ES2291322T3

ES2291322T3 - Enzimas modificadoras de acido nucleico mejoradas.

Info

Publication number: ES2291322T3
Application number: ES01941707T
Authority: ES
Inventors: Yan Wang
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2021-05-29
Also published as: CA2409417C; JP2003534796A; US8415129B2; DE60129549D1; US20170198267A1; US10954495B2; JP4405725B2; US20040191825A1; US9453208B2; AU7503901A; CA2409417A1; US20150218536A1; US6627424B1; US7670808B2; US8895283B2; US7541170B2; DK1283875T3; US20030148330A1; EP1283875B1; US10066218B2

Abstract

Proteína que comprende por los menos dos dominios heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia que se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d o contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d, se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador de ácido nucleico que tiene una naturaleza procesiva, donde la presencia del dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia aumenta la naturaleza procesiva del dominio modificador de ácido nucleico en comparación con una proteína idéntica que no tiene un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia unido a la misma.

Description

Enzimas modificadoras de ácido nucleico mejoradas.

Campo de la invención

La presente invención proporciona una generación de enzimas modificadoras de ácido nucleico mejoradas. La mejora es la unión de un dominio de unión a un ácido nucleico no específico de secuencia con la enzima de manera que mejora la capacidad de la enzima de unirse y modificar catalíticamente el ácido nucleico.

Antecedentes de la invención

La eficacia de una enzima modificadora del ácido nucleico, es decir, la cantidad de producto modificado generado por la enzima por proceso de unión se puede aumentar mediante el incremento de la estabilidad del complejo enzima modificadora/ácido nucleico. La técnica anterior ha sugerido que la unión de un sitio de unión de alta probabilidad, por ejemplo, una cola de unión cargada positivamente a una enzima modificadora del ácido nucleico puede aumentar la frecuencia con la que la enzima modificadora interacciona con el ácido nucleico (véase, por ejemplo, Patente U.S.A. No. 5.474.911).

El documento DE 19840771 se refiere a un complejo termoestable in vitro para la elongación dependiente de plantilla de ácidos nucleicos que comprende una proteína "abrazadera deslizante" termoestable que se afirma que se acopla con una proteína de elongación que muestra actividad de polimerasa termoestable.

Robinson et al. (1998) Nature 392: 202-205 se refiere a las proteínas cromosómicas Sac7d y Sso7d de Sulfolobus acidolcaldarius y solfactaricus, respectivamente. En el mismo se indica que Sac7d plega bruscamente el ADN.

La presente invención proporciona ahora enzimas modificadoras nuevas en las que la conformación de doble cadena del ácido nucleico se estabiliza y aumenta la eficacia de la enzima mediante la unión de un dominio de unión a un ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia a la enzima, o a su dominio catalítico. Las proteínas modificadoras que son procesivas en la naturaleza muestran una mayor procesividad cuando se unen a un dominio de unión en comparación con la enzima sola. Además, las enzimas modificadoras tanto procesivas como no procesivas muestran un aumento de la eficacia a temperaturas más elevadas cuando se unen a un dominio de unión habitual descrito en la presente invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona polimerasas de fusión que proporcionan un aumento de la capacidad para realizar PCR largas, es decir, la amplificación de secuencias de 5 kb o mayores de longitud. La mezcla de polimerasas para realizar PCR largas es conocida en la técnica. Una dificultad con dichas mezclas es que se requieren tiempos de extensión largos para rendimientos óptimos de los productos esperados. Las recomendaciones convencionales son dejar tiempos de extensión de 1 minuto por kb. Para un producto de 10 kb y utilizando 40 ciclos de amplificación, la PCR requiere aproximadamente 7 horas. En la presente invención se describen enzimas polimerasas modificadas que muestran una mayor capacidad de realizar PCR largas en comparación con aquellas polimerasas y/o mezclas de polimerasas actualmente disponibles. Estas enzimas modificadas, por ejemplo, Pfu-Sso7d incorporan una polimerasa con una actividad de corrección de errores y un dominio de unión a ADN de doble cadena no específico de secuencia y, por lo tanto, proporcionan la capacidad de la PCR de amplificar el ADN en más de 5 kb sin necesidad de recurrir a mezclas de polimerasas. Además, dichas enzimas modificadas pueden amplificar de manera eficaz un fragmento determinado utilizando tiempos de extensión más cortos que los requeridos mediante mezclas de polimerasas convencionales. De este modo, la utilización de las polimerasas híbridas descritas en la presente invención en lugar de las mezclas convencionales puede disminuir ampliamente el tiempo de reacción requerido para amplificar fragmentos grandes, por ejemplo, de aproximadamente siete horas a aproximadamente dos horas.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona una proteína que consiste en, como mínimo, dos dominios heterólogos en la que un primer dominio que es un dominio de -anión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador del ácido nucleico que tiene una naturaleza procesiva, donde la presencia del dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia aumenta la naturaleza procesiva del dominio modificador del ácido nucleico en comparación con una proteína idéntica que no tiene un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia unido a la misma. En un aspecto de la presente invención, el dominio modificador del ácido nucleico puede tener actividad polimerasa, que puede ser térmicamente estable, por ejemplo, un dominio polimerasa de Thermus. En realizaciones alternativas, el dominio catalítico es una ARN polimerasa, una transcriptasa inversa, una metilasa, una exonucleasa 3' ó 5', una girasa o una topoisomerasa.

El dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia de la proteína puede unirse específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d. Alternativamente, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia puede contener una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene una similitud de aminoácidos del 50% con Sso7d. El dominio de unión al ácido nucleico también puede ser Sso7d.

En otra realización, una proteína de la presente invención contiene un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia que se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra un homólogo PCNA de Pyrococcus furiosus o puede ser un homólogo PCNA de Pyrococcus furiosus.

En la presente invención se describe una proteína de por lo menos dos dominios heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador del ácido nucleico, donde la presencia de:L dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia estabiliza la conformación de doble cadena de un ácido nucleico en por lo menos 1°C en comparación con una proteína idéntica que no tiene un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia unido a la misma. El dominio modificador del ácido nucleico de dicha proteína puede tener actividad polimerasa, que puede ser térmicamente estable. El dominio modificador del ácido nucleico también puede tener actividad
ARN polimerasa, una transcriptasa inversa, una metilasa, una exonucleasa 3' ó 5', una girasa o una topoisomerasa.

En realizaciones adicionales, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se puede unir específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d, frecuentemente Sso7d, o contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% o un 75% de similitud de aminoácidos con Sso7d. Frecuentemente, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sso7d.

Las proteínas de la presente invención incluyen una proteína en la que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se une a anticuerpos policlonales generados contra el homólogo PCNA de Pyrococcus furiosus; frecuentemente, el dominio de unión es el homólogo PCNA de Pyrococcus furiosus.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de modificación de ácidos nucleicos utilizando las proteínas. Una realización es un método de modificación de un ácido nucleico en una solución acuosa mediante: (i) poner en contacto el ácido nucleico con una proteína que comprende por lo menos dos dominios heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia que se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d o contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d, se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador de ácido nucleico que tiene una naturaleza procesiva, donde el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia: a. se une a ácido nucleico de doble cadena, y b. aumenta la procesividad de la enzima en comparación con una enzima idéntica que no tiene el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia fusionado a la misma, y en donde la solución está a una temperatura y es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico y la enzima actúe de forma catalítica, y (ii) permitir que el dominio catalítico modifique el ácido nucleico en la solución.

En la presente invención se describe un método de modificación de un ácido nucleico mediante: (i) poner en contacto el ácido nucleico con una solución acuosa que contiene una proteína que tiene por lo menos dos dominios heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador del ácido nucleico, donde la presencia del dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia estabiliza la formación de un ácido nucleico de doble cadena en comparación con una proteína que es idéntico a excepción de que no tiene el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia unida a la misma; y donde la solución está a una temperatura y es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico y la enzima actúe de forma catalítica, y (ii) permitir que el dominio catalítico modifique el ácido nucleico en la solución. Los métodos de modificación de un ácido nucleico pueden utilizar cualquiera de las realizaciones de las proteínas descritas en la presente invención.

También se describe un método de amplificación de una subsecuencia de 5 kb o más larga de un ácido nucleico diana en una solución acuosa utilizando una reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo el método: (i) poner en contacto el ácido nucleico diana con una proteína que comprende por lo menos dos dominio heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se une a un segundo dominio que es un dominio polimerasa con actividad de corrección de errores, donde el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia: (a) se une a ácido nucleico de doble cadena, y (b) aumenta la procesividad de la polimerasa en comparación con una polimerasa idéntica que no tiene el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia fusionado a la misma, y en donde la solución es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico diana y el dominio polimerasa extienda un cebador que se hibrida a la secuencia del ácido nucleico diana hasta una longitud de 5 kb o mas larga, (ii) incubar la solución utilizando un perfil de temperaturas de la reacción en cadena de la polimerasa que amplifica la subsecuencia de 5 kb o más larga. En una realización del método, el dominio modificador del ácido nucleico tiene actividad polimerasa térmicamente estable. Frecuentemente, el dominio modificador del ácido nucleico comprende un dominio polimerasa de Pyrococcus. En otras realizaciones del método, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d, contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d, o se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sso7d. En otra realización, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sso7d.

También se describe un método de amplificación de una subsecuencia de un ácido nucleico diana en una solución acuosa utilizando una reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo el método: (i) poner en contacto el ácido nucleico diana con una proteína que comprende por lo menos dos dominio heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se une a un segundo dominio que es un dominio polimerasa con actividad de corrección de errores, donde el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia: (a) se une a ácido nucleico de doble cadena, y (b) aumenta la procesividad de la polimerasa en comparación con una polimerasa idéntica que no tiene el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia fusionado a la misma, y en donde la solución comprende 10^{5} o menos copias/ml del ácido nucleico diana y es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico diana y el dominio polimerasa extienda un cebador que se hibrida a la secuencia del ácido nucleico diana; (ii) incubar la solución utilizando un perfil de temperaturas de la reacción en cadena de la polimerasa que amplifica la subsecuencia. En una realización del método, el dominio modificador del ácido nucleico tiene actividad polimerasa térmicamente estable. Frecuentemente, el dominio modificador del ácido nucleico comprende un dominio polimerasa de Pyrococcus. En otras realizaciones del método, el dominio de unión a ácido nucleico -lo específico de secuencia se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d, contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d, o se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sso7d. En otra realización, el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sso7d.

Definiciones

"Proteína básica pequeña de unión a ADN de Archaea" se refiere a una proteína de entre 50 y 75 aminoácidos que tiene un 50% de homología con una proteína básica pequeña de unión a ADN de Archaea natural, tal como Sso-7d de Sulfolobus sulfataricus o se une a anticuerpos generados contra una proteína básica pequeña de unión a ADN de Archaea nativa.

"Dominios catalíticos modificadores de ácido nucleico que tienen una naturaleza procesiva" se refiere a una secuencia o subsecuencia de proteínas que actúan como una enzima que tiene la capacidad de deslizarse a lo largo de la longitud de una molécula de ácido nucleico y alteran químicamente su estructura de forma repetitiva. Un dominio catalítico puede incluir una enzima completa, una subsecuencia de la misma, o puede incluir secuencias de aminoácidos adicionales que no están unidos a la enzima o subsecuencia tal como se encuentran en la naturaleza.

"Dominio" se refiere a una unidad de una proteína o complejo de proteínas, que comprende una subsecuencia de polipéptido, una secuencia de polipéptido completa, o un conjunto de secuencias de polipéptidos donde esa unidad tiene una función definida. La función se entiende que se define ampliamente y puede ser de unión a ligando, actividad catalítica o puede tener un efecto estabilizador sobre la estructura de la proteína.

"Eficacia" en el contexto de una enzima modificadora de ácido nucleico de la presente invención se refiere a la capacidad de la enzima para realizar su función catalítica en condiciones de reacción específicas. Habitualmente, "eficacia" tal como se define en la presente invención está indicada por la cantidad de bases modificadas generadas por la enzima modificadora por unión a ácido nucleico.

"Aumenta" en el contexto de una enzima se refiere a la mejora de la actividad de la enzima, es decir, el aumento de la cantidad de producto por unidad de enzima por unidad de tiempo.

"Fusionado" se refiere a la unión mediante enlace covalente.

"Heterólogas" cuando se utiliza en referencia a las partes de una proteína, indica que la proteína comprende dos o más dominios que no se hallan en la misma relación entre sí con la naturaleza. Dicha proteína, por ejemplo, una proteína de fusión, contiene dos o más dominios de proteínas no relacionadas dispuestas para fabricar una nueva proteína funcional.

"Unión" se refiere a cualquier procedimiento conocido en la técnica para conectar funcionalmente los dominios de proteínas, incluyendo, pero sin limitación, la fusión recombinante con o sin dominios intermedios, fusión mediada por inteínas, asociación no covalente y enlace covalente, incluyendo enlace disulfuro; enlace de hidrógeno; enlace electrostático; y enlace conformacional, por ejemplo, las asociaciones anticuerpo-antígeno y biotina-avidina.

"Metilasa" se refiere a una enzima que puede modificar un ácido nucleico mediante la adición de un grupo metilo a un nucleótido.

"Nucleasa" se refiere a una enzima capaz de romper los enlaces fosfodiéster entre subunidades de nucleótidos de ácidos nucleicos.

"Enzima modificadora de ácido nucleico" se refiere a una enzima que altera covalentemente un ácido nucleico.

"Polimerasa" se refiere a una enzima que realiza una síntesis dirigida por plantilla de polinucleótidos.

"Actividad de corrección de errores" de una polimerasa o de un dominio de polimerasa se refiere a la actividad de corrección de lectura de exonucleasa de 3' a 5' de una ácido nucleico polimerasa específica de plantilla por la que los nucleótidos que no forman pares de bases de Watson-Crick con la plantilla se eliminan del extremo 3' de un oligonucleótido, es decir, una cadena sintetizada a partir de una plantilla de manera secuencial. Entre los ejemplos de polimerasas que tienen actividad de corrección de errores se incluyen polimerasas de Pyrococcus furiosus, Thermococcus litorales y Thermotoga maritima.

"Procesividad" se refiere a la capacidad de una enzima modificadora de ácido nucleico paca permanecer unida a la plantilla o al sustrato y realizar múltiples reacciones de modificación. Habitualmente "procesividad" se refiere a la capacidad para modificar tramos relativamente largos de ácido nucleico.

"Endonucleasa de restricción" se refiere a cualquier grupo de enzimas, producidas por bacterias que rompen internamente las moléculas de ADN en secuencias de bases específicas.

"Dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia" se refiere a un dominio de proteína que se une con afinidad significativa a un ácido nucleico, por el que no existe un ácido nucleico conocido que se una al dominio de proteína con más de 100 veces más afinidad que otro ácido nucleico con la misma composición de nucleótidos pero con una secuencia de nucleótidos diferente.

"Polimerasa térmicamente estable", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a cualquier enzima que cataliza la síntesis de nucleótidos mediante la adición de unidades de nucleótidos a una cadena de nucleótidos utilizando ADN o ARN como plantilla y tiene una actividad óptima a una temperatura por encima de 45°C.

"Polimerasa de Thermus" se refiere a una ADN polimerasa de la familia A aislada de cualquier especie Thermus, incluyendo sin limitación, Thermus aquaticus, Thermus brockianus y Thermus thermophilus; cualquier enzima recombinante que deriva de la especie Thermus, y cualquier derivado funcional de la misma, tanto si está derivado por modificación genética o modificación química u otros procedimientos conocidos en la técnica.

"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento mediante el cual se amplifica un segmento o subsecuencia específica de un ADN de doble cadena diana en progresión geométrica. La PCR es conocida para los expertos en la materia; véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.683.195 y 4.E83.202 y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., 1990.

"PCR larga" se refiere a la amplificación de un fragmento de ADN de una longitud de 5 kb o más largos. La PCR larga se realiza habitualmente utilizando las polimerasas o mezclas de polimerasas especialmente adaptadas (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.436.149 y 5.512.462) que son diferentes de las polimerasas convencionalmente utilizadas para amplificar productos más cortos.

Un "cebador" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se hibrida a una secuencia en un ácido nucleico diana y sirve como punto de iniciación de la síntesis de ácidos nucleicos. Los cebadores pueden tener una variedad de longitudes y frecuentemente tienen una longitud inferior a 50 nucleótidos, por ejemplo una longitud de 12-25 nucleótidos. La longitud y las secuencias de cebadores para utilizar en la PCR se pueden diseñar en base a los principios conocidos por los expertos en la materia, véase, por ejemplo, Innis et al., supra.

Un "perfil de temperaturas" se refiere a la temperatura y longitudes de tiempo de las etapas de desnaturalización, hibridación y/o extensión de una reacción de PCR. Un perfil de temperaturas para una reacción de PCR consiste habitualmente de 10 a 60 repeticiones de perfiles de temperaturas más cortos similares o idénticos; cada uno de estos perfiles más cortos habitualmente define una reacción de PCR de dos o tres etapas. La selección de un "perfil de temperaturas" se basa en varias consideraciones conocidas por los expertos en la materia, véase, por ejemplo, Innis et al., supra. En una reacción de PCR larga tal y como se describe en la presente invención, el tiempo de extensión requerido para obtener un producto de amplificación de una longitud de 5 kb o más larga se reduce en comparación. a mezclas de polimerasas convencionales.

"Sensibilidad" de la PCR se refiere a. la capacidad de amplificar un ácido nucleico diana que está presente en un número de copias bajo. "Número de copias bajo" se refiere a 10^{5}, frecuentemente 10^{4}, 10^{3}, 10^{2} o menos copias de la secuencia diana en la muestra de ácidos nucleicos a amplificar.

Una "plantilla" se refiere a una secuencia de polinucleótidos de doble cadena que comprende el polinucleótido a amplificar, flanqueado por sitios de hibridación con cebadores. De este modo, una "plantilla diana" comprende la secuencia de nucleótidos diana flanqueada por sitios de hibridación para un cebador 5' y un cebador 3'.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1a-c muestran los resultados de las reacciones de amplificación por PCR realizada utilizando cebadores de diferente longitud para comparar la eficacia de polimerasa modificada con Sso7d con la polimerasa de longitud completa no modificada.

La figura 2 muestra los resultados de una reacción de amplificación por PCR que utiliza un cebador directo de 12 nucleótidos para evaluar los productos de la PCR generados utilizando Sac7d-\DeltaTaq en comparación con Taq.

La figura 3 muestra los resultados de las reacciones de amplificación por PCR que demuestran que Pfu-Sso7d es más eficaz que DyNAzyme EXT en PCR larga.

Descripción detallada Introducción

La presente invención es el descubrimiento de que las proteínas de unión al ácido nucleico de dobla cadena no específico de secuencia se pueden unir a proteínas catalíticas modificadoras de ácido nucleico para aumentar la naturaleza procesiva de la proteína catalítica. Aunque la técnica anterior enseñaba que las proteínas de unión a ácido nucleico pueden aumentar la afinidad de unión de enzimas al ácido nucleico, el grupo de proteínas de unión que tienes la capacidad de aumentar la naturaleza procesiva de las enzimas es particularmente valioso. Sin estar unido por ninguna teoría, los dominios de unión de la presente invención se disocian habitualmente del ácido nucleico de doble cadena a una velocidad muy baja. De este modo, aumentan la procesividad y/o eficacia de una enzima modificadora a la que se unen mediante la estabilización del complejo enzima-ácido nucleico. Por consiguiente, la presente invención incluye el descubrimiento de que los dominios de unión a ADN pueden estabilizar la conformación de doble cadena de un ácido nucleico y aumentar la eficacia de un dominio catalítico que requiere un sustrato de doble cadena. En la presente invención se describen ejemplos y ensayos simples para determinar fácilmente la mejora en la naturaleza catalítica y/o procesiva de las enzimas catalíticas modificadoras del ácido nucleico.

Dominios catalíticos modificadores del ácido nucleico

Un dominio catalítico modificador de ácido nucleico es la región de una enzima de modificación que realiza la función enzimática. Los dominios catalíticos modificadores de ácido nucleico se la presente invención puede ser procesiva, por ejemplo, polimerasa, exonucleasa, etc., o no procesiva, por ejemplo, ligasas, endonucleasas de restricción, etc.

La procesividad refleja la capacidad de una enzima modificadora de ácido nucleico para sintetizar o realizar múltiples modificaciones, por ejemplo, adiciones de nucleótidos o metilaciones en una única unión. Las proteínas procesivas de la presente invención muestran una mayor procesividad debido a la presencia de un dominio de unión a ADN de doble cadena no específica de secuencia que se une a la enzima modificadora procesiva (o al dominio enzimático de la enzima modificadora), proporcionando de esta manera un dominio de unión para estabilizar el complejo ácido nucleico/enzima. Frecuentemente, el dominio de unión es de un organismo termoestable y proporciona un aumento de actividad a temperaturas más elevadas, por ejemplo, temperaturas por encima de 45°C. Entre los ejemplos de enzimas modificadoras procesivas se incluyen Adn polimerasas, Arn polimerasas, transcriptasas inversas, metilasas, 3' ó 5' exonucleasas, girasas o topoisomerasas.

Polimerasas

Las ADN polimerasas son bien conocidas para los expertos en la materia. Entre éstas se incluyen tanto polimerasas dependientes de ADN como polimerasa dependientes de ARN, tales como la transcriptasa inversa. Se conocen por lo menos cinco familias de ADN polimerasas dependientes de ADN, aunque la mayoría están en las familias A, B y C. No existe una similitud en la estructura o la secuencia, o bien, muy pequeña entre las diversas familias. La mayoría de las polimerasas de la familia A son proteínas de cadena única que pueden contener múltiples funciones enzimáticas, incluyendo polimerasa, actividad exonucleasa de 3' a 5' y actividad exonucleasa de 5' a 3', así como factores de acceso. Las polimerasas de la familia C son habitualmente proteínas con multisubunidades con actividad polimerizante y de exonucleasa de 3' a 5'. En E. Coli, se han observado tres tipos de ADN polimerasas, ADN polimerasas I (familia A), II (familia B) y III (familia C). En células eucariotas, tres polimerasas de la familia B diferentes, las ADN polimerasas \alpha, \delta y \varepsilon, están implicadas en la replicación nuclear, y se utiliza una polimerasa de la familia A, la polimerasa \gamma, para la replicación del ADN mitocondrial. Otros tipos de ADN polimerasas incluyen polimerasas de fagos.

De manera similar, la ARN polimerasa incluye habitualmente las ARN polimerasas eucariotas I, II y III, y ARN polimerasas bacterianas, así como polimerasas de fagos y virus. Las ARN polimerasas pueden ser dependientes de ADN y dependientes de ARN.

En una realización, los dominios de polimerasa que tiene una actividad de corrección de errores se utilizan como el dominio catalítico de las polimerasas mejoradas descritas en la presente invención. Estas polimerasas se pueden utilizar para obtener productos de PCR largos, es decir de una longitud de 5 kb, frecuentemente de 10 kb, o superiores. La "PCR larga" que utiliza estas polimerasas mejoradas se puede realizar utilizando tiempo de extensión que se reducen en comparación con la polimerasa y/o mezclas de polimerasas de la "POR larga" de la técnica anterior. Los tiempos de extensión de menos de 30 segundos/kb, frecuentemente 15 segundos por kb se pueden utilizar para amplificar productos largos en reacciones de PCR utilizando las polimerasas mejoradas. Además, estas polimerasas mejoradas también muestran una mayor sensibilidad.

Las polimerasas no correctoras de errores de la técnica anterior, tal como Taq polimerasa, san capaces de amplificar el ADN a partir de concentraciones de copias de entrada muy pequeñas, tales como en el extremo, 10 copias por ml. Sin embargo, debido a la baja fidelidad de dichas polimerasas, los productos clonados de dichas amplificaciones es probable que contengan mutaciones introducidas.

Las polimerasas correctoras de errores de la técnica anterior, tales como Pfu, copian el ADN con una mayor fidelidad que Taq, pero no son capaces de amplificar el ADN a partir de concentraciones de copias de entrada pequeñas. La explicación más probable para dicha disfunción es la procesividad muy baja de Estas enzimas. Las polimerasas correctoras de errores híbridas de la presente invención muestran una procesividad mucho más elevada a la vez que mantienen la actividad de corrección de errores y proporcionan, de este modo, tanto sensibilidad como fidelidad en las reacciones de amplificación.

Otras enzimas modificadoras

Habitualmente, las ADN girasas y topoisomerasas juegan un papel en órdenes superiores de las estructuras de ADN, tales como el superenrollamiento. Las ADN girasas introducen superenrollamientos negativos. En procariotas, la subunidad A es responsable del corte y reunión del ADN y la subunidad B contiene la actividad de hidrólisis de ATP. La ADN girasa introduce el superenrollamiento procesivamente y catalíticamente, introduciendo habitualmente hasta 100 superenrollamientos por minuto por molécula de ADN girasa. En ausencia de ATP, la girasa relajará lentamente los superenrollamientos negativos.

Las topoisomerasas son enzimas que se encuentran en procariotas y eucariotas que catalizan la interconversión de diferentes isómeros topológicos de ADN, provocando de este modo un cambio en el número de uniones. Las topoisomerasas pueden eliminar del ADN los superenrollamientos negativos o positivos o pueden introducir superenrollamientos negativos.

En la técnica también se describen una diversidad de metilasas y 3' ó 5' exonucleasas incluyendo enzimas bacterianas, procariotas, eucariotas y de fago. Habitualmente, las exonucleasas, tales como exonucleasa lambda, y algunas metilasas también son procesivas.

La actividad de una subunidad catalítica se puede medir utilizando ensayos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, una actividad enzimática procesiva, tal como una actividad de polimerasa, se puede medir mediante la determinación de la cantidad de ácido nucleico sintetizado en una reacción, tal como una reacción en cadena de la polimerasa. En la determinación de la eficacia relativa de la enzima, la cantidad de producto obtenido con una enzima modificadora de la presente invención, por ejemplo, una polimerasa que contiene un dominio de unión a ADN de doble cadena no específico de secuencia, se puede comparar entonces con la cantidad de producto obtenido con la enzima modificadora normal, que se describirá detalladamente a continuación y en los Ejemplos.

Las enzimas modificadoras, tales como ligasas o endonucleasas de restricción, se unen a ácidos nucleicos de doble cadena para realizar la función modificadora. La actividad catalítica se mide habitualmente mediante la determinación de la cantidad de producto modificado producido en condiciones de ensayo particulares. Por ejemplo, la actividad de ligasa se puede ensayar mediante la determinación de la cantidad de plásmido circularizado, que se había digerido previamente con una endonucleasa de restricción para generar extremos compatibles, en una reacción de ligación después de la incubación mediante la cuantificación del número de transformantes obtenidos con una alícuota de la reacción de ligación. La actividad de una endonucleasa de restricción se puede determinar mediante la extensión de la digestión del ADN diana, por ejemplo, mediante el análisis de la extensión de la digestión del ADN en un gel.

Un dominio modificador catalítico adecuado para su utilización en la presente invención puede ser la propia enzima modificadora o el dominio modificador catalítico, por ejemplo, Taq polimerasa o un dominio de Taq con actividad de polimerasa. El dominio catalítico puede incluir aminoácidos adicionales y/o puede ser una variante que contiene sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, pero aún mantiene la actividad enzimática.

Dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia

Un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia es una proteína o región definida de una proteína que se une al ácido nucleico de doble cadena de forma independiente de la secuencia, es decir, la unión no muestra una gran preferencia por una secuencia particular. Habitualmente, las proteínas de unión a ácido nucleico de doble cadena muestran una afinidad 10 veces o superior por los ácidos nucleicos de doble cadena frente a los de cadena única. Las proteínas de unión a ácido nucleico de doble cadena en realizaciones particulares de la presente invención son preferiblemente termoestables. Entre los ejemplos de dichas proteínas se incluyen, pero no se limitan a, las proteínas básicas pequeñas de unión a ADN de Arquea Sac7d y Sso7d (véase, por ejemplo, Choli et al., Biochimica et Biophysica Acta 950: 193-203, 1988; Baumann et al., Structural Biol. 1: 808-819,1994; y Gao et al, Nature Struc. Biol. 5: 782-786, 1998), proteínas de tipo HMf de Arquea (véase, por ejemplo, Starich et al., J. Molec. Biol. 255: 187-203, 1996; Sandman et al., Gene 150: 207-208,1994), y homólogos de PCNA (véase, por ejemplo, Cann et al., J. Bacteriology 181: 6591-6599, 1999; Shamoo y Steitz, Cell: 99, 155-166, 1999; De Felice et al., J. Molec. Biol. 291, 47-57, 1999; y Zhang et al., Biochemistry 34: 10703-10712, 1995).

Sso7d y Sac7d

Sso7d y Sac7d son proteínas cromosómicas básicas pequeñas (aproximadamente 7000 kd de PM) de las arqueobacterias Sulfolobus solfataricus y S. acidocaldarius, respectivamente. Estas proteínas son ricas en lisina y tienen una estabilidad térmica, ácida y química elevada. Se unen a ADN de una manera independiente de la secuencia y cuando se une, aumenta la T_{F} de ADN de hasta 40°C bajo algunas condiciones (McAfee et al., Biochemistry 34: 10063-10077, 1995). Estas proteínas y sus homólogos se cree que habitualmente están implicadas en la estabilización de ADN genómico a temperaturas elevadas.

Proteínas tipo HMF

Las proteínas tipo HMf son histonas de arquea que comparten homología tanto en la secuencia de aminoácidos como en la estructura con histonas eucariotas H4, que se cree que interaccionan directamente con ADN. La familia de proteínas HMf forman dímeros estables en solución, y se han identificado varios homólogos de HMf de especies termoestables (por ejemplo, Methanothermus fervidus y cepa GB-3a de Pyrococcus). La familia HMf de proteínas, una vez unidas a Taq ADN polimerasa o cualquier enzima modificadora de ADN con una procesividad intrínseca baja, puede aumentar la capacidad de la enzima para deslizarse a lo largo del sustrato de ADN y, de este modo, aumenta la procesividad. Por ejemplo, la proteína de tipo HMf dimérica se puede unir covalentemente al extremo N terminal de la Taq ADN polimerasa, por ejemplo, mediante modificación química y, de este modo, mejora la procesividad de la polimerasa.

Homólogos de PCNA

Muchas, pero no todas las ADN polimerasas de la familia B, interaccionan con proteínas accesorias para conseguir una síntesis de ADN altamente procesiva. A una clase particularmente importante de proteínas accesorias se hace referencia como abrazadera deslizante. Varias abrazaderas deslizantes caracterizadas existen como trímeros en solución, y pueden formar una estructura de tipo anillo con un pasaje central capaz de acomodarse al ADN de doble cadena. La abrazadera deslizante forma interacciones específicas con los aminoácidos localizados en el extremo C terminal de las ADN polimerasas particulares, y une las polimerasas a la plantilla de ADN durante la replicación. A la abrazadera deslizante en los eucariotas se hace referencia como antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), mientras que a proteínas similares en otros dominios se hace referencia frecuentemente como homólogos de PCNA. Estos homólogos tienen una similitud estructural notable pero una similitud de secuencia limitada.

Recientemente, se han identificado homólogos de PCNA de Archaea termofílica (por ejemplo, Sulfalobus sofataricus, Pyrococcus furiosus, etc.). Algunas polimerasas de la familia B en Archaea tienen un extremo C terminal que contiene una secuencia de aminoácidos de consenso de interacción con PCNA y son capaces de utilizar un homólogo de PCNA como factor de procesividad (véase, por ejemplo, Cann et al., J. Bacterial. 181: 6591-6599, 1999 y De Felice et al., J. Mol. Biol. 291: 47-57, 1999). Estos homólogos de PCNA son dominios de unión a ADN de doble cadena no específicos de secuencia útiles para la presente invención. Por ejemplo, una secuencia de consenso de interacción con PCNA se puede unir a una polimerasa que no interacciona de forma natural con un homólogo de PCNA, permitiendo de este modo que un homólogo de PCNA sirva como factor de procesividad para la polimerasa. A modo de ilustración, la secuencia de interacción con PCNA de PoIII de Pyrococcus furiosus (una ADN polimerasa heterodimérica que contiene dos polipéptidos del tipo de la familia B) se puede unir de forma covalente a PoII de Pyrococcus furiostis (una polimerasa monomérica de la familia B que no interacciona normalmente con un homólogo de PCNA). A continuación, la proteína de fusión resultante se puede dejar asociar de forma no covalente con el homólogo de PCNA de Pyrococcus furiosus para generar una proteína heteróloga nueva con una mayor procesividad con respecto a PoII de Pyrococcus furiosus no modificada.

Otros dominios de unión a ácido nucleico de doble cadena no específicos de secuencia

Los dominios de unión de ácido nucleico adicionales adecuados para su utilización en la presente invención se pueden identificar mediante homología con proteínas de unión a ADN de doble cadena no específicas de secuencia y/o mediante la reactividad cruzada con anticuerpos, o se pueden hallar mediante un ensayo bioquímico.

Identificación de dominios de unión a ácido nucleico en base a la homología

Habitualmente, en la presente invención se pueden utilizar dominios que tienen una identidad en las secuencias de aminoácidos de aproximadamente el 50%, opcionalmente una identidad de secuencias de aminoácidos de aproximadamente el 60%, 75, 80, 85, 90 ó 95-98% con una proteína conocida de unión a ácido nucleico de doble cadena no específica de secuencia sobre una ventana de comparación de aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente aproximadamente 50-100 aminoácidos, o la longitud de la proteína completa. La secuencia se puede comparar y alinear para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada, tal y como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante la alineación manual y la inspección visual. Para los objetivos de la patente, el porcentaje de identidad de aminoácidos se determina mediante los parámetros por defecto de BLAST.

Para la comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se entran en el ordenador las secuencias de prueba y de referencia, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos para las secuencias. Se pueden utilizar los parámetros por defecto del programa o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades en la secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.

La ventana de comparación incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en la que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alineen las dos secuencias de forma óptima. Los procedimientos de alineación de secuencias por comparación son conocidas en la técnica. La alineación óptima de secuencias por comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del procedimiento de similitudes de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444 (198E), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genecics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación múltiple de secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas por parejas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad en las secuencias. También traza un diagrama en árbol o un dendograma que muestra las relaciones en grupos utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El procedimiento utilizado es similar al procedimiento descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con una longitud máxima de 5000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación por pare as de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. A continuación, este grupo se alinea con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionadas. Dos grupos de secuencias se alinean mediante una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones progresivas por parejas. El programa se desarrolla mediante la designación de secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y mediante la designación de los parámetros del programa. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar el porcentaje de relación de identidad en la secuencia utilizando los siguientes parámetros: peso del espacio por defecto (3,00), peso de la longitud del espacio por defecto (0,10) y espacios de los extremos ponderados. PILEUP se puede obtener de los paquetes de software para el análisis de secuencias GCG, por ejemplo, la versión 7.0 (Deveraux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984)).

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad en las secuencias y la similitud de las secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. El software para realizar análisis con BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnologv Information (http://www.ncbi.nhn.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar la identificación de parejas de secuencias con alta puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W de la secuencia en cuestión, que se empareja o satisface cierta puntuación con umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. A T se hace referencia como el umbral de la puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra.). Estos "word hits" en la vecindad iniciales actúan como semillas para el inicio de búsquedas de HSPs más largas que las contienen. Los "word hits" se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia siempre y cuando se pueda incrementar la puntuación de la alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para una pareja de residuos que se emparejan; siempre > 0) y N (puntuación de castigo para residuos que no se emparejan; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las puntas de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de la alineación cae en una cantidad X desde su máximo valor conseguido; la puntuación acumulada baja a 0 o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros de los algoritmos BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10 y alineaciones (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad por la que un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos aparecería por casualidad. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01 y aún más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

Unión de reacción cruzada a anticuerpos

Los dominios de unión a ácido nucleico de doble cadena no específicos de secuencia para utilizar en la presente invención también se pueden identificar mediante reactividad cruzada utilizando anticuerpos, preferiblemente anticuerpos policlonales, que se unen a dominios de unión a ácido nucleico conocidos. Los anticuerpos policlonales se generan utilizando procedimientos conocidos para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)). Las proteínas que son proteínas de unión inmunológicamente de reacción cruzada se pueden detectar a continuación mediante una serie de procedimientos de ensayo. Para las descripciones de varios formatos y condiciones que se pueden utilizar, véase, por ejemplo, Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed, 1993), Coligan, supra, y Harlow & Lane, supra.

Los formatos de inmunoensayo útiles se incluyen ensayos en los que una proteína de muestra se inmoviliza a un soporte sólido. Por ejemplo, se puede identificar una proteína de unión de reacción cruzada utilizando un análisis de inmunotransferencias, tal como una trasnferencia western. La técnica de transferencia western comprende generalmente la separación de proteínas de muestra mediante electroforesis en gel en base al peso molecular, la transferencias de las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado, (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon o un filtro de nylon derivatizado) y la incubación de la muestra con los anticuerpos que se unen al dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia. Los anticuerpos se unen específicamente a polipéptidos de reacción cruzada en el soporte sólido. Los anticuerpos se pueden marcar directamente o, alternativamente, se pueden detectar posteriormente utilizando anticuerpos marcados (por ejemplo, anticuerpos de oveja anti-ratón marcados) que se unen específicamente a los anticuerpos de dominios anti-unión. Para la identificación de proteínas adecuadas para utilizar en la presente invención también son útiles otros ensayos de inmunotransferencia, tales como el análisis de bibliotecas de proteínas recombinantes.

Utilizando esta metodología en condiciones de inmunoensayo designadas, se pueden identificar proteínas inmunológicamente de reacción cruzada que se unen a un anticuerpo particular por lo menos dos veces la base o más, habitualmente 10 veces la base, y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra.

Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva también se pueden utilizar para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, los antisueros policlonales se generan para una proteína conocida de dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia, por ejemplo, un PCNA de Pyrococcus furiosus (Pfu). A continuación, el antígeno diana se puede inmovilizar en un soporte sólido. Los antígenos no diana que tienen una menor reactividad cruzada (si existen) se pueden añadir al ensayo para mejorar la selectividad de los sueros. La capacidad de las proteínas añadidas de competir por la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la capacidad de la proteína del dominio de unión, en este ejemplo PCNA de Pfu, para competir con sí mismo. Se calcula el porcentaje de la reactividad cruzada de las proteínas anteriores utilizando cálculos estándar. Aquellos antisueros con menos de un 10% de reactividad cruzada con la proteína añadida se seleccionan y se agrupan. Los anticuerpos de reactividad cruzada para antígenos no diana también se pueden extraer de los antisueros agrupados mediante inmunoabsorción con los antígenos no diana. Los anticuerpos que se unen específicamente a dominios de unión a ácido nucleico particulares de la presente invención también se pueden fabricar utilizando esta metodología.

A continuación, los antisueros inmunoabsorvidos y agrupados se utilizan en un inmunoensayo de unión competitiva, tal y como se ha descrito anteriormente, para comparar una segunda proteína, que se pensó que quizás era un alelo, variante polimórfica o un homólogo del dominio de unión conocido, por ejemplo, un homólogo de PCNA de otro Pyrococcus sp., con la proteína inmunégena. Con el fin de realizar esta comparación, las dos proteínas se ensayan cada una en un amplio rango de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida para inhibir el 50% de la unión es inferior a 10 veces la cantidad de la proteína de dominio de unión a ácido nucleico que se requiere para inhibir el 50% de la unión, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a los anticuerpos policlonales generados para el dominio de unión a ácido nucleico inmunógeno.

Ensayos para la actividad de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia

La actividad de los dominios de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia se puede evaluar utilizando una serie de ensayos. Los dominios de unión adecuados muestran una preferencia marcada por ácidos nucleicos de doble cadena frente a ácidos nucleicos de cadena única.

La especificidad de unión a ácidos nucleicos de doble cadena se puede ensayar utilizando una serie de ensayos conocidos por los expertos en la materia. Entre éstos se incluyen ensayos de unión en filtro o ensayos de desplazamiento en gel. Por ejemplo, en un ensayo de unión en filtro, el polipéptido en el que se evalúa la actividad de unión a ADN de doble cadena se premezcla con ADN radiomarcado, de doble cadena o cadena única, en el tampón adecuado. La mezcla se filtra a través de una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa) que retiene la proteína y el complejo proteína-ADN. La cantidad de ADN que se retiene en el filtro es indicativo de la cantidad que se ha unido a la proteína. La unión se puede cuantificar mediante un análisis de competición en el que la unión de ADN marcado compite con la adición de cantidades crecientes de ADN no marcado. Un polipéptido que se une a ADN de doble cadena con una afinidad 10 veces o superior que con ADN de cadena única se define en la presente invención como una proteína de unión a ADN de doble cadena. Alternativamente, la actividad de unión se puede evaluar mediante un ensayo de desplazamiento en gel en el que el ADN radiomarcado se incuba con el polipéptido de prueba. El complejo proteína-ADN migrará más lentamente a través del gel que el ADN no unido, dando lugar a una banda desplazada. La cantidad de unión se evalúa mediante la incubación de muestras con cantidades crecientes de ADN no marcado de cadena doble y de cadena única, y la cuantificación de la cantidad de radioactividad en la banda desplazada.

Un dominio de unión adecuado para utilizar en la presente invención se une a ácidos nucleicos de doble cadena de forma independiente a la secuencia, es decir, un dominio de unión de la presente invención se une a ácidos nucleicos de doble cadena con una afinidad significativa, pero, no existe un ácido nucleico conocido que se una al dominio con más de 100 veces más afinidad que otro ácido nucleico con la misma composición de nucleótidos, pero de secuencia de ácidos nucleicos diferente. La unión no específica se puede evaluar utilizando una metodología similar a la descrita para determinar la unión de ácido nucleico de doble cadena frente a la de cadena única. Los ensayos de unión en filtro o los ensayos de desplazamiento de la movilidad en gel se pueden realizar tal como se ha indicado anteriormente utilizando ADNs competidores de la misma composición de nucleótidos, pero diferentes secuencias de ácidos nucleicos para determinar la especificidad de la unión.

Los dominios de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia para utilizar en la presente invención también se puede evaluar, por ejemplo, mediante el ensayo de la capacidad del dominio de unión a doble cadena para aumentar la procesividad o eficacia de una enzima modificadora o para aumentar la estabilidad de una cadena doble de ácido nucleico en por lo menos 1°C. Estas técnicas se describen a continuación en la sección que describe los análisis para una mayor eficacia de una enzima modificadora de ácido nucleico.

Un dominio de unión de la presente invención también se puede identificar mediante la evaluación directa de la capacidad de dicho dominio para estabilizar una conformación de ácido nucleico de doble cadena. Por ejemplo, una curva de fusión de una construcción cebador-plantilla se puede obtener en presencia o ausencia de proteína mediante la monitorización de la absorbancia UV del ADN a 260 nm. La T_{F} del sustrato de doble cadena se puede determinar desde el punto central de la curva de fusión. El efecto de la proteína de unión a incido nucleico de doble cadena no específico de secuencia sobre la TM se puede determinar a continuación mediante la comparación de la T_{F} obtenida en presencia de la enzima modificada con la obtenida en presencia de la enzima no modificada. (La proteína no contribuye significativamente a la absorbancia en UV porque tiene un coeficiente de extinción muy inferior a 260 nm que el ADN). A continuación, un dominio que aumenta la T_{F} en 1º, frecuentemente en 5º, 10º o más se puede seleccionar para utilizar en la invención.

Las nuevas proteínas de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia de la presente invención también se pueden aislar aprovechando su actividad de unión a ADN, por ejemplo, mediante la purificación sobre columnas de ADN-celulosa. A continuación, las proteínas aisladas se pueden purificar adicionalmente mediante medios convencionales, secuenciar y clonar los genes mediante medios convencionales a través de PCR. La proteínas sobreexpresadas a partir de estos clones se pueden analizar a continuación mediante cualquiera de los medios descritos anteriormente.

Unión del dominio catalítico con el dominio de unión a ácido nucleico

El dominio catalítico y el dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena se pueden unir mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen medios químicos y recombinantes.

Los medios químicos de unión de los dominios heterólogos se describen, por ejemplo, en Bioconjugate Techniques, Hermanson, Ed. Academic Press (1996). Entre éstos se incluyen, por ejemplo, la derivatización con el objetivo de unir entre sí los grupos, directamente, o bien, a través de un compuesto de unión, mediante procedimientos que son conocidos en la técnica de la química de proteínas. Por ejemplo, en una realización de conjugación química, el medio de unión del dominio catalítico y el dominio de unión a ácido nucleico comprende un reactivo acopiador heterobifuncional que en última instancia contribuye a la formación de un enlace disulfuro intermolecular entre los dos grupos. Otros tipos de reactivos acopiadores que son útiles en esta capacidad para la presente invención se describen, por ejemplo, en la Patente U.S.A. 4.545.985. Alternativamente, covenientemente se puede formar un enlace disulfuro intermolecular entre cisteínas en cada grupo, que aparecen de forma natural o se insertan mediante ingeniería genética. Los medios de unión de grupos también pueden utilizar uniones tioéter entre los reactivos reticuladores heterobifuncionales o reticuladores específicos divisibles a pH bajo o enlazadores específicos divisibles por proteasas u otras uniones químicas divisibles o no divisibles.

Los medios de unión de los dominios heterólogos de la proteína también pueden comprender un enlace peptidilo formado entre grupos que se sintetizan por separado mediante química de síntesis de péptidos estándar o medios recombinantes. La propia proteína también se puede producir utilizando procedimientos químicos para sintetizar una secuencia de aminoácidos de manera global o parcial. Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar mediante técnicas en fase sólida, tales como, por ejemplo, el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena creciente de aminoácidos, véase, Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2146). El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible desde suministradores tales como PE Corp. (Foster city, CA) y pueden operar generalmente según las instrucciones del fabricante. A continuación, los péptidos sintetizados se pueden dividir de la reina, y purificarse, por ejemplo, mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (véase Creighton, Proteins Structures and Molecular Principies, 50-60 (1983)). La composición de los polipéptidos sintéticos o de subfragmentos del polipéptido se pueden confirmar mediante el análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de la degradación de Edman; véase Creighton, Proteins Structures and Molecular Principies, páginas 34-49 (1983)).

Además, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como sustitución o adición en la secuencia. Ente los aminoácidos no clásicos se incluyen, pero no se limitan a, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido \alpha-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, \gamma-Abu, \varepsilon-Ahx, ácido 6-aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño, tales como \beta-metil aminoácidos, C\alpha-metil aminoácidos, N\alpha-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácidos puede ser D (dextrogiroo) o L (levógiro).

En otra realización, los dominios de una proteína de la presente invención, por ejemplo, Sso7d y Taq polimerasa se unen a través de un grupo enlazador. El grupo enlazador puede ser un agente de reticulación químico, incluyendo, por ejemplo, succinimidil-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SUCO). El grupo enlazador también puede ser una secuencia o secuencias de aminoácidos adicionales, incluyendo, por ejemplo, un grupo enlazador de polialanina, poliglicina o similar.

En una realización específica, las secuencias codificantes de cada polipéptido en la proteína de fusión se unen directamente a sus extremos amino o carboxilo mediante un enlace peptídico en cualquier orden. Alternativamente, se puede utilizar una secuencia enlazadora de aminoácidos para separar el primer y el segundo componentes del polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se plegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia enlazadora de aminoácidos se incorpora en la proteína de fusión utilizando técnicas estándar conocidas en el sector. Las secuencias enlazadores de péptidos adecuadas se pueden elegir en base a los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación flexible extendida; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con epítopos funcionales sobre el primer y el segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcioales de los polipéptidos. Las secuencias enlazadoras de péptidos habituales contienen residuos de Gly, Val y Thr. También se pueden utilizar en la secuencia enlazadora otros aminoácidos casi neutros, tales como Ser y Ala. Las secuencias de aminoácidos que se pueden utilizar de forma útil como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al. (1985) Gene 40: 39-46; Murphy et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 83: 8258-8262; Patente U.S.A. Nos. 4.935.233 y 4.751.180. La secuencia enlazadora puede tener generalmente de 1 a aproximadamente 50 aninoácidos de longitud, por ejemplo, 3, 4, 6 ó 10 aminoácidos de longitud, pero pueden tener 100 ó 200 aninoácidos de longitud. Las secuencias enlazadoras pueden ser innecesarias cuando el primer y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminal no esenciales que se pueden utilizar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Entre otros enlazadores químicos se incluyen enlazadores de carbohidratos, enlazadores de lípidos, enlazadores de ácidos grasos, enlazadores de poliéteres, por ejemplo, PEG, etc. Por ejemplo, los enlazadores de poli(etilenglicol) están disponibles en Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos enlazadores tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfhidrilo o enlaces heterofuncionales.

Otros procedimientos de unión de dominios incluyen la unión iónica mediante la expresión de colas negativas y positivas y de unión indirecta a través de anticuerpos e interacciones estreptavidina-biotina (véase, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, supra). Los dominios también se pueden unir a través de una secuencia de interacción inmediata. Por ejemplo, una secuencia de interacción con PCNA de consenso se puede unir a una polimerasa que no interacciona de forma natural con un homólogo de PCNA. A continuación, la proteína de fusión resultante se puede dejar asociar de forma no covalente con el homólogo de PCNA para generar una proteína heteróloga nueva con una mayor procesividad.

Producción de proteínas de fusión utilizando técnicas recombinantes

En una realización, una proteína de la presente invención se produce mediante la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína, que es conocida por los expertos en la materia. Dicho producto de fusión se puede fabricar mediante la unión de las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidoas deseadas entre sí mediante procedimientos conocidas en la técnica, en el marco de codificación correcto, y la expresión del producto mediante los procedimientos conocidos en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican los dominios a incorporar en las proteínas de fusión de la presente invención se pueden obtener utilizando técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Entre los textos básicos que describen los procedimientos generales de utilización en la presente invención se incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994).

Frecuentemente, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dominios catalíticos o de unión a ácido nucleico u homólogos de secuencias de ácidos nucleicos relacionados se donan a partir de las bibliotecas de ADNc y ADN genómico mediante la hibridación con sondas, o se aíslan utilizando técnicas de amplificación con cebadores oligonucleótidos. Las técnicas de amplificación se pueden utilizar para amplificar y aíslar secuencias de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995)). Alternativamente, el solapamiento de oligonucleótidos se puede producir sintéticamente y unirse para producir uno o más de los dominios. Los ácidos nucleicos que codifican dominios catalíticos o de unión a ácido nucleico de doble cadena también se pueden aislar de las bibliotecas de expresión utilizando anticuerpos como sondas.

En un ejemplo de obtención de un ácido nucleico que codifica un dominio catalítico o de unión a ácido nucleico utilizando PCR, la secuencia o subsecuencia de ácidos nucleicos es amplificada por PCR, utilizando un cebador de sentido que contiene un sitio de restricción y un cebador antisentido que contiene otro sitio de restricción. Esto producirá un ácido nucleico que codifica la secuencia o subsecuencia del dominio deseado y que tiene sitios de restricción terminales. A continuación, este ácido nucleico se puede unir fácilmente a un vector que contiene un ácido nucleico que codifica el segundo dominio y que tiene los sitios de restricción correspondientes apropiados. Los dominios se pueden unir directamente o se pueden separar por un enlazador, u otra secuencia de proteínas. Los cebadores de PCR adecuados pueden determinarse por un experto en la materia utilizando la información de las secuencias proporcionada en el Banco de Genes u otras fuentes. Se pueden añadir también sitios de restricción adecuados para el ácido nucleico que codifica la proteína o subsecuencia de proteínas mediante mutagénesis dirigida de sitio. El plásmido que contiene la secuencia o subsecuencia de nucleótidos que codifican el dominio se divide con la endonucleasa de restricción apropiada y, a continuación, se une en un vector apropiado para la amplificación y/o expresión según los procedimientos estándar.

Algunos ejemplos de técnicas suficientes para guiar a personas expertas en la materia en procedimientos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullís et al., (1987) Patente U.S.A. No. 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de Octubre de 1990) C&EN 3 6-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science 241: 1.077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; y Barringer et al. (1990) Gene 89: 117.

Se pueden comparar otras propiedades físicas de un polipéptido expresado de un ácido nucleico particular con propiedades de proteínas de unión a ácido nucleico de doble cadena no específica de secuencia o dominios catalíticos de enzima modificadora de ácido nucleico para proporcionar otro procedimiento de identificación de ácidos nucleicos adecuados.

En algunas realizaciones, puede ser deseable modificar los polipéptidos que codifican las regiones catalíticas y/o de unión a ácido nucleico de la proteína de fusión recombinante. Un experto en la materia conocerá muchas maneras de generar alteraciones en una construcción de ácidos nucleicos determinada. Entre dichos procedimientos conocidos se incluyen mutagénesis dirigida de sitio, amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que contienen el ácido nucleico a agentes mutagénicos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por ejemplo, conjuntamente con la unión y/o la clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y o:ras técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Giliman y Smith (1979) Gene 8: 81-97, Roberts et al. (1987) Nature 328: 731-734.

Por ejemplo, los dominios catalíticos y/o de unión a ácido nucleico se pueden modificar para facilitar la unión de los dos dominios para obtener los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión de la presente invención. Los dominios catalíticos y los dominios de unión que se modifican mediante estos procedimientos también son parte de la presente invención. Por ejemplo, un codón para un residuo de cisteína se puede colocar en cualquier extremo de un dominio, de manera que el dominio se puede unir mediante, por ejemplo, un enlace sulfuro. La modificación se puede realizar utilizando cualquier procedimiento recombinante o químico (véase, por ejemplo, Pierce Chemical Co., catálogo, Rockford, IL).

Los dominios catalíticos o de unión de la proteína de fusión recombinante están frecuentemente unidos por dominios enlazadores, habitualmente secuencias de polipéptidos tales como las descritos anteriormente, que pueden tener una longitud de aproximadamente 200 aminoácidos o más, siendo habitual de 1 a 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, los residuos de prolina se incorporan al enlazador para evitar la formación de elementos estructurales secundarios significativos por el enlazador. Los enlazadores pueden ser frecuentemente subsecuencias de aminoácidos flexibles que se sintetizan como parte de una proteína de fusión recombinante. Dichos enlazadores flexibles son conocidos por expertos en la materia.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas de la presente invención se modifican para proporcionar codones preferidos que aumentan la traducción del ácido nucleico en un organismo seleccionado (por ejemplo, los codones preferidos de levadura se sustituyen en un ácido nucleico codificante para la expresión en levaduras).

Cassettes de expresión y células huésped para la expresión de los polipéptidos de fusión

Existen muchos sistemas de expresión para producir el polipéptido de fusión que son bien conocidas por los expertos en la materia. (Véase, por ejemplo, Gene Expression systems, Fernández y Hoeffer, Eds. Academic Press, 1999). Habitualmente, el polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión se coloca bajo el control de un promotor que es funcional en la célula huésped deseada. Hay disponibles una variedad extremadamente amplia de promotores y se pueden utilizar en los vectores de expresión de la presente invención, dependiendo de la aplicación concreta. Habitualmente, el promotor seleccionado depende de la célula en la que el promotor va a ser activo. También se incluyen opcionalmente otras secuencias de control de la expresión, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de terminación de la transcripción y similares. Las construcciones que incluyen una o más de estas secuencias de control se denominan "cassettes de expresión". Por consiguiente, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos unidos se incorporan para una expresión de nivel elevado en una célula huésped deseada.

Las secuencias de control de la expresión que son adecuadas para utilizar en una célula huésped concreta se obtienen frecuentemente mediante la donación de un gen que se expresa en esa célula. Entre las secuencias de control procariota utilizadas habitualmente, que se definen en la presente invención para que incluyan promotores para el inicio de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias de sitios de unión a ribosomas, se incluyen dichos promotores utilizados habitualmente como los sistemas de promotores de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Change et al., Nature (1977) 198: 1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic. Acids Res. (1980) 8: 4057), el promotor tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. (1983) 80: 21-25); y el promotor PL derivado de lambda y el sitio de unión a ribosomas del gen N (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). El sistema de promotores concreto no es crítico para la presente invención, se puede utilizar cualquier promotor disponible que funcione en procariotas. Entre los vectores de expresión bacteriana estándar se incluyen plásmidos, tales como plásmidos basados en pBR322, por ejemplo, pBLUESCRIPT^{TM}, pSKF, pET23D, vectores derivados de fago \lambda y sistemas de expresión de fusión, tales como GST y LacZ. También se pueden añadir etiquetas epítopos a proteínas recombinantes para proporcionar procedimientos convenientes de aislamiento, por ejemplo, c-myc, etiqueta HA, etiqueta 6-His (SEC ID No: 30), proteína de unión a maltosa, etiqueta VSV-G, etiqueta anti-DYKDDDDK (SEC ID No: 31), o cualquier otra etiqueta, un gran número de las cuales son bien conocidas por los expertos en la materia.

Para la expresión de polipéptidos de fusión en células procariotas diferentes de E. Coli, se necesita un promotor que funcione en la especie procariota concreta. Dichos promotores se pueden obtener de genes que se han clonado a partir de la especie o se pueden utilizar promotores heterólogos. Por ejemplo, el promotor híbrido trp-lac funciona en Bacillus además de E. Coli. Estos y otros promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. y Ausubel et al. Los sistemas de expresión bacterianos para expresar las proteínas de la presente invención están disponibles en, por ejemplo, E. Coli, Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983). Los kit:; para dichos sistemas de expresión están comercialmente disponibles.

Los sistemas de expresión eucariotas para células de mamíferos, levaduras y células de insectos son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. En las levaduras, los vectores incluyen plásmidos integrantes de levaduras (por ejemplo, YIp5) y plásmidos replicantes en levaduras (los plásmidos de la serie YRp) y pGPD-2. Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se utilizan habitualmente en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores SV40, vectores del virus del papiloma, y vectores derivados del virus Epstein-Barr. Entre otros vectores eucariotas de ejemplo se incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor CMV, promotor temprano de SV40, promotor tardío de SV40, promotor de metalotioneína, promotor de virus de tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina u otros promotores que mostraron ser eficaces para la expresión en células eucariotas.

En la presente invención se pueden utilizar promotores constitutivos o regulados. Los promotores regulados pueden ser ventajosos porque las células huésped se pueden desarrollar hasta densidades elevadas antes de inducir la expresión de los polipéptidos de fusión. La expresión de nivel elevado de proteínas heterólogas ralentiza el crecimiento celular en algunas situaciones. Un promotor inducible es un promotor que dirige la expresión de un gen en el que el nivel de expresión es alterable por factores medioambientales o del desarrollo, tales como por ejemplo, la temperatura, el pH, las condiciones anaeróbicas o aeróbicas, la luz, factores de transcripción y sustancias químicas.

Para E. coli y otras células huésped bacterianas, existen promotores inducibles conocidos por los expertos en la materia. Entre éstos se incluyen, por ejemplo, el promotor tac, el promotor del bacteriófago lambda P_{L}, el promotor híbrido trp-lac (Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21) y el promotor del bacteriófago T7 (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074-8). Estos promotores y sus usos se describen en Sambrook et al., supra.

Los promotores inducibles para otros organismos también son conocidos por los expertos en la materia. Entre éstos se incluyen, por ejemplo, el promotor de metalotioneína, el promotor del choque térmico, así como muchos otros.

El acoplamiento traduccional se puede utilizar para aumentar la expresión. La estrategia utiliza un marco de lectura abierto en dirección 5' de un gen altamente expresado nativo al sistema traduccional, que se sitúa en dirección 3' del promotor, y un sitio de unión a ribosomas seguido después de un grupo de codones de aminoácidos por un codón de terminación. Justo antes del codón de terminación hay un segundo sitio de unión a ribosomas y tras el codón de terminación hay un codón de inicio para el inicio de la traducción. El sistema disuelve la estructura secundaria en el ARN, permitiendo la iniciación eficaz de la traducción. Véase, Squires et al. (1988), J. biol. Chem. 263: 16297-16302.

La construcción de construcciones de polinucleótidos requiere generalmente la utilización de vectores capaces de replicarse en bacterias. Dichos vectores se utilizan habitualmente en la técnica. Hay disponibles comercialmente una plétora de kits para la purificación de plásmidos a partir de bacterias (por ejemplo, EasyPrepJ, FlexiPrepJ, de Pharmacia Biotech; StrataCleanJ, de Stratagene; y, QIAexpress Expression System, Qiagen). A continuación, los plásmidos aislados y purificados se pueden manipular adicionalmente para producir otros plásmidos y utilizar para transformar células.

Los polipéptidos de fusión se pueden expresar intracelularmente o se pueden secretar de la célula. La expresión intracelular da lugar frecuentemente a rendimientos elevados. Si es necesario, la cantidad de polipéptido de fusión activo soluble se puede incrementar llevando a cabo procedimientos de replegamiento (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra.; Marston et al., Bio/Technology (1984) 2: 800; Schoner et al., Bio/Technology (1985) 3: 151). Los polipéptidos de fusión de la presente invención se pueden expresar en una variedad de células huésped, incluyendo E. coli, otros huéspedes bacterianos, levaduras y varias células eucariotas superiores, tales como las líneas de células COS, CHO y HeLa y líneas de células de mieloma. Las células huésped pueden ser células de mamíferos, células de insectos o microorganismos, tales como, por ejemplo, células de levaduras, células bacterianas o células fúngicas.

Una vez expresados, los polipéptidos de fusión recombinantes se puede purificar según los procedimientos estándar de la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel, y similares (véase, en general, R Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academia Press, Inc. N.Y. (1990)). Se prefieren composiciones sustancialmente puras de por lo menos aproximadamente una homogeneidad del 90 al 95%, y son más preferidas de un 98 a un 99% o más homogeneidad. Una vez purificadas, parcialmente o hasta la homogeneidad que se desee, se pueden utilizar entonces los polipéptidos (por ejemplo, como inmunógenos para la producción de anticuerpos).

Para facilitar la purificación de los polipéptidos de fusión de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de fusión también pueden incluir una secuencia codificante para un epítopo o "etiqueta" para el cual hay disponible una reactivo de unión por afinidad. Entre los ejemplos de epítopos adecuados se incluyen los genes informadores myc y V-5; hay comercialmente disponibles vectores de expresión útiles para la producción recombinante de polipéptidos de fusión que tienen estos epítopos (por ejemplo, de Invitrogen (Carlsbad CA) los vectores pcDNA3.1/Myc-His y pcDNA3.1/V5-His son adecuados para la expresión en células de mamíferos). Los vectores de expresión adicionales adecuados para la unión de una etiqueta a las proteínas de fusión de la presente invención, y los sistemas de detección correspondientes son conocidos por los expertos en la materia y existen varios disponibles comercialmente (por ejemplo, "FLAG" (Kodak, Rochester NY). Otro ejemplo de una etiqueta adecuada es una secuencia de polihistidina que es capaz de unirse a ligandos quelatos con afinidad por metales. Habitualmente, se utilizan seis histidinas adyacentes, aunque se pueden utilizar más o menos de seis. Entre los ligandos quelatos adecuados con afinidad por metales que pueden servir como el grupo de unión para la etiqueta de polihistidina se incluye ácido nitrilo-triacético (NTA) (Hochuli, E. (1990) "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" en Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; disponible comercialmente en Qiagen (Santa Clarita, CA)).

Un experto conocería que las modificaciones podrían realizarse en los dominios catalíticos y de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia sin disminuir la actividad biológica. Algunas modificaciones pueden realizarse para facilitar la clonación, expresión o incorporación de un dominio en una proteína de fusión. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la adición de codones en cualquier extremo del polinucleótido que codifica el dominio de unión a proporcionar, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocados en cualquier extremo para crear convenientemente sitios de restricción localizados o codones de terminación o secuencias de purificación.

Ensayos para determinar la mayor actividad para los dominios catalíticos

La actividad del dominio catalítico se puede medir utilizando una serie de ensayos que se pueden utilizar para comparar la procesividad o la actividad de modificación de un dominio de proteína modificador unido a un dominio de unión en comparación con la propia proteína. El aumento de la actividad incluye tanto un aumento de la procesividad y un aumento de la eficacia.

Aumento de la actividad de enzimas modificadoras procesivas

La procesividad de la polimerasa se puede medir en una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la materia. La procesividad de la polimerasa. se define en general como el número de nucleótidos incorporados durante una única unión de una enzima modificadora a una plantilla cebada.

Por ejemplo, un cebador marcado en 5' con PAM se híbrida a ADN ssM13mp circular o linealizado para formar una plantilla cebada. En la medición de la procesividad, la plantilla cebada está presente habitualmente en un exceso molar significativo con respecto al dominio de enzima o catalítico a ensayar, de manera que se minimiza la posibilidad de que cualquier plantilla cebada más de una vez sea extendida por la polimerasa. Por lo tanto, la plantilla cebada se mezcla con el dominio catalítico de la polimerasa a ensayar en una proporción, tal como aproximadamente 4000:1 (ADN cebado: polimerasa de ADN) en presencia de tampón y dNTPs. Se añade MgCl_{2} para iniciar la síntesis de ADN. Las muestras se extraen a varios tiempos después de la iniciación y se analizan en un gel de secuenciación. A una concentración de polimerasa en la que la longitud del producto promedio no cambia con el tiempo o con la concentración de polimerasa, la longitud corresponde con la procesividad de la enzima. La procesividad de una proteína de la invención, es decir, una proteína que contiene un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia fusionado al dominio catalítico de una enzima procesiva modificadora de ácido nucleico, tal como una polimerasa, se compara a continuación con la procesividad de la enzima sin el dominio de unión.

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El aumento de la eficacia también se puede demostrar mediante la medición de la mayor capacidad de una enzima para producir el producto. Dicho análisis mide la estabilidad de la cadena doble del ácido nucleico de doble cadena de forma indirecta mediante la determinación de la cantidad de producto obtenido en una reacción. Por ejemplo, un ensayo de PCR se puede utilizar para medir la cantidad de producto de PCR obtenido con un cebador de longitud corta, por ejemplo 12 nucleótidos, hibridado a temperatura elevada, por ejemplo 50°C. En este análisis, se muestra una mayor eficacia mediante la capacidad de una polimerasa, tal como Taq polimerasa, para producir más producto en una reacción de PCR utilizando el cebador de 12 nucleótidos hibridado a 50°C cuando se une a un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia de la presente invención, por ejemplo Sso7d, que la Taq polimerasa sola. En cambio, un tramo de unión que es una serie de residuos cargados, por ejemplo lisinas, cuando se une a una polimerasa no aumenta la procesividad.

Se pueden utilizar ensayos similares para ensayar un aumento de la procesividad cuando el dominio catalítico es una transcriptasa inversa, metilasa, girasa, topoisomerasa o una exonucleasa. En estos análisis, la procesividad se mide como la capacidad de la enzima para permanecer unida a la plantilla o al sustrato y realizar múltiples reacciones de modificación. La proporción molar de ácido nucleico con respecto a la enzima es habitualmente suficientemente elevada, de manera que por promedio sólo una molécula de enzima está unida al ácido nucleico sustrato. Por ejemplo, la actividad de una exonucleasa procesiva, exonucleasa lambda, se puede ensayar utilizando procedimientos publicados (véase, por ejemplo, Mitsis y Kwagh, Nucleic Acid Research, 27: 3057-3063, 1999). Brevemente, se puede amplificar un sustrato largo de ADN (0,5-20 kb) a partir de una plantilla de ADN utilizando un cebador 5'-biotinilado como el cebador directo y un cebador 5' fosforilado como el cebador inverso, o viceversa. Se utiliza dATP radiomarcado para marcar internamente el fragmento de PCR, que sirve como sustrato para la exonucleasa lambda. El sustrato marcado internamente purificado se mezcla con la enzima en una proporción molar de ADN con respecto a la enzima suficientemente elevada para asegurar que en promedio sólo una molécula de exonucleasa está unida por ADN sustrato. Las alícuotas de la muestra se extraen con. el paso del tiempo y se pueden ensayar mediante electroforesis en gel o mediante monitorización de la formación de radiomarcadores solubles en ácido.

Aumento de la actividad de enzimas modificadoras no procesivas

Los dominios catalíticos de enzimas modificadoras de ADN no procesivas o las propias enzimas se pueden utilizar también en la presente invención. Entre los ejemplos de dichas enzimas modificadoras se incluyen ligasas y endonucleasas de restricción. Frecuentemente, los dominios catalíticos se obtienen de las especies termoestables Thermus o Pyrococcus. Para determinar el aumento de la actividad, la función enzimática se puede analizar bajo una serie de condiciones, frecuentemente mayores temperaturas de reacción, por ejemplo, temperaturas de 45°C o superiores, y en comparación con la actividad de enzima no modificada.

Por ejemplo, la Taq ADN ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre extremos 5'fosfato y 3'hidroxilo yuxtapuestos de dos oligonucleótidos adyacentes que están hibridados a un ADN diana complementario. La enzima es activa a 45°C-65°C. El rendimiento del producto unido depende de con qué eficacia se hibridan las cadenas de ADN complementarias para formar el sustrato para la enzima. Un dominio de unión de la presente invención, tal como una proteína del tipo Sso7d, cuando se une a la ligasa puede estabilizar la cadena doble de ADN mediante el aumento de su temperatura de fusión, de menara que se puede utilizar una temperatura de reacción elevada para maximizar la actividad de la enzima sin comprometer las interacciones entre las pares de bases.

El efecto de la fusión de Sso7d sobre la actividad de una ligasa se puede analizar mediante la comparación de la eficacia de unión de la enzima modificada frente a la de la enzima no modificada. La eficacia de unión de dos fragmentos de ADN lineales se puede monitorizar mediante electroforesis en gel de agarosa, mientras que la eficacia de unión de la conversión de un plásmido linealizado a un plásmido circular se puede monitorizar mediante la transformación del ADN.

En otro ejemplo, el dominio catalítico de una enzima modificadora de ácido nucleico con mayor actividad puede ser de una enzima de restricción aislada de una especie termofílica que requiere de una temperatura de reacción elevada para conseguir una actividad óptima. Por ejemplo, cuando los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción están localizados muy cerca del extremo de un fragmento de ADN o en oligonucleótidos de cadena doble, temperaturas más elevadas pueden desestabilizar la estructura de doble cadena. A una temperatura de reacción más elevada, por ejemplo, 45°C o superior, una enzima de restricción con mayor actividad debido a la presencia de un dominio de unión de la presente invención, por ejemplo, una proteína del tipo Sso7d unida a la endonucleasa de restricción, puede producir una mayor cantidad de producto, es decir, ADN digerido, que la propia enzima de restricción. El rendimiento del producto de una reacción concreta se puede evaluar mediante la visualización en un gel o mediante el cálculo de la eficacia de la transformación.

Los expertos en la materia pueden determinar otros procedimientos para calcular el aumento de la eficacia de las enzimas modificadoras de ácido nucleico mejoradas de la presente invención utilizando ensayos estándar de la actividad enzimática de una enzima de modificación determinada. De este modo, las enzimas modificadoras procesivas, tales como transcriptasas inversas, metilasas, girasas y topoisomerasas y otras enzimas modificadoras no procesivas, se pueden analizar de forma no procesiva mediante la comparación de actividades de la proteína, o un dominio catalítico, unidos a un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia y la propia proteína.

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Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el objetivo de facilitar su entendimiento, será fácilmente obvio para los expertos en la materia en vista de los conocimientos de la presente invención que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones en la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la materia entenderán fácilmente que se podrían cambiar o modificar una serie de parámetros no críticos para producir resultados esencialmente similares.

Ejemplo 1 Construcción de proteínas de fusión Construcción de la fusión Sso7d-\DeltaTaq

El siguiente ejemplo ilustra la construcción de una proteína polimerasa que posee una mayor procesividad en la que la proteína de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia Sso7d se fusiona a la ADN polimerasa Poll de Thermus Aquaticus (una polimerasa de la familia A conocida como Taq ADN polimerasa) a la que se eliminan en el extremo N 289 aminoácidos (\DeltaTaq).

En base a la secuencia de aminoácidos publicada de Sso7d, se utilizaron siete nucleótidos en la construcción de un gen sintético que codifica Sso7d. Los oligonucleótidos se hibridaron y se unieron utilizando T4 ADN ligasa. El producto unido final se utilizó como plantilla en una reacción de PCR utilizando dos oligonucleótidos terminales como cebadores para amplificar el gen de longitud completa. Mediante diseño, el fragmento resultante de la PCR contiene un sitio EcoRl único en el extremo 5' y un sitio BstXI único en el extremo 3'. Además de codificar la proteína Sso7d, el fragmen:o de la PCR anterior también codifica un péptido enlazador con la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Val-Thr (SEC ID No: 32) situada en el extremo C terminal de la proteína sso7d. El gen sintético de Sso7d tiene la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID No: 1 y codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEO ID No: 2.

A continuación, el gen sintético que codifica Sso7d se utilizó para generar una proteína de fusión en la que Sso7d sustituye los primeros 289 aminoácidos de Taq. El fragmento que codifica Sso7d se subclonó en un plásmido que codifica la Taq polimerasa para generar la proteína de fusión tal como se indica a continuación. Brevemente, el fragmento de ADN que contiene el gen sintético de Sso7d se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRI y BstXI y se unió a los sitios correspondientes de un plásmido que codifica Taq. Como resultado, la región que codifica los primeros 289 aminoácidos de Taq se sustituye por el gen sintético de Sso7d. Este plásmido (pYWl) permite la expresión de una polipéptido único que contiene Sso7d fusionado al extremo N terminal de \DeltaTaq a través de un enlazador sintético compuesto de Gly-Gly-Val-Thr (SEC ID No: 32). La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión (Sso7d-\DeltaTaq) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestran en las SEC ID Nos: 3 y 4, respectivamente.

Construcción de la fusión Sso7d-Taq

También se construyó una proteína de fusión Sso7d/Taq de longitud completa. Brevemente, se generó una fragmento de PCR de 1 kb que codifica los primeros 336 aminoácidos de Taq polimerasa utilizando dos cebadores. El cebador 5' introduce un sitio SpeI en el extremo terminal 5' del fragmento de PCR, y el cebador 3' se híbrida a los nucleótidos 1008-1026 del gen de Taq. El fragmento se digirió con SpeI y BstXI liberando un fragmento de 0,9 kb que codifica los primeros 289 aminoácidos de la Taq polimerasa. El fragmento de 0,9 kb se unió a un plásmido pYW1 en los sitios SpeI (situado en la región que codifica el enlazador) y BstXI. El plásmido resultante (pYW2) permite la expresión de un polipéptido único que contiene la proteína Sso7d fusionada al extremo N terminal de la Taq ADN polimerasa de longitud completa a través de un enlazador compuesto de Gly-Gly-Val-Thr (SEC ID No: 32), el mismo que en Sso7d-\DeltaTaq. La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión Sso7d-Taq y la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestran en las SEC ID Nos: 5 y 6, respectivamente.

Construcción de la fusión Pfu-Sso7d

Se creó una tercera proteína de fusión uniendo Sso7d al extremo C terminal de ADN poli de Pyrococcus furiosus (una ADN polimerasa de la familia B conocida como Pfu). Se modificó un plásmido basado en pET que portaba el gen de la Pfu ADN polimerasa, de manera que se introducen un único sitio KpnI y un único sitio SpeI en el extremo 3' del gen de Pfu antes del codón de finalización. El plásmido resultante (pPFKS) expresa una Pfu polimerasa con tres aminoácidos adicionales (Gly-Thr-His) en su extremo c terminal.

Se utilizaron dos cebadores para amplificar por PCR el gen sintético de Sso7d descrito anteriormente para introducir un sitio Kpn I y un sitio NheI flanqueando el gen de Sso7d. El cebador 5' también introdujo seis aminoácidos adicionales (Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly; SEC ID No: 33) que sirven como un enlazador en el extremo N terminal de la proteína Sso7d. Tras la digestión con KpnI y NheI, el fragmento de PCR se unió a pPPFKS en los sitios correspondientes. El plásmido resultante (pPFS) permite la expresión de un único polipéptido que contiene la proteína de fusión Sso7d fusionada al extremo C terminal de la Pfu polimerasa a través de un péptido enlazador (Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly; SEC ID No: 33). La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión (Pfu-Sso7d) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestran en las SEC ID Nos: 7 y 8, respectivamente.

Construcción de la fusión Sac7d-\DeltaTaq

Se construyó una cuarta proteína de fusión que unió una proteína de un ión a ADN no específico de secuencia de una especie diferente a \DeltaTaq. Se utilizaron dos cebadores para amplificar por PCR el gen de Sac7d de ADN genómico de Sulfolobus acidocaldarius. Los cebadores introdujeron un único sitio EcoRI y un único sitio SpeI en el fragmento de PCR en los extremos terminales 3' y 5', respectivamente. Tras la digestión por restricción con EcoRI y SpeI, el fragmento de PCR se unión a pYW1 (descrito anteriormente) en los sitios correspondientes. El plásmido resultante expresa un único polipéptido que contiene la proteína Sac7d fusionada al extremo N terminal de \DeltaTaq a través del mismo enlazador utilizado en Sso7d-\DeltaTaq. La secuencia de ADN de la proteína de fusión (Sac7d-\DeltaTaq) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestran en las SEC ID Nos: 9 y 10, respectivamente.

Construcción de la fusión PL-\DeltaTaq

Una quinta proteína de fusión une un péptido compuesto de 14 lisinas y 2 argininas al extremo N terminal de \DeltaTaq. Para generar la proteína de fusión polilisina (PL)-\DeltaTaq, se hibridaron dos olionucleótidos de 67 nucleótidos para formar una fragmento de ADN de doble cadena con un extremo 5' saliente compatible con un sitio EcoRI y un extremo 3' saliente compatible con un sitio Spel. El fragmento de ADN codifica un péptido rico en lisina de la siguiente composición: NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT (SEC ID No: 34). El número de lisinas y argininas en este péptido es idéntico al de Sso7d. Este fragmento de ADN se unió a pYW1, predigerido con EcoRI y SpeI, para sustituir la región que codifica Sso7d. El plásmido resultante (pLST) expresa un único polipéptido que contiene el péptido rico en lisina fusionado al extremo N terminal de \DeltaTaq. La secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión (PL-\DeltaTaq) y la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestran en las SEC ID Nos: 11 y 12, respectivamente.

Ejemplo 2 Cálculo de la procesividad de las polimerasas de fusión

Este ejemplo ilustra el aumento de la procesividad de las proteínas de fusión de la presente invención generadas en el Ejemplo 1.

Ensayo de definición de la unidad de polimerasa

El siguiente ensayo se utilizó para definir una unidad de polimerasa. Se prehibridó un oligonucleótido a ADN ssM13mp18 en presencia de tampón de reacción sin Mg^{++} y de dNTPs. Se añadió la ADN polimerasa de interés en la mezcla de ADN cebado. Se añadió MgCl_{2} para iniciar la síntesis de ADN a 72°C. Se tomaron muestras en varios tiempos y se añadió tampón TE que contiene PicoGreen (Molecular Probes, Eugene Oregon). Se cuantificó la cantidad de ADN sintetizado utilizando un lector de placa de fluorescencia. Se determinó la actividad por unidad de la ADN polimerasa de interés mediante la comparación de su velocidad inicial con la de una ADN polimerasa de control (por ejemplo, una polimerasa comercial con una concentración unidad conocida).

Ensayo de procesividad

Se midió la procesividad mediante la determinación del número de nucleótidos incorporados durante una unión única de la polimerasa a una plantilla cebada.

Brevemente, se hibridaron 40 nM de un cebador marcado en 5' con FAM (34 nucleótidos de longitud) con 80 nM de ADN ssM13mp18 circular o linealizado para la formación de la plantilla cebada. Se mezcló la plantilla cebada con la ADN polimerasa de interés en una proporción molar de aproximadamente 4000:1 (ADN cebado: ADN polimerasa) en presencia de tampón de PCR estándar (libre de Mg^{++}) y 200 \muM de cada dNTPs. Se añadió MgCl_{2} hasta una concentración final de 2 mM para iniciar la síntesis de ADN. En varios tiempos tras la iniciación, se extrajeron muestras con un colorante de carga secuencia) que contenía un 99% de formamida, y se analizaron en un gel de secuenciación. Se determinó la longitud promedio del producto, que se define como la longitud del producto por encima o por debajo de la cual hay cantidades iguales de productos, en base a la integración de todos los picos de producto detectables. A una concentración de polimerasa con la cual cambia la longitud promedio del producto con el tiempo o con la concentración de la polimerasa, la longitud corresponde a la procesividad de la enzima. Los rangos expuestos en la Tabla I representan el rango de valores obtenido en diversas repeticiones del ensayo.

TABLA I Comparación de procesividad

1

Al comparar la procesividad de una enzima modificada con la enzima no modificada, \DeltaTaq tenía una procesividad de 2-6 nucleótidos, mientras que la fusión Sso7d-\DeltaTaq mostró una procesividad de 39-58 nucleótidos (Tabla I). La Taq de longitud completa tuvo una procesividad de 15-20 nucleótidos, lo cual era significativamente más baja que la de la fusión Sso7d-Taq con una procesividad de 130-160 nucleótidos. Estos resultados demuestran que Sso7d unida a la Taq polimerasa aumentaba la procesividad de la polimerasa.

Pfu pertenece a la familia B de las polimerasas. A diferencia de la Taq polimerasa, Pfu posee una actividad exonucleasa de 3' a 5', lo cual le permite mantener una alta fidelidad durante la síntesis de ADN. Una Pfu polimerasa modificada, en la cual Sso7d se encuentra fusionada al extremo C terminal de la Pfu polimerasa de longitud completa, y se analizó una Pfu polimerasa no modificada en el ensayo de procesividad descrito anteriormente. Tal y como se muestra en la Tabla I, la Pfu polimerasa mostró una procesividad de 2-3 nucleótidos, mientras que la proteína de fusión Pfu-Sso7d tuvo una procesividad de 35-39 nucleótidos. De este modo, la fusión de Sso7d al extremo C terminal de Pfu da lugar a un aumento de la procesividad de más de 10 veces sobre la enzima no modificada.

También se calculó la capacidad de un péptido rico en lisina de aumentar la procesividad de la Taq polimerasa. La procesividad de PL-\DeltaTaq se midió utilizando el procedimiento descrito anteriormente, y se comparó con la de la proteína no modificada, \DeltaTaq. Tal y como se muestra en la Tabla I, la presencia del tramo de polilisina no aumentaba la procesividad de \DeltaTaq. De este modo, aunque la adición de un péptido rico en lisina a una proteína de unión a ácido nucleico puede incrementar la velocidad de asociación de una enzima a su sustrato tal y como se describe en la técnica anterior, la procesividad no aumenta.

Ejemplo 3 Efecto de las proteínas de fusión a temperatura de hibridación de oligonucleótidos

Este experimento demuestra la mayor eficacia de la proteína de fusión Sso7d-\DeltaTaq, en comparación con la Taq, para la producción de producto a temperaturas de hibridación superiores mediante la estabilización del dsADN.

Se utilizaron dos cebadores, el cebador 1008 (19mer, T_{F} = 56,4°C) y el 2180R (20mer, T_{F} = 56,9°C), para amplificar un fragmento de 1 kb (1008-2180) del gen del pol Taq. Para variar la temperatura de hibridación de 50°C a 72°C en un programa de ciclado de PCR se utilizó un ciclador térmico de gradiente (MJ Research, Waltham MA). Se cuantificaron y compararon las cantidades de productos de la PCR generados utilizando la misma cantidad de unidades de Sso7d-\DeltaTaq y de Taq. Los resultados se muestran en la Tabla II. La proteína de fusión Sso7d-\DeltaTaq mostró significativamente una mayor eficacia que la Taq de longitud completa a mayores temperaturas de hibridación. De este modo, la presencia de Sso7d en cis incrementa la temperatura de fusión del cebador en la plantilla.

El ensayo de la temperatura de hibridación anterior se utilizó para investigar si PL-\DeltaTaq tiene algún efecto en la temperatura de hibridación del cebador durante la amplificación por PCR. Tal y como muestra la Tabla II, se observó un producto poco o nada amplificado cuando la temperatura de hibridación era de 63°C o superior.

TABLA II Comparación de las actividades a diferente temperatura de hibridación

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Ejemplo 4 Efecto de las proteínas de fusión en la longitud del cebador requerido

Una aumento de la TF de los cebadores (tal y como se muestra anteriormente) predice que Sso7d-\DeltaTaq y \DeltaTaq pueden utilizar cebadores más cortos para llevar a cabo una amplificación por PCR eficaz, pero no Taq. Este análisis muestra que Sso7d-\DeltaTaq es más eficaz en comparación con Taq en un ensayo que utiliza cebadores más cortos.

Se utilizaron cebadores de diferentes longitudes para comparar las eficacias de la amplificación por PCR por Sso7d-\DeltaTaq y por Taq. Los resultados se muestran en la Tabla III y en la Figura 1A-1C. Cuando se utilizaron dos cebadores largos, 57F (22mer, T_{F} = 58°C) y 732R (24mer, T_{F} = 57°C), no se observó una diferencia significativa entre Sso7d-\DeltaTaq y Taq a bajas o altas temperaturas de hibridación. Cuando se utilizaron cebadores de longitud media, 57F15 (15mer, T_{F} = 35°C) y 732R16 (16mer, T_{F} = 35°C), Sso7d-\DeltaTaq fue más eficaz que Taq, especialmente cuando la temperatura de hibridación era alta. La diferencia más llamativa entre las dos enzimas se observó con los cebadores cortos, 57F12 (12mer) y 732R16 (16mer), en los que Sso7d-\DeltaTaq generó 10 veces más productos que Taq a temperaturas de hibridación tanto bajas como altas.

Se utilizó la PCR que utiliza los cebadores 57F12 (12 nucleótidos) y 732R16 (16 nucleótidos) para comparar la eficacia de Sac7d-\DeltaTaq con respecto a Taq de longitud completa sin modificar en la reacción de PCR. Los resultados se muestran en la Figura 2. De forma similar a Sso7d-\DeltaTaq, Sac7d-\DeltaTaq es significativamente más eficaz que Taq en la amplificación que utiliza cebadores cortos.

Se utilizó un ensayo sobre la longitud de cebador para determinar la capacidad de PL-\DeltaTaq de utilizar cebadores cortos en la amplificación por POR. Cuando se utilizaron cebadores largos (57F y 732R), el producto amplificado generado por PL-\DeltaTaq es de -50% del generado por Sso7d-\DeltaTaq. Cuando se utilizaron los cebadores cortos (57F12 y 732R16), el producto amplificado generado por PL-\DeltaTaq es <20% del generado por Sso7d-\DeltaTaq.

TABLA III Comparación del efecto de la longitud del cebador en la amplificación por PCR con ADN polimerasas Sso7d-\DeltaTaq y Taq

4

Aumento del rendimiento de las polimerasas de fusión en reacciones de PCR

El aumento de la estabilidad y/o la procesividad de las proteínas de fusión de la presente invención proporcionan una mayor eficacia en la realización de varias reacciones de modificación. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden proporcionar una amplificación eficiente más eficaz en reacciones de PCR. Muchos factores influyen en el resultado de una reacción de PCR, incluyendo la especificidad del cebador, la eficacia de la polimerasa, la calidad, cantidad y el contenido en GC de la plantilla, la longitud del amplicón, etc. Los ejemplos 5-8 demuestran que las proteínas de fusión que incluyen un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia, por ejemplo, Sso7d, unido a una polimerasa o dominio de polimerasa termoestable tienen diversas características ventajosas sobre la enzima no modificada en las aplicaciones de PCR.

Ejemplo 5 Las proteínas de fusión Sso7d muestran una tolerancia salina mayor y más amplia en la PCR

La unión de polimerasa a la plantilla de ADN cebado es sensible a la fuerza iónica del tampón de reacción debido a interacciones electroestáticas, que a bajas concentraciones de sal es más fuerte y a altas más débil. La presencia de Sso7d en una proteína de polimerasa de fusión estabiliza la interacción de unión de La polimerasa con la plantilla de ADN. Este ejemplo demuestra que las proteínas de fusión de Sso7d muestran un mejor rendimiento en las reacciones de PCR que contienen concentraciones elevadas de KCl.

Se utilizó ADN lambda (2 pM) como plantilla en las reacciones de PCR con cebadores 57F y 723R. La concentración de KCl se varió de 10 mM a 150 mM, mientras que no se cambiaron el resto de componentes del tampón de la reacción. La reacción de PCR se llevó a cabo utilizando un programa de ciclado de 94°C durante 3 minutos, 20 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, y 72°C durante 30 segundos, seguido de 72°C durante 10 minutos. Tras la finalización de la reacción, se extrajeron 5 \mul de la reacción de PCR y se mezclaron con 195 \mul de dilución 1:400 de PicoGreen en TE para cuantificar las cantidades de amplicón generado. También se analizaron los productos de la reacción de PCR en paralelo en un gel de agarosa para verificar que se generaron amplicones de la longitud esperada (no se muestran datos). En la Tabla IV se muestran los efectos de la concentración de KCl en la eficacia de la PCR de Sso7d-\DeltaTaq frente a la de \DeltaTaq, y Pfu-Sso7d frente a Pfu. Las enzimas no modificadas, \DeltaTaq y Pfu, mostraron una preferencia por la concentración de KCl por debajo de 25 mM y 40 mM, respectivamente, para mantener un 80% de la actividad máxima. En cambio, las proteínas de fusión Sso7d-\DeltaTaq y Pfu-Sso7d mantienen el 80% de la actividad máxima en 30-100 mM y 60-100 mM de KCl, respectivamente. De este modo, las proteínas de fusión Sso7d fueron más tolerantes a los niveles elevados de KCl en comparación con sus homólogos no modificados. Esta característica de la polimerasa híbrida permitirá potencialmente la amplificación por PCR a partir de una plantilla de ADN de baja calidad, por ejemplo, muestras de ADN preparadas a partir de, pero no limitadas a, sangre, comida y de origen vegetal.

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TABLA IV La modificación de Sso7d incrementa la tolerancia salina de la polimerasa en la reacción de PCR

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Ejemplo 6 Las polimerasas de fusión Sso7d requieren un tiempo de extensión más corto en la PCR

La procesividad de una polimerasa afecta directamente en la eficacia de la etapa de polimerización. Por ejemplo, una polimerasa con una procesividad baja se disocia más frecuentemente y requiere más tiempo para volverse a unir a la plantilla cebada, mientras que una polimerasa con una procesividad elevada requiere menos uniones para completar la replicación de toda la plantilla. Tal como se ha demostrado en el Ejemplo 2, las proteínas de fusión Sso7d tienen una procesividad significativamente más elevada que sus homólogos no modificados. De este modo, las proteínas de fusión deberían ser más eficaces durante la etapa de extensión del cebador de una reacción de PCR. En la presente se proporcionan ejemplos que demuestran que una polimerasa de fusión Sso7d requiere un tiempo de extensión más corto para amplificar un fragmento grande durante la PCR en comparación con polimerasas no modificadas. Además, se muestra que una única polimerasa de fusión de enzimas muestra una mayor capacidad de amplificar fragmentos de ADN grandes en una cantidad limitada de tiempo en comparación con una mezcla de enzimas (DyNAzyme EXT) utiliza actualmente en la técnica para la amplificación de fragmentos grandes.

Ejemplo 6-1

Polimerasas de fusión Sso7d requieren tiempos de extensión más cortos en la PCR

Se utilizó Lambda ADN (2,25 pM) como plantilla para PCR. Se utilizaron tres pares de cebadores L71F (5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'; SEC ID No: 13) y L71R (5'-GCACAGCGGCTGGCTGAGGA-3'; SEC ID No: 14), L18015F (5'-TGACGGAGGATAACGCCAGCAG-3'; SEC ID No: 15) y L23474R (5'-GAAAGACGATGGGTC
GCTAATACGC-3'; SEC ID No: 16), y L18015F (5'-TGACGGAGGATAACGCCAGCAG-3'; SEC ID No: 17) y L29930R (5'-GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC-3'; SEC ID No: 18), para amplificar fragmentos de ADN del tamaño de 0,9 kb, 5,5 kb y 11,9 kb, respectivamente. Cada reacción contenía 40 unidades/ml de polimerasa, donde la unidad se definió como se describe en el Ejemplo 2, y 0,36 mM de cada uno de los cuatro dNTPs. El tampón de reacción utilizado para Pfu (de Stratagene) contenía 20 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 2 mM de MgSO_{4}, 10 mM de KCl, 10 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1% de Triton X-100, y 0,1 mg/ml de BSA. El tampón de reacción para Pfu-Sso7d, Taq, y Sso7d-Taq era el tampón anterior con 40 mM de KCl adicional. Se utilizaron dos programas de ciclado con un tiempo de extensión de 1 minuto o de 5 minutos para la amplificación por PCR. Cada programa de ciclado se compuso de 94°C durante 20 segundos, inicio caliente a 80°C mediante la adición de la polimerasa, 20 ciclos de 94°C durante 10 segundos seguido de 72°C durante 1 ó 5 minutos, y 72°C durante 5 minutos. Los resultados mostraron que una proteína de fusión Pfu-Sso7d era capaz de amplificar los fragmentos de 1 kb y 5 kb utilizando un tiempo de extensión de 1 minuto, y también era capaz de amplificar el fragmento de 10 kb utilizando un tiempo de extensión de 5 minutos. En cambio, la polimerasa Pfu sólo amplificó el fragmento de 1 kb utilizando In tiempo de extensión de 1 minuto, o bien, de 5 minutos. De forma similar, la proteína de fusión Sso7d-Taq amplificó el fragmento de 1 kb utilizando un tiempo de extensión de 1 minuto, y los fragmentos de 1 kb y 5 kb con un tiempo de extensión de 5 minutos, mientras que la Taq polimerasa amplificó sólo el fragmento de 1 kb con un tiempo de extensión de 5 minutos.

De este modo, la presencia de Sso7d en la proteína de fusión da lugar a tiempos de extensión más cortos en reacciones de PCR en comparación con la proteína no modificada.

Ejemplo 6-2

La polimerasa de fusión Pfu-Sso7d desarrolla mejor la mezcla de enzimas de PCR larga existente

Actualmente, la amplificación por PCR de fragmentos de ADN largo requiere la utilización de una mezcla de enzimas que contienen una polimerasa no correctora de la lectura (por ejemplo, Taq o DyNAzyme II) y una pequeña cantidad de polimerasa correctora de la lectura (por ejemplo, Pfu o Deep Vent). Se ha comparado una enzima de fusión individual, Pfu-Sso7d, con una de las enzimas de PCR larga de alto rendimiento DyNAzyme EXT (de Finnzymes) en una PCR larga, y se demostró que Pfu-Sso7d desarrolla mejor la DyNAzyme EXT, especialmente con un tiempo de extensión limitado.

Se utilizó ADN Lambda (2,25 pM) como plantilla de PCR. Se utilizaron cuatro pares de cebadores L71F (5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'; SEC ID No: 13) y L71R (5'-GCACAGCGGCTGGCTGAGGA-3'; SEC ID No: 14), L30350F (5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'; SEC ID No: 19) y L35121R (5'-CACATGGTACAGCAAGCC
TGGC-3'; SEC ID No: 20), L2089F (5'-CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC-3'; SEC ID No: 21) y L7112R (5'-CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG-3'; SEC ID No: 22), y L30350F (5'-CCTGCCTGCCGCTTCACGC-3'; SEC ID No: 23) y L40547R (5'-CCAATACCCGTTTCATCGCGGC-3'; SEC ID No: 24) para amplificar fragmentos de ADN del tamaño de 0,9 kb, 4,8 kb, 5,0 kb y 10,2 kb, respectivamente. Se utilizaron cuatro concentraciones (10 unidades/ml, 20 unidades/ml, 40 unidades/ml y 80 unidades/ml) de Pfu-Sso7d, y se utilizaron dos concentraciones (20 unidades/ml y 40 unidades/ml) de DyNAzyme EXT. Cada reacción contenía 0,36 mM de cada una de las cuatro dNTPs. El tampón de reacción para Pfu-Sso7d fue como el descrito en el Ejemplo 6-1. El tampón de reacción para DyNAzyme EXT contenía 20 mM de Tris (pH 9,0) , 2 mM de MgCl_{2}, 15 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, y 0,1% de Tritón X-100 (proporcionado por Finnzymes). Todos los componentes de reacción se mezclaron en primer lugar en hielo, y las reacciones se iniciaron colocando las placas de muestra en un ciclador térmico (MJ Research) precalentada por encima de 90°C. El programa de ciclado de la PCR consiste en 95°C durante 20 segundos, 20 ciclos de 94°C durante 10 segundos y 70°C durante 1 ó 1,5 minutos, y 1 ciclo de 72°C durante 10 min.

Tal como se muestra en la Figura 3, un tiempo de extensión de 1 minutos utilizando Pfu-Sso7d generó cantidades significativas del producto de 0,9 kb en presencia de 10, 20, 40 y 80 unidades/ml de polimerasa. También se produjeron productos de 4,8 kb y 5,0 kb, aunque a un nivel inferior, en presencia de 40 y 80 unidades/ml de polimerasa. Utilizando una extensión de 1,5 minutos, se generaron productos de 4,8 kb y 5,0 kb con 10 unidades/ml o superior de Pfu-Sso7d, y se produjo el fragmento de 10,2 kb en una cantidad significativa con 40 y 80 unidades/ml de Pfu-Sso7d. En cambio, cuando se utilizó DyNAzyme EXT, solo se generaron los productos de 1 kb y 4,8 kb utilizando un tiempo de extensión de 1,5 min en presencia de 40 unidades/ml de polimerasa, y no se detectó producto de 10 kb.

De este modo, la polimerasa de fusión Pfu-Sso7d es notablemente más eficaz como enzima único que una mezcla de enzimas, tales como DyNAzyme EXT en una PCR larga.

Ejemplo 7 Las proteínas de fusión sso7d son más sensibles en la amplificación por PCR

Este ejemplo demuestra que una polimerasa de fusión Sso7d puede amplificar una diana que está presente en un número de copias inferior en comparación con las polimerasas no modificadas. Se utilizó AND plásmido como plantilla de PCR con T3 y T7 como cebadores, que amplifican un fragmento de 500 pb. La cantidad de ADN plásmido se varió de manera que el número de copias de la plantilla de ADN presentes en la reacción de PCR varió de 108 a 1. El programa de ciclado fue de 94°C durante 3 minutos, 25 ó 35 ciclos de 96°C durante 1 segundo, 50°C durante 15 segundos, y 68°C durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 68°C durante 5 minutos. Para números de copias de plantillas de 104 a 108 (por 25 \mul de reacción), se realizaron 25 ciclos de amplificación; para números de copias de plantillas de 1 a 104 (por 25 \mul de reacción), se realizaron 35 ciclos de amplificación.

La polimerasa de fusión Sso7d se compara con la polimerasa no modificada en los requerimientos para un mínimo de copias de plantilla para una amplificación eficaz. Tal y como se muestra en la Tabla V, Pfu-Sso7d es significativamente más sensible que Pfu en su capacidad de amplificar un número de copias bajo de plantilla de ADN, demostrando que la polimerasa de fusión de la presente invención puede aumentar la sensibilidad de las reacciones de PCR como mucho en cinco órdenes de magnitud.

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TABLA V La Proteína de fusión Sso7d puede amplificar utilizando un número de copias inferior de plantilla de ADN

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Ejemplo 8 Las polimerasas de fusión Sso7d mantienen una especificidad elevada en una reacción de PCR

Tal y como se muestra en el Ejemplo 3,. la proteína de fusión Sso7d-\DeltaTaq estabiliza las interacciones cebador-plantilla, tal y como se refleja por su capacidad de permitir una mayor temperatura de hibridación y/o cebadores más cortos en la amplificación por PCR. Para evaluar si esta propiedad de la proteína de fusión daría lugar a una amplificación no específica en PCR, se utilizó como plantilla diana una plantilla de ADN complejo (por ejemplo, ADN genómico humano). Los siguientes dos ejemplos demuestran que la especificidad de la amplificación conseguida utilizando Pfu-Sso7d no es inferior que la de Taq, la enzima de PCR más utilizada habitualmente.

Ejemplo 8-1

Amplificación de un marcador específico de género de ADN humano utilizando Pfu-Sso7d

Se utilizó como plantilla AND de tipo humano de macho o hembra (concentración, 1 fM) de placenta o tejido coriónico (de Sigma). Se utilizaron los cebadores H-Amelo-Y (5'-CCACCTCATCCTGGGCACC-3'; SEC ID No: 25) y H-Amelo-YR (5'-GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC-3'; SEC ID No: 26) para amplificar un amplicón de 212 pb de cromosoma X y un amplicón de 218 pb de cromosoma Y. Debería amplificarse un único fragmento de 212 pb de ADN de tipo hembra, mientras que se esperaban tres fragmentos de ADN del tipo macho (212 pb, 218 pb, y el heterocigoto 212 pb/2:18 pb). Cada reacción contenía 20 unidades/ml de polimerasa y 0,36 mM de cada uno de los cuatro dNTPs. El tampón de reacción para Taq incluía 10 mM de Tris (pH 8,8), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2} y 0,1% de Tritón X-100 (proporcionado por Amersham). El tampón de reacción para Pfu-Sso7d se realizó utilizando el tampón DyNAzyme EXT (véase el Ejemplo 6-2) con 40 mM de KCl adicional. Todos los componentes de la reacción se mezclaron en hielo, y la reacción se inició mediante la colocación de las placas en un ciclador térmico calentado previamente por encima de 65°C. El programa de ciclado consistía en 95°C durante 2 minutos, 30 ciclos de 94°C durante 5 segundos, 64°C durante 10 segundos, y 72°C durante 10 segundos, seguido de 1 ciclo de 7 minutos a 72°C. Los amplicones específicos de los tamaños esperados se amplificaron mediante Pfu-Sso7d y Taq polimerasa.

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Ejemplo 8-2

Amplificación del gen de \beta-globina de ADN humano utilizando Pfu-Sso7d

Se utilizó como plantilla ADN humano (1 fM) de placenta o tejido coriónico (de Sigma). Se utilizaron tres pares de cebadores, Bglbn536F (5'-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3'; SEC ID No: 27) y Bglbn536R (5'-GCTCACT
CAGTGTGGCAAAG-3'; SEC ID No: 28), Bglbn536F y Bglbn1083R, y Bglbn536F y Bglbn1408R (5'-GATTAG
CAAAAGGGCCTAGCTTGG-3'; SEC ID No: 29) para amplificar fragmentos de ADN del tamaño de 0,5, 1,1 y 1,4 kb, respectivamente. Cada reacción contenía 20 unidades/ml de polimerasa y 0,36 mM de cada uno de los cuatro dNTPs. El tampón de reacción para Taq y Pfu-Sso7d fueron los descritos en el Ejemplo 8-1. Todos los componentes de la reacción se mezclaron en primer lugar en hielo, y las reacciones se iniciaron mediante la colocación de las placas en un ciclador térmico calentado previamente por encima de 65°C. El programa de ciclado consiste en 95°C durante 2 minutos, 30 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 64°C durante 45 segundos, y 72°C durante 1 minuto, seguido de 1 ciclo de 7 minutos a 72°C. Con cada uno de los tres pares de cebadores utilizados, se produjo un producto amplificado del tamaño esperado utilizando Pfu-Sso7d. Estos resultados muestran que la especificidad de la amplificación conseguido utilizando Pfu-Sso7d es igual o mejor que con la Taq polimerasa.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

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SEC ID No: 1 Gen de Sso7d sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 2 La secuencia de aminoácidos de Sso7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

1000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 3 Secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión Sso7d-\DeltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 4 Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Sso7d-\DeltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 5 Secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión Sso7d-Taq

\vskip1.000000\baselineskip

100

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 6 Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Sso7d-Taq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\newpage

SEC ID No: 7 Secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión Pfu-Sso7d

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 8 Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Puf-Sso7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

17

\newpage

SEC ID No: 9 Secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión Sac7d-\DeltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 10 Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Sac7d-\DeltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 11 Secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión PL-\DeltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 12 Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión PL-\DeltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 13 CEBADOR L71F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 14 CEBADOR L71R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GCACAGCGGCTGGCTGAGGA-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 15 CEBADOR L18015F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-TGACGGAGGATAACGCCAGCAG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 16 CEBADOR L23474R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 17 CEBADOR L18015F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-TGACGGAGGATAACGCCAGCAG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 18 CEBADOR L29930R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 19 CEBADOR L30350F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 20 CEBADOR L35121R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CACATGGTACAGCAAGCCTGGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 21 CEBADOR L2089F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CCCGTATCTGCTGGGA TACTGGC-3

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 22 CEBADOR L7112R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG-3

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 23 CEBADOR L30350F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CCTGCCTGCCGCTTCACGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 24 CEBADOR L40547R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CCAATACCCGTTTCA TCGCGGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 25 CEBADOR H-Amelo-Y

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-CCACCTCATCCTGG GCACC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 26 CEBADOR H-Amelo-YR

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 27 Cebador de beta-globina humana 536F

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 28 Cebador de beta-globina humana 536R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID No: 29 Cebador de beta-globina humana 1408R

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm5'-GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> MJ Bioworks, Inc.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Enzimas modificadoras de ácido nucleico mejoradas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> SMK/FP6110811

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 01941707.0

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-05-29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US01/17492

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-05-29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/207,567

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-05-26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/640,958

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-08-16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína sintética de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia Ssod7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (189)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ssod7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1899

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Sso7d-deltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (1899)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ssod7d-deltaTaq

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 632

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial; proteína de fusión Ssod7-delta Taq

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2763

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Sso7d/Taq de longitud completa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (2763)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ssod7d/Taq de longitud completa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

30

300

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 920

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Ssod7/Taq de longitud completa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

31

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Pfu-Sso7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (2535)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pfu-Ssod7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

34

340

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 844

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Pfu-Sso7d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

35

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1904

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Sac7d-deltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1904)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sac7d-delta Taq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

38

380

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 634

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión Sac7d-delta Taq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1965

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión PL-deltaTaq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (1965)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PL-delta Taq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 654

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína de fusión PL-delta Taq

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

42

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L71F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgctctgc cgcttcacgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L71R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacagcggc tggctgagga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L18015F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacggagga taacgccagc ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L23474R

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaagacgat gggtcgctaa tacgc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L18015F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacggagga taacgccagc ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L29930R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggttggag gtcaatgggt tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L30350F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgctctgc cgcttcacgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L35121R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacatggtac agcaagcctg gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L2089F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgtatctg ctgggatact ggc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L7112R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcggtgct gactgaatca tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L30350F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgcctgcc gcttcacgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador L40547R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaatacccg tttcatcgcg gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador H-Amelo-Y

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacctcatc ctgggcacc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador H-Amelo-YR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttgaggcc aaccatcaga gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador de beta-globina humana Bglbn536F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttggccaa tctactccca gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador de beta-globina humana Bglbn536R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcactcag tgtggcaaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador de beta-globina humana Bglbn1408R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattagcaaa agggcctagc ttgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: epítopo etiqueta 6-His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His His His His His His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: epítopo etiqueta anti-DYKDDDDK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Val Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido enlazador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Gly Gly Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido rico en lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Lys}

\sac{Gly Gly Gly Val Thr}

Claims

1. Proteína que comprende por los menos dos dominios heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia que se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d o contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d, se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador de ácido nucleico que tiene una naturaleza procesiva, donde la presencia del dominio de unión a ácido nucleico de doble cadena no específico de secuencia aumenta la naturaleza procesiva del dominio modificador de ácido nucleico en comparación con una proteína idéntica que no tiene un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia unido a la misma.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sac7d.

3. Proteína según la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia tiene un 75% de identidad con Sso7d.

4. Proteína según la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sso7d.

5. Proteína según la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sso7d.

6. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el dominio modificador de ácido nucleico tiene actividad polimerasa.

7. Proteína según la reivindicación 6, en la que el dominio modificador de ácido nucleico tiene actividad polimerasa térmicamente estable.

8. Proteína según la reivindicación 7, en la que el dominio modificador de ácido nucleico comprende un dominio de polimerasa de Thermus.

9. Proteína según la reivindicación 7, en la que el dominio modificador de ácido nucleico comprende un dominio de polimerasa de Pyrococcus.

10. Proteína según la reivindicación 1, en la que el dominio modificador de ácido nucleico tiene una actividad de ARN polimerasa, una transcriptasa inversa, una metilasa, una exonucleasa 3', una girasa o una topoisomerasa.

11. Procedimiento de modificación de un ácido nucleico en una solución acuosa mediante:

(i) poner en contacto el ácido nucleico con una proteína que comprende por lo menos dos dominios heterólogos, en la que un primer dominio que es un dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia que se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sac7d o Sso7d o contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que contiene un 50% de similitud de aminoácidos con Sso7d, se une a un segundo dominio que es un dominio catalítico modificador de ácido nucleico que tiene una naturaleza procesiva, donde el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia:

a.: se une a ácido nucleico de doble cadena, y

b.: aumenta la procesividad de la enzima en comparación con una enzima idéntica que no tiene el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia fusionado a la misma, y en donde la solución está a una temperatura y es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico y la enzima actúe de forma catalítica, y

(ii) permitir que el dominio catalítico modifique el ácido nucleico en la solución.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sac7d.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia contiene una subsecuencia de 50 aminoácidos que tiene un 75% de similitud de aminoácidos con Sso7d.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia tiene por lo menos un 75% de identidad con Sso7d.

15. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra Sso7d.

16. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el dominio de unión a ácido nucleico no específico de secuencia es Sso7d.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la que el dominio modificador de ácido nucleico tiene actividad polimerasa.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el dominio modificador de ácido nucleico tiene actividad polimerasa térmicamente estable.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el dominio modificador de ácido nucleico comprende un dominio de polimerasa de Thermus.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el dominio modificador de ácido nucleico comprende un dominio de polimerasa de Pyrococcus.

21. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la enzima modificadora de ácido nucleico tiene una actividad de una ARN polimerasa, una transcriptasa inversa, una metilasa, una exonucleasa 3', una girasa o una topoisomerasa u otra actividad de enzima procesiva que interacciona con el ácido nucleico.

22. Procedimiento de amplificación de una subsecuencia de un ácido nucleico diana utilizando una reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo el procedimiento:

(i) poner en contacto el ácido nucleico diana en una solución acuosa con una proteína según la reivindicación 6, donde la solución acuosa es de una composición que permite que el dominio de unión se una al ácido nucleico diana y el dominio polimerasa extienda un cebador que se hibrida a la secuencia del ácido nucleico diana;

(ii) incubar la solución utilizando un perfil de temperaturas de la reacción en cadena de la polimerasa que amplifica la subsecuencia.