JP2010000089A - 改良された核酸修飾酵素 - Google Patents
改良された核酸修飾酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010000089A JP2010000089A JP2009203587A JP2009203587A JP2010000089A JP 2010000089 A JP2010000089 A JP 2010000089A JP 2009203587 A JP2009203587 A JP 2009203587A JP 2009203587 A JP2009203587 A JP 2009203587A JP 2010000089 A JP2010000089 A JP 2010000089A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- protein
- sequence
- domain
- binding domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 159
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 150
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 150
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 119
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 167
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 149
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 85
- 101000844752 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) DNA-binding protein 7d Proteins 0.000 claims description 82
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 61
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 52
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 48
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 48
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 13
- 101000844753 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) DNA-binding protein 7d Proteins 0.000 claims description 13
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 13
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 11
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 10
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 claims description 9
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 claims description 9
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 claims description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 9
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 8
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 claims description 4
- -1 gyrase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims 4
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 claims 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 42
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 99
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 87
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 78
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 53
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 43
- 239000000047 product Substances 0.000 description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 27
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 21
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 20
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 18
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 17
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 17
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 17
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 16
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 9
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 8
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 6
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 4
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 102220504264 Endogenous retrovirus group K member 104 Rec protein_L71F_mutation Human genes 0.000 description 3
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRPAUEVGEGEPFQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 ZRPAUEVGEGEPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220644177 Serum paraoxonase/arylesterase 2_L71R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 102000022788 double-stranded DNA binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- JVKRKMWZYMKVTQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JVKRKMWZYMKVTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710149498 Double-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N Gly-Thr-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101710135007 Histone-like protein p6 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000202997 Methanothermus Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101150076840 PolI gene Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241001467519 Pyrococcus sp. Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000205101 Sulfolobus Species 0.000 description 1
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 1
- 241000557720 Thermus brockianus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091013637 double-stranded DNA binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001447 template-directed synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】前記改良点は、前記核酸を結合し、そして触媒的に修飾する酵素の能力を増強する態様での、前記酵素への配列−非特異的核酸結合ドメインの結合である。
【選択図】なし
Description
“古細菌小型塩基性DNA結合タンパク質”とは、天然の小さな塩基性DNA結合タンパク質、例えばスルホロバス・スルファタリカス(Sulfolobus sulfataricus)由来のSso−7dに対して50%相同体を有するか、又は天然の小さな塩基性DNA結合タンパク質に対して生成される抗体に対して結合する、50〜75個のアミノ酸のタンパク質を指す。
酵素における“増強する”とは、酵素の活性の改良、すなわち単位酵素及び単位時間当たりの生成物の量上昇を意味する。
“融合された”とは、共有結合による結合を意味する。
“連結する”とは、タンパク質ドメインを機能的に結合するための当業界において知られているいずれかの方法、例えば介在性ドメインを有するか又は有さない組換え融合、イントロン−介在性融合、非共有結合及び共有結合、例えばジスルフィド結合;水素結合;静電結合;及びコンホメーション結合、例えば抗体―抗原及びビオチン−アビジン結合を意味する。
“ヌクレアーゼ”とは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を分解できる酵素を意味する。
“核酸修飾酵素”とは、核酸を共有的に変更する酵素を意味する。
“ポリメラーゼ”とは、ポリヌクレオチドの鋳型依存合成(template-directed synthesis)を行う酵素を意味する。
“制限エンドヌクレアーゼ”とは、特定の塩基配列でDNAの分子を内部的に分解する、細菌により生成される酵素グループのいずれかを意味する。
“配列−非特異的核酸結合ドメイン”とは、核酸に有意な親和性を伴って結合するタンパク質ドメインを言及し、このためには、同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なったヌクレオチド配列を有するもう1つの核酸よりも100倍以上高い親和性を伴ってタンパク質ドメインに結語する既知の核酸は存在しない。
“鋳型”とは、プライマーハイブリダイゼーション部位を両端に有する、増幅されるポリヌクレオチドを含んで成る二本鎖ポリヌクレオチド配列を意味する。従って、“標的鋳型”は、5’プライマー及び3’プライマーのためのハイブリダイゼーション部位を端に有する標的ポリヌクレオチド配列を含んで成る。
本発明は、配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質が、触媒タンパク質のプロセッシング性質を増強するために触媒性核酸修飾タンパク質に結合され得る発見である。従来技術は、核酸結合タンパク質が核酸への酵素の結合親和性を高めることができることを教授するが、酵素のプロセッシング性質を増強する能力を有する結合タンパク質のグループは特定の価値のものである。
触媒性核酸修飾ドメインは、酵素機能を行う修飾酵素の領域である。本発明の触媒性核酸修飾ドメインは、プロセッシング性、例えばポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、等であるか、又は非プロセッシング性、例えばリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、等であり得る。
DNAポリメラーゼは、当業者に良く知られている。それらは、DNA依存性ポリメラーゼ及びRNA依存性ポリメラーゼ、例えば逆転写酵素を包含する。少なくとも5種のファミリーのDNA依存性DNAポリメラーゼが知られているが、但しほとんどはファミリーA、B及びCに分類される。ほとんどのファミリーAのポリメラーゼは、ポリメラーゼ、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を包含する複数の酵素機能を含むことができる一本鎖タンパク質である。
典型的には、DNAジャイレース及びトポイソメラーゼは、高次DNA構造、例えばスーパーコイル化において役割を演じる。DNAジャイレースは、負のスーパーコイルを導入する。原核生物においては、AサブユニットはDNA切断及び再結合を担当し、そしてBサブユニットはATP−加水分解性を含む。DNAジャイレースは、スーパーコイル化をプロセッシング的に及び触媒的に導入し、典型的には、DNAジャイレースの分子及び分当たり100までのスーパーコリルを導入する。ATPの不在下で、ジャイレースは負のスーパーコイルをゆっくり弛緩する。
種々のメチラーゼ及び3’又は5’エキソヌクレアーゼ、例えば細菌、原核、真核及びファージ酵素はまた、当業界において記載されている。典型的には、エキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼ、及びいくつかのメチラーゼもまた、プロセッシング性である。
二本鎖配列−非特異的核酸結合ドメインは、配列独立性態様で二本鎖核酸に結合するタンパク質又はタンパク質の定義された領域であり、すなわち結合は特定の配列のために著しい選択を示さない。典型的には、二本鎖核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸対一本鎖核酸に関して、10倍又はそれよりも高い親和性を示す。本発明の特定の態様における二本鎖核酸結合タンパク質は好ましくは、熱安定性である。そのようなタンパク質の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない:
Sso7d及びSac7dは、それぞれ過好熱性アルキバクテリアのスルホロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)及びスルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)由来の小さな(約7.000kdのMW)塩基性染色体タンパク質である。それらのタンパク質はリシンに富んでおり、そして高い熱、酸及び化学物質安定性を有する。それらは、配列独立的態様でDNAを結合し、そして結合される場合、同じ条件下で40℃までDNAのTMを高める(McAfeeなど., Biochemistry 34: 10063-10077, 1995)。それらのタンパク質及びそれらの相同体は典型的には、高温でのゲノムDNAの安定化に関与すると思われる。
HMf様タンパク質は、真核H4ヒストンと、アミノ酸配列及び構造において相同性を共有する原始ヒストンである。HMfファミリーのタンパク質は溶液において安定したダイマーを形成し、そしていくつかのHMf相同体は熱安定性種(例えば、メタノサーマス・フェルビダス(Methanothermus fevidus)及びピロコーカス株GB−3a)から同定されている。HMfファミリーのタンパク質は、Taq DNAポリメラーゼ又は低い内因性プロセッシング性を有するいずれかのDNA修飾酵素に連結されると、DNA基質に沿っての酵素のスライドする能力を増強し、そして従ってそのプロセッシング性を高める。例えば、ダイマー性HMf様タンパク質は、例えば化学的修飾を通して、Taq DNAポリメラーゼのN末端に共有結合され得、そして従って、ポリメラーゼのプロセッシング性を改良する。
すべてではないが、多くのファミリーBのDNAポリメラーゼは、プロセッシング性DNA合成を達成するためにアクセサリータンパク質と相互作用する。特に重要な種類のアクセサリータンパク質は、スライドするクランプとして言及される。いくつかの特徴化されたスライドするクランプは、溶液においてトリマーとして存在し、そして二本鎖DNAを収容することができる中心通路を有する環状構造を形成することができる。
本発明への使用のために適切な追加の核酸結合ドメインは、既知の配列−非特異的二本鎖DNA結合タンパク質との相同性により及び/又は抗体交差反応性により同定され得るか、又は生化学的アッセイにより見出され得る。
典型的には、約25個のアミノ酸、任意には約50〜100個のアミノ酸又は完全なタンパク質の長さの比較窓にわたって、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質に対して、約50%のアミノ酸配列同一性、任意には、約60%、75%、80%、85%、90%又は95〜98%のアミノ酸配列同一性を有するドメインが、本発明において使用され得る。配列が比較され、そして比較窓、又は次の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、又は手動的一列整列及び視覚的調査により測定されるような企画された領域にわたって最大の対応性について一列配列され得る。本発明のためには、%アミノ酸同一性は、BLASTのデフォールトパラメーターにより決定される。
本発明への使用のための配列特異的二本鎖核酸結合ドメインはまた、抗体、好ましくは既知の核酸結合ドメインに結合するポリクローナル抗体を用いて、交差反応性により同定され得る。ポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて生成される(例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane , Antibodies, A Laboratory Manual (1988) を参照のこと)。次に、免疫学的に交差反応性の結合タンパク質であるそれらのタンパク質は、種々のアッセイ方法により検出され得る。使用され得る種々の型及び条件の記載については、例えばMethods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Volume 37 (Asai, など., 1993), Colligan, 前記、及びHarlow & Lane, 前記を参照のこと。
配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの活性は、種々のアッセイを用いて評価され得る。適切な結合ドメインは、二本鎖核酸対一本鎖核酸について著しい性能を示す。
触媒性ドメイン及び二本鎖核酸結合ドメインは、当業者に良く知られている方法により連結され得る。それらの方法は、化学的及び組換え手段を包含する。
異種ドメインを連結する化学的手段は、例えばBioconjugate Techniques, Hermanson, Ed., Academic Press (1996)に記載されている。それらは、例えばタンパク質化学の業界において良く知られている方法により、直接的に又は連結化合物を通して、成分をお互い連結するための誘導体化を包含する。例えば、1つの化学的接合態様においては、触媒性ドメイン及び核酸結合ドメインを連結する手段は、2種の成分の分子間ジスルフィド結合の形成に究極的に寄与する異種二官能価カップリング試薬を含んで成る。
触媒ドメインの活性は、単独でのタンパク質に比較して、結合ドメインに連結される修飾タンパク質のプロセッシング性又は修飾活性を比較するために使用され得る種々のアッセイを用いて測定され得る。活性の改良性は、高められたプロセッシング性及び高められた効率の両者を包含する。
Sso7d−ΔTaq融合体の構成:次の例は、増強されたプロセッシング性を有するポリメラーゼタンパク質の構成を例示し、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質Sso7dは、289個のアミノ酸(ΔTaq)によりN末端で欠失されているサーマス・アクアチカスPolDNAポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼとして知られているファミリーAポリメラーゼ)に融合されている。
Sso7d/十分な長さのTaq融合タンパク質をまた構成した。手短には、Taqポリメラーゼの最初の336個のアミノ酸をコードする1kbのPCRフラグメントを、2種のプライマーを用いて生成した。5’プライマーは、SpeI部位をPCRフラグメントの5’末端中に導入し、そして3’プライマーはTaq遺伝子のヌクレオチド1008−1026にハイブリダイズする。フラグメントをSpeI及びBstXIにより消化し、Taqポリメラーゼの最初の289個のアミノ酸をコードする0.9kbのフラグメントを開放する。
ピロコーカス・フリオサスDNA polI(Pfuとして知られているファミリーBのDNAポリメラーゼ)のC末端にSso7dを連結する第3の融合タンパク質を構造した。Pfu DNAポリメラーゼ遺伝子を担持するpETに基づくプラスミドを修飾し、その結果、ユニークKpnI部位及びユニークSpeI部位を、停止コドンの前の Pfu遺伝子の3’末端で導入する。得られるプラスミド(pPFKS)は、そのC末端で追加のアミノ酸(Gly−Thr−His)を有するPfuポリメ ラーゼを発現する。
異なった種からのタンパク質をΔTaqに結合する配列−非特異的DNA結合タンパク質を連結する第4の融合タンパク質を構成した。2種のプライマーを用いて、スルホロバス・アシドカルダリウムのゲノムDNAからのSac7d遺伝子をPCR増幅した。前記プライマーは、それぞれ5’及び3’末端でPCRフラグメントにユニークEcoRI部位及びユニークSpeI部位を導入した。EcoRI及びSpeIによる制限消化に基づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpYW1(上記に記載される)中に連結した。得られるプラスミドは、Sso7d−ΔTaqに使用されるのと同じリンカーを通してΔTaqのN末端に融合されるSac7dタンパク質を含む単一のポリペプチドを発現する。融合タンパク質(Sac7d−ΔTaq)のDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号9及び10で示される。
第5の融合タンパク質は、14個のリシン及び2個アルギニンから構成されるペプチドをΔTaqのN末端に連結する。ポリリシン(PL)−ΔTaq融合タンパク質を生成するために、2種の67ntのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、EcoRI部位を適合する5’突出末端及びSpeI部位と適合する3’突出末端を有する重複DNAフラグメントを形成した。前記DNAフラグメントは、次の組成のリシンに富んでいるペプチドをコードする:NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT。
この例は、例1において生成される本発明の融合タンパク質のプロセッシング性の増強を示す。
ポリメラーゼ単位定義アッセイ:次のアッセイを用いて、ポリメラーゼ単位を定義した。オリゴヌクレオチドを、Mg2+−フリー反応緩衝液及びdNTPの存在下でssM13mp18DNAにプレアニーリングした。興味あるDNAポリメラーゼを、プライムされたDNA混合物に添加した。MgCl2を添加し、72℃でのDNA合成を開始した。サンプルを種々の時点で採取し、そしてPicoGreen(Molecular Probes, Eugene Oregon)を含むTE緩衝液に添加した。合成されるDNAの量を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。興味あるDNAポリメラーゼの単位活性を、その初期割合と対照DNAポリメラーゼ(例えば、既知の単位濃度の市販のポリメラーゼ)のその割合とを比較することによって決定した。
プロセッシング性を、プライムされた鋳型へのポリメラーゼの1回の結合現象の間に組み込まれるヌクレオチドの数を決定することによって測定した。
手短には、40nMの5’FAM−ラベルされたプライマー(34ntの長さ)を、80nMの環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングし、プライムされた鋳型を形成した。プライムされた鋳型を、標準のPCR緩衝液(Mg2+を有さない)及び200μMの個々のdNTPの存在下で、興味あるDNAポリメラーゼと共に、約4000:1のモル比(プライムされたDNA:DNAポリメラーゼ)で混合した。
この実験は、dsDNAを安定化することによって高いアニーリング温度で生成物を生成するために、Taqに比較して、Sso7d−ΔTaq融合タンパク質の高められた効率を示す。
2種のプライマー、すなわちプライマー1008(19マー、TM=56.4℃)及び2180R(20マー、TM=56.9℃)を用いて、Taqpol遺伝子の1kbフラグメント(1008−2180)を増幅した。グラジエント熱サイクラー(MJ Research, Waltham MA)を用いて、PCRサイクリングプログラムにおいて50℃から72℃にアニーリング温度を変えた。同一数の単位のSso7d−ΔTaq及びTaqを用いて生成されるPCR生成物の量を、定量化し、そして比較した。結果は表IIに示される。Sso7d−ΔTaq融合タンパク質は、高いアニーリング温度での十分な長さのTaqよりも有意に高い効率を示した。従って、シスでのSso7dの存在は、鋳型上でのプライマーの溶融温度を高める。
プライマー(上記に示されるような)のTMの 増強は、より短いプライマーが効果的なPCR増幅を達成するために、Taqによってではなく、Sso7d−ΔTaqにより使用され得ることを予測する。こ の分析は、Sso7d−ΔTaqが、Taqに比較して、より短いプライマーを用いてアッセイにおいてより効果的であることを示す。
プライマー長アッセイを用いて、PCR増幅における短いプライマーを用いるPL−ΔTaqの能力を決定した。長いプライマー(57F及び732F)が使用 され得る場合、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の約50%である。短いプライマー(57F12及び 732R16)が使用される場合、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の20%以下である。
本発明の融合タンパク質の高められた安定性及び/又はプロセッシング性は、種々の修飾反応の実施において高められた効率を提供する。例えば、ポリメラーゼ融合タンパク質は、PCR反応においてより効果的な増幅を提供することができる。多くの因子が、PCR反応の結果、例えばプライマー特異性、ポリメラーゼの効率、鋳型の量及びGC−含有率、アンプリコンの長さ、等に影響を及ぼす。例5〜8は、熱安定性ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメインに連結される二本鎖配列−非特異的核酸結合ドメイン、例えばSso7dを包含する融合タンパク質が、PCR増幅において、修飾されていない酵素に対していくつかの好都合な特徴を有することを示す。
プライムされたDNA鋳型へのポリメラーゼの結合は、低い塩濃度でより強く、そして高い濃度でより弱い、静電相互作用のために反応緩衝液のイオン強度に対して敏感である。融合ポリメラーゼタンパク質におけるSso7dの存在は、DNA鋳型へのポリメラーゼの結合相互作用を安定化する。この例は、Sso7d融合タンパク質が、高められたKCl濃度を包含するPCR反応において改良された性能を表すことを示す。
ポリメラーゼのプロセッシング性は、重合段階の効率に直接的に影響を及ぼす。例えば、低いプロセッシング性を有するポリメラーゼは、より頻繁に解離し、そしてプライムされた鋳型に再結合するのにより時間を必要とし、ところが高いプロセッシング性を有するポリメラーゼは完全な鋳型の複製を完結するためにより少ない結合現象を必要とする。例2に示されるように、Sso7d融合タンパク質は、それらの修飾されていない対抗部分よりも有意に高いプロセッシング性を有する。
λDNA(2.25pM)を、PCR鋳型として使用した。3種のプライマー対、すなわち L71F(5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’)及びL71R(5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’)、L18015F(5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’)及び L23474R(5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’)、及び L18015F(5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’)及びL29930R(5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’)を、それぞれ、0.9kb、5.5kb、及び11.9kbのサイズのDNA フラグメントを増幅するために使用した。個々の反応は40単位/mlのポリメラーゼ(前記単位は、例2に記載のように定義された)、及び0.36mMの個 々の4種のdNTPを含んだ。
従って、融合タンパク質におけるSso7dの存在は、修飾されていないタンパク質に比較して、PCR反応において短い延長時間をもたらす。
現在、長いDNAフラグメントのPCR増幅は、非プル−フリーディングポリメラーゼ(例えば、Taq又はDyNAymeII)及び少量のプルーフリーディングポリメラーゼ(例えば、Pfu又はDeep Vent)の両者を含む酵素混合物の使用を必要とする。本発明者は、長いPCRにおいて1つの高性能の長いPCR酵素DyNAzyme EXT(Finnzymesからの)に単一の融合酵素Pfu−Sso7dを比較し、そしてPfu−Sso7dが、特に制限された延長時間を伴なって、DyNAzyme EX7より性能がすぐれていることを示した。
従って、融合ポリメラーゼPfu−Sso7dは、長いPCRにおいて、酵素混合物、例えばDyNAzyme EXTよりも単一の酵素として著しくより効果的である。
この例は、Sso7dの融合ポリメラーゼが、修飾されていないポリメラーゼに比較して、低コピー数で存在する標的物を増幅できることを示す。プラスミドDNAを、PCR鋳型として使用し、そしてT3及びT7を、500bpのフラグメントを増幅するプライマーとして使用した。プラスミドDNAの量は変化し、その結果、PCR反応に存在するDNA鋳型のコピー数は108〜1の範囲であった。サイクリングプログラムは、99℃で3分、96℃で1秒、50℃で15秒、及び68℃で30秒(25又は35サイクル)、続いて68℃で5分(1サイクル)であった。104〜108の鋳型コピー数(25μlの反応当たり)に関しては、25サイクルの増幅が行われ;1〜104の鋳型コピー数(25μlの反応数当たり)に関しては、35サイクルの増幅が行われた。
例3に示されるように、Sso7d−Δtaq融合タンパク質は、PCR増幅において高いアニーリング温度及び/又は短いプライマーを可能にするその能力により表されるように、プライマー鋳型相互作用を安定化する。融合タンパク質のこの性質がPCRにおいて非特異的増幅をもたらすかどうかを評価するために、複合DNA鋳型(例えばヒトゲノムDNA)を、標的鋳型として使用した。次の2種の例は、Pfu−Sso7dを用いて達成される増幅の特異性が最も通常に使用されるPCR酵素であるTaqほどであることを示す。
胎盤又は絨毛膜組織(Sigmaからの)からのヒト雌又は雄型DNA(濃度、1fM)を鋳型として使用した。プライマーH−Amelo−Y(5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3’)及びH−Amelo−YR(5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’)を用いて、X染色体からの212bpのアンプリコン及びY染色体からの218bpのアンプリコンを増幅した。単一の212bpのフラグメントは、雌型DNAから増幅され、そして3種のフラグメント(212bp、218bp及び212bp/218bpのヘテロ接合体)は雄型DNAから予測された。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の4種のdNTPを含んだ。
胎盤又は絨毛膜組織(Sigmaからの)からのヒトDNA(1fM)を鋳型として使用した。3種のプライマー対、すなわちBglbn536F(5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG−3’)及びBglbn536R(5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’)、Bglbn536F及びBglbn1083R、及びBglbn536及びBglbn1408R(5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’)を用いて、それぞれ0.5、1.1及び1.4kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の4種のdNTDを含んだ。Tgq及びPfu−Sso7dのための反応緩衝液は例8−1に記載されている。
5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’
配列番号14:プライマーL71R:
5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’
配列番号15:プライマーL18015F:
5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’
配列番号16:プライマーL2347R:
5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’
配列番号17:プライマーL18015F:
5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’
5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’
配列番号19:プライマーL30350F:
5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’
配列番号20:プライマーL35121R:
5’−CACATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’
配列番号21:プライマーL2089F:
5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’
配列番号22:プライマーL7112R:
5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’
配列番号23:プライマーL30350F:
5’−CCTGCCTGCCGCTTCACGC−3’
5’−CCAATACCCGTTTCATCGCGGC−3’
配列番号25:プライマーH-Amelo-Y:
5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3’
配列番号26 :プライマーH-Amelo-YR:
5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’
配列番号27 :ヒトβ−グロビンプライマー536F:
5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG−3’
配列番号28 :ヒトβ−グロビンプライマー536R:
5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’
配列番号29 :ヒトβ−グロビンプライマー1408R:
5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’
Claims (44)
- 配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合されている少なくとも2種の異種ドメインから成るタンパク質であって、前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸修飾ドメインのプロセッシング性質を増強することを特徴とするタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求項1記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する請求項1記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、サーマス(Thermus)ポリメラーゼドメインを含んで成る請求項1記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、ピロコーカス(Pyrococcus)ポリメラーゼドメインを含んで成る請求項1記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を有する請求項1記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項1記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して50%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項1記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項1記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請求項1記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、ピロコーカスポリメラーゼドメインを含んで成る請求項10記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・フリオサス(Pyrococcusfuriosus)のPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項1記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・フルオサスのPCNA相同体である請求項1記載のタンパク質。
- 配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合されている少なくとも2種の異種ドメインから成るタンパク質であって、前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少なくとも1℃安定化することを特徴とするタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求項14記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する請求項14記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を有する請求項14記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項14記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して50%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項14記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項14記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請求項14記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項14記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・フルオサスのPCNA相同体である請求項14記載のタンパク質。
- 水溶液中の核酸を修飾するための方法であって、(i)前記核酸と少なくとも2種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、a.二本鎖核酸に結合し、そしてb.それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一の酵素と比較して、前記酵素のプロセッシング性を増強し、そしてここで前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり;そして(ii)前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る方法。
- 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求項24記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する請求項24記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、サーマスポリメラーゼドメインを含んで成る請求項26記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、ピロコーカスポリメラーゼドメインを含んで成る請求項26記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼ、又は核酸と相互反応する他のプロセッシング酵素活性を有する請求項24記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項24記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して50%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項24記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項24記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請求項24記載のタンパク質。
- 核酸を修飾するための方法であって、(i)前記核酸と少なくとも2種の異種ドメインを有するタンパク質を含む水溶液とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合され、前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない他の同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少なくとも1℃安定化し、そして前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり;そして(ii)前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る方法。
- 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求項34記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する請求項34記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、サーマスポリメラーゼドメインを含んで成る請求項36記載のタンパク質。
- 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を有する請求項34記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項34記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して50%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項34記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して75%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項34記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項34記載のタンパク質。
- 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請求項34記載のタンパク質。
- ポリメラーゼ鎖反応を用いての標的核酸の副配列の修飾方法であって、(i)水溶液における前記標記核酸と請求項1又は14記載のタンパク質とを接触せしめ、ここで前記水溶液は、結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによる拡張を可能にする組成のものであり;
(ii)前記副配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20756700P | 2000-05-26 | 2000-05-26 | |
US09/640,958 US6627424B1 (en) | 2000-05-26 | 2000-08-16 | Nucleic acid modifying enzymes |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002500693A Division JP4405725B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-29 | 改良された核酸修飾酵素 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010000089A true JP2010000089A (ja) | 2010-01-07 |
Family
ID=26902363
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002500693A Expired - Lifetime JP4405725B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-29 | 改良された核酸修飾酵素 |
JP2009203587A Pending JP2010000089A (ja) | 2000-05-26 | 2009-09-03 | 改良された核酸修飾酵素 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002500693A Expired - Lifetime JP4405725B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-29 | 改良された核酸修飾酵素 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (10) | US6627424B1 (ja) |
EP (1) | EP1283875B1 (ja) |
JP (2) | JP4405725B2 (ja) |
AT (1) | ATE368104T1 (ja) |
AU (2) | AU7503901A (ja) |
CA (1) | CA2409417C (ja) |
DE (1) | DE60129549T2 (ja) |
DK (1) | DK1283875T3 (ja) |
ES (1) | ES2291322T3 (ja) |
WO (1) | WO2001092501A1 (ja) |
Families Citing this family (118)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050123940A1 (en) * | 1999-10-29 | 2005-06-09 | Stratagene California | Compositions and methods for synthesizing cDNA |
US20030228616A1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-12-11 | Stratagene | DNA polymerase mutants with reverse transcriptase activity |
US20040009486A1 (en) * | 1999-10-29 | 2004-01-15 | Sorge Joseph A. | Compositions and methods utilizing DNA polymerases |
US8268605B2 (en) | 1999-10-29 | 2012-09-18 | Agilent Technologies, Inc. | Compositions and methods utilizing DNA polymerases |
ATE395420T1 (de) * | 2000-02-17 | 2008-05-15 | Qiagen Gmbh | Thermostabile chimäre nucleinsäurepolymerasen und ihre verwendungen |
US6627424B1 (en) * | 2000-05-26 | 2003-09-30 | Mj Bioworks, Inc. | Nucleic acid modifying enzymes |
DE10049211A1 (de) * | 2000-10-05 | 2002-04-18 | Qiagen Gmbh | Thermostabile Polymerase aus Thermococcus pacificus |
WO2002044425A2 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
ES2311638T5 (es) * | 2001-11-28 | 2011-09-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Métodos de uso de polimerasas mejoradas. |
EP1456409B1 (en) * | 2001-11-28 | 2010-02-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction |
AU2003279696A1 (en) * | 2002-05-14 | 2004-02-23 | Fidelity Systems, Inc. | Helix-hairpin-helix motifs to manipulate properties of dna processing enzymes |
ATE486931T1 (de) * | 2002-07-25 | 2010-11-15 | Bio Rad Laboratories | Hybridpolymerase-verfahren und -zusammensetzungen |
US7560260B2 (en) * | 2002-07-25 | 2009-07-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions with polymerase activity |
US7666645B2 (en) | 2002-10-23 | 2010-02-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sso7-polymerase conjugate proteins |
US8283148B2 (en) | 2002-10-25 | 2012-10-09 | Agilent Technologies, Inc. | DNA polymerase compositions for quantitative PCR and methods thereof |
EP1578951A4 (en) * | 2002-10-25 | 2005-11-16 | Stratagene California | DNA POLYMERASE WITH REDUCED DETECTION ACTIVITY FOR BASE ANALOGS |
US7960157B2 (en) * | 2002-12-20 | 2011-06-14 | Agilent Technologies, Inc. | DNA polymerase blends and uses thereof |
JP4722035B2 (ja) * | 2003-03-25 | 2011-07-13 | アジレント・テクノロジーズ・インク | Dnaポリメラーゼ融合物およびその使用 |
US7417133B2 (en) * | 2004-02-27 | 2008-08-26 | Institut Pasteur | Methods for obtaining thermostable enzymes, DNA polymerase I variants from Thermus aquaticus having new catalytic activities, methods for obtaining the same, and applications of the same |
DK2332977T3 (en) * | 2004-07-23 | 2016-02-29 | Acceleron Pharma Inc | ActRII receptor polypeptides |
US20060105348A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Lee Jun E | Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
AU2006204006A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-13 | Applera Corporation | Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification |
DE602006018701D1 (de) * | 2005-01-06 | 2011-01-20 | Life Technologies Corp | Polypeptide mit nukleinsäurebindender aktivität |
WO2007050125A2 (en) * | 2005-05-27 | 2007-05-03 | William Marsh Rice University | High processivity polymerases |
WO2007008728A2 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Quanta Biosciences, Inc. | Compositions and methods for increasing amplification efficiency |
CA2615151A1 (en) * | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Stratagene California | Dna binding protein-polymerase chimeras |
US20070059713A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
EP3811965A1 (en) | 2005-11-23 | 2021-04-28 | Acceleron Pharma, Inc. | Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth |
US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
JP5106416B2 (ja) * | 2006-01-06 | 2012-12-26 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 濃縮(packed)DNAポリメラーゼを含む核酸複製のための反応緩衝液組成物 |
US8568982B2 (en) | 2006-08-09 | 2013-10-29 | National University Of Singapore | Methods of nucleic acid synthesis using particular crowding agents and concentrations |
US8895016B2 (en) * | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
ES2415666T3 (es) | 2007-02-01 | 2013-07-26 | Acceleron Pharma, Inc. | Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama |
TW202104248A (zh) | 2007-02-02 | 2021-02-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
TW201934141A (zh) | 2007-02-09 | 2019-09-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途 |
EP2207562B1 (en) | 2007-09-18 | 2017-05-31 | Acceleron Pharma, Inc. | Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion |
EP2212430B1 (en) * | 2007-11-27 | 2016-01-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Reduced inhibition of one-step rt-pcr |
US20110020877A1 (en) * | 2008-01-11 | 2011-01-27 | Genesys Limited | Cren7 chimeric protein |
GB0803628D0 (en) | 2008-02-28 | 2008-04-02 | Genesys Ltd | Enzyme |
GB0804721D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
GB0804722D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
PL2340031T4 (pl) | 2008-08-14 | 2020-12-28 | Acceleron Pharma Inc. | Zastosowanie pułapek GDF do leczenia niedokrwistości |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
JP5258512B2 (ja) * | 2008-10-30 | 2013-08-07 | 株式会社日立製作所 | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 |
JP2012507986A (ja) | 2008-11-03 | 2012-04-05 | カパバイオシステムズ | キメラdnaポリメラーゼ |
CA2742594C (en) | 2008-11-03 | 2020-03-24 | William Bourn | Modified type a dna polymerases |
CA2749093C (en) * | 2009-01-08 | 2019-03-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Exonuclease deficient hybrid polymerase and uses thereof in amplification reactions |
EP3415621A1 (en) * | 2009-03-04 | 2018-12-19 | Board Of Regents The University Of Texas System | Stabilized reverse transcriptase fusion proteins |
US9778188B2 (en) | 2009-03-11 | 2017-10-03 | Industrial Technology Research Institute | Apparatus and method for detection and discrimination molecular object |
WO2010111686A2 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Life Technologies Corp | Labeled enzyme compositions, methods & systems |
US8535925B2 (en) | 2009-04-10 | 2013-09-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Modified DNase compositions and methods of use thereof |
MX355042B (es) | 2009-06-08 | 2018-04-02 | Acceleon Pharma Inc | Metodos para aumentar adipositos termogenicos. |
EP2440577A4 (en) | 2009-06-12 | 2013-01-23 | Acceleron Pharma Inc | SHORTEN ACTRIIB FC FUSION PROTEINS |
US8889394B2 (en) * | 2009-09-07 | 2014-11-18 | Empire Technology Development Llc | Multiple domain proteins |
ES2869580T3 (es) * | 2009-09-09 | 2021-10-25 | Acceleron Pharma Inc | Antagonistas de ActRIIB y dosificación y usos de los mismos para tratar obesidad o diabetes tipo 2 regulando el contenido de grasa corporal |
CN102597006A (zh) * | 2009-09-16 | 2012-07-18 | 梅西大学 | 融合多肽以及其应用 |
CA2781152A1 (en) | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Acceleron Pharma Inc. | Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
EP3461889A1 (en) * | 2009-11-19 | 2019-04-03 | Solis Biodyne | Compositions for increasing polypeptide stability and activity, and related methods |
EP2539471B1 (en) | 2010-02-26 | 2014-08-06 | Life Technologies Corporation | Method for sequencing using a modified polymerase |
US9482615B2 (en) | 2010-03-15 | 2016-11-01 | Industrial Technology Research Institute | Single-molecule detection system and methods |
US9670243B2 (en) | 2010-06-02 | 2017-06-06 | Industrial Technology Research Institute | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
US8865078B2 (en) | 2010-06-11 | 2014-10-21 | Industrial Technology Research Institute | Apparatus for single-molecule detection |
JP5917519B2 (ja) | 2010-09-10 | 2016-05-18 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | クロマチン分析のためのdnaのサイズ選択 |
WO2012046140A1 (en) | 2010-10-05 | 2012-04-12 | Finnzymes Oy | Enzyme mixture |
WO2012064771A1 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Acceleron Pharma, Inc. | Actriia binding agents and uses thereof |
US9315787B2 (en) | 2011-01-14 | 2016-04-19 | Kapa Biosystems, Inc. | Modified DNA polymerases for improved amplification |
US9868945B2 (en) | 2011-02-08 | 2018-01-16 | Life Technologies Corporation | Linking methods, compositions, systems, kits and apparatuses |
WO2012112606A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detecting methylati0n in a subpopulation of genomic dna |
SG10201601853XA (en) | 2011-03-11 | 2016-04-28 | Univ Singapore | Pericyte progenitors from peripheral blood |
EP2694670B1 (en) | 2011-04-08 | 2017-07-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pcr reaction mixtures with decreased non-specific activity |
US8715987B2 (en) | 2011-05-02 | 2014-05-06 | New England Biolabs, Inc. | Solubilized phospholipids for stabilizing nucleic acid polymerases |
US8921044B2 (en) | 2011-05-11 | 2014-12-30 | New England Biolabs, Inc. | DNA polymerase variants with reduced exonuclease activity and uses thereof |
US8921043B2 (en) | 2011-05-11 | 2014-12-30 | New England Biolabs, Inc. | DNA polymerase variants with reduced exonuclease activity and uses thereof |
US8470573B2 (en) * | 2011-06-21 | 2013-06-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hybrid polymerases having the ability to produce long amplicons |
WO2013019960A1 (en) | 2011-08-03 | 2013-02-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Filtering small nucleic acids using permeabilized cells |
ES2884095T3 (es) | 2012-11-02 | 2021-12-10 | Celgene Corp | Antagonistas de activina-actrii y usos para el tratamiento de trastornos óseos y otros trastornos |
WO2015085230A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Fusion polymerases |
CN114699529A (zh) | 2014-06-13 | 2022-07-05 | 阿塞勒隆制药公司 | 用于治疗溃疡的方法和组合物 |
CN107075544B (zh) | 2014-07-22 | 2021-01-29 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 与聚合酶联用的缓冲液 |
WO2016028671A1 (en) * | 2014-08-19 | 2016-02-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Rna amplification methods |
MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
WO2016077795A1 (en) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Illumina, Inc. | Polymerases |
US10053676B2 (en) | 2014-11-25 | 2018-08-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Arginine improves polymerase storage stability |
SI3227675T1 (sl) | 2014-12-03 | 2023-07-31 | Celgene Corporation | Antagonisti aktivin-actrii in uporaba za zdravljenje mielodisplastičnega sindroma |
EP3712261A1 (en) | 2015-02-02 | 2020-09-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Polymerase variants and uses thereof |
WO2016134059A1 (en) | 2015-02-17 | 2016-08-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Small nucleic acid quantification using split cycle amplification |
WO2017050723A1 (en) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Genia Technologies, Inc. | Pol7 polymerase variants |
US20190055527A1 (en) * | 2015-11-27 | 2019-02-21 | Kyushu University, National University Corporation | Dna polymerase variant |
CN116144626A (zh) | 2016-01-13 | 2023-05-23 | 新英格兰生物实验室公司 | T7 rna聚合酶的热稳定变体 |
EP3402880B1 (en) | 2016-01-15 | 2024-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics UAB | Thermophilic dna polymerase mutants |
US10273530B2 (en) | 2016-01-15 | 2019-04-30 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Antibodies that bind thermophilic DNA polymerases |
WO2017148860A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-09-08 | Genia Technologies, Inc. | Polymerase-template complexes for nanopore sequencing |
ES2880331T3 (es) | 2016-02-29 | 2021-11-24 | Genia Tech Inc | Variantes de polimerasa |
WO2017148861A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-09-08 | Genia Technologies, Inc. | Exonuclease deficient polymerases |
JP6720632B2 (ja) * | 2016-03-29 | 2020-07-08 | 東洋紡株式会社 | 融合タンパク質 |
JP7157048B2 (ja) | 2016-09-22 | 2022-10-19 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | Pol6ポリメラーゼバリアント |
US11618891B2 (en) * | 2017-06-26 | 2023-04-04 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic DNA polymerase mutants |
CN111556900A (zh) | 2017-12-22 | 2020-08-18 | 赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司 | 包括胺的聚合酶链反应组合物 |
US11136565B2 (en) | 2018-09-11 | 2021-10-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified archaeal family B polymerases |
CN109266628B (zh) * | 2018-10-09 | 2020-04-14 | 南京市胸科医院 | 一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用 |
US10934533B1 (en) | 2018-10-10 | 2021-03-02 | New England Biolabs, Inc. | Variant DNA polymerases having improved properties and method for improved isothermal amplification of a target DNA |
CN109679932B (zh) * | 2018-12-05 | 2020-03-17 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用 |
CN112175091A (zh) * | 2019-07-05 | 2021-01-05 | 赛纳生物科技(北京)有限公司 | 通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法及应用 |
US11512295B2 (en) | 2019-09-12 | 2022-11-29 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified thermoccocus polymerases |
EP4103702A1 (en) | 2020-02-13 | 2022-12-21 | New England Biolabs, Inc. | Variant family d dna polymerases |
EP4103701A1 (en) | 2020-02-13 | 2022-12-21 | New England Biolabs, Inc. | Variant family d dna polymerases |
US11034942B1 (en) | 2020-02-27 | 2021-06-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified pyrococcus polymerases and uses thereof |
CN111518873B (zh) * | 2020-05-11 | 2024-07-09 | 上海羿鸣生物科技有限公司 | 一种优化的扩增目标核酸的方法及应用 |
PL241698B1 (pl) * | 2021-01-27 | 2022-11-21 | Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej | Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy |
US11486001B2 (en) | 2021-02-08 | 2022-11-01 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides |
EP4347804A1 (en) | 2021-05-27 | 2024-04-10 | New England Biolabs, Inc. | Dnase i variants, compositions, methods, and kits |
EP4095254A3 (en) | 2021-05-27 | 2022-12-14 | New England Biolabs, Inc. | Fragmentation of dna |
US11993792B2 (en) | 2021-05-27 | 2024-05-28 | New England Biolabs, Inc. | DNase I variants, compositions, methods, and kits |
WO2022249133A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Erebus Enzymes Inc. | Ultra-processive, stutter-resistant polymerase system |
EP4399292A2 (en) | 2021-09-08 | 2024-07-17 | Flagship Pioneering Innovations VI, LLC | Methods and compositions for modulating a genome |
WO2023089175A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable polymerase variants |
WO2023146243A1 (ko) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | 주식회사 씨젠 | 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법 |
US20240263158A1 (en) | 2023-02-01 | 2024-08-08 | New England Biolabs, Inc. | Duplex-specific dnases |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997029209A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | President And Fellows Of Harvard College | Dna polymerase with modified processivity |
JPH1189588A (ja) * | 1997-07-09 | 1999-04-06 | F Hoffmann La Roche Ag | 変性キメラdnaポリメラーゼ |
WO2000008164A2 (de) * | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Lion Bioscience Ag | Thermostabiler in vitro-komplex mit polymeraseaktivität |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2069948A1 (en) | 1989-12-01 | 1991-06-02 | Brian Wylie Pontius | Promotion of high specificity molecular assembly |
US5747911A (en) | 1994-09-30 | 1998-05-05 | Itt Automotive Electrical Systems, Inc. | Brush holder |
DE19810879A1 (de) * | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymerasenchimären |
DE19840771A1 (de) * | 1998-08-06 | 2000-02-10 | Lion Bioscience Ag | Thermostabiler in vitro-Komplex mit Polymeraseaktivität |
ATE395420T1 (de) | 2000-02-17 | 2008-05-15 | Qiagen Gmbh | Thermostabile chimäre nucleinsäurepolymerasen und ihre verwendungen |
US6627424B1 (en) * | 2000-05-26 | 2003-09-30 | Mj Bioworks, Inc. | Nucleic acid modifying enzymes |
-
2000
- 2000-08-16 US US09/640,958 patent/US6627424B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-05-29 WO PCT/US2001/017492 patent/WO2001092501A1/en active IP Right Grant
- 2001-05-29 DE DE60129549T patent/DE60129549T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 AU AU7503901A patent/AU7503901A/xx active Pending
- 2001-05-29 AU AU2001275039A patent/AU2001275039B2/en not_active Expired
- 2001-05-29 AT AT01941707T patent/ATE368104T1/de active
- 2001-05-29 ES ES01941707T patent/ES2291322T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 DK DK01941707T patent/DK1283875T3/da active
- 2001-05-29 JP JP2002500693A patent/JP4405725B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 EP EP01941707A patent/EP1283875B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 CA CA2409417A patent/CA2409417C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-30 US US09/870,353 patent/US7541170B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-27 US US10/256,705 patent/US7919296B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-04-09 US US10/821,583 patent/US7670808B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-09-03 JP JP2009203587A patent/JP2010000089A/ja active Pending
-
2011
- 2011-03-14 US US13/047,638 patent/US8415129B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-03-25 US US13/850,048 patent/US8895283B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2013-10-18 US US14/058,044 patent/US8900846B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-11-17 US US14/543,625 patent/US9453208B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-09-13 US US15/264,345 patent/US10066218B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2018
- 2018-08-13 US US16/101,895 patent/US10954495B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997029209A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | President And Fellows Of Harvard College | Dna polymerase with modified processivity |
JPH1189588A (ja) * | 1997-07-09 | 1999-04-06 | F Hoffmann La Roche Ag | 変性キメラdnaポリメラーゼ |
WO2000008164A2 (de) * | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Lion Bioscience Ag | Thermostabiler in vitro-komplex mit polymeraseaktivität |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4405725B2 (ja) | 改良された核酸修飾酵素 | |
US11208635B2 (en) | Compositions with polymerase activity | |
AU2001275039A1 (en) | Improved nucleic acid modifying enzymes | |
EP2723880B1 (en) | Hybrid polymerases having the ability to produce long amplicons | |
JP2010166918A (ja) | 改良型Sso7−ポリメラーゼ複合体タンパク質 | |
EP1832652B1 (en) | Improved nucleic acid modifying enzymes | |
AU2006228065A1 (en) | Improved nucleic acid modifying enzymes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091002 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091002 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111004 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111228 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120106 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120605 |