＴｍａ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子配列は、サーマス・スペーシス
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のその対応する領域により置
換される。サーマス・スペーシスＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子のその対応する領域は、切断されたタンパク質の不
所望の内部開始を提供しない。結果として、キメラＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を含む組換え発現系は、もっぱら
完全な長さのキメラＤＮＡポリメラーゼを発現する。
【００８６】本発明のＤＮＡポリメラーゼの調製 本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・スペーシス
ＤＮＡポリメラーゼに由来する部分、及びＴｍａ ＤＮ
Ａポリメラーゼに由来する部分から成るキメラ酵素であ
る。そのキメラ酵素は、キメラ遺伝子、すなわちキメラ
酵素をコードし、そしてサーマス・スペーシスＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子に由来する部分及びＴｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子に由来する部分から成るＤＮＡから調
製される。キメラ遺伝子は、下記に詳細に記載されるよ
うに、分子生物学の分野において良く知られている標準
の遺伝子操作技法を用いて、サーマス・スペーシスＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子から生成される。
【００８７】Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼをコードする
遺伝子は、アメリカ特許第５，４２０，０２９号及び第
５，４６６，５９１号に記載される。Ｔｍａ ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、及びそのコード
されたタンパク質の完全なアミノ酸配列が、そこに記載
されている。前記’０２９号特許の例５は、プラスミド
ｐＴｍａ０１（１９９０年１１月７日にＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．６８４７１の寄託番号下でＥ．コリＤＧ１０１，ｐ
ＢＳＭ：Ｔｍａ Ｘｍａ７−１として寄託される；１９
９８年５月２２日にＡＴＣＣ Ｎｏ．９８７６４として
再寄託される）及びｐＴｍａ０４（１９９０年１１月７
日にＡＴＣＣ Ｎｏ．６８４７２下でＥ．コリＤＧ１０
１，ｐＢＳＭ：Ｔｍａ Ｘｍａ１１−１δ Ｂａ／Ｂｇ
１として寄託される；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ
Ｎｏ．９８７６５として再寄託される）により開始す
る完全な長さのＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを含む種々
のプラスミド、たとえばプラスミドｐＴｍａ１２−１及
びｐＴｍａ１３の構成を記載する。それらの発現ベクタ
ーのいづれかが、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
源として適切である。
【００８８】ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド
配列及びそのコードされたタンパク質のアミノ酸配列を
包含する、多くのサーマス・スペーシスからのＤＮＡポ
リメラーゼをコードする遺伝子は記載されている。多く
のそれらの遺伝子は、公開されているプラスミドから得
ることができる。追加のサーマス・スペーシスからの遺
伝子は、アメリカ特許第５，０７９，３５２号；第５，
４５５，１７０号；第５，４０５，７７４号及び第５，
４６６，５９１号（引用により本明細書に組込まれる）
に記載される方法を用いて宿主生物から得られる。
【００８９】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードする
遺伝子は、アメリカ特許第５，０７９，３５２号及び第
５，４６６，５９１号に記載される。Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼのヌクレオチド配列、及びそのコードされた
タンパク質の完全なアミノ酸配列がそこに記載されてい
る。前記’３５２号特許の例Ｖ−VII は、プラスミドｐ
ＦＣ８３（１９８７年５月２９日に寄託されたＡＴＣＣ
６７４２２；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．９８７６３として再寄託された）及びｐＦＣ８５
（１９８７年５月２９日に寄託されたＡＴＣＣ ６７４
２１；１９９８年５月２２日にＡＴＣＣ Ｎｏ．９８７
６２として再寄託された）により開始する完全な長さの
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む種々の発現プ
ラスミド、たとえばプラスミドｐＬＳＰ１，ｐＬＳＧ
２，ｐＳＹＣ１５７８，ｐＬＳＧ５及びｐＬＳＧ６の構
成を記載する。それらの発現ベクターのいづれかが、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の源として適切であ
る。
【００９０】Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼをコードする
遺伝子、前記遺伝子を得るための方法、及び前記遺伝子
を含む発現プラスミドが、アメリカ特許第５，６１８，
７１１号及び第５，４６６，５９１号に記載される。Ｔ
Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、前記
遺伝子を得るための方法、及び前記遺伝子を含む発現プ
ラスミドが、アメリカ特許第５，４５５，１７０号及び
第５，４６６，５９１号に記載される。
【００９１】Ｔｓｐｓ１７ ＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする遺伝子、前記遺伝子を得るための方法、及び前記
遺伝子を含む発現プラスミドが、アメリカ特許第５，４
０５，７７４号及び第５，４６６，５９１号に記載され
る。Ｔｆｉ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、Ａｋｈｍｅ
ｔｚｊａｎｏｖ ａｎｄＶａｋｈｉｔｏｖ，１９９２，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０
（２１）：５８３９（引用により本明細書に組込まれ
る）に記載される。
【００９２】Ｔｆｉ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、参
照された特許に記載される方法を用いてＡＴＣＣ ４３
２８０から回収され得る（また、１９８４，ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２：１４９−１５３
（１９８４）も参照のこと）。Ｔｃａ ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子は、Ｋｗｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
ｓ ７（２）：２６４−２７１に記載されており；そし
てそのヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ
受託番号Ｕ６２５８４として入手できる。
【００９３】さらなるサーマス・スペーシスＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子は、次のＡＴＣＣ寄託から、上記引用さ
れる特許に記載される技法を用いて回収され得る：ＡＴ
ＣＣ４３８１４及び４３８１５（Ａｌｆｒｅｄｓｓｏ
ｎ，１９８６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．５２：１３１３−１３１６を参照のこと）；
ＡＴＣＣ ２７９７８（Ｒａｍａｌｅｙ，１９７０，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１４：５５６−５６２；１
９７３；前記、１０３：５２７−５２８を参照のこ
と）；ＡＴＣＣ ３１６７４（アメリカ特許第４，４４
２，２１４号及び第４，４８０，０３６号を参照のこ
と）；ＡＴＣＣ ３５９４８（Ｔ．ルベル（Ｔ．ｒｕｂ
ｅｒ），Ｌｏｇｉｎｏｖａ，１９８４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓ
ｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３４：４９８−４９９を
参照のこと）。すべての文献は引用により本明細書に組
込まれる。
【００９４】さらなるサーマス・スペーシスは、次のＤ
ｅｕｒｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）寄託から、上記引用さ
れる特許に記載される技法を用いて回収され得る：ＤＳ
Ｍ：１２７９（Ｌｏｇｉｎｏｖａ，など．，１９７５，
Ｉｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＫ Ｓｅｒ．Ｂｉ
ｏｌ．：３０４−３０７を参照のこと）；ＤＳＭ：５７
９；ＤＳＭ：６２５（ＮＵＭ：２２４８）（Ｄｅｇｒｙ
ｓｅなど．，１９７８，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．１８９：１９６）；ＤＳＭ：１２７９（ＮＵＭ：３
８４４）（Ｌｏｇｉｎｏｖａなど．，１９８４，Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：４９８−４
９９を参照のこと）；及びＤＳＭ：６２５（ＮＵＭ：１
００２）（Ｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｆｒｅｅｚｅ，１９６
９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．：２８９−２９７を参照
のこと）。すべての文献は、引用により本明細書に組込
まれる。
【００９５】記載されるさらなるサーマス・スペーシス
は、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓなど．，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．４６（２）：４０３−４０８を参照の
こと）；Ｔ．シルベヌス（Ｔ．ｓｉｌｖａｎｕｓ）及び
Ｔ．クリアロフィラス（Ｔ．ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕ
ｓ）（Ｔｅｎｒｅｉｒｏなど．，１９９５，Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４５（４）：６３
３−６３９を参照のこと）；Ｔ．スコトダクタス（Ｔ．
ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）（Ｔｅｎｒｅｉｒｏなど．，
１９９５，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４６
（４）：３１５−３２４を参照のこと）；及びＴ．ルベ
ル（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）（Ｓｈａｄｒｉｎａなど．，１９
８２，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ ５１（４）：６
１１−６１５を参照のこと）を包含する（前記すべての
文献は引用により本明細書に組込まれる）。
【００９６】本明細書に提供される案内に従って、及び
よく知られた技法のみを用いて、当業者は、ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子から、種々の宿主システムのいづれかに
おいて本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを発現するた
めに適切なキメラ遺伝子を含むいづれかの数の発現ベク
ターを調製することができるであろう。
【００９７】好ましい態様においては、本発明のキメラ
遺伝子は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼからのアミノ酸
１−１９０及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼからのアミ
ノ酸１９１−８９３から成り、ここで前記両領域は関連
するエキソヌクレアーゼ活性を排除するために適切に変
異誘発される。この好ましい態様は、上記の寄託された
プラスミドから得られた又は宿主生物から回収された、
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｍａ ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子から直接的に構成され得る。しかしなが
ら、そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼは、１９９７
年５月２８日に寄託番号第９８４４３号としてＡＴＣＣ
に寄託されたプラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５から最
とも容易に構成され得る。
【００９８】プラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５は、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１９０及びＴ
ｍａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１９１−８９３か
ら成るキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含
む。ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５によりコードされるキメラ
タンパク質は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ部分におい
てＧ４６Ｄ変異を含む。ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５のキメ
ラ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号９として提供
される。
【００９９】適切な発現系は、キメラ遺伝子を適切な発
現ベクター中にサブクローニングし、コードされたタン
パク質の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を弱めるか
又は排除する１又は複数の点変異を導入し、そしてＴｍ
ａ ＤＮＡポリメラーゼ部分にＦ７３０Ｙ変異を導入す
ることによって、ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５から構成され
る。５′−ヌクレアーゼドメインにＧ４６Ｄ変異、３′
→５′エキソヌクレアーゼドメインにＤ３２３Ａ及びＥ
３２５Ａ変異、及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ部分に
Ｆ７３０Ｙ変異を含むキメラタンパク質をコードする、
好ましい発現系の構成は、実施例に記載される。
【０１００】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１
−１９０をコードするｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５のヌクレ
オチド配列は、アメリカ特許第５，４６６，５９１号に
記載されるプラスミドｐＲＤＡ３−２に関連し、そして
従って、そこに記載されるＧ４６Ｄ変異を含むアミノ酸
配列をコードする。ｐＲＤＡ３−２及び従って、ｐＵＣ
１８：Ｔｍａ２５のヌクレオチド配列はまた、サイレン
トである、すなわちコードされたアミノ酸配列を変更し
ない生来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列（配
列番号９）に対する追加の変異を含む。
【０１０１】遺伝子コードの冗長性のために、典型的に
は多数のＤＮＡ配列が、いづれか一定のアミノ酸配列を
コードし、そしてこの場合、同等である。下記に説明さ
れるように、発現ベクターが挿入されるであろう宿主細
胞の好ましいコドン使用に基づいて、発現ベクターへの
使用のための１又はもう１つの同等のＤＮＡ配列を選択
することが所望される。本発明は、キメラ酵素をコード
するすべてのＤＮＡ配列を包含することが意図される。
従って、本発明のキメラ遺伝子は、野生型サース種及び
Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からの配列のみを含
むことに制限されないが、しかし本発明のキメラＤＮＡ
ポリメラーゼをコードするいづれかのＤＮＡ配列を含む
ことができる。
【０１０２】本発明の酵素の生成は、組換え発現クロー
ンを用いて実施される。組換え発現クローンの構成、発
現クローンによる宿主細胞の形質転換、及び発現を促進
する条件下での形質転換された宿主細胞の培養は、当業
界において良く理解されている分子生物学の技法を用い
て、宿主の手段で実施され得る。それらの段階の個々の
ための方法は、下記に一般的に記載される。好ましい方
法は、実施例に詳細に記載される。
【０１０３】作用可能な発現クローンは、発現ベクター
における適切な制御配列により作用可能な連鎖における
コード配列を置換することによって構成される。ベクタ
ーは、宿主細胞において自律的に複製し、又は宿主細胞
の染色体ＤＮＡ中に組込むように企画され得る。得られ
るクローンは適切な宿主を形質転換するために使用さ
れ、そしてその形質転換された宿主がコード配列の発現
のために適切な条件下で培養される。発現されたタンパ
ク質は、多くの場合、タンパク質の回収及び精製は必要
ではないが、培地又は細胞から単離される。
【０１０４】コード配列及び適切な制御配列を含む適切
なクローンの構成は、当業界において良く知られている
標準の連結及び制御技法を用いる。一般的に、単離され
たプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成されたオリゴヌクレ
オチドが、切断され、修飾され、そして所望する形で再
連結される。適切な制限部位は、通常利用できない場
合、発現クローンの構成を促進するためにコード配列の
末端に付加され得る。
【０１０５】部位特異的ＤＮＡ切断は、当業界において
一般的に理解され、そして市販の制限酵素の製造業者に
より規定される条件下で、適切な制限酵素（又は複数の
酵素）により処理することによって実施される。たとえ
ば、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇ
ｈｔｓ，ＩＬ），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及びＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）からの製品カタログを参照のこと。一般的に、約１
μｇのプラスミド又は他のＤＮＡが、約２０μｌの緩衝
溶液における１単位の酵素により切断され；下記例にお
いては、過剰の制限酵素が一般的に、ＤＮＡの完全な消
化を確保するために使用される。
【０１０６】特定の酵素のために最適である温度での約
１〜２時間のインキュベーション時間が典型的である。
個々のインキュベーションの後、タンパク質はフェノー
ル及びクロロホルムによる抽出により除かれ；この抽出
の後、エーテル抽出、及びエタノールによる沈殿により
水性画分からのＤＮＡの回収が伴なう。所望により、切
断されたフラグメントのサイズ分離が、標準の技法を用
いて、ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気
泳動により実施され得る。たとえば、Ｍａｘａｍな
ど．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｚｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１９８０，６５：４９９−５６０を参照のこと。
【０１０７】一本鎖“オーバーハング”末端を有する制
限−切断されたフラグメントは、５０mMのトリス（pH
７．６）、５０mMのＮａＣｌ，１０mMのＭｇＣｌ2 ，１
０mMのＤＴＴ及び５〜１０μＭのｄＮＴＰの溶液におい
て２０℃〜２５℃で約１５〜２５分のインキュベーショ
ン時間を用いて、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
（ｄＮＴＰ）の存在下で、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ
の大きなフラグメント（クレノウ）により処理すること
によって、ブラント末端化（二本鎖末端）され得る。
【０１０８】クレノウフラグメントは５′突出末端でフ
ィルインし、そして４種のｄＮＴＰが存在する場合でさ
え、突出する３′一本鎖をチューバックする。所望によ
り、選択的修復が、前記突出する末端の性質により指図
される制限内に１又は複数の選択されたｄＮＴＰを供給
することによって実施され得る。クレノウによる処理の
後、その混合物がフェノール／クロロホルムにより抽出
され、そしてエタノール沈殿される。類似する結果が、
Ｓ１ヌクレアーゼを用いて達成され得る。なぜならば、
Ｓ１ヌクレアーゼによる適切な条件下での処理は核酸の
いづれかの一本鎖部分の加水分解をもたらすからであ
る。
【０１０９】連結は、次の標準の条件及び温度下で１５
〜３０μｌの体積において実施される：２０mMのトリス
−Ｃｌ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ2 ，１０mMのＤＴ
Ｔ，３３μｇ／mlのＢＳＡ，１０〜５０mMのＮａＣｌ、
及び40μＭのＡＴＰ及び０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓ
ｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（０℃）（相補的一本
鎖末端を有するフラグメントの連結のための）又は１mM
のＡＴＰ及び０．３−０．６単位のＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ（１４℃）（“ブラント末端”連結のための）のいづ
れか。相補的末端を有するフラグメントの分子間連結は
通常、３３〜１００μｇ／mlの合計ＤＮＡ濃度（５〜１
００nMの合計末端濃度）で実施される。分子間ブラント
末端連結（通常、任意には、２０〜３０倍モル過剰のリ
ンカーを用いる）が１μＭの合計末端濃度で実施され
る。
【０１１０】ベクターの構成においては、ベクターフラ
グメントが、５′リン酸を除去し、そしてベクターの再
連結及び再構成を妨げるために細菌又はウシ小腸アルカ
リホスファターゼ（ＢＡＰ又はＣＩＡＰ）により通常処
理される。ＢＡＰ及びＣＩＡＰ消化条件は、当業界にお
いて良く知られており、そして公開されたプロトコール
は市販されているＢＡＰ及びＣＩＡＰ酵素を通常付随す
る。核酸フラグメントを回収するためには、調製物がフ
ェノール−クロロホルムにより抽出され、そしてエタノ
ール沈殿され、ホスファターゼが除去され、そしてＤＮ
Ａが精製される。他方では、所望しないベクターフラグ
メントの再連結は、適切な制限部位が利用できる場合、
連結の前又は後、制限酵素消化により阻止され得る。
【０１１１】下記に示される構成においては、プラスミ
ド構成のための正しい連結は、その連結混合物により適
切な宿主、たとえばＥ．コリ株ＤＧ１０１（ＡＴＣＣ
４７０４３）又はＥ．コリ株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ ５
３６０６）をまず形質転換することによって確認され
る。好結果をもたらす形質転換体は、当業界において理
解されているように、アンピシリン、テトラサイクリン
又は他の抗生物質耐性により、又は他のマーカーを用い
ることにより、プラスミド構成の態様に依存して選択さ
れる。
【０１１２】次に、形質転換体からのプラスミドが、任
意には、クロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ，
１９７２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０：６６７）
に続いて、Ｃｌｅｗｅｌｌなど．，１９６９，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６２：１１
５９の方法に従って調製される。他方では、プラスミド
ＤＮＡが、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｃ
ｕｓ ５（２）のページ１１の“塩基−酸”抽出法を用
いて調製され得、そしてひじょうに純粋なプラスミドＤ
ＮＡが、ＤＮＡのＣｓＣｌ／臭化エチジウム超遠心分離
により前記プロトコールの段階１２〜１７を置換するこ
とによって得られる。
【０１１３】単離されたＤＮＡは、制限酵素消化により
分析され、そして／又はＳａｎｇｅｒなど．，１９７
７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７４：５４６３のジデオキシ方法（Ｍｅｓｓｉｎｇな
ど．，１９８１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：３
０９によりさらに記載されるような）により、又はＭａ
ｘａｍなど．，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９の方法により配列決定
される。
【０１１４】制御配列、発現ベクター及び形質転換方法
は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞のタイ
プに依存する。一般的に、原核、酵母、昆虫、又は哺乳
類細胞が宿主として使用される。原核宿主は一般的に、
組換えタンパク質の生成のために最とも効果的且つ便利
な宿主であり、そして従って、タンパク質の発現のため
に好ましい。
【０１１５】組換えタンパク質を発現するために最とも
頻繁に使用される原核生物は、Ｅ．コリである。しかし
ながら、Ｅ．コリ以外の微生物株、たとえばバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、たとえばバシラス スブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），プソイドモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種々の種、及び他の
細菌株が、タンパク質の組換え発現のためにまた使用さ
れ得る。そのような原核システムにおいては、宿主又は
その宿主と適合する種に由来する複製部位及び制御配列
を含むプラスミドベクターが典型的には、使用される。
【０１１６】ほとんどの細菌プロモーターの制御下での
構造体の発現のためには、ＧＣＳＣ＃６１３５としての
Ｅ．コリＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒか
ら得られたＥ．コリＫ１２株ＭＭ２９４が、宿主として
使用され得る。ＰL ＮRBS 又はＰL ＴJRBS制御配列を有
する発現ベクターのためには、Ｅ．コリＫ１２株ＭＣ１
００λ溶原菌、すなわちＮ7 Ｎ53ｃＩ８５７ Ｓｕｓ
Ｐ80（ＡＴＣＣ ３９５３１）が使用され得る。１９８
７年４月７日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ５３６０６）に寄
託されたＥ．コリＤＧ１１６、及び１９８５年３月２９
日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ５３０７５）に寄託されたＥ．
コリＫＢ２はまた、有用な宿主細胞である。Ｍ１３ファ
ージ組換え体のためには、ファージ感染に対して敏感な
Ｅ．コリ株、たとえばＥ．コリＫ１２株ＤＧ９８（ＡＴ
ＣＣ ３９７６８）が使用される。ＤＧ９８株は、１９
８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託された。
【０１１７】たとえば、Ｅ．コリは典型的には、Ｂｏｌ
ｉｖａｒなど．，１９７７，Ｇｅｎｅ ２：９５により
記載されるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換され
る。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテト
ラサイクリン耐性のための遺伝子を含む。それらの薬物
耐性マーカーは、所望するベクターの構成において保持
されるか、又は破壊され得、そしてその結果、所望する
組換え体の存在の検出を助けることができる。
【０１１８】通常使用される原核制御配列、すなわちリ
ボソーム結合部位配列と共に、任意にはオペレーターを
有する転写開始のためのプロモーターは、β−ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロ
モーターシステム（Ｃｈａｎｇなど．，１９７７，Ｎａ
ｔｕｒｅ １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌなど．，１
９８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５
７）、及びλ−由来のＰL プロモーター（Ｓｈｉｍａｔ
ａｋｅなど．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２
８）並びに遺伝子Ｎリボソーム結合部位（ＮRBS ）を包
含する。移植可能な制御システムカセットが、１９８７
年１２月８日に発行されたアメリカ特許第４，７１１，
８４５号に示されている。
【０１１９】このカセットは、ＮRBS 配列の３′側の６
個の塩基対内での切断を可能にする少なくとも１つの制
御部位を有する第３ＤＮＡ配列の上流に位置するＮRBS
に操作可能的に連結されるＰL プロモーターを含んで成
る。１９８６年１０月８日に公開されたヨーロッパ特許
公開第１９６，８６４号においてＣｈａｎｇなど．によ
り記載されるホスファターゼＡ（ｐｈｏＡ）システムが
また有用である。しかしながら、原核生物と適合でき
る、いづれかの利用できるプロモーターシステムが、本
発明の発現ベクターを構成するために使用され得る。
【０１２０】細菌の他に、真核微生物、たとえば酵母が
また、粗換え宿主細胞としても使用され得る。サッカロ
ミセス セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわちパン酵母の実験室用
菌株が最ともしばしば使用されるが、但し、多くの他の
菌株も通常利用できる。複製の２ミクロン起点を有する
ベクターが通常であるが（Ｂｒｏａｃｈ，１９８３，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３０７）、酵母発現のために
適切である他のプラスミドベクターも知られている（た
とえば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど．，１９７９，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８２：３９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅなど．，１
９８０，Ｇｅｎｅ １０：１５７；及びＣｌａｒｋｅな
ど．，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３００を
参照のこと）。
【０１２１】酵母ベクターのための制御配列は、解糖酵
素の合成のためのプロモーターを含む（Ｈｅｓｓな
ど．，１９６８，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．
７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄなど．，１９７８，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：４９００；及びＨｏｌｌ
ａｎｄなど．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５６：１３８５）。当業界において知られているさらな
るプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼの
ためのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど．，１９８
０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３）、及
び他の解糖酵素、たとえばグリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコー
ス−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキ
ナーゼのためのプロモーターを包含する。
【０１２２】増殖条件により制御される転写のさらなる
利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、
窒素代謝に関連する分解酵素、及びマルトース及びガラ
クトース使用を担当する酵素のためのプロモーター領域
である（Ｈｏｌｌａｎｄ、前記）。ターミネーター配列
はまた、コード配列の３′末端で配置される場合、発現
を増強するために使用され得る。そのようなターミネー
ターは、酵母由来の遺伝子におけるコード配列に続く
３′未翻訳領域に見出される。酵母適合性プロモータ
ー、複製の起点、及び他の制御配列を含むいづれかのベ
クターが、酵母発現ベクターの構成への使用のために適
切である。
【０１２３】前記コード配列はまた、複数細胞生物に由
来する真核宿主細胞培養物においても発現され得る。た
とえば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏ
ｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）を参照のこと。有用な
宿主細胞系は、ＣＯＳ−７，ＣＯＳ−Ａ２，ＣＶ−１、
ネズミ細胞、たとえばネズミ骨髄腫Ｎ５１及びＶＥＲ
Ｏ，ＨｅＬａ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞を包含する。
【０１２４】そのような細胞のための発現ベクターは、
哺乳類細胞と適合するプロモーター及び制御配列、たと
えばＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）から
の通常使用される初期及び後期プロモーター（Ｆｉｅｒ
ｓなど．，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１
３）、又は他のウィルスプロモーター、たとえばポリオ
ーマ、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ
Ｖ）又は鳥類肉腫ウィルスに由来するプロモーター、又
は免疫グロブリンプロモーター及び熱ショックプロモー
ターを包含する。ＢＰＶベクターシステムを用いて哺乳
類系においてＤＮＡを発現するためのシステムが、アメ
リカ特許第４，４１９，４４６号に開示される。
【０１２５】このシステムの修飾がアメリカ特許第４，
６０１，９７８号に記載される。哺乳類宿主システム形
質転換の一般的な観点がアメリカ特許第４，３９９，２
１６号（ＡL ｘｅｌ）により記載されている。“エンハ
ンサー”領域はまた、発現の最適化においても重要であ
り；それらは一般的に、プロモーター領域の上流に見出
される配列である。複製の起点は、必要とされる場合、
ウィルス源から得られる。しかしながら、染色体中への
組込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製のための通常の
機構である。
【０１２６】植物細胞はまた、宿主としても使用され
得、そして植物細胞と適合できる制御配列、たとえばノ
パリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグ
ナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒなど．，１９８２，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：５６１）が利用できる。
バキュロウィルスベクターにより供給される制御システ
ムを利用する、昆虫細胞使用の発現系がまた記載されて
いる（Ｍｉｌｌｅｒなど．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６），Ｓｅｔｌｏｗなど．，ｅ
ｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｖｏ
ｌ．８，ｐｐ．２７７−２９７）。昆虫細胞に基づく発
現は、スポドプテラフルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｄｉａ）において達成され得る。そ
れらのシステムはまた、組換え酵素の生成においても好
都合である。
【０１２７】使用される宿主細胞に依存して、形質転換
は、そのような細胞に対して適切な標準の技法を用いて
なされる。Ｃｏｈｅｎ，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０により
記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム
処理が、実質的な細胞壁バリヤーを含む、原核生物又は
他の細胞のために使用される。アグロバクテリウム ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）による感染（Ｓｈａｗなど．，１９
８３，Ｇｅｎｅ ２３：３１５）が、一定の植物細胞の
ために使用される。哺乳類細胞のためには、Ｇｒａｈａ
ｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７８，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿法が
好ましい。酵母の形質転換は、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅ
ｎなど．，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６及
びＨｓｉａｏなど．，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３８２９の方法に従
って実施される。
【０１２８】コードされたタンパク質のアミノ酸配列を
修飾しないで、宿主細胞のコドン使用とより適合できる
配列を供給するために本発明の酵素をコードするＤＮＡ
の配列を修飾することが所望される。初期５〜６のコド
ンに対するそのような修飾は、発現効率を改良すること
ができる。発現効率を改良するために修飾されている
が、しかし同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
は、同等であり、そして本発明により包含されると思わ
れる。
【０１２９】種々の部位特異的プライマー指図された変
異誘発方法が利用でき、そして当業界において良く知ら
れている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，１９８９、第２版、Ｃｈａｐｔｅｒ １５．５
１，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｏ−ｍｅｄｉａｔ
ｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，（引用により本明細
書に組込まれる）を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）は、部位特異的変異誘発を行なうために用い
られ得る。
【０１３０】当業界において現在、標準であるもう１つ
の技法においては、所望する変異をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドが、変異誘発プライマーの延長生成物の
構成のために鋳型として作用する、一本鎖ベクター、た
とえばｐＢＳＭ１３＋誘導体に含まれる相補的核酸配列
の合成を方向付けるためにプライマーとして使用され
る。変異誘発されたＤＮＡを用いて、宿主細胞が形質転
換され、そして形質転換された細菌の培養物がプレート
され、そして同定される。
【０１３１】修飾されたベクターの同定は、選択された
形質転換体のＤＮＡのニトロセルロースフィルター又は
他の膜へのトランスファー、及び修飾された配列への正
確なハイブリダイゼーションを可能にするが、しかし元
の変異誘発されていない鎖とのハイブリダイゼーション
を妨げる温度でのキナーゼ処理された合成変異誘発プラ
イマーによりハイブリダイズされた“リフト（ｌｉｆ
ｔ）”を包含する。プローブとハイブリダイズするＤＮ
Ａを含む形質転換体が次に培養され（ＤＮＡの配列が一
般的に、配列分析により確認される）、そして修飾され
たＤＮＡの貯蔵として作用する。
【０１３２】タンパク質が組換え宿主細胞において発現
されると、そのタンパク質の精製が所望される。種々の
精製方法が、本発明の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼを精製するために使用され得る。例としては、アメリ
カ特許第４，８８９，８１８号；第５，３５２，６００
号及び第５，０７９，３５２号に記載されるＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼを精製するための方法；アメリカ特許第
５，６１８，７１１号及び第５，３１０，６５２号に記
載されるサーマスサーモフィリス（Ｔｔｈ）からＤＮＡ
ポリメラーゼを精製するための方法；及びアメリカ特許
第５，３７４，５５３号及び第５，４２０，０２９号に
記載されるＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼを精製するため
の方法を挙げることができる。それらのＤＮＡポリメラ
ーゼを精製するための方法はまた、アメリカ特許第５，
４６６，５９１号にも記載される。上記特許のすべて
は、引用により本明細書に組込まれる。
【０１３３】好ましい方法においては、ＤＮＡポリメラ
ーゼの発現は、中温菌の細菌宿主細胞である。Ｅ．コリ
において実施される。Ｅ．コリ宿主タンパク質は感熱性
であるので、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、粗
溶解物を熱不活性化することによって実質的に富化され
得る。この段階は、他の細胞溶解物タンパク質とのＤＮ
Ａポリメラーゼのイオン性相互作用を減じるために、十
分量の塩（典型的には、０．２〜０．４Ｍの硫酸アンモ
ニウム）の存在下で行なわれる。精製されたＤＮＡポリ
メラーゼの活性は、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７（引用によ
り本明細書に組込まれる）に記載のようにしてアッセイ
される。
【０１３４】長期安定性のために、精製されたＤＮＡポ
リメラーゼ酵素は、１又は複数の非イオン性ポリマー界
面活性剤を含む緩衝液に貯蔵されるべきである。そのよ
うな界面活性剤は一般的に、約１００〜２５０，００
０、好ましくは約４，０００〜２００，０００ドルトン
の範囲の分子量を有し、そして約３．５〜約９．５、好
ましくは約４〜８．５のpHで酵素を安定化するものであ
る。そのような界面活性剤の例は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏ
ｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｌｉ
ｎｇ Ｃｏ．，１７５ Ｒｏｃｋ Ｒｏａｄ，Ｃｌｅｎ
Ｒｏｃｋ，ＮＪ（ＵＳＡ）により出版されたＭｃＣｕ
ｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｎｌｓｉｆｉｅｒｓ ＆ Ｄｅ
ｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ（１９８３）の２９５〜２９８ページに特
定されるものを包含する（その開示は、引用により本明
細書に組込まれる）。
【０１３５】好ましくは、界面活性剤は、エトキシル化
された脂肪アルコールエーテル及びラウリルエーテル、
エトキシル化されたアルキルフェノール、オクチルフェ
ノキシポリエトキシエタノール化合物、変性されたオキ
シエチル化された及び／又はオキシプロピル化された直
鎖アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート
化合物、ポリソルベート化合物、及びフェノール性脂肪
アルコールエーテルから成る群から選択される。より特
定には、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌ
ｍｉｎｔｏｎ，ＤＥ）からのＴｗｅｅｎ ２０TM、すな
わちポリエトキシエチル化された（２０）ソルビタンモ
ノラウレート、及びＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃ
ｏｒｐ．（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）からのＩｃｏ
ｎｏｌTMＮＰ−４０、すなわちエトキシル化されたアル
キルフェノール（ノニル）が好ましい。
【０１３６】本発明の熱安定性酵素は、熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼが必要であるか又は所望されるいづれかの
目的のために使用され得る。好ましい態様においては、
酵素はＤＮＡ配列決定のためである（Ｉｎｎｉｓな
ど．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５：９４３６−９４４０；引用により本
明細書に組込まれる）。次の例は、例示的であって、本
発明の範囲を限定するものではない。それらの例におい
て、すべての百分率は、特にことわらない限り、固体の
場合、重量によってであり、そして液体の場合、体積に
よってである。
【０１３７】
【実施例】例１ ．発現系の構成 発現系は、当業界において良く知られている従来の技法
を用いて、ヌクレオチド配列、配列番号９を有する遺伝
子を含む寄託されたプラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５
から構成される。下記により詳細に記載される、関与す
る段階は、次の通りである。−ｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５
に含まれるＤＮＡポリメラーゼコード配列を、ｐＤＧ１
６０発現ベクター中にサブクローン化し、プラスミドｐ
ＴＭＡ２５をもたらす。
【０１３８】−Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａ変異を、部位
特異的プライマー指図された変異誘発によりｐＴＭＡ２
５に付加し、プラスミドｐＴＭＡ３０をもたらす。 −次に、ｐＴＡＭ３０からの変異誘発された遺伝子コー
ド配列を、コドン１−２８３が欠失されるようにｐＤＧ
１８４発現ベクター中にサブクローン化し、プラスミド
ｐＴＭＡ３１をもたらす。 −Ｆ７３０Ｙ変異を、部位特異的プライマー指図された
変異誘発によりｐＴＭＡ３１に付加し、プラスミドｐＴ
ＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕をもたらす。
【０１３９】−Ｆ７３０Ｙ変異を含むｐＴＭＡ３１〔Ｆ
７３０Ｙ〕からの変異誘発されたコード配列のフラグメ
ントを、その対応する変異誘発されていないフラグメン
トを置換するためにｐＴＭＡ３０中にサブクローン化
し、プラスミドｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕をもたら
す。
【０１４０】個々の変異誘発又はサブクローニング段階
に続いて、Ｅ．コリ株ＤＧ１１６宿主細胞を、プラスミ
ド構造体により形質転換する。アンピシリン耐性（プラ
スミド含有）コロニーを、標準方法を用いて、所望する
プラスミドの存在についてスクリーンする。典型的に
は、第１のコロニーを、ゲル電気泳動サイズ分別により
予測されるサイズのプラスミドの存在について選択す
る。候補体コロニーを、１又は複数の制限酵素による消
化に続いて、予測されるフラグメントパターンを示すプ
ラスミドについてさらにスクリーンする。最終的に、突
然誘発された部位及び連結接合部分を配列決定し、意図
された配列を確認する。
【０１４１】プラスミドｐＤＧ１６０は、アメリカ特許
第５，６１８，７１１号（引用により本明細書に組込ま
れる）に記載される。プラスミドｐＤＧ１６０は、バク
テリオファージλＰL プロモーター及び遺伝子Ｎリボソ
ーム結合部位（アメリカ特許第４，７１１，８４５号、
引用により本明細書に組込まれる）、ポリリンカー中に
クローン化された配列がλＰL プロモーターの制御下で
発現され得るように配置された制限部位ポリリンカー及
び遺伝子Ｎリボソーム結合部位、及びバシラス・スリン
ギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ）デルタ−トキシン遺伝子からの転写ターミネー
ター（アメリカ特許第４，６６６，８４８号を参照のこ
と、引用により本明細書に組込まれる）を含んで成るク
ローニング及び発現ベクターである。プラスミドｐＤＧ
１６０はまた、そのプラスミドを、コピー数のために感
温性にする変異誘発されたＲＮＡII遺伝子を担持する
（アメリカ特許第４，６３１，２５７号を参照のこと、
引用により本明細書に組込まれる）。
【０１４２】それらの要素は、プラスミドｐＤＧ１６０
をひじょうに有用で且つ強力な発現ベクターにするため
に強力して作用する。３０〜３２℃で、プラスミドのコ
ピー数は低く、そして感温性リプレッサー遺伝子、たと
えばｃＩ８５７を担持する宿主細胞においては、ＰL プ
ロモーターは機能しない。しかしながら、３７〜４１℃
で、プラスミドのコピー数は３０〜３２℃でのコピー数
よりも５０倍高く、そしてｃＩ８５７リプレッサーが不
活性化され、ＰL プロモーターの機能を可能にする。プ
ラスミドｐＤＧ１６０はまた、アンピシリン耐性（Ａｍ
ｐＲ）マーカーも担持する。要約すると、プラスミドｐ
ＤＧ１６０は、ＡｍｐＲマーカー、ＰLプロモーター及
び遺伝子Ｎリボソーム結合部位、ポリリンカー及びＢＴ
ｃｒｙＰＲＥ（ＢＴ陽性逆調節要素、アメリカ特許第
４，６６６，８４８号）を、ＣｏｌＥ１ ｃｏｐtsベク
ターに含んで成る。
【０１４３】プラスミドｐＤＧ１８４は、アメリカ特許
第５，４２０，０２９号（引用により本明細書に組込ま
れる）に記載される。プラスミドｐＤＧ１８４は、挿入
された遺伝子の開始コドンでＮｃｏＩ部位を含むよう修
飾された、ｐＤＧ１６０の誘導体である。前記プラスミ
ドの残りは、ｐＤＧ１６０からであり、機能的に変更さ
れていない。
【０１４４】Ｉ．サブクローニングＩ プラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５からのＤＮＡポリメ
ラーゼコード配列を、ｐＤＧ１６０発現プラスミド中に
次の通りにしてサブクローン化する： Ａ．プラスミドｐＵＣ１８：Ｔｍａ２５、すなわち５３
４７個の塩基対（bp）のプラスミドを、位置２０８４
（コード配列の最初のヌクレオチドから出発して番号付
けされた）で切断するＮｓｐＶによる消化により線状化
する。 Ｂ．ＮｓｐＶ消化に起因する線状化されたプラスミド
を、ヌクレオチド（ｎｔ）位置１６６１，１９８９，２
０３９及び２６８６で切断するＢａｍＨＩによりさらに
消化する。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３′末端を含む
６０２bpのＮｓｐＶ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ゲル
精製する。
【０１４５】Ｃ．別の反応において、ＮｓｐＶ消化に起
因する線状化されたプラスミドを、位置２６２９及び５
３４２で切断するＨｉｎｄIII によりさらに消化する。
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５′末端を含む２０８９bp
のＮｓｐＶ／ＨｉｎｄIII フラグメント（ｎｔ５３４３
−２０８４）をゲル精製する。 Ｄ．プラスミドｐＤＧ１６０を、ＨｉｎｄIII 及びＢａ
ｍＨＩにより消化し、そしてウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（ＣＩＡＰ）により処理し、５′リン酸を除去し、
そしてベクターの連結及び再構成を阻止する。他方で
は、その消化されたベクターフラグメントを、ゲル精製
する。
【０１４６】Ｅ．段階Ｂ及びＣからの単離されたフラグ
メントを、段階Ｄからの消化されたｐＤＧ１６０プラス
ミドと共に、合計のＤＮＡ１μｌ当たり１０〜４０ngの
濃度で２：２：１の比で組合し、そして連結し、８２１
８bpのプラスミドをもたらす。 Ｆ．連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞（上
記に記載される）を形質転換し、そしてｐＴＭＡ２５と
称する所望するプラスミドを含む形質転換体コロニー
を、スクリーニングにより同定する。
【０１４７】II．変異誘発Ｉ：Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５
Ａ Ｄ３２３Ａ及びＥ３２５Ａアミノ酸変異をもたらす、ｐ
ＴＭＡ２５の配列のコードするＤＮＡポリメラーゼにお
ける変異を、部位−特異的プライマー指図された変異誘
発を用いて行なう。後での操作における便利さのため
に、ＢｇｌII制限酵素切断部位を排除し、そしてＳｐｅ
Ｉ制限酵素切断部位を創造する追加の変異誘発を行な
う。それらの追加の変異は、コードされたアミノ酸配列
が変更されないように行なわれる。
【０１４８】次のプライマーが変異誘発に使用される： −プライマーＰ１：下記表に記載されるような変異を有
する、配列番号９のヌクレオチド９５８−９８８に対応
する変異誘発性上流プライマー。 −プライマーＰ２：プライマーＰ１の逆補体から成る変
異誘発性下流プライマー。 −プライマーＰ３：ＸｂａＩ部位（ヌクレオチド６２１
−６２６）を包含する、配列番号９のヌクレオチド６０
８−６２７に対応する上流プライマー。 −プライマーＰ４：ＳａｃＩ部位の一部（ヌクレオチド
１３１８−１３２３）を包含する、配列番号９のヌクレ
オチド１３１９−１３３９に対応する下流プライマー。
【０１４９】変異誘発性上流プライマーＰ１の配列は、
配列番号９のコード鎖のヌクレオチド９５８−９８８か
ら成るが、但し、下記表に示される変更は伴わない。コ
ドン３２３（ヌクレオチド９６７−９６９）における変
更は、ＢｇｌII部位の排除をもたらした。コドン３２６
（ヌクレオチド９６６−９７８）及び３２７（ヌクレオ
チド９７９−９８１）における変更は、コードされたア
ミノ酸の配列に影響を及ぼさないが、しかしＳｐｅＩ部
位の創造をもたらす。
【０１５０】
【表４】
【０１５１】変異誘発は、下記に記載のようにして実施
される。すべての増幅は、当業界において良く知られて
いる条件下でＰＣＲにより実施される。たとえば、増幅
は、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ登録商標 ＤＮＡポリメラーゼ
を有するＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ
ｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ
Ｔ）を用いて、実施され得る。 Ａ．コード配列の領域を、プライマーＰ３及びＰ２を用
いて、精製されたｐＴＭＡ２５から増幅し、そしてその
得られる３８１bpの増幅された生成物をゲル精製する。
【０１５２】Ｂ．コード配列の領域を、プライマーＰ１
及びＰ４を用いて、精製されたｐＴＭＡ２５から増幅
し、そしてその得られる３８２bpの増幅された生成物を
ゲル精製する。 Ｃ．段階Ａ及びＢからの増幅された生成物を組合し、９
５℃で熱変性し、アニーリングし、そして標準の技法を
用いて、ＤＮＡポリメラーゼにより延長する。 Ｄ．段階Ｃからのアニーリングされ、そして延長された
複合ＤＮＡを、プライマーＰ３及びＰ４を用いて再増幅
し、そしてその得られる７３２bpの増幅された生成物を
ゲル精製する。 Ｅ．段階Ｄからの増幅されたＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＳ
ａｃＩにより消化する。
【０１５３】Ｆ．プラスミドｐＴＭＡ２５をＸｂａＩ及
びＳａｃＩにより消化し、そしてウシ腸アルカリホスフ
ァターゼ（ＣＩＡＰ）により処理し、５′リン酸を除去
し、そしてベクターの再連結及び再構成を阻止する。 Ｇ．段階Ｅからの消化されたＤＮＡを、段階Ｆからの消
化されたプラスミドと、３：１の比で組合し、そして連
結する。 Ｈ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞
を形質転換し、そしてｐＴＭＡ３０と称する、所望する
プラスミドを含む形質転換体コロニーを、スクリーニン
グすることにより同定する。
【０１５４】III ．サブクローニングII 次に、ｐＴＭＡ３０からの配列をコードする変異誘発さ
れた遺伝子を、コドン１−２８３が欠失されるようにｐ
ＤＧ１８４発現ベクター中にサブクローン化する。ここ
で使用されるヌクレオチド位置数は、プラスミド内の位
置を言及し、ここで位置１はＰL プロモーターの上流の
ＥｃｏＲＩ部位により定義される。サブクローン化は次
の通りにして行なわれる。
【０１５５】Ａ．８２１８bpのプラスミドであるプラス
ミドｐＴＭＡ３０を、ヌクレオチド位置４４４３で切断
するＭｌｕＩ；位置１２１０，４７６１，５７６９及び
５８７４で切断するＢｓｐＨＩ；及び位置７８２７で切
断するＡｆｌIIにより消化する。所望するフラグメント
の、単離を促進するために、ＡｆｌII消化を行ない、所
望する３２３３bpのＢｓｐＨＩ／ＭｌｕＩフラグメント
にサイズ的に類似する３５５４bpのＢｓｐＨＩ／Ｂｓｐ
ＨＩフラグメントをさらに分解する。前記消化は、３２
３３，１９５２，１６０１，１００８，３１８及び１０
５bpの長さを有する６種のフラグメントを生成した。前
記プラスミドのヌクレオチド１２１１−４４４３に対応
する３２３３bpのＢｓｐＨＩ／ＭｌｕＩフラグメント
を、ゲル電気泳動により単離する。
【０１５６】Ｂ．５４７４bpプラスミドのプラスミドｐ
ＤＧ１８４を、位置１６９９で切断するＭｌｕＩ、及び
位置２８４で切断するＮｃｏＩにより消化する。その消
化されたフラグメントを、ウシ腸アルカリホスファター
ゼ（ＣＩＡＰ）により処理し、５′リン酸を除去し、そ
してベクターの再連結及び再構成を阻止する。他方で
は、４０５９bpのフラグメントを、ゲル電気泳動により
単離する。
【０１５７】Ｃ．段階Ａからの単離されたフラグメント
を、段階Ｂからの消化されたｐＤＧ１８４プラスミドと
共に、合計ＤＮＡ１μｌ当たり１０〜４０ngの濃度で、
１：１の比で組合し、そして連結し、７２９２bpのプラ
スミドをもたらす。 Ｄ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞
を形質転換し、そしてｐＴＭＡ３１と称する所望するプ
ラスミドを含む形質転換体コロニーを、スクリーニング
により同定する。
【０１５８】IV．変異誘発II：Ｆ７３０Ｙ コードされたアミノ酸配列変異においてＦ７３０Ｙ変異
をもたらすｐＴＭＡ３１の配列をコードするＤＮＡポリ
メラーゼにおける追加の変異を、部位−特異的 −指図された変異誘発を用いて行なった。前記変異誘発
は、上記に記載される方法に類似する方法を用いて実施
された。次のプライマーが変異誘発に使用された。 −プライマーＦＲ１：下記表に記載されるような変異を
有する、配列番号９のヌクレオチド２１７３−２２０２
に対応する変異誘発性上流プライマー。
【０１５９】−プライマーＦＲ２：プライマーＦＲ１の
逆補体から実質的に成るが、しかし配列番号９のヌクレ
オチド２１７２−２２００に対応する変異誘発性下流プ
ライマー。 −プライマーＦＲ３：ＢｓｔＸＩ部位の上流に位置す
る、配列番号９のヌクレオチド１９５２−１９７２に対
応する上流プライマー。 −プライマーＦＲ４：ＸｍａＩ部位の下流に位置する、
配列番号９のヌクレオチド２４１５−２４３３に対応す
る下流プライマー。 変異誘発性上流プライマーＦＲ１の配列は、配列番号９
のコード鎖のヌクレオチド２１７３−２２０２から成る
が、但し、下記表に示される変更は存在しない。コドン
７２９（２１８５−２１８７）における変更は、コード
されたアミノ酸の配列に影響を及ぼさないが、しかしＨ
ｐａＩ部位の創造をもたらす。
【０１６０】
【表５】
【０１６１】変異誘発を、下記に記載のようにして実施
した。 Ａ．コード配列の領域を、プライマーＦＲ３及びＦＲ２
を用いて、精製されたｐＴＭＡ３１から増幅し、そして
得られる２４９bpの増幅された生成物をゲル精製した。 Ｂ．コード配列の領域を、プライマーＦＲ１及びＦＲ４
を用いて、精製されたｐＴＭＡ３１から精製し、そして
得られる２６１bpの増幅された生成物をゲル精製した。
【０１６２】Ｃ．段階Ａ及びＢからの増幅された生成物
を組合し、９５℃で熱変性し、アニーリングし、そして
標準の技法を用いてＤＮＡポリメラーゼにより延長し
た。 Ｄ．段階Ｃからのアニーリングされ、そして延長された
複合ＤＮＡを、プライマーＦＲ３及びＦＲ４を用いて再
増幅し、そして得られる４８２bpの増幅された生成物を
フェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、そし
てＥｔＯＨにより沈殿せしめた。 Ｅ．段階Ｄからの増幅されたＤＮＡをＢｓｔＸＩ及びＸ
ｍａＩにより消化し、そして所望される３３７bpのＤＮ
Ａフラグメントを、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ １００カラム
（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、よ
り小さなフラグメントから分離した。
【０１６３】Ｆ．プラスミドｐＴＭＡ３１を、ＢｓｔＸ
Ｉ及びＸｂａＩにより消化した。 Ｇ．段階Ｅからの消化されたＤＮＡを、段階Ｆからの消
化されたプラスミドと共に３：１の比で組合し、そして
連結した。 Ｈ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤＧ１１６細胞
を形質転換した。変異誘発の間に導入されるユニークＨ
ｐａＩ部位を包含する領域を増幅するプライマーＦＲ３
及びＦＲ４を用いて、プラスミドＤＮＡを増幅し、前記
増幅された生成物をＨｐａＩにより消化し、そして前記
消化生成物をゲル電気泳動により分析することによっ
て、コロニーを、所望する変異誘発されたプラスミドの
存在についてスクリーンした。ｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０
Ｙ〕と称する所望するプラスミドを含むコロニーを選択
し、そしてその遺伝子配列をＤＮＡ配列決定により確か
めた。
【０１６４】その得られる発現系は、Ｄ３２３Ａ，Ｅ３
２５Ａ及びＦ７３０Ｙ変異により変異誘発された、Ｔｍ
ａ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８４−８９３から
成る、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３１ ＤＮＡポリメラーゼと
称するＤＮＡポリメラーゼを発現する。
【０１６５】Ｖ．サブクローニングIII Ｆ７３０Ｙ変異を含むｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕から
の変異誘発されたコード配列のフラグメントを、ｐＴＭ
Ａ３０中にサブクローン化し、その対応する変異誘発さ
れたフラグメントを置換し、プラスミドｐＴＭＡ３０
〔Ｆ７３０Ｙ〕をもたらした。ここで使用されるヌクレ
オチド位置数は、プラスミド内の位置を言及し、ここで
位置１は、λＰL プロモーターの上流のＥｃｏＲＩ部位
により定義される。サブクローニングを、次の通りにし
て実施した。
【０１６６】Ａ．７２９２bpのプラスミドであるプラス
ミドｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕を、ヌクレオチド位置
３５１７で切断するＭｌｕＩ、及び位置４１２で切断す
るＳｐｅＩにより消化した。プラスミドのヌクレオチド
４１３〜３５１７に対応する３１０５bpのＭｌｕＩ／Ｓ
ｐｅＩフラグメントを、ゲル電気泳動により単離した。
【０１６７】Ｂ．８２１８bpのプラスミドであるプラス
ミドｐＴＭＡ３０を、ヌクレオチド位置４４４３で切断
するＭｌｕＩ、及び位置１３３８で切断するＳｐｅＩに
より消化する。プラスミドフラグメントのヌクレオチド
４４４４−１３３８に対応する５１１３bpのＭｌｕＩ／
ＳｐｅＩフラグメントをゲル電気泳動により単離する。 Ｃ．段階Ａからの単離されたフラグメントを、段階Ｂか
らの単離されたフラグメントと共に、合計ＤＮＡ１μｌ
当たり１０〜４０ngの濃度で１：１の比で組合し、そし
て連結する。
【０１６８】Ｄ．前記連結生成物を用いて、Ｅ．コリＤ
Ｇ１１６細胞を形質転換した。変異誘発の間に導入され
るユニークＨｐａＩ及びＳｐｅＩ部位を包含する領域を
増幅するプライマーを用いてプラスミドＤＮＡを増幅
し、その増幅された生成物をＨｐａＩ又はＳｐｅＩによ
り消化し、そして前記消化生成物をゲル電気泳動により
分析することによって、コロニーを、所望する８．２kb
のフラグメントの存在についてスクリーンした。プラス
ミドＤＮＡを、スクリーンにおいて予測される消化パタ
ーンを示すプラスミドを含むコロニーから調製し、そし
てＨｐａＩ，ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩによる消化、続く、
消化されたＤＮＡのゲル分析によりさらに分析した。ｐ
ＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕と称する所望するプラスミド
を含むコロニーを選択し、そしてその遺伝子配列をＤＮ
Ａ配列決定により確かめた。
【０１６９】得られる発現プラスミドｐＴＭＡ３０〔Ｆ
７３０Ｙ〕は、バクテリオファージλＰL プロモーター
及び遺伝子Ｎリボソーム結合部位、並びにバシラススリ
ンギエンシスデルタ−トキシン遺伝子からの陽性逆調節
要素（ＰＲＥ、転写ターミネーター）の制御下にある。
プラスミドはまた、プラスミドをコピー数のために感温
性にする変異誘発されたＲＮＡII遺伝子、及びアンピシ
リン耐性遺伝子を担持する。
【０１７０】例２．組換えＤＮＡポリメラーゼの発現 この例は、実質的に例１に記載されるようなプラスミド
ｐＴＭＡ３０〔Ｆ７３０Ｙ〕を有するＥ．コリＫ１２株
ＤＧ１１６細胞の発現系を用いて、Ｆ７３０ＹＴｍａ３
０ ＤＮＡポリメラーゼの発現及び精製を記載する。発
現系細胞の初期増殖を、種フラスコにおいて実施した。
大規模発酵を、種培養物により接種された１０ｌの発酵
フラスコにおいて実施した。使用される培地及びプロト
コールは、次の通りである。
【０１７１】種培地は、ＩＸ Ｂｏｎｎｅｒ−Ｖｏｇｅ
ｌ塩（９．６mMのクエン酸、５７mMのＫ2 ＨＰＯ4 ，１
６．８mMのＮａＮＨ4 ＨＰＯ4 ，０．８mMのＭｇＳ
Ｏ4 ）＋２５mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２mMのＭｇＳＯ
4 ，１０μｇ／mlのチアミン−ＨＣｌ，０．２％のグル
コース、０．２５％のカサミノ酸及び１００μｇ／mlの
アンピシリン及びメチシリンから成った。培地は無菌貯
蔵溶液から配合し、次に使用の前、フィルター殺菌し
た。
【０１７２】発酵培地は、ＩＸ Ｂｏｎｎｅｒ−Ｖｏｇ
ｅｌ塩（９．０mMのクエン酸、５７mMのＫ2 ＨＰＯ4 ，
１６．８mMのＮａＮＨ4 ＨＰＯ4 ，０．８mMのＭｇＳＯ
4 ）＋２５mMの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２mMのＭｇＳ
Ｏ4 ，１０μＭのＭｎＳＯ4 ，６．９μＭのＺｎＣ
ｌ2 ，８．４μＭのＣｏＣｌ2 ，８．３μＭのＮａＭｏ
Ｏ4 ，６．８μＭのＣａＣｌ2 ，７．４μＭのＣｕＣｌ
2 ，８．１μＭのＨ3 ＢＯ3 ，１μＭのＦｅＣｌ3 ，
０．５ml／ｌのＭａｃｏｌｌ Ｐ２０００消泡剤、１０
μｇ／mlのチアミン−ＨＣｌ，１．６％のグルコース、
２．０％のカサミノ酸、及び１００μｇ／mlのアンピシ
リンから成った。上記成分（消泡剤まで）を、１２１℃
で２０分間、現場殺菌し、そして残りを、接種の直前、
殺菌された貯蔵溶液から添加した。
【０１７３】種培養物を、０．１mlの凍結された発現系
細胞により接種された種培養物の１００mlフラスコにお
いて増殖した。接種に続いて、その培養物を３０℃で一
晩、振盪した。全フラスコ培養物を用いて、１０ｌの発
酵培養物を接種した。発酵を次のようにして実施した。
初期温度は３０℃であり、pHは４ＮのＮＨ4ＯＨ及び氷
酢酸により６．９±０．１で調整され、そして溶解され
る酸素は、３００rpm の初期最少値から必要とされるよ
うな撹拌速度を調節することによって、３０％で調整さ
れた。エアレーション速度を、５ｌ／分で一定して維持
した。培養物が２．５OD（６８０nm）に達した場合、約
６〜７．５時間後、温度を３８．５℃に、０．４℃／分
の速度で、ＤＮＡポリメラーゼの合成を誘発するために
変えた。発酵を、約２４時間の合計実験時間まで、一晩
続けた。細胞ペーストを、交差流濾過及び遠心分離によ
り収穫し、そして−２０℃で凍結した。
【０１７４】例３．組換えＤＮＡポリメラーゼの精製 この例は、上記発酵からの発現されたＦ７３０Ｙ Ｔｍ
ａ３０ ＤＮＡポリメラーゼの精製を記載する。前記精
製は、下記変性を伴って、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９
３，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ２：２７５−２８７に記載のようにして実質
的に実施した。
【０１７５】次の標準略語を使用する。 ＰＥＩ＝ポリエチレンイミン ＴＬＣＫ＝Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチ
ルケトン−ＨＣｌ ＰＥＩは、特にＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．
（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から入手できる。ＴＬ
ＣＫは、中でも、Ｓｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手できる。
【０１７６】発酵からの約１５０ｇの凍結された（−７
０℃）細胞を、１０mMのＥＤＴＡ，１mMのジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）、２mMのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ（Ｃ
ｅｎｔｅｒｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃ
Ｔ），１μｇ／mlのＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）、及び１mMのＴＬＣＫを含む溶解緩衝液（５
０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５）に融解した。細胞
を、１０，０００psi でＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ
に５回通すことにより溶解した。その溶解物を、５．５
×細胞の最終体積（湿量）に、溶解緩衝液により希釈し
た。得られる溶解物を画分Ｉと命名した。
【０１７７】硫酸アンモニウムを画分Ｉに徐々に添加
し、０．２Ｍの濃度にした。次に、画分Ｉを次のように
してＰＥＩ−沈殿せしめた。ＰＥＩ滴定を用いて、核酸
を沈殿せしめるのに必要な最少量のＰＥＩを決定した。
１０μｌの個々の試験沈殿物を、標準のマイクロウェル
プレートにおいて０．５μｇ／mlの臭化エチジウム１０
０μｌに添加した。対照は、ＰＥＩを含まない適切に希
釈された溶解物から成った。プレートをＵＶ光により照
射し、そして核酸の少なくとも９９％を除去するために
必要とされるＰＥＩの濃度を決定した。
【０１７８】ＰＥＩを撹拌しながらゆっくり添加し、
０．４％（滴定から決定されるような濃度）にした。Ｐ
ＥＩ処理された溶解物を、８，０００RPM （１１，３０
０×ｇ）で３０分間、５℃でＪＡ−１０ローター（５０
０mlボトル）において遠心分離した。上清液（画分II）
をデカントし、そして保持した。硫酸アンモニウムを画
分II上清液に添加し、０．４Ｍの濃度とした。次に、画
分IIを次のようにして熱処理した。
【０１７９】熱処理は３ｌのＢｒａｕｎ発酵器において
行なわれた。撹拌速度は２５０rpmであった。温度を７
５℃に６分間にわたって上げ、１５分間維持し、次にで
きるだけ早く、発酵器において３０℃に冷却した。ＰＥ
Ｉ沈殿からの熱処理された画分II上清液を発酵器から除
去し、そして少なくとも３０分間、氷上に保持し、次に
上記のようにして遠心分離した。上清液（画分III ）を
デカントし、そして維持した。
【０１８０】画分III を次のようにして、フェニルセフ
ァロースカラムクロマトグラフィーにかけた。２５０ml
のラジアル流カラム（Ｓｅｐｒａｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，
Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
により充填した。画分III を５０mMのトリス（pH７．
５）、１０mMのＥＤＴＡ溶液により希釈し、硫酸アンモ
ニウムの濃度を０．３Ｍに減じ、そして次に、カラムに
適用した。
【０１８１】カラムを１５〜２０分間、次の４種の緩衝
液の個々により（３〜４カラム体積）、洗浄した（５０
ml／分の流速）：（１）５０mMのトリス、pH７．５，１
０mMのＥＤＴＡ，０．３Ｍの硫酸アンモニウム、１mMの
ＤＴＴ；（２）２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤ
ＴＡ，１mMのＤＴＴ；（３）２５mMのトリス、pH７．
５，１mMのＥＤＴＡ，２０％ｖ／ｖのエチレングリコー
ル、１mMのＤＴＴ；及び（４）２５mMのトリス、pH７．
５，１mMのＥＤＴＡ，２０％ｖ／ｖのエチレングリコー
ル、１mMのＤＴＴ，２．０Ｍの尿素。ＤＮＡポリメラー
ゼを含む尿素溶離物（画分IV）を、約３〜１８分の尿素
溶出から単一のプールとして集めた。全フェニルセファ
ロースカラム段階を、２時間以内に完結した。
【０１８２】画分IVを次のようにしてヘパリンセファロ
ースカラムクロマトグラフィーにゆだねた。画分IV（約
７５０ml）を、ＫＣｌ（３Ｍの原液から）において０．
０５Ｍにし、そして次に、２５mMのトリス、pH７．５，
１mMのＥＤＴＡ，０．０５ＭのＫＣｌ，１mMのＤＴＴ溶
液により平衡化された１００mlのラジアル流ヘパリンセ
ファロースカラム上に負荷した。
【０１８３】負荷の後、カラムを平衡化緩衝液、次に２
５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，０．１０Ｍ
のＫＣｌ，１mMのＤＴＴ溶液により３０分間、洗浄した
（２０ml／分の流速）。最終的に、ＤＮＡポリメラーゼ
を、２５mMのトリス、pH７．５，１mMのＥＤＴＡ，０．
１０〜０．５ＭのＫＣｌ、及び１mMのＤＴＴ溶液におけ
る１２カラム体積グラジエントにおいて溶離し、それぞ
れ１６mlの７５の画分を集めた。ヘパリンセファロース
カラム段階を、３時間以下で完結した。画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析し、そして低い純度である、ＤＮＡ
ポリメラーゼを含むいくつかの初期画分をプールから除
去した（画分Ｖ）。
【０１８４】画分Ｖを、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ３０膜（Ａ
ｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）上で２
０mlに濃縮した。その濃縮物を、３×貯蔵緩衝液（６０
mMのトリス、pH８．０，０．３mMのＥＤＴＡ，０．３mM
のＫＣｌ，３mMのＤＴＴ）に対して４℃で一晩、透析し
た。グリセロールを透析物に添加し、５０％（ｖ／ｖ）
〜８０％（ｖ／ｖ）の最終濃度の原液にした。Ｔｗｅｅ
ｎ２０TMを添加し、０．２％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／
ｖ）の最終濃度の原液にした。
【０１８５】殺菌された水を添加し、調製物の体積を元
の溶解物の体積の３倍にし、画分Ｖ、すなわち貯蔵安定
性のＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼの調
製物を生成した。画分VIを、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９
８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７（引
用により本明細書に組込まれる）に実質的に記載される
ようにして、ＤＮＡポリメラーゼ活性についてアッセイ
した。
【０１８６】例４．延長速度 Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼの延長速
度を、鋳型−限定されたプライマー延長アッセイを用い
て測定した。アッセイを、延長速度がＤＮＡポリメラー
ゼ濃度に無関係な条件下で、過剰のＤＮＡポリメラーゼ
を用いて実施した。
【０１８７】本発明のキメラ酵素、すなわちＦ７３０Ｙ
Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼを、上記プラスミド
ｐＴＭＡ３１〔Ｆ７３０Ｙ〕から発現されたＦ７３０Ｙ
Ｔｍａ３１ ＤＮＡポリメラーゼに比較した。Ｆ７３
０Ｙ Ｔｍａ３１ ＤＮＡポリメラーゼは、３′→５′
エキソヌクレアーゼ活性を不活性化するＤ３２３Ａ及び
Ｅ３２５Ａ変異及びＦ７３０Ｙ変異を組込むＵＩＴｍａ
TM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，
Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）の変異誘発されたバージョンで
ある。
【０１８８】Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラ
ーゼ及びＦ７３１Ｙ Ｔｍａ３１ＤＮＡポリメラーゼ
は、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼが
５′−ヌクレアーゼ活性を不活性化するよう変異誘発さ
れているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼからの５′−ヌク
レアーゼドメインを含むが、ところがＦ７３０Ｙ Ｔｍ
ａ３１ ＤＮＡポリメラーゼはＴｍａ ＤＮＡポリメラ
ーゼの最初の２８３個のアミノ酸をミッシングしている
ことにおいて主に異なる。従って、Ｆ７３０ＹＴｍａ３
１ ＤＮＡポリメラーゼは、５′−ヌクレアーゼドメイ
ンの欠失の結果として５′−ヌクレアーゼ活性を欠いて
いる。
【０１８９】ＤＮＡポリメラーゼ調製物を最初、Ｌａｗ
ｙｅｒなど．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６４：６４２７に記載のようにしてアッセイし、その単
位濃度を決定し、そして前記酵素が過剰に存在するよ
う、必要とされる酵素の量を決定した。それらのアッセ
イに基づけば、下記延長速度アッセイにおいて１単位の
Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼ又は３．
５単位のＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３１ ＤＮＡポリメラーゼ
の使用が、延長速度が酵素濃度に無関係であることを確
かめるために十分であることが決定された。酵素の単位
の定義は、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９８９、前記に定義
される通りである。
【０１９０】延長速度は、５μｌのＤＮＡポリメラーゼ
（上記単位量を含むように、Ｌａｗｙｅｒなど．，１９
８９、前記に記載のようにして希釈された）を含む反応
混合物５０μｌ、及び５０mMのＢｉｃｉｎｅ，pH８．
３，２５℃；２．５mMのＭｇＣｌ2 ；１mMのβ−メルカ
プトエタノール；２００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ；１００μＭの〔α−33Ｐ〕ｄＧＰ
（０．８μCi／反応）；及びプライマーＤＧ４８、すな
わち（配列番号11；5'-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCG
C)にプレアニーリングされたＭ１３ｍｐ１８（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）鋳型ＤＮＡ
０．０７５ｐモルを含む反応緩衝液４５μｌにおいて、
７５℃で３分間、アッセイされた。反応は、６０mMのＥ
ＤＴＡ１０μｌの添加により停止され、そして０℃で貯
蔵それた。
【０１９１】停止された反応の一部２５μｌを、キャリ
ヤーとして５０μｇ／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡを
含む２mMのＥＤＴＡ溶液１mlにより希釈した。ＤＮＡを
２０％のトリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）及び２％ピロリン酸
ナトリウム溶液１mlの添加により沈殿せしめ、そして０
℃で１５分間インキュベートした。沈殿されたＤＮＡを
ＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｔｄ．，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，
Ｅｎｇｌａｎｄ）上で集め、そして５％トリクロロ酢酸
及び２％ピロリン酸ナトリウムにより、次に５％トリク
ロロ酢酸により、次に９５％エタノール５mlにより広範
に洗浄し、乾燥せしめ、そして計数した。１分当たりに
組込まれる〔α−33Ｐ〕ｄＣＭＰの量を、個々のサンプ
ルについて決定した。下記に示されるデータは、２つの
反応の平均を表わす。
【０１９２】
【表６】
【０１９３】データは、上記アッセイにより測定される
場合、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼが
Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３１ ＤＮＡポリメラーゼよりも４
１％早い延長速度を有することを示す。２種の酵素間の
差異の観点から、データは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼからの５′−ヌクレアーゼドメインのＦ７３０ＹＴｍ
ａ３０ ＤＮＡポリメラーゼにおける存在が、Ｇ４６Ｄ
変異により不活性化されるけれども、有意に早い延長速
度をもたらすことを示す。一連の時点からの延長生成物
を、変性アガロースゲル電気泳動によりさらに分析し、
その結果が酵素の延長速度の上昇を示すことを確かめ
た。
【０１９４】例５．色素ターミネーターサイクル配列決
定 この例は、色素−ラベルされた、ジデオキシ−ターミネ
ーターサイクル配列決定へのＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０
ＤＮＡポリメラーゼの適用を示す。比較のために、サイ
クル配列決定反応をまた、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ、すなわちＦ７３０Ｙ Ｔ
ｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼにおけるＦ７３０Ｙ変異
に対して類似する、エキソヌクレアーゼ活性を欠き、そ
してＦ６６７Ｙ変異を組込んでいるＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼの変異形を用いて実施した。
【０１９５】サイクル配列決定反応を、Ａｍｐｌｉ Ｔ
ａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを有するＡＢ
Ｉ ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃ
ｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ ｋｉｔ
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）
の試薬及びプロトコールを用いて実施した。このキット
における別の試薬のパッケージが、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ
（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳのためのＦ７３０
Ｙ Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼの容易な置換を可能に
した。このキットにおいては、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登
録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳは、ｒＴｔｈ熱安定性
無機ピロホスファターゼと組合されて供給される。
【０１９６】Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる反応のためには、キットのＤＮＡポリメラ
ーゼ／ピロホスファターゼ混合物が、１０単位のＦ７３
０ＹＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ及び２０単位のｒＴｔ
ｈ熱安定性無機ピロホスファターゼにより置換された。
ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼは、同時続続
アメリカ特許第５，６６５，５５１号（引用により本明
細書に組込まれる）に記載される。キットと共に供給さ
れる、陽性の対照鋳型、すなわちｐＧＥＭ（登録商標）
−３Ｚｆ（＋）及びプライマー、 -２１Ｍ１３が使用さ
れた。反応を、推薦される熱サイクルプロトコール（２
５サイクル：９６℃で１０秒；５０℃で５秒；及び６０
℃で４分）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣ
Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）において実施し
た。
【０１９７】延長生成物を、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅ
ｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）からの
Ｃｅｎｔｒｉ−ＳｅｐTMカラムを用いての回転カラム精
製により、組込まれていない色素ターミネーターについ
て精製し、そして前記プロトコールに推薦されるように
して、真空遠心分離機において乾燥せしめた。サンプル
を、回転せしめ、９０℃に３分間、加熱し、変性し、そ
して次に、予備電気泳動された４８cm（ウェルから読取
りまで）の４％ポリアクリルアミド／６Ｍ尿素ゲル上に
負荷し、そして電気泳動せしめ、そして製造業者の説明
書に従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ３７７ ＤＮＡ配
列決定機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，ＣＴ）上で分析した。
【０１９８】得られる配列決定トレースは、図に示され
る。図３，４、及び５は、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いてのサイクル配列決定反応から
の配列決定トレースを提供し、そして図６，７及び８
は、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼＦＳを用いてのサイクル配列決定反応からの配列決定
トレースを提供する。基本コーリングは、プライマーか
らの１０番目のヌクレオチドで開始するよう設定され
た。
【０１９９】Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラ
ーゼの使用が、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡ
ポリメラーゼＦＳを用いて得られる結果に比較される場
合、ピークの高さの全体的な均等性において有意な改良
点をもたらすことが、配列トレースの比較から明白であ
る。特に、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラー
ゼの使用は、ＤＮＡ配列の情況のために、Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳが使用され
る場合、ひじょうに低いピークの高さをもたらすそれら
の塩基、たとえばＡ又はＣの後のＧ、Ａ又はＣの後の
Ａ、及びＴの後のＴのピークの高さを有意に高める。
【０２００】同様に、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡ
ポリメラーゼの使用は、ＤＮＡ配列の情況のために、Ａ
ｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ
が使用される場合、ひじょうに高いピークの高さをもた
らすそれらの塩基、たとえばＧの後のＡのピークの高さ
を有意に低める。ピークの高さの均等性は、配列決定の
精度の上昇に寄与する。
【０２０１】配列決定の精度、すなわち２回の重複され
た反応について平均された、正しく配列決定された塩基
の割合が、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ３７７ ＤＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ分析ソフトウェアに
より、自動化された基本コーリングの結果から計算され
た。その結果は、下記表に要約される。典型的には、配
列決定誤差は、プライマーに続く領域、及びプライマー
から遠くの末端領域において最とも有力である。従っ
て、プライマーに続く最初の１０個のヌクレオチドは無
視され、そして精度が、続く５０個のヌクレオチド、次
の５００個のヌクレオチド、及び最終的に２つの末端領
域（それぞれ、長さ１００個のヌクレオチド）について
別々に計算された。
【０２０２】
【表７】
【０２０３】前記結果は、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ Ｄ
ＮＡポリメラーゼが配列決定の精度において実質的な改
良性；目立ったことには、より長い読取りの長さ（５６
０個以上のヌクレオチド）でそのような改良性を提供す
ることを示す。Ｆ７３０ＹＴｍａ３０ ＤＮＡポリメラ
ーゼの使用は、ヌクレオチド５１〜５５０からの５００
個のヌクレオチド領域及びヌクレオチド５５１〜６６０
からの最初の末端領域において完全に誤差を排除した。
さらに、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼ
の使用は、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリ
メラーゼＦＳを用いての６５０個のヌクレオチドから、
Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼを用いて
の少なくとも７５０個のヌクレオチドまでの少なくとも
１００個のヌクレオチドを、少なくとも９７％の精度で
配列決定できる標的物の長さを延長した。
【０２０４】例６．色素プライマーサイクル配列決定 この例は、色素プライマー配列決定への本発明のＤＮＡ
ポリメラーゼの適用を示す。サイクル配列決定反応を、
２５mMのトリス−ＨＣｌ（pH９．１）及び３．５mMのＭ
ｇＣｌ2 から成る緩衝液において実施する。４種の個々
の反応、すなわち４種のジデオキシターミネーターの個
々についての反応を実施する。それらの４種の反応の個
々についての反応条件を、下記に記載する：
【０２０５】１．ジデオキシ−ＡＴＰ反応（５μｌ）：
１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｃ７ｄＧ
ＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｊ）、０．５μＭのｄｄＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、０．１μｇのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、０．４ｐモルのＪＯＥ
色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１単位
のＤＮＡポリメラーゼ、及び５単位のｒＴｔｈ熱安定性
無機ピロホスファターゼ。
【０２０６】２．ジデオキシ−ＣＴＰ反応（５μｌ）：
１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｃ７ｄＧ
ＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．５μＭのｄｄＣＴＰ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１μｇのＭ１３ｍｐ１８
一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、０．
４ｐモルのＦＡＭ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ）、１単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び５単位の
ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０７】３．ジデオキシ−ＧＴＰ反応（１０μ
ｌ）：１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴ
ＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｃ７
ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．５μＭのｄｄＧ
ＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．２μｇのＭ１３ｍｐ
１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．８ｐモルＴＡＭＲＡ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ）、２単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び１
０単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０８】４．ジデオキシ−ＴＴＰ反応（１０μ
ｌ）：１００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴ
ＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１００μＭのｃ７
ｄＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．５μＭのｄｄＴ
ＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．２μｇのＭ１３ｍｐ
１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、
０．８ｐモルのＲＯＸ色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ）、２単位のＤＮＡポリメラーゼ、及び１０
単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ。
【０２０９】４種の反応の個々を、予備加熱された（７
５℃）Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐ（登録
商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００熱サイクラーに配
置し、そして９６℃で１５秒間、５５℃で１秒間、及び
７０℃で１分間の１５サイクル、続いて、９６℃で１５
秒及び７０℃で１分間の１５サイクルにゆだねる。４種
の反応物をプールし、そして９５％エタノール１００μ
ｌ及び３Ｍの酢酸ナトリウム（pH５．３）２．０μｌの
４℃での１５分間にわたっての添加により沈殿せしめ
る。
【０２１０】プールされた反応物を１５分間、微量遠心
分離し、沈殿物を集め、上清液を除去し、そしてペレッ
トを乾燥せしめる。ペレットを、脱イオン化されたホル
ムアミド／５０mMのＥＤＴＡ（pH８．０）５／ｌ（ｖ／
ｖ）６μｌに再懸濁し、９０℃で２分間、加熱し、そし
て予備−電気泳動された４％ポリアクリルアミド／６Ｍ
の尿素ゲル上に負荷し、そして電気泳動し、そして製造
業者の説明書に従って、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ３７７
ＤＮＡ配列決定機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏ
ｒｗａｌｋ，ＣＴ）上で分析する。
【０２１１】例７．ピロホスファターゼの効果 上記例５に記載される色素−ターミネーター反応におい
て、２０単位のｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファター
ゼ（ＰＰアーゼ）を前記反応物に添加し、ピロリン酸分
解の効果を低めた。この量のＰＰアーゼが、Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いる
反応のために有益であることが決定された。次の実験
を、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼを用
いて、サイクル配列決定反応の結果に対するＰＰアーゼ
濃度の効果を決定するために実施した。
【０２１２】色素−ターミネーターサイクル配列決定反
応を、上記例５に実質的に記載のようにして実施した。
但し、ＰＰアーゼ濃度は反応間で変更された。反応当た
り０，０．５，１及び２０単位のＰＰアーゼ濃度を試験
した。標的ＤＮＡ，ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）、及び使用
されるプライマーＭ１３（−２１）は、ＰｅｒｋｉｎＥ
ｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）からのＡＢＩ ＰＲ
ＩＳＭTM ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ ｋｉｔからであっ
た。すべての反応は、二重反復して行なわれた。
【０２１３】個々の配列決定反応の結果を、配列決定ト
レースの直接的な比較により比較した。その結果は、４
種ＰＰアーゼ濃度間の明白な差異を示さなかった。配列
決定トレースピークの高さ及びバックグラウンドは、少
なくとも５００個の塩基対の読取りに匹敵した。従っ
て、そのデータは、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポ
リメラーゼの使用が、添加されるＰＰアーゼを伴わない
で、サイクル配列決定反応の実施を可能にすることを示
す。
【０２１４】例８．最適ｄＩＴＰ濃度 上記例５で使用される、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを有するＡＢＩ ＰＲＩＳ
ＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）が、５：１：
１：１の比でｄＩＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴ
Ｐを含むｄＮＴＰ混合物を供給する。ｄＩＴＰの高めら
れた濃度は、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポ
リメラーゼＦＳにより所有される低いｄＩＴＰ組込み効
率を補足する。
【０２１５】例５に記載されるサイクル配列決定反応に
おいて生成されるＧシグナルピークの強さの分析は、Ｆ
７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼがｄＩＴＰ
をより高い効率で組込み、そして従って、ｄＩＴＰ濃度
が低められるべきであることを示唆した。さらなる反応
を実施し、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラー
ゼを用いての色素−ターミネーターサイクル配列決定反
応への使用のためのｄＩＴＰの最適濃度を決定した。
【０２１６】反応を、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）
ＤＮＡポリメラーゼＦＳを有するＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM
Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ ｋｉｔを用いて、例５に実
質的に記載のようにして実施した。前記キットにより供
給されるｄＮＴＰ混合物の代わりに、１００μＭの個々
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ，ＴＥ緩衝液（１
０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８，０．１mMのＥＤＴＡ）
中、広範囲のｄＩＴＰ濃縮物を含むｄＮＴＰ混合物を使
用した。例５に記載されるように、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ
３０ ＤＮＡポリメラーゼ／ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロ
ホスファターゼ混合物を、キットにより供給されるＡｍ
ｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ／
ｒＴｔｈ熱安定性無機ピロホスファターゼ混合物と置換
した。
【０２１７】最適ｄＩＴＰ濃度を、配列トレース及び処
理されていないシグナル強度データの両者の比較により
決定した。それらの実験に基づいて、ｄＩＴＰ濃度が好
ましくは、１５０〜２５０μＭに低められたことが決定
された。その結果は、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡ
ポリメラーゼがＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡ
ポリメラーゼＦＳよりも有意により効果的にｄＩＴＰを
組込むことが決定された。他の熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼに対するＦ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラ
ーゼを比較するためのさらなる実験（結果は示されてい
ない）はまた、Ｆ７３０Ｙ Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメ
ラーゼが、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関して、
ｄＩＴＰ組込みの有意に高められた効率を有することも
示唆した。
【０２１８】寄託 次の寄託が下記の日に行なわれた：
【表８】
【０２１９】この寄託は、ブダペスト条件下での特許手
続き及び規則のために微生物の寄託の国際認識に基づい
てブダペスト条件の規定下で、American Type Calture
Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockvill
e, MD20852, U.S.A. に、ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, In
c., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 9450
1, U.S.A.により行なわれた。これは、寄託の日から３
０年間、生存培養物の維持を保証する。
【０２２０】生物は、ブダペスト条件下でＡＴＣＣによ
り入手され、そして出願人とＡＴＣＣとの間の同意を必
要とし、そしてＡＴＣＣは、関連するアメリカ特許の発
行に基づいて、又はいづれかのアメリカ又は外国特許出
願の公衆への公開に基づいて、どちらが最初であろう
と、培養物の子孫の永久的且つ自由な利用性を保証し、
そしてＢ５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２及びそれに従っての
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒの規則（８８６ＯＧ６３８に
特に関する３７Ｃ．Ｆ．Ｋ．§１．１４を包含する）に
従って権利を与えられるＵ．Ｓ．Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
ｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒ
ｋｓによる決定により前記子孫の利用性を保証する。
【０２２１】本出願の譲受人は、寄託上の培養物が適切
な培養下で培養される場合、死亡し、又は失なわれ又は
破壊される場合、それはすぐに、同じ培養物の生存検体
により、通知に基づいて交換されるであろう。寄託され
た菌株の利用性は、その特許法に従っていづれかの政府
の権力下で許可される権利に違反して本発明を実施する
ためのライセンスとして解釈されるべきではない。
【０２２２】ＲＯＣＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＳＹＳ
ＴＥＭＳ，Ｉｎｃ．，１１４５ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ａ
ｖｅｎｕｅ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
９４５０１，Ｕ．Ｓ．Ａ．は、アメリカ特許出願番号第
６０−０２３３７６からの優先権を主張する外国特許出
願に前述の寄託された生物学的材料を照会するために公
認されたＦ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ Ａ
Ｇ，１２４Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，ＣＨ
−４０７０ Ｂａｓｌｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを有
し、そして寄託された材料が公衆に利用され得る、無条
件で且つ変更できない同意を与えている。
【０２２３】
【配列表】
（１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：F. Hoffmann - La Roche Ltd （Ｂ）通り：Grenzacher Strasse 124 （Ｃ）市：Basel （Ｄ）州：BS （Ｅ）国：Switzerland （Ｆ）郵便番号：（ZIP) : CH-4070 （Ｇ）電話：（0) 61 688 24 03 （Ｈ）テレファックス：（0) 61 688 13 95 （Ｉ）テレックス：962292/965512 hlr ch （ii）発明の名称：変異キメラＤＮＡポリメラーゼ （iii)配列の数：１１ （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１： Met Ala Arg Leu Phe Leu Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ala Tyr Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Leu Asp Arg Ser Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ile Pro Thr 20 25 30 Asn Ala Thr Tyr Gly Val Ala Arg Met Leu Val Arg Phe Ile Lys Asp 35 40 45 His Ile Ile Val Gly Lys Asp Tyr Val Ala Val Ala Phe Asp Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Thr Phe Arg His Lys Leu Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Gln Arg 65 70 75 80 Pro Lys Thr Pro Asp Leu Leu Ile Gln Gln Leu Pro Tyr Ile Lys Lys 85 90 95 Leu Val Glu Ala Leu Gly Met Lys Val Leu Glu Val Glu Gly Tyr Glu 100 105 110 Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ala Val Lys Gly Leu Pro Leu Phe 115 120 125 Asp Glu Ile Phe Ile Val Thr Gly Asp Lys Asp Met Leu Gln Leu Val 130 135 140 Asn Glu Lys Ile Lys Val Trp Arg Ile Val Lys Gly Ile Ser Asp Leu 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Asp Ala Gln Lys Val Lys Glu Lys Tyr Gly Val Glu Pro 165 170 175 Gln Gln Ile Pro Asp Leu Leu Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ile Asp Asn 180 185 190 Ile Pro Gly Val Thr Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Gln Leu Leu 195 200 205 Glu Lys Tyr Lys Asp Leu Glu Asp Ile Leu Asn His Val Arg Glu Leu 210 215 220 Pro Gln Lys Val Arg Lys Ala Leu Leu Arg Asp Arg Glu Asn Ala Ile 225 230 235 240 Leu Ser Lys Lys Leu Ala Ile Leu Glu Thr Asn Val Pro Ile Glu Ile 245 250 255 Asn Trp Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Gly Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Leu 260 265 270 Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Phe Ala Ser Ile Met Lys Glu Leu Gln 275 280 285 Leu Tyr Glu 290
【０２２４】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８９個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号２： Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu
【０２２５】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８８個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号３： Met Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val 1 5 10 15 Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu 20 25 30 Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys 35 40 45 Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Val Val Val Val Val 50 55 60 Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr 65 70 75 80 Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val 100 105 110 Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Arg Ala 115 120 125 Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu 130 135 140 Tyr Gln Leu Leu Ser Glu Arg Ile Ala Ile Leu His Pro Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Tyr Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Glu 165 170 175 Gln Trp Val Asp Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp Pro Ser Asp Asn Ile 180 185 190 Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Gln Arg Leu Ile Arg 195 200 205 Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Phe Gln His Leu Asp Gln Val Lys 210 215 220 Pro Ser Leu Arg Glu Lys Leu Gln Ala Gly Met Glu Ala Leu Ala Leu 225 230 235 240 Ser Arg Lys Leu Ser Gln Val His Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp 245 250 255 Phe Gly Arg Arg Arg Thr Pro Asn Leu Glu Gly Leu Arg Ala Phe Leu 260 265 270 Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu 275 280 285
【０２２６】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号４： Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu 290
【０２２７】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号５： Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Pro Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu 290
【０２２８】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９１個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号６： Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Asn Pro Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Asp Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Gln Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu 290
【０２２９】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号７： Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr 20 25 30 Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Val Ala Ile Val Val Phe Asp 50 55 60 Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala 65 70 75 80 Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile 85 90 95 Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val Pro Gly 100 105 110 Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala Glu Arg 115 120 125 Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Ser Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln 130 135 140 Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Leu Leu His Pro Glu Gly Glu Val Leu 145 150 155 160 Thr Pro Gly Trp Leu Gln Glu Arg Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Arg Trp 165 170 175 Val Glu Tyr Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly 180 185 190 Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Trp 195 200 205 Gly Ser Leu Glu Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asp Gln Val Lys Pro Glu 210 215 220 Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Asn Asn Leu Asp Lys Leu Gln Met Ser 225 230 235 240 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe 245 250 255 Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Trp Glu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Glu 260 265 270 Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu 275 280 285
【０２３０】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号８： Met Leu Pro Leu Leu Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr 20 25 30 Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Val Ala Ile Val Val Phe Asp 50 55 60 Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala 65 70 75 80 Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile 85 90 95 Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val Pro Gly 100 105 110 Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Arg Lys Ala Glu Arg 115 120 125 Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Ser Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln 130 135 140 Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Leu Leu His Pro Glu Gly Glu Val Leu 145 150 155 160 Thr Pro Gly Trp Leu Gln Glu Arg Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Arg Trp 165 170 175 Val Glu Tyr Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly 180 185 190 Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Trp 195 200 205 Gly Ser Leu Glu Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asp Gln Val Lys Pro Glu 210 215 220 Arg Val Trp Glu Ala Ile Arg Asn Asn Leu Asp Lys Leu Gln Met Ser 225 230 235 240 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe 245 250 255 Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Trp Glu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Glu 260 265 270 Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu 275 280 285
【０２３１】（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６８２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号９： ATGAGAGGCA TGCTTCCACT TTTTGAGCCC AAGGGCCGGG TCCTCCTGGT GGACGGCCAC 60 CACCTGGCCT ACCGCACCTT CCACGCCCTG AAGGGCCTCA CCACCAGCCG GGGGGAGCCG 120 GTGCAGGCGG TCTACGACTT CGCCAAGAGC CTCCTCAAGG CCCTCAAGGA GGACGGGGAC 180 GCGGTGATCG TGGTCTTTGA CGCCAAGGCC CCCTCCTTCC GCCACGAGGC CTACGGTGGG 240 TACAAGGCGG GCCGGGCCCC CACGCCGGAG GACTTTCCCC GGCAACTCGC CCTCATCAAG 300 GAGCTGGTAG ATCTCCTGGG GCTGGCGCGC CTCGAGGTCC CGGGCTACGA GGCGGACGAC 360 GTCCTGGCCA GCCTGGCCAA GAAGGCGGAA AAGGAGGGCT ACGAGGTCCG CATCCTCACC 420 GCCGACAAAG ACCTTTACCA GCTCCTTTCC GACCGCATCC ACGTCCTCCA CCCCGAGGGG 480 TACCTCATCA CCCCGGCCTG GCTTTGGGAA AAGTACGGCC TGAGGCCCGA CCAGTGGGCC 540 GACTACCGGG CCCTGACCGG GGACGAGTCC GACAACATCC CCGGGGTCAC TGGGATCGGT 600 GAGAAGACTG CTGTTCAGCT TCTAGAGAAG TACAAAGACC TCGAAGACAT ACTGAATCAT 660 GTTCGCGAAC TTCCTCAAAA GGTGAGAAAA GCCCTGCTTC GAGACAGAGA AAACGCCATT 720 CTCAGCAAAA AGCTGGCGAT TCTGGAAACA AACGTTCCCA TTGAAATAAA CTGGGAAGAA 780 CTTCGCTACC AGGGCTACGA CAGAGAGAAA CTCTTACCAC TTTTGAAAGA ACTGGAATTC 840 GCATCCATCA TGAAGGAACT TCAACTGTAC GAAGAGTCCG AACCCGTTGG ATACAGAATA 900 GTGAAAGACC TAGTGGAATT TGAAAAACTC ATAGAGAAAC TGAGAGAATC CCCTTCGTTC 960 GCCATAGATC TTGAGACGTC TTCCCTCGAT CCTTTCGACT GCGACATTGT CGGTATCTCT 1020 GTGTCTTTCA AACCAAAGGA AGCGTACTAC ATACCACTCC ATCATAGAAA CGCCCAGAAC 1080 CTGGACGAAA AAGAGGTTCT GAAAAAGCTC AAAGAAATTC TGGAGGACCC CGGAGCAAAG 1140 ATCGTTGGTC AGAATTTGAA ATTCGATTAC AAGGTGTTGA TGGTGAAGGG TGTTGAACCT 1200 GTTCCTCCTT ACTTCGACAC GATGATAGCG GCTTACCTTC TTGAGCCGAA CGAAAAGAAG 1260 TTCAATCTGG ACGATCTCGC ATTGAAATTT CTTGGATACA AAATGACATC TTACCAAGAG 1320 CTCATGTCCT TCTCTTTTCC GCTGTTTGGT TTCAGTTTTG CCGATGTTCC TGTAGAAAAA 1380 GCAGCGAACT ACTCCTGTGA AGATGCAGAC ATCACCTACA GACTTTACAA GACCCTGAGC 1440 TTAAAACTCC ACGAGGCAGA TCTGGAAAAC GTGTTCTACA AGATAGAAAT GCCCCTTGTG 1500 AACGTGCTTG CACGGATGGA ACTGAACGGT GTGTATGTGG ACACAGAGTT CCTGAAGAAA 1560 CTCTCAGAAG AGTACGGAAA AAAACTCGAA GAACTGGCAG AGGAAATATA CAGGATAGCT 1620 GGAGAGCCGT TCAACATAAA CTCACCGAAG CAGGTTTCAA GGATCCTTTT TGAAAAACTC 1680 GGCATAAAAC CACGTGGTAA AACGACGAAA ACGGGAGACT ATTCAACACG CATAGAAGTC 1740 CTCGAGGAAC TTGCCGGTGA ACACGAAATC ATTCCTCTGA TTCTTGAATA CAGAAAGATA 1800 CAGAAATTGA AATCAACCTA CATAGACGCT CTTCCCAAGA TGGTCAACCC AAAGACCGGA 1860 AGGATTCATG CTTCTTTCAA TCAAACGGGG ACTGCCACTG GAAGACTTAG CAGCAGCGAT 1920 CCCAATCTTC AGAACCTCCC GACGAAAAGT GAAGAGGGAA AAGAAATCAG GAAAGCGATA 1980 GTTCCTCAGG ATCCAAACTG GTGGATCGTC AGTGCCGACT ACTCCCAAAT AGAACTGAGG 2040 ATCCTCGCCC ATCTCAGTGG TGATGAGAAT CTTTTGAGGG CATTCGAAGA GGGCATCGAC 2100 GTCCACACTC TAACAGCTTC CAGAATATTC AACGTGAAAC CCGAAGAAGT AACCGAAGAA 2160 ATGCGCCGCG CTGGTAAAAT GGTTAATTTT TCCATCATAT ACGGTGTAAC ACCTTACGGT 2220 CTGTCTGTGA GGCTTGGAGT ACCTGTGAAA GAAGCAGAAA AGATGATCGT CAACTACTTC 2280 GTCCTCTACC CAAAGGTGCG CGATTACATT CAGAGGGTCG TATCGGAAGC GAAAGAAAAA 2340 GGCTATGTTA GAACGCTGTT TGGAAGAAAA AGAGACATAC CACAGCTCAT GGCCCGGGAC 2400 AGGAACACAC AGGCTGAAGG AGAACGAATT GCCATAAACA CTCCCATACA GGGTACAGCA 2460 GCGGATATAA TAAAGCTGGC TATGATAGAA ATAGACAGGG AACTGAAAGA AAGAAAAATG 2520 AGATCGAAGA TGATCATACA GGTCCACGAC GAACTGGTTT TTGAAGTGCC CAATGAGGAA 2580 AAGGACGCGC TCGTCGAGCT GGTGAAAGAC AGAATGACGA ATGTGGTAAA GCTTTCAGTG 2640 CCGCTCGAAG TGGATGTAAC CATCGGCAAA ACATGGTCGT GA 2682
【０２３２】（２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８９３個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１０： Met Ala Arg Leu Phe Leu Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ala Tyr Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Leu Asp Arg Ser Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ile Pro Thr 20 25 30 Asn Ala Thr Tyr Gly Val Ala Arg Met Leu Val Arg Phe Ile Lys Asp 35 40 45 His Ile Ile Val Gly Lys Asp Tyr Val Ala Val Ala Phe Asp Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Thr Phe Arg His Lys Leu Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Gln Arg 65 70 75 80 Pro Lys Thr Pro Asp Leu Leu Ile Gln Gln Leu Pro Tyr Ile Lys Lys 85 90 95 Leu Val Glu Ala Leu Gly Met Lys Val Leu Glu Val Glu Gly Tyr Glu 100 105 110 Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ala Val Lys Gly Leu Pro Leu Phe 115 120 125 Asp Glu Ile Phe Ile Val Thr Gly Asp Lys Asp Met Leu Gln Leu Val 130 135 140 Asn Glu Lys Ile Lys Val Trp Arg Ile Val Lys Gly Ile Ser Asp Leu 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Asp Ala Gln Lys Val Lys Glu Lys Tyr Gly Val Glu Pro 165 170 175 Gln Gln Ile Pro Asp Leu Leu Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ile Asp Asn 180 185 190 Ile Pro Gly Val Thr Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Gln Leu Leu 195 200 205 Glu Lys Tyr Lys Asp Leu Glu Asp Ile Leu Asn His Val Arg Glu Leu 210 215 220 Pro Gln Lys Val Arg Lys Ala Leu Leu Arg Asp Arg Glu Asn Ala Ile 225 230 235 240 Leu Ser Lys Lys Leu Ala Ile Leu Glu Thr Asn Val Pro Ile Glu Ile 245 250 255 Asn Trp Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Gly Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Leu 260 265 270 Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Phe Ala Ser Ile Met Lys Glu Leu Gln 275 280 285 Leu Tyr Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu 290 295 300 Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile 325 330 335 Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys 355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro 385 390 395 400 Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu 485 490 495 Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540 Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575 Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro 580 585 590 Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605 Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala 610 615 620 Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile 645 650 655 Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala 660 665 670 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp 675 680 685 Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu 690 695 700 Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu 705 710 715 720 Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val 725 730 735 Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala 740 745 750 Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp 755 760 765 Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg 770 775 780 Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp 785 790 795 800 Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 805 810 815 Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp 820 825 830 Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val 835 840 845 His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 850 855 860 Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val 865 870 875 880 Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser 885 890
【０２３３】（２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号１１： GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC 30
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、及びサ
ーマス属の７つの種からのＤＮＡポリメラーゼの５′−
ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列整合を示す。５′
−ヌクレアーゼ活性に対して決定的であるアミノ酸は星
印により示される。
【図２】図２は、図１の続きであって、同じようにＤＮ
Ａポリメラーゼの５′−ヌクレアーゼドメインのアミノ
酸配列整合を示す。
【図３】図３は、例５に記載されるようなＦ７３０Ｙ
Ｔｍａ３０ ＤＮＡポリメラーゼを用いてのサイクル配
列決定反応からの配列決定トレースを示す。
【図４】図４は、図３の続きであって、同じように配列
決定トレースを示す。
【図５】図５は、図４の続きであって、同じように配列
決定トレースを示す。
【図６】図６は、例５に記載されるようなＡｍｐｌｉ
Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳを用いての
サイクル配列決定反応からの配列決定トレースを示す。
【図７】図７は、図６の続きであって、同じように配列
決定トレースを示す。
【図８】図８は、図７の続きであって、同じように配列
決定トレースを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フレッド ローレンス レイチャート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94610, オークランド，ウォーフィールド アベニ ュ 859

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｎ−末端領域及びＣ−末端領域から成る
    熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであって；前記Ｎ−末端領
    域はサーマス・スペーシス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃ
    ｉｅｓ）ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１〜ｎから成
    り、ここでｎはサーマトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔ
    ｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラ
    ーゼ、すなわち配列番号１０のアミノ酸ｍに対応するア
    ミノ酸であり、このｍは１３７位と２９１位の間にあ
    り；前記Ｃ−末端領域はＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、
    すなわち配列番号１０のアミノ酸ｍ＋１〜８９３から成
    り；前記Ｎ−末端領域は、前記サーマス・スペーシスＤ
    ＮＡポリメラーゼに存在する場合、５′−ヌクレアーゼ
    活性を実質的に低めるか又は排除する少なくとも１つの
    点変異により修飾されており、又は前記Ｃ−末端領域
    は、Ｔｍａ ＤＮＡに存在する場合、５′−ヌクレアー
    ゼ活性を実質的に低めるか又は排除する、Ｔｍａ ＤＮ
    Ａポリメラーゼのアミノ酸ｍ＋１〜２９１である領域内
    での少なくとも１つの点変異により修飾されており；前
    記Ｃ−末端領域が、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼに存在
    する場合、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を実質的
    に低める少なくとも１つの点変異により修飾され；そし
    て前記Ｃ−末端領域がアミノ酸７３０にチロシンを含む
    ように修飾されていることを特徴とする熱安定性ＤＮＡ
    ポリメラーゼ。
  2. 【請求項２】 前記Ｎ−末端領域が、Ｄ１８，Ｒ２５，
    Ｇ４６，Ｄ６７，Ｆ７３，Ｒ７４，Ｙ８１，Ｇ１０７，
    Ｅ１１７，Ｄ１１９，Ｄ１２０，Ｄ１４２，Ｄ１４４，
    Ｇ１８７，Ｄ１８８，Ｄ１９１及びＧ１９５から成る群
    から選択されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおけるア
    ミノ酸に対応するアミノ酸位置における点変異を含む請
    求項１記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  3. 【請求項３】 前記Ｃ−末端領域が、Ｄ３２３，Ｅ３２
    ５，Ｌ３２９，Ｎ３８５，Ｄ３８９，Ｌ３９３，Ｙ４６
    ４及びＤ４６８から成る群から選択されたアミノ酸位置
    における点変異を含む請求項１記載の熱安定性ＤＮＡポ
    リメラーゼ。
  4. 【請求項４】 前記Ｎ−末端領域が、Ｔａｑ ＤＮＡポ
    リメラーゼにおけるアミノ酸Ｇ４６に対応するアミノ酸
    位置でアスパラギン酸を含む請求項２に記載の熱安定性
    ＤＮＡポリメラーゼ。
  5. 【請求項５】 前記Ｃ−末端領域がＤ３２３Ａ又はＥ３
    ２５Ａ変異を含む請求項３記載の熱安定性ＤＮＡポリメ
    ラーゼ。
  6. 【請求項６】 前記サーマス・スペーシスが、サーマス
    ・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
    ｓ），サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕ
    ｓ），サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔ
    ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・スペーシスＺ０
    ５、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａ
    ｌｄｏｆｉｌｕｓ），サーマス・スペーシスｓｐｓ１
    ７，及びサーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
    ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）から成る群から選択される請求
    項１記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  7. 【請求項７】 前記サーマス・スペーシスが、サーマス
    ・アクアチカスである請求項６記載の熱安定性ＤＮＡポ
    リメラーゼ。
  8. 【請求項８】 前記ｎが１９０である請求項１記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  9. 【請求項９】 前記Ｎ−末端領域が、Ｇ４６Ｄ変異を含
    み、そして前記Ｃ−末端領域がＤ３２３Ａ変異及びＥ３
    ２５Ａ変異を含む請求項８記載の熱安定性ＤＮＡポリメ
    ラーゼ。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮ
    Ａ。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含んで
    成るプラスミド。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含んで
    成る発現ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含んで
    成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの製造方
    法であって、 （ａ）請求項１〜９のいづれか１項記載の熱安定性ＤＮ
    ＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベ
    クターにより形質転換された宿主細胞を、熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼの発現を促進する条件下で培養し；そし
    て （ｂ）前記宿主細胞から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを
    単離する；ことを含んで成る方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載の方法により製造され
    た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜９又は１５のいづれか１項
    記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される、核酸
    を配列決定するための方法。
  17. 【請求項１７】 核酸増幅又は配列決定反応への請求項
    １〜９又は１５のいづれか１項記載の熱安定性ＤＮＡポ
    リメラーゼの使用。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜９又は１５のいづれか１項
    記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び１又は複数の
    非イオン性ポリマー界面活性剤を含んで成る組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜９又は１５のいづれか１項
    記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成る、プラ
    イマー延長反応を実施するためのキット。
  20. 【請求項２０】 本明細書に記載された発明。
JP20853398A 1997-07-09 1998-07-09 変性キメラｄｎａポリメラーゼ Expired - Fee Related JP4350815B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5206597P 1997-07-09 1997-07-09
US60/052065 1997-07-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH1189588A true JPH1189588A (ja) 1999-04-06
JP4350815B2 JP4350815B2 (ja) 2009-10-21

Family

ID=21975226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP20853398A Expired - Fee Related JP4350815B2 (ja) 1997-07-09 1998-07-09 変性キメラｄｎａポリメラーゼ

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6228628B1 (ja)
EP (1) EP0892058B1 (ja)
JP (1) JP4350815B2 (ja)
AT (1) ATE325877T1 (ja)
CA (1) CA2240570C (ja)
DE (1) DE69836779T2 (ja)
ES (1) ES2263188T3 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004521606A (ja) * 2000-05-24 2004-07-22 サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク Ｒｎａの検出法
JP2006513726A (ja) * 2002-12-20 2006-04-27 ストラタジーン カリフォルニア Ｄｎａポリメラーゼブレンドおよびその使用
JP2006311867A (ja) * 2002-04-02 2006-11-16 F Hoffmann La Roche Ag 弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性ｄｎａポリメラーゼ
JP2010000089A (ja) * 2000-05-26 2010-01-07 Bio Rad Lab Inc 改良された核酸修飾酵素
JP2011504732A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 向上したピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ）能力を有する変異ｄｎａポリメラーゼ
JP4989004B2 (ja) * 2000-02-23 2012-08-01 シティ・オブ・ホープ 加ピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ）：アリル−特異的増幅および核酸配列決定への適応

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6759226B1 (en) 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
AU4174397A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US6306588B1 (en) 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
DE19810879A1 (de) * 1998-03-13 1999-09-16 Roche Diagnostics Gmbh Polymerasenchimären
GB9818432D0 (en) * 1998-08-24 1998-10-21 Bioline Limited Thermostable DNA Polymerase
WO2001061015A2 (en) * 2000-02-17 2001-08-23 Qiagen Gmbh Thermostable chimeric nucleic acid polymerases and uses thereof
US7033763B2 (en) 2000-02-23 2006-04-25 City Of Hope Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP)
JP2004502443A (ja) * 2000-07-12 2004-01-29 インヴィトロジェン　コーポレーション 高忠実度ポリメラーゼおよびその使用方法
US7238505B2 (en) 2000-10-04 2007-07-03 Ahram Biosystems Inc. Immobilized DNA polymerase
DE10049211A1 (de) * 2000-10-05 2002-04-18 Qiagen Gmbh Thermostabile Polymerase aus Thermococcus pacificus
WO2002057414A2 (en) * 2000-10-20 2002-07-25 Expression Diagnostics, Inc. Leukocyte expression profiling
US7026121B1 (en) * 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6905827B2 (en) * 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US20050042629A1 (en) * 2002-09-13 2005-02-24 Applera Corporation Thermus scotoductus nucleic acid polymerases
AU2002351198B2 (en) 2001-11-28 2008-08-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods of using improved polymerases
AU2002346498A1 (en) 2001-11-30 2003-06-17 Applera Corporation Thermus brockianus nucleic acid polymerases
US7666645B2 (en) * 2002-10-23 2010-02-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sso7-polymerase conjugate proteins
US7892745B2 (en) * 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
GB2416538B (en) * 2004-07-26 2008-07-30 Bioline Ltd Chimeric DNA polymerase
US7645575B2 (en) * 2004-09-08 2010-01-12 Xdx, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
US20060223067A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Paolo Vatta Mutant DNA polymerases and methods of use
US7378260B2 (en) * 2005-04-01 2008-05-27 Applera Corporation Products and methods for reducing dye artifacts
EP1885889A4 (en) * 2005-05-11 2010-01-20 Expression Diagnostics Inc METHOD FOR MONITORING THE OPERATING STATUS OF TRANSPLANTS OVER GENLISTS
US20060292578A1 (en) * 2005-06-28 2006-12-28 Weidong Zheng DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases
US20070190538A1 (en) * 2005-07-29 2007-08-16 Applera Corporation Chimeric polymerases
CA2648580A1 (en) * 2006-04-07 2008-05-02 Xdx, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
US7993832B2 (en) 2006-08-14 2011-08-09 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
US8962293B2 (en) 2006-10-18 2015-02-24 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases and related methods
US8148067B2 (en) * 2006-11-09 2012-04-03 Xdx, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
US8540517B2 (en) * 2006-11-27 2013-09-24 Pharos Innovations, Llc Calculating a behavioral path based on a statistical profile
CN102245761A (zh) 2008-11-03 2011-11-16 卡帕生物系统 修饰a型dna聚合酶
US8206929B2 (en) 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
US8039215B2 (en) 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
US9428737B1 (en) * 2010-01-11 2016-08-30 Eric Gaucher Taq polymerase sequences useful for incorporating analogs of nucleoside triphosphates
US8741617B2 (en) 2010-06-18 2014-06-03 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination
US8722380B2 (en) 2010-06-18 2014-05-13 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination
WO2011157435A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
AU2011267421B2 (en) 2010-06-18 2014-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag DNA polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
EP2582804B1 (en) 2010-06-18 2015-02-25 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
EP2582808B1 (en) 2010-06-18 2015-04-22 Roche Diagniostics GmbH Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
US8715991B2 (en) 2010-06-18 2014-05-06 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
CN103003418B (zh) 2010-06-18 2015-08-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶
WO2012082753A2 (en) 2010-12-13 2012-06-21 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using activation by polyphosphorolysis (app) reactions
US9315787B2 (en) 2011-01-14 2016-04-19 Kapa Biosystems, Inc. Modified DNA polymerases for improved amplification
JP5847201B2 (ja) 2011-02-15 2016-01-20 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ
ES2561885T3 (es) 2011-04-11 2016-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag ADN polimerasas de actividad mejorada
EP2718260B1 (en) 2011-06-08 2018-07-25 Life Technologies Corporation Design and development of novel detergents for use in pcr systems
WO2012170907A2 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
CN103687943B (zh) 2011-07-28 2015-11-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶
ES2569723T3 (es) 2011-12-08 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Polimerasas de DNA con actividad mejorada
EP2788480B1 (en) 2011-12-08 2019-01-16 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerases with improved activity
EP2788481B1 (en) 2011-12-08 2018-03-07 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerases with improved activity
US9920360B2 (en) 2012-11-02 2018-03-20 Life Technologies Corporation Small RNA capture, detection and quantification
US11254977B2 (en) 2013-03-12 2022-02-22 Life Technologies Corporation Universal reporter-based genotyping methods and materials
EP3063129B1 (en) 2013-10-25 2019-04-17 Life Technologies Corporation Novel compounds for use in pcr systems and applications thereof
ES2788949T3 (es) 2014-06-27 2020-10-23 Illumina Inc Polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos
EP3967768A1 (en) 2015-03-13 2022-03-16 Life Technologies Corporation Compositions for small rna capture, detection and quantification
WO2019122200A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Polymerase chain reaction composition comprising amines
WO2019180137A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps
WO2020053327A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Mutant dna polymerase(s) with improved strand displacement ability
JP2022503427A (ja) 2018-10-31 2022-01-12 イラミーナ インコーポレーテッド ポリメラーゼ、組成物、および使用方法
KR20210098844A (ko) 2018-12-05 2021-08-11 일루미나, 인코포레이티드 중합효소, 조성물, 및 사용 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US5466591A (en) 1986-08-22 1995-11-14 Hoffmann-La Roche Inc. 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
DK0550687T3 (da) * 1990-09-28 1999-12-13 Hoffmann La Roche 5' til 3'-exonukleasemutationer af termostabile DNA-polymeraser
US5474920A (en) 1993-11-23 1995-12-12 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Modified thermo-resistant DNA polymerases
US5912155A (en) * 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
EP0655506B1 (en) * 1994-10-17 1996-09-18 President And Fellows Of Harvard College DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US5614365A (en) 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
US5948614A (en) * 1995-09-08 1999-09-07 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from thermotoga maritima and mutants thereof

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4989004B2 (ja) * 2000-02-23 2012-08-01 シティ・オブ・ホープ 加ピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ）：アリル−特異的増幅および核酸配列決定への適応
JP2004521606A (ja) * 2000-05-24 2004-07-22 サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク Ｒｎａの検出法
JP2010000089A (ja) * 2000-05-26 2010-01-07 Bio Rad Lab Inc 改良された核酸修飾酵素
JP2006311867A (ja) * 2002-04-02 2006-11-16 F Hoffmann La Roche Ag 弱化３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性又は熱活性ｄｎａポリメラーゼ
JP2006513726A (ja) * 2002-12-20 2006-04-27 ストラタジーン カリフォルニア Ｄｎａポリメラーゼブレンドおよびその使用
US7960157B2 (en) 2002-12-20 2011-06-14 Agilent Technologies, Inc. DNA polymerase blends and uses thereof
JP2011504732A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 向上したピロリン酸分解活性化重合（ｐａｐ）能力を有する変異ｄｎａポリメラーゼ

Also Published As

Publication number Publication date
EP0892058B1 (en) 2006-05-10
CA2240570A1 (en) 1999-01-09
EP0892058A3 (en) 2001-09-26
ES2263188T3 (es) 2006-12-01
DE69836779T2 (de) 2007-04-26
US6228628B1 (en) 2001-05-08
EP0892058A2 (en) 1999-01-20
DE69836779D1 (de) 2007-02-15
CA2240570C (en) 2009-12-15
JP4350815B2 (ja) 2009-10-21
ATE325877T1 (de) 2006-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4350815B2 (ja) 変性キメラｄｎａポリメラーゼ
EP2272952B1 (en) Thermostable or thermoactive DNA polymerase with attenuated 3'-5' exonuclease activity
US5968799A (en) Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermosipho africanus
US5405774A (en) DNA encoding a mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermus species sps17
US5624833A (en) Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermotoga maritima
US5455170A (en) Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05
US5489523A (en) Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5466591A (en) 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
EP0550687B1 (en) 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable dna polymerases
US7045328B2 (en) Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US5545552A (en) Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
WO1992009689A1 (en) PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
US5866395A (en) Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I
CA2185362C (en) Purified nucleic acid encoding a thermostable pyrophosphatase
JP4714848B2 (ja) Ｄｎａポリメラーゼ変異体
KR20020067092A (ko) 써머스 에스피 엑스-1로부터 분리된 내열성 디엔에이중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050531

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050531

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080520

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080819

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20081125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090225

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20090623

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20090723

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120731

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130731

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees