ES2788949T3 - Polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos - Google Patents

Abstract

Una ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada que comprende mutaciones de sustitución de aminoácidos en posiciones posicionalmente equivalentes a Leu408, Tyr409, Pro410 y Lys477 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N de tipo salvaje SEQ ID NO: 5, en donde las mutaciones por sustitución son homólogas a Leu408Ala, Tyr409Ala, Pro410Ile y Lys477Met, en donde la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de arquea de la familia B alterada es al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 5 y, en uso, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B exhibe actividad de polimerasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Polimerasas modificadas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos

Antecedentes

Todos los organismos confían en las ADN polimerasas para replicar y mantener sus genomas. Permiten la replicación de ADN de alta fidelidad detectando la complementariedad entre bases, así como reconociendo características estructurales adicionales de la base. Sigue existiendo la necesidad de polimerasas modificadas con una incorporación mejorada de análogos de nucleótidos, en particular nucleótidos que se modifican en el hidroxilo de azúcar 3'.

El número de acceso a la base de datos UNIPROT: P61876 describe la polimerasa B que tiene una identidad del 80,3% a lo largo de 773 posiciones para la SEQ ID NO: 5 y que exhibe isoleucina en la posición correspondiente a la posición 477 de la SEQ ID NO: 5.

El número de acceso a la base de datos UNIPROT: A8AACO describe la polimerasa B de Archaea Ignicoccus hospitalis DSM18386 que tiene una identidad del 27,6% a lo largo de 840 posiciones para la SEQ ID NO: 5 y que exhibe metionina en la posición correspondiente a la posición 477 de la SEQ ID NO: 5.

El documento US5948666 describe la polimerasa 23Py1 de Metallosphaera prunae con un 27,6% de identidad a lo largo de 838 posiciones para la SEQ ID NO: 5 y que exhibe metionina en la posición correspondiente a la posición 477 de la SEQ ID NO: 5.

El documento US649216 divulga la ADN polimerasa de Plasmodium y Drosophila con una identidad del 28% o 26% a lo largo de 838 posiciones a la SEQ ID NO: 5 y que exhibe metionina en la posición correspondiente a la posición 477 de la SEQ ID NO: 5.

El documento EP0892058 describe enzimas quiméricas que combinan una región N-terminal derivada del dominio nucleasa 5' de especies Thermus con una región C-terminal derivada de la exonucleasa 3' a 5' y el dominio polimerasa de la Tma polimerasa.

El documento WO2012/154934 describe proteínas mutantes que modifican las ADN polimerasas de la familia B que contienen actividad exonucleasa residual que interfiere con las técnicas de secuenciación y con la detección de polimorfismos de un solo nucleótido.

Listado de secuencias

La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de Secuencias se proporciona como un archivo titulado IP1152.TXT, creado el 28 de mayo de 2014, que tiene un tamaño de 186 Kb. La información en el formato electrónico del Listado de Secuencias se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

Breve sumario

En este documento se presentan enzimas polimerasas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos, en particular nucleótidos que se modifican en el hidroxilo 3’ del azúcar de manera que el sustituyente es de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' que se produce de forma natural. Los autores de la presente invención han identificado sorprendentemente ciertas polimerasas alteradas que exhiben una incorporación mejorada de los análogos deseados y tienen un cierto número de otras ventajas asociadas.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende al menos una mutación por sustitución de aminoácidos en la posición funcionalmente equivalente a Lys477 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. La secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N de tipo salvaje se recoge en la SEQ ID NO: 5. En ciertas realizaciones, la mutación por sustitución comprende una mutación a un residuo que tiene una cadena lateral más pequeña. En ciertas realizaciones, la mutación por sustitución comprende una mutación a un residuo que tiene una cadena lateral hidrofóbica. También se describen los casos en los que la mutación por sustitución comprende una mutación a un residuo de metionina.

También se presenta en este documento una ADN polimerasa recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% idéntica a la SEQ ID NO: 29, ADN polimerasa recombinante que comprende en la posición funcionalmente equivalente a Lys477 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

También se presenta en este documento una ADN polimerasa recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% idéntica a la SEQ ID NO: 31, ADN polimerasa recombinante que comprende en la posición funcionalmente equivalente a Lys477 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

También se presenta en este documento una ADN polimerasa recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% idéntica a la SEQ ID NO: 5, ADN polimerasa recombinante que comprende en la posición funcionalmente equivalente a Lys477 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

De acuerdo con la invención, la polimerasa es una ADN polimerasa. La polimerasa alterada de la reivindicación 1, en donde la ADN polimerasa es una ADN polimerasa del tipo de la familia B. La polimerasa es una ADN polimerasa de arqueas de la familia B. También se describen los casos en los que la polimerasa es ADN polimerasa-a humana, T4, RB69, y ADN polimerasas del fago phi29. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B es de un género seleccionado del grupo que consiste en Thermococcus, Pyrococcus y Methanococcus. Por ejemplo, la polimerasa se puede seleccionar del grupo que consiste en polimerasa Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B es polimerasa 9°N.

De acuerdo con la invención, la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Leu408, Tyr409, Pro410 y Lys477 en la secuencia de aminoácidos de ADN polimerasa 9°N de tipo salvaje SEQ ID NO: 5, en donde las mutaciones por sustitución son posicionalmente equivalentes a Leu408Ala, Tyr409Ala, Pro410Ile y LYS477Met, en donde la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 5, y en donde, en uso, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B exhibe actividad de polimerasa.

En algunas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una actividad exonucleasa reducida en comparación con una polimerasa de tipo salvaje. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Asp141 y/o Glu143 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende, además, mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Ala485 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Ala485Leu o Ala485Val en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende, además, una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Cys223Ser en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la al menos una mutación por sustitución comprende una mutación a la posición equivalente a Thr514 y/o Ile521. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Thr514Ala, Thr514Ser y/o Ile521Leu en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se describen los casos en los que la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución adicional para separar una metionina interna. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Met129 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. También se describen los casos en los que la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Met129Ala en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se presenta en este documento una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución al dominio semi-conservado que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4, en la que la mutación por sustitución comprende una mutación en la posición 3 a cualquier residuo que no sea cualquier residuo aparte de Lys, Ile o Gln.

También se describen los casos en los que la polimerasa alterada comprende una mutación a Met en la posición 3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4.

De acuerdo con la invención, la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Leu408, Tyr409, Pro410 y Lys477 en la secuencia de aminoácidos SEQ ID N0: 5 de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, las mutaciones por sustitución comprenden mutaciones por sustitución posicionalmente equivalentes a Leu408Ala, Tyr409Ala, Pro410Ile y Lys477Met, en donde la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 5, y en donde, en uso, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada exhibe actividad de polimerasa.

En algunas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una actividad de exonucleasa reducida en comparación con una polimerasa de tipo salvaje. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Asp141 y/o Glu143 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende, además, mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Ala485 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Ala485Leu o Ala485Val en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende, además, una mutación a la posición equivalente a Thr514 y/o Ile521 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Thr514Ala, Thr514Ser y/o Ile521 Leu en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende, además, una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Cys223Ser en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se describen los casos en los que la polimerasa alterada puede comprender una mutación por sustitución adicional para separar una metionina interna. Por ejemplo, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Met129 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. También se describen los casos en los que la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Met129Ala en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se presenta en este documento una polimerasa alterada que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24, 26-28, 30 y 32.

También se presenta en este documento una molécula de ácido nucleico que codifica una polimerasa alterada según se define en cualquiera de las realizaciones anteriores. También se presenta en este documento un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. También se presenta en este documento una célula huésped que comprende el vector descrito anteriormente.

También se presenta en este documento un método para incorporar nucleótidos modificados en el ADN, que comprende permitir que interactúen los siguientes componentes: (i) una polimerasa alterada de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, (ii) un molde de ADN; y (iii) una solución de nucleótidos. En ciertas realizaciones, el molde de ADN comprende una matriz agrupada.

También se proporciona en este documento un kit para realizar una reacción de incorporación de nucleótidos, que comprende: una polimerasa como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores y una solución de nucleótidos. La solución de nucleótidos puede comprender nucleótidos marcados. Los nucleótidos pueden comprender nucleótidos sintéticos. Los nucleótidos pueden comprender nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden modificarse en el hidroxilo 3’ del azúcar de modo que el sustituyente sea de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' que se produce de forma natural. Los nucleótidos modificados pueden comprender un nucleótido modificado o una molécula de nucleósido que comprende una base de purina o pirimidina y un resto de azúcar ribosa o desoxirribosa que tiene un grupo bloqueante 3'-OH separable unido covalentemente al mismo, de modo que el átomo de carbono 3' tiene unido un grupo de la estructura

-O-Z

en donde Z es cualquiera de -C(R')²-O-R", -C(R')²-N(R")² , -C(R')²-N(H)R", -C(R')²-S-R" y -C(R')²-F,

en donde cada uno de los R" es o es parte de un grupo protector separable;

cada uno de los R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcador detectable unido a través de un grupo de enlace; o (R^')2 representa un grupo alquilideno de fórmula =C(R"')² , en donde cada uno de los R"' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno y halógeno y grupos alquilo; y

en donde la molécula puede reaccionar para producir un compuesto intermedio en el que cada uno de los R" se intercambia por H, o en donde Z es -C(R')²-F, el F se cambia por OH, SH o NH², preferiblemente OH, cuyo compuesto intermedio se disocia en condiciones acuosas para proporcionar una molécula con un 3'OH libre; con la condición de que en los casos en los que Z sea -C(R')²-S-R", ambos grupos R' no son H.

R' del nucleótido o nucleósido modificado puede ser un alquilo o alquilo sustituido. -Z del nucleótido o nucleósido modificado puede ser de fórmula -C(R')2-N3. Z puede ser un grupo azidometilo.

Los nucleótidos modificados pueden marcarse con fluorescencia para permitir su detección. Los nucleótidos modificados pueden comprender un nucleótido o nucleósido que tiene una base unida a un marcador detectable a través de un enlazador escindible. El marcador detectable puede comprender un marcador fluorescente. El kit puede comprender, además, una o más moléculas de molde de ADN y/o cebadores.

Los detalles de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción que figuran a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un esquema que muestra el alineamiento de secuencias de aminoácidos de polimerasa 9°N-7 (9°N) de Thermococcus sp., polimerasa 9°N T514S/I521L mutante (Pol957), Thermococcus gorgonarius (TGO), Thermococcus kodakaraensis (KOD1), Pyrococcus furiosus (Pfu), Methanococcus maripaludis (MMS2) y ADN polimerasa del fago RB69. La numeración que se muestra representa la numeración de los residuos de aminoácidos en la polimerasa 9°N.

La Figura 2 es un esquema que muestra dos partes resaltadas del alineamiento mostrado en la Figura 1.

Descripción detallada

En este documento se presentan enzimas polimerasas para la incorporación mejorada de análogos de nucleótidos, en particular nucleótidos que están modificados en el hidroxilo 3’ del azúcar de manera que el sustituyente es de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' que se produce de forma natural. Los autores de la presente invención han identificado sorprendentemente ciertas polimerasas alteradas que exhiben una incorporación mejorada de los análogos deseados y tienen una serie de otras ventajas asociadas.

Tal como se describe con mayor detalle en lo que sigue, los autores de la invención han descubierto sorprendentemente que una o más mutaciones en uno o más residuos en la polimerasa dan como resultado un aumento profundo en la velocidad de rotación y una reducción en la pirofosforolisis. Estas polimerasas alteradas tienen un rendimiento mejorado en la secuenciación del ADN por síntesis (SBS) y dan como resultado una reducción de los ajustes de fases y/o pre-ajuste de fases.

Tal como se usa en este documento, la expresión "ajustes de fases " se refiere a un fenómeno en SBS que es causado por la incorporación incompleta de un nucleótido en alguna porción de cadenas de ADN dentro de grupos por polimerasas en un ciclo de secuenciación dado. La expresión "pre-ajuste de fases" se refiere a un fenómeno en SBS que es causado por la incorporación de nucleótidos sin terminadores 3' efectivos, lo que provoca que el evento de incorporación avance 1 ciclo. El ajuste de fases y el pre-ajuste de fases hacen que las intensidades extraídas para un ciclo específico consistan en la señal del ciclo actual, así como en el ruido de los ciclos que le preceden y siguientes. A medida que aumenta el número de ciclos, aumenta la fracción de secuencias por grupo afectado por el ajuste de fases, lo que dificulta la identificación de la base correcta. El ajuste de fases puede ser causado, por ejemplo, por una polimerasa que realiza la reacción inversa de la incorporación de nucleótidos, como se sabe que ocurre en condiciones propicias para la pirofosforolisis. Por consiguiente, el descubrimiento de polimerasas alteradas que disminuyen la incidencia del ajuste de fases y/o el pre-ajuste de fases es sorprendente y proporciona una gran ventaja en las aplicaciones de SBS. Por ejemplo, las polimerasas alteradas proporcionan un tiempo de ciclo SBS más rápido, valores más bajos de ajuste de fases y pre-ajuste de fases y una mayor longitud de lectura de la secuencia. La caracterización de las polimerasas alteradas como se proporciona en este documento se expone en la sección de Ejemplos que figura más adelante.

La mutación por sustitución puede comprender una mutación a un residuo que tiene una cadena lateral más pequeña. Los tamaños relativos de las cadenas laterales de aminoácidos son bien conocidos en la técnica y se pueden comparar usando cualquier métrica conocida, incluidos los efectos estéricos y/o la densidad de electrones. Por lo tanto, un ejemplo de aminoácidos establecidos en orden de tamaño creciente sería G, A, S, C, V, T, P, I, L, D, N, E, Q, M, K, H, F, Y, R, W. La mutación por sustitución puede comprender una mutación a un residuo que tiene una cadena lateral hidrófoba, tal como A, I, L, V, F, W, Y.

También se presenta en este documento una polimerasa alterada que comprende una mutación por sustitución a un dominio semi-conservado de la polimerasa. Tal como se usa en este documento, la expresión "dominio semiconservado" se refiere a una porción de polimerasa que está completamente conservada, o al menos parcialmente conservada entre diversas especies. Sorprendentemente, se descubrió que la mutación de uno o más residuos en el dominio semi-conservado afecta la actividad de la polimerasa en presencia de nucleótidos bloqueados en 3', lo que resulta en profundos aumentos en la velocidad de rotación y la reducción en la pirofosforolisis. Estas polimerasas alteradas tienen un rendimiento mejorado en la secuenciación del ADN por síntesis y dan como resultado errores de ajustes de fases reducidos tal como se describe en la sección de Ejemplos que figura más adelante.

También se describe que el dominio semi-conservado comprende aminoácidos que tienen la secuencia recogida en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. Las SEQ ID NOs: 1-4 corresponden a residuos en el dominio semi-conservado entre diversas especies. La SEQ ID NO: 4 corresponde a los residuos 475-492 de la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N, que se recoge en este documento como SEQ ID NO: 5. Se establece un alineamiento que muestra la conservación entre diversas especies en el dominio semi-conservado se recoge en las Figuras 1 y 2. Las secuencias de polimerasa mostradas en las Figuras 1 y 2 se obtuvieron de los números de acceso a la base de datos de Genbank Q56366 (ADN polimerasa 9°N), NP_577941 (Pfu), YP_182414 (KOD1), NP_987500 (MMS2), AAP75958 (RB69), P56689 (TGo).

Sorprendentemente, se ha encontrado que las mutaciones en uno o más residuos en el dominio semi-conservado aumentan la velocidad de rotación y la reducción de la pirofosforolisis, lo que da como resultado una reducción de los errores del ajuste de fases. Por ejemplo, en algunas realizaciones de las polimerasas alteradas presentadas en este documento, la mutación por sustitución comprende una mutación en la posición 3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 a cualquier resto que no sea Lys, Ile o Gln. En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación a Met en la posición 3 de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4.

La polimerasa es una ADN polimerasa. La ADN polimerasa es una ADN polimerasa de tipo de la familia B. La polimerasa es una ADN polimerasa de arqueas de la familia B. También se describe la ADN polimerasa-a humana y las polimerasas de fago, por ejemplo, las polimerasas de fago, tales como las ADN polimerasas de fago T4, RB69 y phi29.

Las ADN polimerasas de arqueas de la familia B son bien conocidas en la técnica tal como se ejemplifica por la divulgación de la Patente de EE.UU. N° 8.283149. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa de arqueas es de arqueas hipertermófilas, lo que significa que las polimerasas son a menudo termoestables. Por consiguiente, en una realización preferida adicional, la polimerasa se selecciona de polimerasa Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu. Vent y Deep Vent son nombres comerciales utilizados para las ADN polimerasas de la familia B aisladas de las arqueas hipertermófilas. La polimerasa 9°N de Thermococcus litoralis también se identificó a partir de Thermococcus sp. La polimerasa Pfu se aisló de Pyrococcus furiosus.

En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B es de un género tal como, por ejemplo, las del género Thermococcus, Pyrococcus y Methanococcus. Miembros del género Thermococcus son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a Thermococcus 4557, Thermococcus barophilus, Thermococcus gammatolerans, Thermococcus onnurineus, Thermococcus sibiricus, Thermococcus kodakarensis, Thermococcus gorgonarius. Miembros del género Pyrococcus son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a Pyrococcus NA2, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus yayanosii, Pyrococcus endeavori, Pyrococcus glycovorans, Pyrococcus woesei. Miembros del género Methanococcus son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a M. aeolicus, M. maripaludis, M. vannielii, M. voltae, "M. thermolithotrophicus" y "M. jannaschii".

Por ejemplo, la polimerasa se puede seleccionar del grupo que consiste en polimerasa Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu. En ciertas realizaciones, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B es polimerasa 9°N.

Comparación de Secuencias, Identidad y Homología

El término "idéntico" o la expresión "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son el mismo, cuando se compara y se alinea para una correspondencia máxima, medido utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias que se describen más adelante (u otros algoritmos disponibles para personas expertas) o mediante inspección visual.

La expresión "sustancialmente idénticas", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (p. ej., ADN que codifican una polimerasa, o la secuencia de aminoácidos de una polimerasa) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90-95%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se compara y se alinea para una correspondencia máxima, medida utilizando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Dichas secuencias "sustancialmente idénticas" se consideran típicamente "homólogas", sin referencia a la ascendencia real. Preferiblemente, la "identidad sustancial" existe a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 residuos de longitud, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y lo más preferiblemente, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 residuos, o a lo largo de toda la longitud de las dos secuencias a comparar.

Las proteínas y/o secuencias de proteínas son "homólogas" cuando se derivan, de forma natural o artificialmente, de una proteína o secuencia de proteínas ancestral común. De manera similar, los ácidos nucleicos y/o las secuencias de ácido nucleico son homólogos cuando se derivan, de forma natural o artificialmente, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. La homología generalmente se infiere de la similitud de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje exacto de similitud entre secuencias que es útil para establecer la homología varía con el ácido nucleico y la proteína en cuestión, pero se utiliza de forma rutinaria tan poco como un 25% de similitud de secuencia a lo largo de 50, 100, 150 o más residuos para establecer la homología. También se pueden usar niveles más altos de similitud de secuencia, p. ej., 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más, para establecer la homología. Métodos para determinar los porcentajes de similitud de secuencia (p. ej., BLASTP y BLASTN usando parámetros por defecto) se describen en este documento y están generalmente disponibles.

Para la comparación de secuencias y la determinación de homología, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin) o mediante inspección visual (véase generalmente Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., complementada hasta 2004).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et l., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Luego, las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las secuencias hasta que se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos que no coinciden; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras en cada una de las direcciones se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. uSa 89:10915).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.

Por "funcionalmente equivalente" se entiende que la polimerasa de control, en el caso de estudios que usan una polimerasa completamente diferente, contendrá la sustitución de aminoácidos que se considera que ocurre en la posición de aminoácidos en la otra polimerasa que tiene el mismo papel funcional en la enzima. Como ejemplo, la mutación en la posición 412 de Tirosina a Valina (Y412V) en la ADN polimerasa Vent sería funcionalmente equivalente a una sustitución en la posición 409 de Tirosina a Valina (Y409V) en la polimerasa 9°N.

En general, se producen mutaciones por sustitución funcionalmente equivalentes en dos o más polimerasas diferentes en posiciones de aminoácidos homólogas en las secuencias de aminoácidos de las polimerasas. Por lo tanto, el uso en este documento de la expresión "funcionalmente equivalente" también abarca mutaciones que son "posicionalmente equivalentes" u "homólogas" a una mutación dada, independientemente de si se conoce o no la función particular del aminoácido mutado. Es posible identificar residuos de aminoácidos posicionalmente equivalentes u homólogos en las secuencias de aminoácidos de dos o más polimerasas diferentes sobre la base del alineamiento de secuencia y/o el modelado molecular. Un ejemplo de alineamiento de secuencia para identificar residuos posicionalmente equivalentes y/o funcionalmente equivalentes se recoge en las Figuras 1 y 2. Así, por ejemplo, tal como se muestra en la Figura 2, los residuos en el dominio semi-conservado identificados como posiciones 475-492 de la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Los residuos correspondientes en las polimerasas TGO, KOD1, Pfu, MmS2 y RB69 se identifican en la Figura como alineados verticalmente y se consideran posicionalmente equivalentes, así como funcionalmente equivalentes al residuo correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

Las polimerasas alteradas descritas anteriormente en este documento pueden comprender mutaciones por sustitución adicionales que se sabe que potencian uno o más aspectos de la actividad de la polimerasa en presencia de nucleótidos bloqueados en 3' y/o en aplicaciones de secuenciación de ADN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender, además, mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Leu408 y/o Tyr409 y/o Pro410 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Se puede hacer cualquiera de una diversidad de mutaciones por sustitución en una o más de las posiciones en posiciones funcionalmente equivalentes a 408-410 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N, lo cual da como resultado una mayor incorporación de nucleótidos bloqueados tal como se conoce en la técnica y se ejemplifica por la divulgación de los documentos US 2006/0240439 y US 2006/0281109. Por ejemplo, las mutaciones por sustitución pueden comprender mutaciones por sustitución homólogas a Leu408Ala y/o Tyr409Ala y/o Pro410Ile en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. En ciertas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada comprende, además, mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Ala485 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Ala485Leu o Ala485Val en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

En algunas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una actividad de exonucleasa reducida en comparación con una polimerasa de tipo salvaje. Se puede realizar cualquiera de una diversidad de mutaciones por sustitución en una o más de las posiciones que se sabe que dan como resultado una actividad de exonucleasa reducida tal como se conoce en la técnica y se ejemplifica por los documentos US 2006/0240439 y US 2006/0281109. Por ejemplo, en algunas realizaciones, además de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender, además, mutaciones por sustitución en posiciones funcionalmente equivalentes a Asp141 y/o Glu143 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. En ciertas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada comprende, además, una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N tal como se conoce en la técnica y se ejemplifica por el documento US 2006/0281109. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación de sustitución funcionalmente equivalente a Cys223Ser en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

En ciertas realizaciones, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones a las posiciones equivalentes a Thr514 y/o Ile521 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N tal como se conoce en la técnica y se ejemplifica por la divulgación del documento PCT/US2013/031694. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Thr514Ala, Thr514Ser y/o Ile521Leu en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se describe en este documento que, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones en las posiciones equivalentes a Arg713 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N tal como se conoce en la técnica y se ejemplifica por la divulgación de la Patente de EE.UU. N° 8.623.628. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Arg713Gly, Arg713Met o Arg713Ala en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se describe en este documento que, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones en las posiciones equivalentes a Arg743 y/o Lys705 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N tal como se conoce en la técnica y se ejemplifica por la divulgación de la Patente de EE.UU. N° 8.623.628. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Arg743Ala y/o Lys705Ala en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

También se describe en este documento que, además de cualquiera de las mutaciones anteriores, la polimerasa alterada puede comprender una o más mutaciones por sustitución adicionales para separar una metionina interna. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición funcionalmente equivalente a Met129 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N. En ciertas realizaciones, la polimerasa alterada comprende una mutación por sustitución funcionalmente equivalente a Met129Ala en la secuencia de aminoácidos de la polimerasa 9°N.

Polimerasas mutantes

En la presente divulgación se usan opcionalmente diversos tipos de mutagénesis, p. ej., para modificar polimerasas para producir variantes, p. ej., de acuerdo con modelos de polimerasa y predicciones de modelos como se discutió anteriormente, o usando enfoques mutacionales aleatorios o semi-aleatorios. En general, cualquier procedimiento de mutagénesis disponible puede usarse para hacer mutantes de polimerasa. Tales procedimientos de mutagénesis incluyen opcionalmente la selección de ácidos nucleicos mutantes y polipéptidos para una o más actividades de interés (p. ej., reducción de pirofosforolisis, aumento de rotación, p. ej., para un análogo de nucleótido dado).

Procedimientos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: mutagénesis puntual dirigida al sitio, mutagénesis puntual aleatoria, recombinación homóloga in vitro o in vivo (reordenamiento de ADN y PCR de solapamiento combinatoria), mutagénesis utilizando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificada con fosforotioato, mutagénesis utilizando ADN dúplex con huecos, reparación de emparejamiento erróneo puntual, mutagénesis utilizando cepas huésped deficientes en reparación, selección por restricción y purificación por restricción, mutagénesis por deleción, mutagénesis por síntesis génica total, PCR degenerada, reparación de rotura de doble cadena, y muchos otros conocidos por personas expertas. La polimerasa de partida para la mutación puede ser cualquiera de las mencionadas en este documento, incluidos mutantes de polimerasa disponibles tales como los identificados, p. ej., en los documentos US 2006/0240439 y US 2006/0281109.

Opcionalmente, la mutagénesis puede guiarse por información conocida de una molécula de polimerasa que se produce de forma natural, o de una polimerasa alterada o mutada conocida (p. ej., usando una polimerasa mutante existente tal como se indica en las referencias anteriores), p. ej., secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina y/o similares tal como se discutió anteriormente. Sin embargo, en otra clase de realizaciones, la modificación puede ser esencialmente aleatoria (p. ej., tal como en el reordenamiento de ADN clásico o "familiar", véase, p. ej., Crameri et al. (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelarates directed evolution" Nature 391:288-291).

Información adicional sobre formatos de mutación se encuentra en: Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado hasta 2011) ("Ausubel")) y Protocolos de PCR A guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, California (1990)) ("Innis"). Las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas proporcionan detalles adicionales sobre formatos de mutación: Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specifities, Science 242:240-245 (1988); Bordo y Argos (1991) Suggestions for “Safe” Residue Substitutions in Site-directed Mutagenesis 217:721-729; Botstein y Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Carter, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phophorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Eghtedarzadeh y Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16:6987-6999 (1988); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagénesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Hayes (2002) Combining Computational and Experimental Screening for rapid Optimization of Protein Properties PNAS 99 (25) 15926-15931; Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. ^uS^a 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Oligonucleotidedirected construction of mutations via gapped duplex DNA de Kramer y Fritz, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984)); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed constructions of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Lorimer y Pastan Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. 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(2001) "Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS): a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling" Gene 271:13-20; e Hiraga y Arnold (2003) “General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis” : J. Mol. Biol. 330:287-296. Se pueden encontrar detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para resolver problemas con diversos métodos de mutagénesis.

Fabricación y Aislamiento de Polimerasas Recombinantes

En general, los ácidos nucleicos que codifican una polimerasa tal como se presenta en este documento pueden prepararse mediante clonación, recombinación, síntesis in vitro, amplificación in vitro y/u otros métodos disponibles. Se puede usar una diversidad de métodos recombinantes para expresar un vector de expresión que codifica una polimerasa tal como se presenta en este documento. Métodos para preparar ácidos nucleicos recombinantes, la expresión y el aislamiento de productos expresados son bien conocidos y se describen en la técnica. En este documento se describe un cierto número de mutaciones y combinaciones de mutaciones ilustrativas, así como estrategias para el diseño de mutaciones deseables. Métodos para realizar y seleccionar mutaciones en el sitio activo de las polimerasas, incluida la modificación de características estéricas en o cerca del sitio activo para permitir un acceso mejorado por los análogos de nucleótidos se encuentran en este documento anteriormente y, p. ej., en los documentos WO 2007/076057 y PCT/US2007/022459.

Referencias útiles adicionales para la mutación, métodos de manipulación de ácidos nucleicos recombinantes e in vitro (que incluyen clonación, expresión, PCR y similares) incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, California (Berger); Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Segunda edición Ceske (ed) CRC Press (Kaufman); y The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley); Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols, segunda edición (Methods in Molecular Biology, volumen 192) Humana Press; y en Viljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032.

Además, hay una gran cantidad de kits disponibles comercialmente para la purificación de plásmidos u otros ácidos nucleicos relevantes de las células (véase, p. ej., EasyPrep.TM., FlexiPrep.TM. ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean.TM. de Stratagene; y QIAprep.TM de Qiagen). Cualquier ácido nucleico aislado y/o purificado puede manipularse adicionalmente para producir otros ácidos nucleicos, utilizados para transfectar células, incorporados en vectores relacionados para infectar organismos para la expresión, y/o similares. Vectores de clonación típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio de la transcripción y la traducción y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia de terminador independiente, secuencias que permiten la replicación del casete en eucariotas o procariotas, o ambos (p. ej., vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas procariotas y eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas o ambos.

Otras referencias útiles, p. ej., para el aislamiento y el cultivo celular (por ejemplo, para el posterior aislamiento de ácidos nucleicos) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas allí; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, N.Y.; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) c Rc Press, Boca Raton, Fla.

Los ácidos nucleicos que codifican las polimerasas recombinantes de las descritas en este documento también son una característica de las realizaciones presentadas en este documento. Un aminoácido particular puede ser codificado por múltiples codones, y ciertos sistemas de traducción (p. ej., células procariotas o eucariotas) a menudo exhiben preferencia codónica, p. ej., diferentes organismos prefieren a menudo uno de los varios codones sinónimos que codifican el mismo aminoácido. Como tales, los ácidos nucleicos presentados en este documento están opcionalmente "optimizado en codones", lo que significa que los ácidos nucleicos se sintetizan para incluir codones que son preferidos por el sistema de traducción particular que se emplea para expresar la polimerasa. Por ejemplo, cuando es deseable expresar la polimerasa en una célula bacteriana (o incluso una cepa particular de bacteria), el ácido nucleico puede sintetizarse para incluir codones que se encuentran con mayor frecuencia en el genoma de esa célula bacteriana, para una expresión eficiente de la polimerasa Se puede emplear una estrategia similar cuando es deseable expresar la polimerasa en una célula eucariota, p. ej., el ácido nucleico puede incluir codones preferidos por esa célula eucariota.

Se conoce una diversidad de métodos de aislamiento y detección de proteínas y se pueden usar para aislar polimerasas, p. ej., de cultivos recombinantes de células que expresan las polimerasas recombinantes presentadas en este documento. Una diversidad de métodos de aislamiento y detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, incluidos, p. ej., los establecidos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2.a edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990): Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal: Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3.a edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, segunda edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols en CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias citadas allí. Se pueden encontrar detalles adicionales sobre los métodos de purificación y detección de proteínas en Satinder Ahuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000). Métodos de uso

Las polimerasas alteradas presentadas en este documento pueden usarse en un procedimiento de secuenciación, tal como una técnica de secuenciación por síntesis (SBS). Brevemente, la SBS puede iniciarse poniendo en contacto los ácidos nucleicos diana con uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc. Las características en las que se extiende un cebador usando el ácido nucleico diana como molde incorporarán un nucleótido marcado que puede detectarse. Opcionalmente, los nucleótidos marcados pueden incluir, además, una propiedad de terminación reversible que termina una extensión adicional del cebador una vez que se ha añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, un análogo de nucleótidos que tiene un resto terminador reversible se puede añadir a un cebador de modo que la extensión posterior no pueda ocurrir hasta que se administre un agente de desbloqueo para separar el resto. Por lo tanto, para realizaciones que usan terminación reversible, se puede administrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados se pueden realizar entre las distintas etapas de suministro. El ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando así una secuencia de longitud n. Procedimientos de SBS ilustrativos, los sistemas fluídicos y las plataformas de detección que se pueden adaptar fácilmente para uso con una matriz producida por los métodos de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), documentos WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744; patentes de EE.UU. N°. 7.057.026; 7.329.492; 7.211.414; 7.315.019 o 7.405.281 y publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2008/0108082 A1.

Se pueden usar otros procedimientos de secuenciación que usan reacciones cíclicas tales como la pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en una cadena de ácido nucleico naciente (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281 (5375), 363 (1998)); patentes de EE.UU. N° 6.210.891; 6.258.568 y 6.274.320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado puede detectarse al convertirse en trifosfato de adenosina (ATP) mediante ATP sulfurilasa, y el ATP resultante puede detectarse a través de fotones producidos por la luciferasa. Por lo tanto, la reacción de secuenciación puede controlarse mediante un sistema de detección de luminiscencia. Fuentes de radiación de excitación utilizadas para sistemas de detección basados en fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Los sistemas fluídico, detectores y procedimientos útiles que se pueden usar para la aplicación de pirosecuenciación a matrices de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de la OMPI N° de Serie PCT/US11/57111, publicación de solicitud de patente de ^{E e . U U .} N° 2005/0191698 A1, patente de EE.UU. N° 7.595.883 y patente de EE.UU. N° 7.244.559.

Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican la monitorización en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Por ejemplo, incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa que contiene fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato, o con guíaondas de modo cero. Técnicas y reactivos para la secuenciación basada en FRET se describen, por ejemplo, en Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett.

33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008).

Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles comercialmente de Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N°. 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; o 2010/0282617 A1.

Por consiguiente, en este documento se presentan métodos para incorporar análogos de nucleótidos en el ADN, que comprenden permitir que los siguientes componentes interactúen: (i) una polimerasa alterada de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, (ii) un molde de ADN; y (iii) una solución de nucleótidos. En ciertas realizaciones, el molde de ADN comprende una matriz agrupada. En ciertas realizaciones, los nucleótidos se modifican en el hidroxilo 3’ del azúcar e incluyen modificaciones en el hidroxilo 3’ del azúcar de modo que el sustituyente es de mayor tamaño que el grupo hidroxilo 3' que se produce de forma natural.

Ácidos nucleicos que codifican polimerasas alteradas

Además, en este documento se presentan moléculas de ácido nucleico que codifican las enzimas polimerasas alteradas presentadas en este documento. Para cualquier polimerasa alterada dada que sea una versión mutante de una polimerasa para la que se conoce la secuencia de aminoácidos y preferiblemente también la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje que codifica la polimerasa es posible obtener una secuencia de nucleótidos que codifica el mutante de acuerdo con los principios básicos de la biología molecular. Por ejemplo, dado que se conoce la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje que codifica la polimerasa 9°N, es posible deducir una secuencia de nucleótidos que codifique cualquier versión mutante dada de 9°N que tenga una o más sustituciones de aminoácidos usando el código genético estándar. De manera similar, las secuencias de nucleótidos se pueden derivar fácilmente para versiones mutantes de otras polimerasas, tales como, por ejemplo, Vent™, Pfu, Tsp JDF-3, Taq, etc. Moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos requerida se pueden construir utilizando técnicas estándares de biología molecular conocidas en la técnica.

De acuerdo con las realizaciones presentadas en este documento, un ácido nucleico definido incluye no solo el ácido nucleico idéntico, sino también cualquier variación de base menor que incluye, en particular, sustituciones en los casos que dan como resultado un codón sinónimo (un codón diferente que especifica el mismo residuo de aminoácido) debido al código degenerado en sustituciones conservadoras de aminoácidos. La expresión "secuencia de ácido nucleico" también incluye la secuencia complementaria a cualquier secuencia de cadena sencilla dada con respecto a las variaciones de base.

Las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento también pueden incluirse, ventajosamente, en un vector de expresión adecuado para expresar las proteínas de polimerasa codificadas a partir de ellas en un huésped adecuado. La incorporación de ADN clonado en un vector de expresión adecuado para la transformación posterior de dicha célula y la posterior selección de las células transformadas es bien conocida por los expertos en la técnica tal como se proporciona en Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.

Un vector de expresión de este tipo incluye un vector que tiene un ácido nucleico de acuerdo con las realizaciones presentadas en esta memoria operativamente enlazadas a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. La expresión "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Vectores de este tipo pueden transformarse en una célula huésped adecuada para proporcionar la expresión de una proteína de acuerdo con las realizaciones presentadas en este documento.

La molécula de ácido nucleico puede codificar una proteína madura o una proteína que tiene una prosecuencia, incluida la que codifica una secuencia conductora en la preproteína que luego es escindida por la célula huésped para formar una proteína madura. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmidos, virus o fagos provistos de un origen de replicación y, opcionalmente, un promotor para la expresión de dicho nucleótido y, opcionalmente, un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más marcadores seleccionables, tales como, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos.

Elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias de promotor para unir la ARN polimerasa y dirigir un nivel apropiado de inicio de la transcripción y también secuencias de inicio de la traducción para la unión al ribosoma. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano puede incluir un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la traducción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG. De manera similar, un vector de expresión eucariota puede incluir un promotor heterólogo u homólogo para la ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación aguas abajo, el codón de inicio AUG y un codón de terminación para el desprendimiento del ribosoma. Vectores de este tipo pueden obtenerse comercialmente o ensamblarse a partir de las secuencias descritas por métodos bien conocidos en la técnica.

La transcripción de ADN que codifica la polimerasa por eucariotas superiores puede optimizarse incluyendo una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis que actúan sobre un promotor para aumentar el nivel de transcripción. Los vectores también incluirán generalmente orígenes de replicación además de los marcadores seleccionables.

Ejemplo 1

Métodos y Condiciones Generales de Ensayo

Los siguientes párrafos describen las condiciones generales de ensayo utilizadas en los Ejemplos que se presentan a continuación.

1. Ensayo basado en gel

Esta sección describe un ensayo basado en gel utilizado en los Ejemplos que figuran más adelante para controlar la actividad pirofosforolítica de una polimerasa.

Brevemente, la actividad pirofosforolítica de una polimerasa modificada ilustrativa se midió mezclando enzima 300 nM y ADN de molde de cebador dúplex 100 nM con diferentes concentraciones (0, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 y 4 mM) de pirofosfato de sodio, respectivamente, en el tampón de reacción que contiene: Tris-HCl 50 mM (pH 9,0), NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgSO46 mM y Tween-20 al 0,05% (v/v). Las reacciones se realizaron a 55°C durante 1 minuto y se detuvieron agregando un volumen igual de solución de enfriamiento brusco 2X que contenía azul de bromofenol al 0,025%, EDTA 30 mM y formamida desionizada al 95%.

Los productos de reacción se desnaturalizaron a 95°C durante 5 minutos y se resolvieron en electroforesis en gel de urea-poliacrilamida 7M al 15% (urea-PAGE). Los resultados se visualizaron escaneando el gel con el Typhoon 8000 PhosphorImager de GE Healthcare.

El dúplex cebador-molde dúplex se formó reasociando los siguientes oligonucleótidos:

Cebador: 5'-GCTTGCACAGGTGCGTTCGT*-3'

Molde: 5'-CGTTAGTCCACGAACGCACCTGTGCAAGC-3'

Este cebador comprende un colorante fluorescente 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA) enlazado al extremo 5' del oligonucleótido. El último "T*" contiene un resto de bloqueo 3'-O azido metilo en el nucleótido. Las pistas que muestran degradación del cebador marcado indican pirofosforolisis mejorada (reacción inversa de la polimerización de ADN) en comparación con el control.

2. Clonación y expresión de polimerasas

Esta sección describe el enfoque utilizado para la clonación y expresión de los diversos mutantes de polimerasa utilizados en los Ejemplos que figuran más adelante.

La mutagénesis se realizó en el gen que codifica la secuencia del gen de la cadena principal para la polimerasa usando la metodología estándar de mutagénesis dirigida al sitio. Para cada una de las mutaciones realizadas, se confirmó la secuencia adecuada de los genes mutados secuenciando la secuencia del gen clonado.

Los genes de polimerasa se subclonaron en un vector pET 11a y se transformaron en células de expresión BL21 Star (DE3) de Invitrogen. Las células transformadas se cultivaron a 37°C en matraces Fernbock de 2,8 L hasta que se alcanzó una DO600 de 0,8. Luego se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG 1 mM, seguido de 3 horas de crecimiento adicional. Los cultivos se centrifugaron luego a 7000 rpm durante 20 minutos. Los sedimentos celulares se almacenaron a - 20°C hasta la purificación.

La lisis de células bacterianas se realizó resuspendiendo los cultivos congelados en tampón de lisis 10x p/v (Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). Se añadió inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche) al sedimento celular resuspendido. Todas las etapas de lisis y purificación se realizaron a 4°C. El cultivo resuspendido se hizo pasar a través de un microfluidizador cuatro veces para completar la lisis celular. El lisado se centrifugó luego a 20.000 rpm durante 20 minutos para separar los desechos celulares. Se añadió polietilenimina (concentración final 0,5%) al sobrenadante lentamente con agitación durante 45 minutos para precipitar el ácido nucleico bacteriano. El lisado se centrifugó a 20.000 rpm durante 20 minutos; el sedimento fue descartado. El lisado se precipitó luego con sulfato de amonio usando dos volúmenes de (NH4)2SO4 saturado en frío en dH2O estéril. La proteína precipitada se centrifugó a 20.000 rpm durante 20 minutos. Los sedimentos de proteína se resuspendieron en 250 mL de tampón A (Tris 50 mM pH 7,5, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM). El lisado resuspendido se purificó luego usando una columna SP FastFlow (GE) de 5 mL pre-equilibrada en tampón A. La columna se eluyó usando un gradiente de 50 mL de KCl 0,1 a 1 M. Las fracciones pico se agruparon y se diluyeron con tampón C (Tris pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) hasta que la conductividad fue igual al tampón D (Tris pH 7,5, KCl 50 mM, ^e D^t A 0,1 mM, DTT 1 mM). Las fracciones agrupadas se cargaron luego en una columna HiTrap Heparin Fastflow de 5 mL. La polimerasa se eluyó luego usando un gradiente de 100 mL de KCl 50 mM a 1 M. Las fracciones pico se agruparon, se dializaron en tampón de almacenamiento (Tris 20 mM, pH 7,5, KCl 300 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 50%) y se congelaron a - 80°C.

3. Análisis de ajuste de fases/pre-ajuste de fases

Esta sección describe el enfoque utilizado para analizar el rendimiento de los mutantes de polimerasa utilizados en los Ejemplos que figuran a continuación en una secuenciación por ensayo de síntesis.

Se usaron experimentos cortos de secuenciación de 12 ciclos para generar valores de ajuste de fases y pre-ajuste de fases. Los experimentos se llevaron a cabo en un sistema Illumina Genome Analyzer que se convirtió en un sistema de una sola pita que ejecuta la química MiSeq Fast (Illumina, Inc., San Diego, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, para cada una de las polimerasas se generaron mezclas de incorporación separadas (IMX) y se realizó una operación de 4 x 12 ciclos usando una posición diferente para cada una de las IMX. Se usaron formulaciones de reactivos MiSeq estándar, con la polimerasa estándar sustituida con la polimerasa que se estaba ensayando. La colección de ADN utilizada se realizó siguiendo el protocolo estándar TruSeq HT de ADN genómico PhiX (suministrado como control con reactivos Illumina). El software Illumina RTA se utilizó para evaluar los niveles de ajuste de fases y pre-ajuste de fases.

Ejemplo 2

identificación y Rastreo de Mutantes de polimerasa 9°N para el ajuste de fases/pre-ajuste de fases

Se realiza un rastreo de mutagénesis de saturación de residuos de mutagénesis en el bolsillo de bloque 3'. Se generaron mutaciones en dos secuencias de la cadena principal de polimerasa 9°N modificadas (SEQ ID NO: 29 y 31), se clonaron, se expresaron y se purificaron tal como se describe en general en el Ejemplo 1.

Las polimerasas mutantes purificadas se rastrean para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 29 y 31. De esos mutantes que se seleccionan, un panel de los mutantes, incluidos los siguientes mutantes, se rastrean adicionalmente para determinar la actividad del ajuste de fases/preajuste de fases tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.

Los resultados del rastreo se resumen en la Tabla que figura a continuación. Como se muestra en la Tabla, cada uno de los mutantes anteriores muestra mejoras inesperadas y significativas en uno o más de los ajustes de fase y pre-ajustes de fase en comparación con las polimerasas de control, Pol957 o Pol955.

Ejemplo 3

Rastreo de Mutantes de Polimerasa 9°N WT

Se generan, clonan, expresan y purifican mutaciones a la secuencia de la cadena principal de la polimerasa de tipo salvaje 9°N-7 (9°N) (SEQ ID NO: 5) de Thermococcus sp tal como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NO: 6-8.

Las polimerasas mutantes purificadas se seleccionan para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia recogida en SEQ ID NO: 5. De esos mutantes que se rastrean, se rastrea adicionalmente un panel de mutantes en cuanto a la actividad de ajuste de fases/pre-ajuste de fases tal como se describe en general en el Ejemplo 1. Las polimerasas que tienen las siguientes mutaciones muestran una actividad de ajuste de fases y/o preajuste de fases mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 4

Rastreo de mutantes de la Exo- Polimerasa 9°N

Se generan, clonan, expresan y purifican mutaciones a la secuencia de la cadena principal de la Exo-polimerasa 9°N (SEQ ID NO: 9) tal como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NO: 10-12.

Las polimerasas mutantes purificadas se rastrean para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia recogida en SEQ ID NO: 9. De esos mutantes que se rastrean, se rastrea adicionalmente un panel de mutantes en cuanto a la actividad de ajuste de fases/pre-ajuste de fases tal como se describe en general en el Ejemplo 1. Las polimerasas que tienen las siguientes mutaciones muestran una actividad de ajuste de fases y/o de pre-ajuste de fases mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 5

Rastreo de Mutantes de Polimerasa 9°N Alterada

Se generan, clonan, expresan y purifican mutaciones a la secuencia de la cadena principal de la polimerasa 9°N alterada (SEQ ID NO: 13) tal como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NO: 14-16.

Las polimerasas mutantes purificadas se rastrean para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 13. De esos mutantes que se rastrean, se rastrea adicionalmente un panel de mutantes en cuanto a la actividad de ajuste de fases/pre-ajuste de fases tal como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1. Se demuestra que las polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de ajuste de fases y/o pre-ajuste de fases mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 6

Rastreo de mutantes de Exo- Polimerasa Pfu

Basado en el análisis del alineamiento de la secuencia con la secuencia de la cadena principal de la polimerasa 9°N (véase la Figura 1), se generan, clonan, expresan y purifican mutaciones a la secuencia de la cadena principal de las mutaciones específicas para Exo- polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu) (SEQ ID NO: 17) tal como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NO: 18-20.

Las polimerasas mutantes purificadas se rastrean para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia recogida en SEQ ID NO: 17. De esos mutantes que se rastrean, se rastrea adicionalmente un panel de mutantes en cuanto a la actividad de ajuste de fases/pre-ajuste de fases tal como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1. Se demuestra que las polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de ajuste de fases y/o pre-ajuste de fases mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 7

Rastreo de Mutantes de Exo- Polimerasa KOD1

Basado en el análisis del alineamiento de la secuencia con la secuencia de la cadena principal de la polimerasa 9°N (véase la Figura 1), se generan, clonan, expresan y purifican mutaciones específicas a la secuencia de la cadena principal de mutaciones específicas para la cadena principal de la Exo- polimerasa de Thermococcus kodakaraensis (KOD1) (SEQ ID NO: 21) tal como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NO: 22-24.

Las polimerasas mutantes purificadas se rastrean para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia recogida en SEQ ID NO: 21. De esos mutantes que se rastrean, se rastrea adicionalmente un panel de mutantes en cuanto a la actividad de ajuste de fases/pre-ajuste de fases tal como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1. Se demuestra que las polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen actividad de ajuste de fases y/o pre-ajuste de fases mejorada en comparación con el control:

Ejemplo 8

Rastreo de Mutantes de Exo- Polimerasa MMS2

Basado en el análisis del alineamiento de la secuencia con la secuencia de la cadena principal de la polimerasa 9°N (véase la Figura 1), se identifican mutaciones específicas para la cadena principal de la Exo- polimerasa de Methanococcus maripaludis (MMS2) (SEQ ID NO: 25) en base a la homología en un alineamiento con la polimerasa 9°N (véase la Figura 2). Los mutantes se generan, clonan, expresan y purifican tal como se describe en general en el Ejemplo 1, produciendo enzimas polimerasa que tienen las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NO: 26-28.

Las polimerasas mutantes purificadas se rastrean para determinar la cinética de explosión utilizando el ensayo basado en gel descrito anteriormente en el Ejemplo 1 y se comparan con la polimerasa de control que tiene la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 25. De esos mutantes que se rastrean, se rastrea adicionalmente un panel de mutantes en cuanto a la actividad de ajuste de fases/pre-ajuste de fases tal como se describe en general anteriormente en el Ejemplo 1. Se demuestra que las polimerasas que tienen las siguientes mutaciones tienen una actividad de ajuste de fases y/o pre-ajuste de fases mejorada en comparación con el control:

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada que comprende mutaciones de sustitución de aminoácidos en posiciones posicionalmente equivalentes a Leu408, Tyr409, Pro410 y Lys477 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N de tipo salvaje SEQ ID NO: 5, en donde las mutaciones por sustitución son homólogas a Leu408Ala, Tyr409Ala, Pro410Ile y Lys477Met, en donde la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de arquea de la familia B alterada es al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 5 y, en uso, la ADN polimerasa de arqueas de la familia B exhibe actividad de polimerasa.

2. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 1, en donde la ADN polimerasa de arqueas de la familia B es de un género seleccionado del grupo que consiste en Thermococcus, Pyrococcus y Methanococcus.

3. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en polimerasa Vent, Deep Vent, 9°N y Pfu; y en donde preferiblemente la ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada es polimerasa 9°N.

4. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 1, en donde la ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada comprende, además, mutaciones por sustitución en posiciones posicionalmente equivalentes a Asp 141 y/o GluI43 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

5. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada comprende, además, una mutación por sustitución en una posición posicionalmente equivalente a Ala485 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

6. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 5, en donde dicha mutación por sustitución adicional es homóloga a Ala485Leu o Ala485Val.

7. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende, además, una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición posicionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

8. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 7, en donde dicha mutación por sustitución adicional en la posición posicionalmente equivalente a Cys223 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N es homóloga a Cys223Ser.

9. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende, además, una mutación por sustitución a un aminoácido diferente en la posición posicionalmente equivalente a Thr514 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

10. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 9, en donde dicha mutación por sustitución adicional en la posición posicionalmente equivalente a Thr514 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N es homóloga a Thr514Ala o Thr514Ser.

11. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende, además, una mutación de sustitución a un aminoácido diferente en la posición posicionalmente equivalente a Ile521 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N.

12. La ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada de la reivindicación 11, en donde dicha mutación por sustitución adicional en la posición posicionalmente equivalente a Ile521 en la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa 9°N es homóloga a Ile521 Leu.

13. Una ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-8, 10-12, 14-16, 18-20, 22-24 y 26-28, 30 y 32.

14. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ADN polimerasa de arqueas de la familia B alterada según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -13.

15. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 14.

16. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 15.