CN106536728A - 用于核苷酸类似物的改进的掺入的修饰的聚合酶 - Google Patents
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Abstract
本文呈现了用于核苷酸类似物,特别是在3’糖羟基处修饰的核苷酸的改进的掺入的聚合酶以及使用该聚合酶的方法和试剂盒。
Description
背景
所有生物体都依赖于DNA聚合酶来复制和维持其基因组。DNA聚合酶通过检测碱基间的互补性以及识别碱基的另外的结构特征允许DNA的高保真性复制。对具有核苷酸类似物,特别是在3’糖羟基处修饰的核苷酸的改进的掺入的修饰的聚合酶存在需求。
序列表
本申请被连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为标题为IP1152.TXT的文件提供,所述文件被创建于2014年5月28日,大小为186Kb。电子格式的序列表的信息通过引用以其整体被并入本文。
简述
本文呈现了用于核苷酸类似物的改进的掺入的聚合酶,所述核苷酸类似物特别是在3’糖羟基处修饰以使得取代基在尺寸上大于天然存在的3’羟基的核苷酸。本发明人已出人意外地鉴定出某些改造的聚合酶,所述改造的聚合酶表现出期望的类似物的改进的掺入并且具有许多其他相关的优势。
在某些实施方案中,改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含至少一个氨基酸置换突变。野生型9°N DNA聚合酶氨基酸序列如SEQID NO:5所列。在某些实施方案中,置换突变包括突变成具有较小侧链的残基的突变。在某些实施方案中,置换突变包括突变成具有疏水性侧链的残基的突变。在某些实施方案中,置换突变包括突变成甲硫氨酸残基的突变。
本文还呈现了重组的DNA聚合酶,所述重组的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:29至少60%、70%、80%、90%、95%、99%同一的氨基酸序列,所述重组DNA聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含。
本文还呈现了重组的DNA聚合酶,所述重组的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:31至少60%、70%、80%、90%、95%、99%同一的氨基酸序列,所述重组DNA聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含。
本文还呈现了重组的DNA聚合酶,所述重组的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:5至少60%、70%、80%、90%、95%、99%同一的氨基酸序列,所述重组的DNA聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含。
在一些实施方案中,聚合酶是DNA聚合酶。权利要求1所述的改造的聚合酶,其中DNA聚合酶是B家族型DNA聚合酶。聚合酶可以是例如B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α、T4、RB69和phi29噬菌体DNA聚合酶。在某些实施方案中,B家族古细菌DNA聚合酶来自选自由嗜热球菌属(Thermococcus)、火球菌属(Pyrococcus)和甲烷球菌属(Methanococcus)组成的组的属。例如,聚合酶可以选自由Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、9°N聚合酶和Pfu聚合酶组成的组。在某些实施方案中,B家族古细菌DNA聚合酶是9°N聚合酶。
在一些实施方案中,除了以上突变之外,改造的聚合酶还可以在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置处包含置换突变。例如,置换突变可以包括与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408Ala和/或Tyr409Ala和/或Pro410Ile同源的置换突变。
在一些实施方案中,改造的聚合酶与野生型聚合酶相比包含降低的外切核酸酶活性。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Asp141和/或Glu143的位置处包含置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ala485的位置处包含置换突变。例如,在一些实施方案中,聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ala485Leu或Ala485Val的置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Cys223的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Cys223Ser的置换突变。
在某些实施方案中,至少一个置换突变包括对等同于Thr514和/或Ile521的位置的突变。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Thr514Ala、Thr514Ser和/或Ile521Leu的置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶可以包含另外的置换突变以去除内部的甲硫氨酸。例如,在一些实施方案中,改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Met129的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Met129Ala的置换突变。
本文还呈现了包含对半保守结构域的置换突变的改造的聚合酶,所述半保守结构域包含SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列,其中置换突变包括在位置3处突变成除了Lys、Ile或Gln之外的任一残基的突变。在某些实施方案中,改造的聚合酶在SEQ ID NO:1-4中任一个的位置3处包含突变成Met的突变。
在一些实施方案中,除了以上突变之外,改造的聚合酶还可以在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置处包含置换突变。例如,置换突变可以包括与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408Ala和/或Tyr409Ala和/或Pro410Ile同源的置换突变。
在一些实施方案中,改造的聚合酶与野生型聚合酶相比包含降低的外切核酸酶活性。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Asp141和/或Glu143的位置处包含置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ala485的位置处包含置换突变。例如,在一些实施方案中,聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ala485Leu或Ala485Val的置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶还包含对等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Thr514和/或Ile521的位置的突变。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Thr514Ala、Thr514Ser和/或Ile521Leu的置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Cys223的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Cys223Ser的置换突变。
在某些实施方案中,改造的聚合酶可以包含另外的置换突变以去除内部的甲硫氨酸。例如,在一些实施方案中,改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Met129的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Met129Ala的置换突变。
本文还呈现了包含SEQ ID NO:6-8、10-12、14-16、18-20、22-24、26-28、30和32中的任一个的氨基酸序列的改造的聚合酶。
本文还呈现了编码如在任一以上实施方案中定义的改造的聚合酶的核酸分子。本文还呈现了包含以上描述的核酸分子的表达载体。本文还呈现了包含以上描述的载体的宿主细胞。
本文还呈现了用于将修饰的核苷酸掺入DNA的方法,所述方法包括允许以下组分相互作用:(i)根据以上实施方案中的任一个的改造的聚合酶,(ii)DNA模板;和(iii)核苷酸溶液。在某些实施方案中,DNA模板包括聚簇阵列(clustered array)。
本文还呈现了用于进行核苷酸掺入反应的试剂盒,所述试剂盒包含:如在以上实施方案的任一个中定义的聚合酶和核苷酸溶液。在某些实施方案中,核苷酸溶液包含带标记的核苷酸。在某些实施方案中,核苷酸包括合成的核苷酸。在某些实施方案中,核苷酸包括修饰的核苷酸。在某些实施方案中,修饰的核苷酸在3’糖羟基处已被修饰以使得取代基在尺寸上大于天然存在的3’羟基。在某些实施方案中,修饰的核苷酸包括包含嘌呤碱基或嘧啶碱基和以下核糖或脱氧核糖糖部分的修饰的核苷酸或核苷分子,所述核糖或脱氧核糖部分具有与其共价地附接的可移除的3’-OH封闭基团以使得3’碳原子已附接以下结构
-O-Z
其中Z是-C(R’)2-O-R”、-C(R’)2-N(R”)2、-C(R’)2-N(H)R”、-C(R’)2-S-R”和-C(R’)2-F中的任一个,
其中每个R”是可移除的保护基团或可移除的保护基团的一部分;
每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基团、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基(amido),或通过连接基团附接的可检测的标记物;或(R’)2代表式=C(R”’)2的亚烷基,其中每个R”’可以是相同的或不同的并且选自包括氢原子和卤素原子以及烷基的组;并且
其中分子可以反应以产生中间体,在所述中间体中每个R”被交换为H,或当Z是-C(R’)2-F时,F被交换为OH、SH或NH2,优选地OH,所述中间体在水性条件下解离以提供带有游离3’OH的分子;
条件是:当Z是-C(R’)2-S-R”时,两个R’基团均不是H。
在某些实施方案中,修饰的核苷酸或核苷的R'是烷基或取代的烷基。在某些实施方案中,修饰的核苷酸或核苷的-Z是式-C(R’)2-N3。在某些实施方案中,Z是叠氮甲基。
在某些实施方案中,修饰的核苷酸被荧光标记以允许其检测。在某些实施方案中,修饰的核苷酸包含具有经由可裂解的接头附接到可检测的标记物的碱基的核苷酸或核苷。在某些实施方案中,可检测的标记物包括荧光标记物。在某些实施方案中,试剂盒还包含一个或更多个DNA模板分子和/或引物。
一个或更多个实施方案的细节在附图和以下说明中被描述。从说明书和附图,以及从权利要求,其他的特征、目标和优势将是明显的。
附图简述
图1是显示聚合酶氨基酸序列的比对的示意图,所述氨基酸序列来自嗜热球菌属物种Thermococcus sp.9°N-7(9°N)、9°N聚合酶T514S/I521L突变体(Pol957)、Thermococcus gorgonarius(TGO)、Thermococcus kodakaraensis(KOD1)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、Methanococcus maripaludis(MMS2)和RB69噬菌体DNA聚合酶。显示的编号代表9°N聚合酶中的氨基酸残基的编号。
图2是显示图1中所示的比对的两个突出部分的示意图。
详细描述
本文呈现了用于核苷酸类似物的改进的掺入的聚合酶,所述核苷酸类似物特别是在3’糖羟基处修饰以使得取代基在尺寸上大于天然存在的3’羟基的核苷酸。本发明人已出人意外地鉴定出某些改造的聚合酶,所述改造的聚合酶表现出期望的类似物的改进的掺入并且具有许多其他相关的优势。
如在下文更详细地描述的,发明人已出人意外地发现对聚合酶中的一个或更多个残基的一个或更多个突变导致周转率的显著增大和焦磷酸解的减少。这些改造的聚合酶在DNA合成测序(SBS)中具有改善的性能,并且导致减少的phasing和/或pre-phasing错误。
如本文使用的,术语“phasing”指在SBS中在给定的测序循环,由聚合酶对聚簇内的DNA链的一些部分中的核苷酸的不完全掺入而引起的现象。术语“pre-phasing”指在SBS中由掺入核苷酸而无有效的3’终止子而引起的现象,导致掺入事件提前1个循环。Phasing和pre-phasing导致对特定的循环得出的强度由当前循环的信号以及来自前面和后面的循环的噪音组成。随着循环数增加,被phasing影响的序列/簇的比例增加,妨碍正确碱基的识别。phasing可以例如由进行核苷酸掺入的逆反应的聚合酶引起,所述核苷酸掺入的逆反应如已知在有益于焦磷酸解的条件下发生的。因此,降低phasing和/或pre-phasing的发生率的改造的聚合酶的发现是出人意外的,并且在SBS应用中提供了大的优势。例如,改造的聚合酶提供了较快的SBS循环时间、较低的phasing值和pre-phasing值以及较长的测序读段长度。如本文提供的改造的聚合酶的特征在以下实施例部分列出。
在某些实施方案中,置换突变包括突变成具有较小侧链的残基的突变。氨基酸侧链的相对尺寸在本领域是熟知的,并且可以使用任何已知的度量标准比较,所述度量标准包括立体效应和/或电子密度。因此,以渐增的尺寸的顺序列出的氨基酸的一个实例将是G、A、S、C、V、T、P、I、L、D、N、E、Q、M、K、H、F、Y、R、W。在某些实施方案中,置换突变包括突变成具有疏水性侧链的残基的突变,诸如A、I、L、V、F、W、Y。
本文还呈现了包含对聚合酶的半保守结构域的置换突变的改造的聚合酶。如本文使用的,术语“半保守结构域”指在多个物种中完全保守或至少部分保守的聚合酶部分。已出人意外地发现,半保守结构域中的一个或更多个残基的突变在3’封闭的核苷酸(3’blocked nucleotides)的存在下影响聚合酶活性,导致周转率的显著增大和焦磷酸解的减少。这些改造的聚合酶在DNA合成测序中具有改善的性能,并且导致减少的phasing错误,如在下面的实施例部分中描述的。
在一些实施方案中,半保守结构域包含具有SEQ ID NO:1-4的任一个所列的序列的氨基酸。SEQ ID NO:1-4对应于多个物种中的半保守结构域中的残基。SEQ ID NO:4对应于在本文中被列为SEQ ID NO:5的9°N DNA聚合酶氨基酸序列的残基475-492。图1和2列出了显示半保守结构域在多个物种中的保守性的比对。图1和2中示出的聚合酶序列获取自Genbank数据库登录号Q56366(9°N DNA聚合酶)、NP_577941(Pfu)、YP_182414(KOD1)、NP_987500(MMS2)、AAP75958(RB69)、P56689(TGo)。
已出人意外地发现对半保守结构域中的一个或更多个残基的突变导致周转率的增大和焦磷酸解的减少,导致减少的phasing错误。例如,在本文呈现的改造的聚合酶的一些实施方案中,置换突变包括在SEQ ID NO:1-4中任一个的位置3处突变成除了Lys、Ile或Gln之外的任何残基的突变。在某些实施方案中,改造的聚合酶在SEQ ID NO:1-4中任一个的位置3处包含突变成Met的突变。
在一些实施方案中,聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方案中,DNA聚合酶是B家族型DNA聚合酶。聚合酶可以是例如B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α和噬菌体聚合酶。任何噬菌体聚合酶可被用于本文呈现的实施方案,所述任何噬菌体聚合酶包括例如噬菌体聚合酶,诸如T4、RB69和phi29噬菌体DNA聚合酶。
B家族古细菌DNA聚合酶在本领域是熟知的,如由美国专利号8,283149的公开内容示例的,其通过引用被以其整体并入。在某些实施方案中,古细菌DNA聚合酶来自超嗜热古细菌,这意指聚合酶通常是热稳定的。因此,在另外的优选的实施方案中,聚合酶选自Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、9°N聚合酶和Pfu聚合酶。Vent和Deep Vent是用于从超嗜热古细菌海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)分离的B家族DNA聚合酶的商业名。还从嗜热球菌属物种Thermococcus sp.鉴定出9°N聚合酶。Pfu聚合酶分离自强烈火球菌。
在某些实施方案中,B家族古细菌DNA聚合酶来自诸如例如嗜热球菌属(Thermococcus)、火球菌属(Pyrococcus)和甲烷球菌属(Methanococcus)的那些属的属。嗜热球菌属的成员在本领域是熟知的,并且包括但不限于Thermococcus 4557、Thermococcusbarophilus、Thermococcus gammatolerans、Thermococcus onnurineus、Thermococcussibiricus、Thermococcus kodakarensis、Thermococcus gorgonarius。火球菌属的成员在本领域是熟知的,并且包括但不限于Pyrococcus NA2、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、强烈火球菌、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus yayanosii、Pyrococcus endeavori、Pyrococcus glycovorans、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)。甲烷球菌属的成员在本领域是熟知的,并且包括但不限于M.aeolicus M.maripaludis、万氏甲烷球菌(M.vannielii)、沃氏甲烷球菌(M.voltae)、“M.thermolithotrophicus”和“詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)”。
例如,聚合酶可以选自由Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、9°N聚合酶和Pfu聚合酶组成的组。在某些实施方案中,B家族古细菌DNA聚合酶是9°N聚合酶。
序列比较、同一性和同源性
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中,术语“同一的”或“同一性百分比”指当针对最大的对应性比较和对齐时,相同或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列,如利用下面描述的序列比较算法中的一个(或技术人员可得的其他算法)或通过视觉检查测量的。
在两个核酸或多肽(例如,编码聚合酶的DNA或聚合酶的氨基酸序列)的上下文中,词组“基本上同一的”指当针对最大的对应性比较和对齐时,具有至少约60%、约80%、约90-95%、约98%、约99%或更大的核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列,如利用序列比较算法或通过视觉检查测量的。此类“基本上同一的”序列通常被认为是“同源的”,而不是指实际的祖先。优选地,“基本同一”存在于长度为至少约50个残基的序列的区域上,更优选地,存在于至少约100个残基的区域上,并且最优选地,序列在至少约150个残基上或在待比较的两个序列的全长上基本上同一。
当蛋白和/或蛋白序列天然地或人工地源自共同的祖先蛋白或蛋白序列时,所述蛋白和/或蛋白序列是“同源的”。类似的,当核酸和/或核酸序列天然地或人工地源自共同的祖先核酸或核酸序列时,所述核酸和/或核酸序列是“同源的”。同源性通常从两个或更多个核酸或蛋白(或其序列)之间的序列相似性推断出。在用于建立同源性的序列之间的相似性的精确百分比随着被讨论的核酸和蛋白而变化,但是对于50、100、150或更多个残基仅仅25%的序列相似性被常规地用于建立同源性。还可以使用较高水平的序列相似性,例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更高。在本文中描述了用于确定序列相似性百分比的方法(例如,使用缺省参数的BLASTP和BLASTN),并且通常是可得的。
对于序列比较和同源性确定,通常一个序列充当参考序列,测试序列与其比较。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入计算机中,如需要则指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳对齐可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法,通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜寻方法,通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过视觉检查(大体参见Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等,编,CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.之间的合资企业,2004年补充)来进行。
适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法,所述BLAST算法被描述于Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开地可得的。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字鉴定高得分序列对(HSP),所述长度为W的短字在与数据库序列中的相同长度的字对齐时,匹配或满足一些正值的阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等,同上)。这些初始的相邻字击中充当种子,用于起始搜索以发现包含它们的更长的HSP。然后,字击中沿着每个序列在两个方向上延伸,远至累积对齐得分不可被增加。对于核苷酸序列,使用参数M(对于一对匹配的残基的奖励得分;总是>0)和N(对于不匹配的残基的罚分;总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列,使用得分矩阵来计算累积得分。当累积对齐得分由于一个或更多个负得分的残基对齐的累积而从其达到的最大值下降量X;累积得分到达零或零以下时,字击中在每个方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望(E)10、截断100、M=5、N=-4和两条链的比较作为缺省。对于氨基酸序列,BLAST程序使用字长(W)3、期望(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)作为缺省。
除了计算序列同一性百分比之外,BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见,例如,Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一个相似性测量是最小总概率(P(N)),所述最小总概率提供两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如,如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总概率小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001,则认为核酸与参考序列相似。
在使用完全不同的聚合酶的研究的情况中,“功能上等同”意指对照聚合酶将在酶中包含被认为发生于其它聚合酶中具有相同功能作用的氨基酸位置处的氨基酸置换。例如,在Vent DNA聚合酶中在位置412处从酪氨酸到缬氨酸的突变(Y412V)将功能上等同于在9°N聚合酶中在位置409处从酪氨酸到缬氨酸的突变(Y409V)。
通常,两个或更多个不同的聚合酶中的功能上等同的置换突变发生在聚合酶的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。因此,在本文中术语“功能上等同”的使用还包括与给定的突变“位置上等同”或“同源”的突变,不管突变的氨基酸的特定功能是否是已知的。基于序列比对和/或分子建模鉴定两个或更多个不同的聚合酶的氨基酸序列中的在位置上等同或同源的氨基酸残基是可能的。序列比对以鉴定在位置上等同和/或在功能上等同的残基的实例被列于图1和2中。因此,例如,如图2中示出的,半保守结构域中的残基被鉴定为9°NDNA聚合酶氨基酸序列的位置475-492。TGO、KOD1、Pfu、MmS2和RB69聚合酶中的相应残基在图中被鉴定为竖直地对齐的,并且被认为在位置上等同于以及功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列的相应残基。
上文描述的改造的聚合酶可以包含已知在3’封闭的核苷酸的存在下和/或在DNA测序应用中增强聚合酶活性的一个或更多个方面的另外的置换突变。例如,在一些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶还可以在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置处包含置换突变。可以进行功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的408-410的位置处的一个或更多个位置处的多个置换突变中的任一个,所述多个置换突变中的任一个导致封闭的核苷酸的增加的掺入,如本领域已知并由US 2006/0240439和US2006/0281109的公开内容例示的,其每一个通过引用以其整体被并入。例如,置换突变可以包括与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408Ala和/或Tyr409Ala和/或Pro410Ile同源的置换突变。在某些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ala485的位置处包含置换突变。例如,在一些实施方案中,聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ala485Leu或Ala485Val的置换突变。
在一些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶与野生型聚合酶相比可以包含降低的外切核酸酶活性。可以进行在已知导致降低的外切核酸酶活性的一个或更多个位置处的多个置换突变中的任一个,如在本领域已知并由US 2006/0240439和US 2006/0281109的并入材料例示的。例如,在一些实施方案中,除了以上突变之外,改造的聚合酶还可以在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Asp141和/或Glu143的位置处包含置换突变。
在某些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Cys223的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变,如在本领域已知并由US 2006/0281109的并入材料例示的。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Cys223Ser的置换突变。
在某些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶可以包含对等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Thr514和/或Ile521的位置的一个或更多个突变,如在本领域已知并由PCT/US2013/031694的公开内容例示的,其通过引用以其整体被并入。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Thr514Ala、Thr514Ser和/或Ile521Leu的置换突变。
在某些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶可以包含对等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Arg713的位置的一个或更多个突变,如在本领域已知并由美国专利号8,623,628的公开内容例示的,其通过引用以其整体被并入。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Arg713Gly、Arg713Met或Arg713Ala的置换突变。
在某些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶可以包含对等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Arg743和/或Lys705的位置的一个或更多个突变,如在本领域已知并由美国专利号8,623,628的公开内容例示的,其通过引用以其整体被并入。例如,在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Arg743Ala和/或Lys705Ala的置换突变。
在某些实施方案中,除了以上突变中的任一个之外,改造的聚合酶可以包含一个或更多个另外的置换突变以去除内部的甲硫氨酸。例如,在一些实施方案中,改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Met129的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。在某些实施方案中,改造的聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Met129Ala的置换突变。
突变聚合酶
例如根据如以上讨论的聚合酶模型和模型预测,或使用随机或半随机突变方法,多种类型的诱变被任选地用于本公开内容,例如来修饰聚合酶以产生变体。通常,任何可得的诱变程序可以被用于制备聚合酶突变体。此类诱变程序任选地包括针对一种或更多种感兴趣的活性(例如对于给定的核苷酸类似物例如降低的焦磷酸解、增加的周转)选择突变的核酸和多肽。可以使用的程序包括但不限于:定点诱变、随机点诱变、体外或体内同源重组(DNA重排和组合的重叠PCR)、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸修饰的DNA诱变、使用有缺口的二聚体DNA的诱变、点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、简并PCR、双链断裂修复和技术人员已知的许多其他的程序。用于突变的起始聚合酶可以是本文提到的那些聚合酶中的任一个,包括可得的聚合酶突变体诸如例如在US 2006/0240439和US 2006/0281109中鉴定的那些聚合酶突变体,其每一个通过引用以其整体被并入。
任选地,诱变可由来自天然存在的聚合酶分子的信息或已知的改造或突变的聚合酶(例如,使用如前面的参考中提到的现存的突变聚合酶)的信息,例如以上讨论的序列、序列比较、物理性质、晶体结构等来指导。但是,在另一类实施方案中,修饰可以是基本上随机的(例如,如在经典或“家族”DNA重排中,参见,例如Crameri等(1998)"DNA shuffling of afamily of genes from diverse species accelerates directed evolution"Nature391:288-291)。
突变形式的另外的信息在以下中找到:Sambrook等,Molecular Cloning--ALaboratory Manual(第3版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.,2000(”Sambrook”);Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等,编,Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.之间的合资企业,(2011年补充)(”Ausubel”))和PCR Protocols A Guideto Methods and Applications(Innis等编)Academic Press Inc.San Diego,Calif.(1990)("Innis")。在引用的以下出版物和参考文献内,提供了突变形式的另外的详细说明:Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion inBiotechnology 4:450-455(1993);Bass等,Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities,Science 242:240-245(1988);Bordo和Argos(1991)Suggestionsfor"Safe"Residue Substitutions in Site-directed Mutagenesis217:721-729;Botstein&Shortle,Strategies and applications of in vitro mutagenesis,Science229:1193-1201(1985);Carter等,Improved oligonucleotide site-directedmutagenesis using M13vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985);Carter,Site-directed 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fragments using phage display libraries"Nature 352:624-628;Gibbs等(2001)"Degenerate oligonucleotide gene shuffling(DOGS):a method for enhancingthe frequency of recombination with family shuffling"Gene 271:13-20;以及Hiraga和Arnold(2003)"General method for sequence-independent site-directedchimeragenesis:J.Mol.Biol.330:287-296。可以在Methods in Enzymology第154卷中找到许多以上方法的另外的详细说明,其还描述了用于对多种诱变方法解决故障的问题的有用的对照。
制备并分离重组聚合酶
通常,编码如本文呈现的聚合酶的核酸可通过克隆、重组、体外合成、体外扩增和/或其他可用的方法来制备。多种重组方法可用于表达编码如本文呈现的聚合酶的表达载体。用于制备重组核酸、表达和分离表达的产物的方法在本领域是熟知的并被充分描述。本文描述了许多示例性突变和突变组合以及用于设计期望的突变的策略。用于在聚合酶的活性位点中产生并选择突变,包括用于修饰活性位点中或活性位点附近的立体特征以允许核苷酸类似物改进地进入的方法在上文以及例如WO 2007/076057和PCT/US2007/022459中找到,其通过引用以其整体被并入。
用于突变、重组和体外核酸操作方法(包括克隆、表达、PCR等)的另外的有用的参考文献包括:Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Kaufman等(2003)Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine第二版Ceske(编)CRC Press(Kaufman);和The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley(编)(2000)Cold Spring Harbor,Humana Press Inc(Rapley);Chen等(编)PCR CloningProtocols,第二版(Methods in Molecular Biology,第192卷)Humana Press;和Viljoen等(2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer,ISBN1402034032。
另外,对于从细胞纯化质粒或其他相关核酸,许多试剂盒是商业可得的(参见,例如,均来自Pharmacia Biotech的EasyPrep.TM.、FlexiPrep.TM.;来自Stratagene的StrataClean.TM.;和来自Qiagen的QIAprep.TM.)。任何分离和/或纯化的核酸可被进一步操作以产生其他核酸、用于转染细胞、掺入相关的载体以感染生物体用于表达等。通常的克隆载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列、和用于调节特定靶核酸的表达的启动子。载体任选地包含通用表达盒,所述通用表达盒含有至少一个独立的终止子序列、允许盒在真核生物或原核生物或二者中复制的序列(例如穿梭载体)和用于原核系统和真核系统二者的选择标记物。载体适合于在原核生物、真核生物或二者中复制和整合。
例如用于细胞分离和培养(例如,用于随后的核酸分离)的其他有用的参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第三版,Wiley-Liss,New York和其中引用的参考文献;Payne等(1992)Plant Cell and TissueCulture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,N.Y.;Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods SpringerLab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)TheHandbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,Fla。
编码本文公开的重组聚合酶的核酸还是本文呈现的实施方案的特征。特定的氨基酸可由多个密码子编码,并且某些翻译系统(例如,原核细胞或真核细胞)往往表现出密码子偏倚,例如,不同的生物体往往优选编码同一氨基酸的若干同义密码子中的一个。因此,本文呈现的核酸任选地是“密码子优化的”,意指合成核酸以包含被采用以表达聚合酶的特定翻译系统优选的密码子。例如,当期望在细菌细胞(或甚至细菌的特定菌株)中表达聚合酶时,可以合成核酸以包含在该细菌细胞的基因组中最频繁发现的密码子,用于有效表达聚合酶。当期望在真核细胞中表达聚合酶时,可以采用类似的策略,例如,核酸可以包含该真核细胞优选的密码子。
多种蛋白分离和检测方法是已知的,并且可用于例如从表达本文呈现的重组聚合酶的细胞的重组培养物分离聚合酶。多种蛋白分离和检测方法在本领域是熟知的,包括例如在以下参考文献中列出的那些方法:R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.(1982);Deutscher,Methods in Enzymology第182卷:Guide to ProteinPurification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990);Sandana(1997)Bioseparation ofProteins,Academic Press,Inc.;Bollag等(1996)Protein Methods,第二增补版Wiley-Liss,NY;Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ,Harris和Angal(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Pressat Oxford,Oxford,England;Harris和Angal Protein Purification Methods:APractical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England;Scopes(1993)ProteinPurification:Principles and Practice第三增补版Springer Verlag,NY;Janson andRyden(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods andApplications,第二版Wiley-VCH,NY;和Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press,NJ;以及其中引用的参考文献。关于蛋白纯化和检测方法的另外的详细说明可以在Satinder Ahuja编,Handbook of Bioseparations,Academic Press(2000)找到。
使用方法
本文呈现的改造的聚合酶可以用于测序程序,诸如合成测序(SBS)技术。简而言之,SBS可通过使靶核酸与一个或更多个带标记的核苷酸、DNA聚合酶等接触起始。当使用靶核酸作为模板延伸引物时,那些特征将掺入可被检测的带标记的核苷酸。任选地,带标记的核苷酸还可包括可逆终止特性,所述可逆终止特性在核苷酸已被添加至引物后终止进一步的引物延伸。例如,具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可被添加至引物,以使得随后的延伸不能发生,直到递送解封剂以去除该部分。因此,对于使用可逆终止的实施方案,可将解封试剂递送至流通池(在检测发生之前或之后)。在多个递送步骤之间可进行洗涤。然后可重复循环n次,以将引物延伸n个核苷酸,从而检测长度n的序列。可容易地改编以与由本公开内容的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台被描述于例如Bentley等,Nature 456:53-59(2008);WO 04/018497;WO 91/06678;WO 07/123744;美国专利号7,057,026、7,329,492、7,211,414、7,315,019或7,405,281和美国专利申请公布号2008/0108082A1,其每个通过引用被并入本文。
可利用使用循环反应的其他测序程序,诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测随着特定核苷酸被掺入到初生态核酸链中的无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi,等,AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996);Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001);Ronaghi等Science 281(5375),363(1998);美国专利号6,210,891、6,258,568和6,274,320,其每个被通过引用并入本文。在焦磷酸测序中,释放的PPi可通过由ATP硫酸化酶转化成腺苷三磷酸(ATP)来检测,并且得到的ATP可经由萤光素酶产生的光子来检测。因此,测序反应可经由发光检测系统来监测。用于基于荧光的检测系统的激发放射源对于焦磷酸测序程序不是必需的。可用于对本公开内容的阵列应用焦磷酸测序的有用的流体系统、检测器和程序被描述在例如WIPO专利申请序号PCT/US11/57111、美国专利申请公布号2005/0191698A1、美国专利号7,595,883和美国专利号7,244,559中,其每个通过引用被并入本文。
一些实施方案可利用包括DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如,核苷酸掺入可通过载有荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用,或用零模波导来检测。用于基于FRET的测序的技术和试剂被描述于例如Levene等Science 299,682–686(2003);Lundquist等Opt.Lett.33,1026–1028(2008);Korlach等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008),通过引用将其公开内容并入本文。
一些SBS实施方案包括检测将核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如,基于检测释放的质子的测序可使用电子检测器和从Ion Torrent(Guilford,CT,a LifeTechnologies subsidiary)商业可得的相关技术,或在美国专利申请公布号2009/0026082A1、2009/0127589A1、2010/0137143A1、或2010/0282617A1中描述的测序方法和系统,通过引用将其每个并入本文。
相应地,本文呈现了用于将核苷酸类似物掺入DNA的方法,所述方法包括允许以下组分相互作用:(i)根据以上实施方案中的任一个的改造的聚合酶,(ii)DNA模板;和(iii)核苷酸溶液。在某些实施方案中,DNA模板包括聚簇阵列。在某些实施方案中,核苷酸在3’糖羟基处被修饰,并且在3’糖羟基处包含修饰以使得取代基在尺寸上大于天然存在的3’羟基。
编码改造的核苷酸的核酸
本文还呈现了编码本文呈现的改造的聚合酶的核酸分子。对于氨基酸序列并且优选地还有编码聚合酶的野生型核苷酸序列是已知的、为突变形式的聚合酶的任何给定的改造的聚合酶,根据分子生物学的基本原理获得编码突变体的核苷酸序列是可能的。例如,给定编码9°N聚合酶的野生型核苷酸序列是已知的,则推断出使用标准遗传密码编码具有一个或更多个氨基酸置换的任何给定的突变形式的9°N的核苷酸序列是可能的。类似地,对于其他聚合酶诸如例如VentTM、Pfu、Tsp JDF-3、Taq等的突变形式,可容易地得到核苷酸序列。然后,可使用本领域已知的标准分子生物学技术构建具有需要的核苷酸序列的核酸分子。
根据本文呈现的实施方案,定义的核酸不仅包括相同的核酸,还包括任何小的碱基变异,所述小的碱基变异特别地包括在保守氨基酸置换中由于简并密码子而导致同义密码子(指定相同氨基酸残基的不同密码子)的情况中的置换。术语“核酸序列”还包括关于碱基变异给出的任何单链序列的互补序列。
本文描述的核酸分子还可以有利地被包含在合适的表达载体中,以在合适的宿主中从所述表达载体表达编码的聚合酶蛋白。将克隆的DNA掺入合适的表达载体是本领域技术人员熟知的,所述合适的表达载体用于随后的所述细胞的转化和随后的转化细胞的选择,如在Sambrook等(1989),Molecular cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory中提供的,其通过引用以其整体被并入。
此类表达载体包括具有根据本文呈现的实施方案的核酸的载体,所述核酸可操作地连接至能够影响所述DNA片段的表达的调节序列,诸如启动子区域。术语“可操作地连接的”指其中描述的组分处于允许它们以其预期的方式发挥功能的关系的并置(juxtaposition)。此类载体可被转化入合适的宿主细胞以提供根据本文呈现的实施方案的蛋白的表达。
核酸分子可以编码成熟蛋白或具有前序列的蛋白,所述前序列包括编码前体蛋白上的前导序列的前序列,所述前导序列然后被宿主细胞裂解以形成成熟蛋白。载体可以是例如具有复制起点、和任选地用于所述核苷酸的表达的启动子及任选地该启动子的调节物的质粒载体、病毒载体或噬菌体载体。载体可以含有一个或更多个可选择的标志物,诸如,例如,抗生素抗性基因。
表达需要的调节元件包括:结合RNA聚合酶以及指导合适的转录起始水平的启动子序列;以及用于核糖体结合的翻译起始序列。例如,细菌表达载体可以包括:启动子,诸如lac启动子;和用于翻译起始的Shine-Dalgarno序列;以及起始密码子AUG。类似地,真核表达载体可以包括用于RNA聚合酶II的异源或同源启动子、下游多腺苷酸化信号、起始密码子AUG和用于核糖体的脱离的终止密码子。此类载体是商业可得的,或可通过本领域熟知的方法从描述的序列组装。
通过在载体中包含增强子序列,编码聚合酶的DNA被高等真核生物的转录可以被优化。增强子是在启动子上起作用以增加转录的水平的DNA顺式作用元件。除了可选择的标志物之外,载体通常还将包含复制起点。
实施例1
通用测定方法和条件
以下段落描述了在下面呈现的实施例中使用的通用测定条件。
1.基于凝胶的测定
该部分描述了在下面的实施例中使用的用于监测聚合酶的焦磷酸解活性的基于凝胶的测定。
简而言之,通过在反应缓冲液中使300nM酶和100nM双链引物-模板DNA分别与不同浓度(0mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM和4mM)的焦磷酸钠混合来测量示例性修饰的聚合酶的焦磷酸解活性,所述反应缓冲液含有:50mM Tris-HCl(pH 9.0)、50mM NaCl、1mMEDTA、6mM MgSO4和0.05%(v/v)Tween-20。反应在55℃进行持续1分钟,并且通过添加等体积的含有0.025%溴酚蓝、30mM EDTA和95%去离子甲酰胺的2X猝灭溶液终止。
使反应产物在95℃变性持续5min,并在15%7M尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素-PAGE)中分辨。通过用GE Healthcare Typhoon 8000PhosphorImager扫描使结果可视化。
通过使以下寡核苷酸退火形成双链引物-模板双链体:
引物:5′-GCTTGCACAGGTGCGTTCGT*-3′
模板:5′-CGTTAGTCCACGAACGCACCTGTGCAAGC-3′
该引物包含与寡核苷酸的5′末端连接的6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)荧光染料。最后的“T*”在核苷酸上含有3’-O叠氮甲基封闭部分。显示带标记的引物的降解的泳道指示与对照相比增强的焦磷酸解(DNA聚合的逆反应)。
2.聚合酶的克隆和表达
该部分描述了用于克隆和表达在下面的实施例中使用的多种聚合酶突变体的方法。
使用标准定点诱变方法在编码聚合酶的骨架基因序列的基因上进行诱变。对于进行的每个突变,通过对克隆的基因序列测序来确认突变的基因的正确序列。
将聚合酶基因亚克隆到pET11a载体中,并转化到来自Invitrogen的BL21Star(DE3)表达细胞中。在37℃在2.8L Fernbock烧瓶中培养转化细胞,直到OD600达到0.8。然后,通过添加1mM IPTG诱导蛋白表达,随后另外生长3小时。然后将培养物以7000rpm离心持续20分钟。将细胞团块储存在-20℃直至纯化。
细菌细胞裂解通过在10x w/v裂解缓冲液(Tris pH 7.5、500mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT)中重悬冷冻的培养物进行。将无EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)添加到重悬的细胞团块中。所有的裂解和纯化步骤均在4℃进行。将重悬的培养物通过微射流机(microfluidizer)四次以完成细胞裂解。然后,使裂解物以20,000rpm离心持续20分钟以除去细胞碎片。将聚乙烯亚胺(终浓度0.5%)缓慢地添加至上清液中,搅拌持续45分钟以沉淀细菌核酸。使裂解物以20,000rpm离心持续20分钟;丢弃团块。然后,使用两体积的在无菌dH2O中冷饱和的(NH4)2SO4使裂解物硫酸铵沉淀。将沉淀的蛋白以20,000rpm离心持续20分钟。将蛋白团块重悬在250mL缓冲液A(50mM Tris pH 7.5、50mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT)中。然后,使用在缓冲液A中预平衡的5mL SP FastFlow柱(GE)纯化重悬的裂解物。使用从0.1M至1M KCl的50mL梯度洗脱柱。汇集峰级分,并用缓冲液C(Tris pH 7.5、0.1mM EDTA、1mM DTT)稀释直到传导性等于缓冲液D(Tris pH 7.5、50mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT)。然后,将汇集的级分装载到5mL HiTrap Heparin Fastflow柱上。然后,使用从50mM至1M KCl的100mL梯度洗脱聚合酶。将峰级分汇集,透析至储存缓冲液(20mM Tris pH 7.5、300mMKCl、0.1mM EDTA、50%甘油)中并在-80℃冷冻。
3.Phasing/Pre-phasing分析
该部分描述了用于分析在以下实施例中使用的聚合酶突变体在合成测序测定中的性能的方法。
短12循环测序实验(short 12-cycle sequencing experiments)被用于产生phasing值和pre-phasing值。根据制造商的指示,在被转变成运行MiSeq Fast化学的单泳道系统的Illumina Genome Analyzer系统(Illumina,Inc.,San Diego,CA)上进行实验。例如,对于每个聚合酶,产生单独的掺入混合物(IMX),并对每种IMX使用不同的位置进行4x12个循环运行。使用标准MiSeq试剂配制品并用正被测试的聚合酶替代标准聚合酶。按照标准TruSeq HT方案从PhiX基因组DNA(与Illumina试剂一起被提供为对照)制备使用的DNA文库。使用Illumina RTA软件来评价phasing水平和pre-phasing水平。
实施例2
针对Phasing/Pre-Phasing鉴定和筛选9°N聚合酶突变体
进行3’封闭袋(3’block pocket)中的残基的饱和诱变筛选。产生、克隆、表达并纯化对两个修饰的9°N聚合酶骨架序列(SEQ ID NO:29和31)的突变,如在实施例1中大体描述的。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定,针对爆发动力学(burstkinetics)筛选纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:29和31所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,包括以下突变体的一组突变体被进一步如在以上实施例1中描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。
筛选的结果被归纳在下面的表中。如表中显示的,当与对照聚合酶Pol957或Pol955相比时,以上突变体的每一个在phasing和pre-phasing的一个或更多个方面显示出出乎意料的和显著的改进。
突变(名称) | SEQ ID NO: | 与对照相比phasing减少? |
对照 | 29 | - |
K477M | 30 | 是 |
对照 | 31 | - |
K477M | 32 | 是 |
实施例3
筛选9°N WT聚合酶的突变体
如在实施例1中大体描述的产生、克隆、表达和纯化对嗜热球菌属物种Thermococcus sp.9°N-7(9°N)野生型聚合酶骨架序列(SEQ ID NO:5)的突变,产生了具有如SEQ ID NO:6-8列出的氨基酸序列的聚合酶。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定针对爆发动力学筛选所纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:5所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,一组突变体被进一步如以上在实施例1中大体描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。具有以下突变的那些聚合酶与对照相比显示出具有改进的phasing和/或pre-phasing活性。
实施例4
筛选9°N Exo
-
聚合酶的突变体
如在实施例1中大体描述的产生、克隆、表达并纯化对9°N Exo-聚合酶骨架序列(SEQ ID NO:9)的突变,产生了具有如SEQ ID NO:10-12列出的氨基酸序列的聚合酶。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定针对爆发动力学筛选所纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:9所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,一组突变体被进一步如以上在实施例1中大体描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。具有以下突变的那些聚合酶与对照相比显示出具有改进的phasing和/或pre-phasing活性。
实施例5
筛选改造的9°N聚合酶的突变体
如在实施例1中大体描述的产生、克隆、表达并纯化改造的9°N聚合酶骨架序列(SEQ ID NO:13)的突变,产生了具有如SEQ ID NO:14-16列出的氨基酸序列的聚合酶。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定针对爆发动力学筛选所纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:13所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,一组突变体被进一步如以上在实施例1中大体描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。具有以下突变的那些聚合酶与对照相比显示出具有改进的phasing和/或pre-phasing活性。
实施例6
筛选Pfu Exo
-
聚合酶的突变体
基于与9°N聚合酶骨架序列的序列比对分析(参见图1),如在实施例1中大体描述的产生、克隆、表达并纯化对强烈火球菌(Pfu)Exo-聚合酶骨架序列(SEQ ID NO:17)的特定突变,产生了具有如SEQ ID NO:18-20列出的氨基酸序列的聚合酶。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定针对爆发动力学筛选所纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:17所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,一组突变体被进一步如以上在实施例1中大体描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。具有以下突变的那些聚合酶与对照相比显示出具有改进的phasing和/或pre-phasing活性。
实施例7
筛选KOD1Exo
-
聚合酶的突变体
基于与9°N聚合酶骨架序列的序列比对分析(参见图1),如在实施例1中大体描述的产生、克隆、表达并纯化Thermococcus kodakaraensis(KOD1)Exo-聚合酶骨架序列(SEQID NO:21)的特定突变,产生具有如SEQ ID NO:22-24列出的氨基酸序列的聚合酶。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定针对爆发动力学筛选所纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:21所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,一组突变体被进一步如以上在实施例1中大体描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。具有以下突变的那些聚合酶与对照相比显示出具有改进的phasing和/或pre-phasing活性。
实施例8
筛选MMS2Exo
-
聚合酶的突变体
基于与9°N聚合酶骨架序列的序列比对分析(参见图1),基于在与9°N聚合酶比对中的同源性(参见图2),鉴定对M.maripaludis(MMS2)Exo-聚合酶骨架序列(SEQ ID NO:25)的特定突变。如在实施例1中大体描述的产生、克隆、表达并纯化突变体,产生了具有如SEQID NO:26-28列出的氨基酸序列的聚合酶。
使用以上在实施例1中描述的基于凝胶的测定针对爆发动力学筛选所纯化的突变体聚合酶,并与具有SEQ ID NO:25所列的序列的对照聚合酶比较。在筛选的那些突变体中,一组突变体被进一步如以上在实施例1中大体描述的针对phasing/pre-phasing活性筛选。具有以下突变的那些聚合酶与对照相比显示出具有改进的phasing和/或pre-phasing活性。
贯穿本申请已参考多个出版物、专利和/或专利申请。这些出版物的公开内容通过引用以其整体特此并入本申请。
在本文中术语包括意图是开放式的,不仅包括所引述的要素,而且还包括任何另外的要素。
已描述了很多实施方案。但是,将理解可进行多种改变。因此,其他的实施方案在以下权利要求书的范围内。
Claims (66)
1.一种改造的聚合酶,所述改造的聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含至少一个氨基酸置换突变。
2.根据权利要求1所述的改造的聚合酶,其中所述置换突变包含突变成具有较小侧链的残基的突变。
3.根据权利要求1所述的改造的聚合酶,其中所述置换突变包含突变成具有疏水性侧链的残基的突变。
4.根据权利要求1所述的改造的聚合酶,其中所述置换突变包含与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477Met同源的突变。
5.根据权利要求1所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
6.权利要求1所述的改造的聚合酶,其中所述DNA聚合酶是B家族型DNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的改造的聚合酶,所述改造的聚合酶选自由以下组成的组:B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α、T4、RB69和phi29噬菌体DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的改造的聚合酶,其中所述B家族古细菌DNA聚合酶来自选自由嗜热球菌属(Thermococcus)、火球菌属(Pyrococcus)和甲烷球菌属(Methanococcus)组成的组的属。
9.根据权利要求7所述的B家族古细菌DNA聚合酶,所述B家族古细菌DNA聚合酶选自由Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、9°N聚合酶和Pfu聚合酶组成的组。
10.根据权利要求9所述的改造的聚合酶,其中所述B家族古细菌DNA聚合酶是9°N聚合酶。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置处包含置换突变。
12.根据权利要求11所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶包含与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408Ala和/或Tyr409Ala和/或Pro410Ile同源的置换突变。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶与野生型聚合酶相比包含降低的外切核酸酶活性。
14.根据权利要求13所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Asp141和/或Glu143的位置处包含置换突变。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ala485的位置处包含置换突变。
16.根据权利要求15所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ala485Leu或Ala485Val的置换突变。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的改造的聚合酶,所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Cys223的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
18.根据权利要求17所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Cys223Ser的置换突变。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的改造的聚合酶,所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Thr514的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
20.根据权利要求19所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Thr514Ala或Thr514Ser的置换突变。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的改造的聚合酶,所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ile521的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
22.根据权利要求21所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ile521Leu的置换突变。
23.一种改造的聚合酶,所述改造的聚合酶包含对半保守结构域的置换突变,所述半保守结构域包含SEQ ID NO:1-4中的任一个的氨基酸序列,其中所述置换突变包括选自以下的突变:在位置3处置换成除了Lys、Ile或Gln之外的任一残基。
24.根据权利要求23所述的改造的聚合酶,其中所述突变包括在位置3处置换成Met。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置处包含置换突变。
26.根据权利要求25所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶包含与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408Ala和/或Tyr409Ala和/或Pro410Ile同源的置换突变。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶与野生型聚合酶相比包含降低的外切核酸酶活性。
28.根据权利要求27所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Asp141和/或Glu143的位置处包含置换突变。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的改造的聚合酶,其中所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ala485的位置处包含置换突变。
30.根据权利要求29所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ala485Leu或Ala485Val的置换突变。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的改造的聚合酶,所述改造的聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Cys223的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
32.根据权利要求31所述的改造的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Cys223Ser的置换突变。
33.一种改造的聚合酶,所述改造的聚合酶包含以下中的任一个的氨基酸序列:SEQ IDNO:6-8、10-12、14-16、18-20、22-24和26-28、30和32。
34.一种核酸分子,所述核酸分子编码如在权利要求1-33的任一项中定义的改造的聚合酶。
35.一种表达载体,所述表达载体包含权利要求34所述的核酸分子。
36.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含权利要求35所述的载体。
37.一种用于将修饰的核苷酸掺入DNA的方法,所述方法包括允许以下组分相互作用:(i)根据权利要求1-33中任一项所述的改造的聚合酶,(ii)DNA模板;和(iii)核苷酸溶液。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述DNA模板包括聚簇阵列。
39.一种用于进行核苷酸掺入反应的试剂盒,所述试剂盒包含:如在权利要求1-33中任一项中定义的聚合酶和核苷酸溶液。
40.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述核苷酸溶液包含带标记的核苷酸。
41.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述核苷酸包括合成的核苷酸。
42.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述核苷酸包括修饰的核苷酸。
43.根据权利要求42所述的试剂盒,其中所述修饰的核苷酸已在3’糖羟基处被修饰以使得取代基在尺寸上大于天然存在的3’羟基。
44.根据权利要求42所述的试剂盒,其中修饰的核苷酸包括包含嘌呤碱基或嘧啶碱基和以下核糖或脱氧核糖部分的修饰的核苷酸或核苷分子,所述核糖或脱氧核糖部分具有与其共价地附接的可移除的3’-OH封闭基团,以使得3’碳原子已附接以下结构的基团
-O-Z
其中Z是-C(R’)2-O-R”、-C(R’)2-N(R”)2、-C(R’)2-N(H)R”、-C(R’)2-S-R”和-C(R’)2-F中的任一个,
其中每个R”是可移除的保护基团或可移除的保护基团的一部分;
每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基团、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基,或通过连接基团附接的可检测的标记物;或(R’)2代表式=C(R”’)2的亚烷基,其中每个R”’可以是相同的或不同的并且选自包括氢原子和卤素原子以及烷基的组;并且
其中所述分子可以反应以产生中间体,在所述中间体中每个R”被交换为H,或当Z是-C(R’)2-F时,F被交换为OH、SH或NH2,优选地OH,所述中间体在水性条件下解离以提供带有游离3’OH的分子;
条件是当Z是-C(R’)2-S-R”时,两个R’基团均不是H。
45.根据权利要求44所述的试剂盒,其中所述修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基。
46.根据权利要求45所述的试剂盒,其中所述修饰的核苷酸或核苷的-Z是式-C(R’)2-N3。
47.根据权利要求46所述的试剂盒,其中Z是叠氮甲基。
48.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述修饰的核苷酸被荧光标记以允许所述修饰的核苷酸的检测。
49.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述修饰的核苷酸包括具有经由可裂解的接头与可检测的标记物附接的碱基的核苷酸或核苷。
50.根据权利要求49所述的试剂盒,其中所述可检测的标记物包括荧光标记物。
51.根据权利要求39所述的试剂盒,所述试剂盒还包含一种或更多种DNA模板分子和/或引物。
52.一种重组DNA聚合酶,所述重组DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:29至少60%、70%、80%、90%、95%、99%同一的氨基酸序列,所述重组DNA聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含。
53.一种重组DNA聚合酶,所述重组DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:31至少60%、70%、80%、90%、95%、99%同一的氨基酸序列,所述重组DNA聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的位置处包含。
54.根据权利要求52-53中任一项所述的聚合酶,其中所述聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408和/或Tyr409和/或Pro410的位置处包含置换突变。
55.根据权利要求54所述的聚合酶,其中所述聚合酶包含与9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Leu408Ala和/或Tyr409Ala和/或Pro410Ile同源的置换突变。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的聚合酶,其中所述聚合酶与野生型聚合酶相比包含降低的外切核酸酶活性。
57.根据权利要求56所述的聚合酶,其中所述聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Asp141和/或Glu143的位置处包含置换突变。
58.根据权利要求52-57中任一项所述的聚合酶,其中所述聚合酶还在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Ala485的位置处包含置换突变。
59.根据权利要求58所述的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ala485Leu或Ala485Val的置换突变。
60.根据权利要求52-59中任一项所述的聚合酶,所述聚合酶还在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Cys223的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
61.根据权利要求60所述的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Cys223Ser的置换突变。
62.根据权利要求52-61中任一项所述的聚合酶,所述聚合酶还在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Thr514的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
63.根据权利要求62所述的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Thr514Ala或Thr514Ser的置换突变。
64.根据权利要求52-63中任一项所述的聚合酶,所述聚合酶还在功能上等同于9°NDNA聚合酶氨基酸序列中的Ile521的位置处包含突变成不同的氨基酸的置换突变。
65.根据权利要求64所述的聚合酶,其中所述聚合酶包含功能上等同于9°N聚合酶氨基酸序列中的Ile521Leu的置换突变。
66.一种重组DNA聚合酶,所述重组DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:5至少60%、70%、80%、90%、95%、99%同一的氨基酸序列,所述重组聚合酶在功能上等同于9°N DNA聚合酶氨基酸序列中的Lys477的一个或更多个位置处包含至少一个氨基酸置换突变。
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