PL241698B1

PL241698B1 - Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy

Info

Publication number: PL241698B1
Application number: PL436784A
Authority: PL
Inventors: Marta SKWARECKA; Marta Skwarecka; Kasjan SZEMIAKO; Kasjan Szemiako; Marcin Olszewski; Sabina ŻOŁĘDOWSKA; Sabina Żołędowska; Dawid NIDZWORSKI; Dawid Nidzworski
Original assignee: Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-11-21
Also published as: EP4036237A1; PL436784A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB oraz sposób jej klonowania. Ponadto przedmiotem wynalazku jest wyizolowany plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.

Description

Opis wynalazku

Organizmy termofilne oraz hipertermofilne stanowią potencjalne źródło enzymów pożądanych w różnych gałęziach przemysłu, dzięki swojej wysokiej stabilności w wysokich temperaturach. Przykładem białek o szerokim zastosowaniu są termostabilne polimerazy DNA, których optymalna aktywność osiągana jest w temperaturze powyżej 70°C, a wiele z nich zachowuje swoją aktywność nawet powyżej 100°C. Budowa termostabilnych polimeraz DNA różni się od ich odpowiedników pochodzenia mezofilnego. Struktura ich jest sztywniejsza i bardziej upakowana. Stabilność α-helis jest zapewniona m.in. przez zmniejszoną zawartość takich reszt aminokwasowych jak izoleucyna czy walina, które w znacznym stopniu przyczyniają się do występowania przestrzennych naprężeń. W enzymach tych zaobserwowano znaczne zwiększenie oddziaływań, takich jak: oddziaływani a jonowe, van der Waalsa czy hydrofobowe, które również mają istotny wpływ na wzrost termostabilności białek. W technikach biologii molekularnej czy inżynierii genetycznej najczęściej korzysta się z termostabilnych polimeraz DNA pochodzenia bakteryjnego: Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Bacillus stearothermophilus lub z archeonów tj.: Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei. Główne zastosowanie tych polimeraz DNA to amplifikacja fragmentów DNA z udziałem techniki PCR oraz sekwencjonowanie DNA.

Jedną z najlepiej znanych polimeraz DNA, pochodzących z Euryarcheota i wykorzystywanych w biologii oraz diagnostyce molekularnej jest polimeraza DNA Pwo z Pyrococcus woesei. Jej struktura przypomina pierścień, na który składają się domena 3’^5’ egzonukleazy oraz domena polimeryzacyjna zbudowana z subdomeny śródręcza, palców i kciuka (rysunek 1).

Aktywność polimeryzacyjna oraz korektorska polimeraz DNA archeonów jest związana z pętlą w domenie odpowiedzialnej za aktywność egzonukleolityczną. Jest to element silnie zakonserwowany i występujący wyłącznie u tej grupy mikroorganizmów. Reszty aminokwasowe budujące pętlę oddziałują z dodatnio naładowaną krawędzią subdomeny kciuka i umożliwiają wiązanie końca 3’ ssDNA do centrum aktywnego enzymu. Polimeraza DNA Pwo charakteryzuje się wysoką procesywnością i wiernością replikacji DNA, co związane jest z obecnością domeny korektorskiej 3’^5’ egzonukleazy. Jej termostabilność znacznie przewyższa bakteryjną polimerazę DNA Taq, gdyż czas jej półtrwania wynosi prawie 3 h w 100°C. Ponadto wykazuje większą procesywność i rzadziej popełnia błędy w trakcie syntezy.

Białko NeqSSB należy do rodziny białek SSB (ang. Single-Stranded DNA Binding protein). Białka SSB wykazują różnorodność sekwencji aminokwasowych oraz struktury. Mimo to wszystkie posiadają charakterystyczną, silnie zakonserwowaną, ok. 100 - aminokwasową domenę oligonukleotydową OB (ang. Oligonucleotide/Oligosaccharide Binding Fold Domain). Występuje ona powszechnie u białek posiadających zdolności wiązania ssDNA, determinuje, więc tą podstawową i wspólną dla wszystkich białek SSB cechę - niespecyficzne wiązanie jednoniciowej nici DNA, a także, odkryte znacznie później, wiązanie RNA. Białka SSB odgrywają zasadniczą rolę w procesach ściśle związanych z ssDNA. Odgrywają istotną rolę w replikacji, rekombinacji i naprawie DNA. Odpowiadają za interakcje z jednoni ci owym DNA, zapobiegają tworzeniu struktur drugorzędowych i chronią przed degradacyjnym działaniem nukleaz.

Odkrycie białek SSB datuje się na połowę lat 60-tych XX wieku. Pierwsze wykryte białka to białko SSB faga T4 oraz E. coli. Odkryto wtedy ich silne właściwości związane z oddziaływaniem z ssDNA oraz elucję białka w złożu ssDNA-celuloza w obecności wysokiego stężenia soli - 2 M NaCl. Zwrócono również uwagę na bardzo wysoką selektywność tego białka do jednoni ci owego DNA. Potwierdzeniem fundamentalnej roli białek SSB w procesach związanych z ssDNA jest fakt, iż występują one u wszystkich organizmów żywych, a także u wirusów.

Wiązanie się białka SSB z ssDNA polega na upakowaniu aromatycznych reszt aminokwasowych między zasady w łańcuchu oligonukleotydowym. Ponadto dodatnio naładowane reszt aminokwasowych oddziałują ze szkieletem fosforanowym w cząsteczce ssDNA.

Mimo przynależności białka NeqSSB do rodziny białek SSB odbiega ono swoimi cechami od klasycznych białek SSB, stąd określane jest jako białko NeqSS B-podobne. Białko to pochodzi z hipertermofilnego archeona Nanoarchaeum equitans, który pasożytuje w craenarchaeonie Ignicoccus hospitalis. Optymalne warunki wzrostu tego mikroorganizmu wymagają ściśle beztleno

PL 241 698 B1 wych warunków i temperatury 90°C. Co ciekawe Nanoarchaeum equitans posiada najmniejszy znany genom składający się z 490,885 par zasad. W przeciwieństwie do większości znanych organizmów o obniżonych genomach, posiada pełny zestaw enzymów biorących udział w replikacji, naprawie i rekombinacji DNA, w tym białko SSB.

Białko NeqSSB podobnie jak inne białka z tej rodziny posiada naturalną zdolność wiązania DNA. Składa się z 243 reszt aminokwasowych, a w swojej strukturze ma jedną domenę OB (rys 1). Wykazuje biologiczną aktywność jako monomer, podobnie do niektórych wirusowych białek SSB. Badania wskazują na jego nietypowe dla innych białek SSB zdolności wiązania wszystkich form DNA (ssDNA, dsDNA) oraz mRNA bez strukturalnych preferencji. Ponadto białko charakteryzuje się wysoką termostabilnością. Czas półtrwania przy zachowaniu aktywności biologicznej wynosi 5 min w 100°C, natomiast temperatura topnienia to 100,2°C.

Celem wynalazku jest stworzenie nowej polimerazy Pwo-NeqSSB, która będzie miała zastosowanie do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.

Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ. ID 1.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o SEQ.ID 1, którą otrzymuje się DNA insertu przeznaczonego do klonowania, które polega na przeprowadzeniu dwóch niezależnych reakcji PCR:

- w pierwszej reakcji amplifikacji otrzymuje się produkt o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji genu kodującego polimerazę DNA Pwo z dodatkową sekwencją łącznika oraz komplementarną do 11 początkowych nukleotydów białka NeqSSB na C-końcu;

- drugi produkt zawiera sekwencję nukleotydową genu kodującego białko NeqSSB wiążącego DNA z dodatkowymi nukleotydarni charakterystycznymi dla łącznika oraz 11 dodatkowymi nukleotydarni komplementarnymi do końcowej sekwencji nukleotydowej polimerazy Pwo na N-końcu;

- matrycę do reakcji PCR stanowi wyizolowane genomowe DNA,

- otrzymane produkty w dwóch powyższych reakcjach rozdziela się w żelu agarozowym z bromkiem etydyny i poddaje się izolacji z żelu.

Sposób, gdzie produkty dwóch reakcji PCR służą, jako inserty w reakcji Gibsona, gdzie:

- Trawienie plazmidu pET30EKLIC

- w celu zlinearyzowania plazmidu pET30EKLIC poddaje się go trawieniu enzymem BamHI i Ndel (NEB), które tną w dwóch miejscach zostawiając niekomplementarne do siebie końce DNA,

- reakcję trawienia DNA wektora prowadzi się przez 2 h w temperaturze 37°C z dodatkiem odpowiedniego buforu,

- potrawiony plazmid poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu i izoluje się;

- Reakcja składania genów,

- reakcja Gibsona prowadzi się w termocyklerze w 50°C przez 60 min, gdzie mieszanina zawiera bufor, nukleotydy, enzymy, wodę jałową, insert I, Insert II, wektor,

- po reakcji mieszanina dodaje się do świeżo przygotowanych komórek kompetentnych E. coli TOP10,

- otrzymaną mieszaninę inkubuje się w lodzie przez 40 min, po tym czasie inkubacji przeprowadza się szok termiczny polegający na umieszczeniu mieszaniny komórek na 60 s w termobloku o temperaturze 42°C, a następnie 2 min inkubacji w lodzie, po szoku termicznym komórki poddaje się 60 min inkubacji w 37°C z dodatkiem 600 ml LB, po tym czasie komórki wiruje się (10 min, 1800 obr./min), odrzucono 500 ml przesączu, osad zawieszono w pozostałej ilości supernatantu i wysiano na płytki z podłożem LA z dodatkiem kanamycyny, płytki inkubowano przez ok. 16 h w 37°C.

Sposób, gdzie w celu uzyskania białka fuzyjnego Pwo-Neq SSB, komórki E. coli BL RIL poddaje się transformacji z użyciem DNA plazmidu rekombinantowego pET30-Pwo-NeqSSB i przeprowadza się produkcję pożądanych białek fuzyjnych, hodowle z dodatkiem kanamycyny i chloramfenikolu prowadzi się przez 16 h w 37°C, odmłodzono i po osiągnięciu przez hodowle OD600 = 0,5 dodaje się IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM; po indukcji hodowle prowadzi się jeszcze przez 5 h, po czym wiruje się (10 min, 5000 obr./min) i poddaje się oczyszczaniu metodą metalopowinowactwa; rezultaty produkcji białek analizuje się za pomocą białkowej elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących.

PL 241 698 B1

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany plazmid rekombinantowy, który obejmuje fragment nukleotydowej sekwencji białka kodujące polimerazę Pwo- NeqSSB od 5076 do 8168 z plazmidu pET30EKLIC o SEQ. ID. 5.

Wyizolowany plazmid pET30-Pwo-NeqSSB o sekwencji SEQ.ID.5.

Przedmiotem wynalazku są również startery do klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o sekwencjach SEQ.ID. 6.-9.

Przedmiotem wynalazku jest polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ. ID 1 do zastosowania do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.

Opis rysunków (figur) i sekwencji:

Rys. 1 - przedstawia strukturę czwartorzędową polimerazy DNA Pwo, która składa się z domeny egzonukleazy (kolor niebieski), domeny N-końcowej (kolor fioletowy) oraz trzech subdomen: śródręcza (kolor pomarańczowy), palców (kolor zielony), kciuka (kolor czerwony).

Rys. 2 - schematyczne przedstawienie podstawowych domen występujących w białku NeqSSB Rys. 3 - przedstawia schemat klonowania metodą Gibsona.

Rys. 4 - przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów po reakcji PCR.

A - rozdział produktów po pierwszej reakcji PCR pozwalający na otrzymanie produktu o wielkości 762 pz.

B - rozdział produktów po drugiej reakcji PCR pozwalający na otrzymanie produktu o wielkości 2372 pz. M - marker DNA HyperLadder II, 1-4 oczekiwany produkt PCR.

Rys. 5 - przedstawia rozdział elektroforetyczny plazmidu pD454-SR po reakcji trawienia. M - marker DNA SM0311 (ThermoScientific), 1 - pET30EKLIC nietrawiony,

- pET30EKLIC po reakcji trawienia

Rys. 6 - przedstawia rozdział elektroforetyczny przedstawiający wyniki oczyszczania polimerazy DNA Pwo-Neq na kolumnie ze złożem His-Trap

M - Białkowy marker wielkości (14,4-116 kDa) o wielkości białek wzorcowych: 116; 66,2; 45; 35; 25; 18,4; 14,4 kDa;

- Lizat komórkowy E. coli BL RIL/pET30-Pwo-NeqSSB po sonikacji i denaturacji białek gospodarza

- Frakcja po płukaniu buforem B (200 ml)

- Frakcja po elucji buforem C (15 ml)

- Frakcja po drugiej elucji buforem C (15 ml)

Rys. 7 - przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów po reakcji PCR z dodatkiem różnego stężenia jonów magnezu. 1-0,5 ul Mg2+ 50 mM, 2-0,75 ul Mg2+ 50 mM, 3-1 ul Mg2+‘ 50 mM, 4-1,25 ul Mg2+ 50 mM, 5-1,5 ul Mg2+ 50 mM, 6-1,75 ul Mg2+ 50 mM, 7-2 ul Mg2+ 50 mM, 8-2,25 ul Mg2+ 50 mM, 9-2,5 ul Mg2+ 50 mM, K- - bez magnezu.

Rys. 8 - przedstawia wykres zależności fluorescencji barwnika SybrGreen w czasie prowadzenia reakcji RT qPCR z zastosowaniem polimerazy Pwo-Neq w reakcji identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 na matrycy wyizolowanego RNA wirusowego.

Rys. 9 - przedstawia wykres zależności fluorescencji barwnika SybrGreen w czasie prowadzenia reakcji RT qPCR z zastosowaniem polimerazy Pwo-Neq w reakcji identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 bezpośrednio z wymazu.

Rys. 10 -przedstawia wykres zależności fluorescencji barwnika SybrGreen w czasie prowadzenia reakcji RT qPCR z zastosowaniem polimerazy Pwo-Neq w reakcji identyfikacji wirusa SARS-CoV-2 bezpośrednio ze śliny w buforze rozbijającym.

SEQ. ID 1 - przedstawia sekwencję aminokwasową konstruktu polimerazy fuzyjnej PwoNeqSSB, gdzie: Główny rdzeń polimerazy stanowi polimeraza Pwo, która na swoim C-końcu, za pomocą sześcioaminokwasowego łącznika (GSGGVD), połączona zostanie z białkiem NeqSSB (wyizolowanym z Nanoarchaeum equitans). Obecność łącznika zapewnia białku fuzyjnemu pewną elastyczność i stosunkowo swobodne ułożenie się w stosunku do polimerazy, co ma na celu zapobieganie ewentualnej zawadzie sterycznej.

SEQ.ID.2 - przedstawia sekwencję aminokwasową polimerazy Pwo

SEQ.ID.3 - przedstawia sewkencję aminokwasową łącznika/linkera

SEQ.ID.4 - przedstawia sekwencję aminokwasową białka NeqSSB.

PL 241 698 B1

SEQ.ID.5 - przedstawia sekwencję plazmidu z genem kodującym białko Pwo-NeqSSB SEQ.ID.6-9 - przedstawiają sekwencje starterów

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jego ograniczenia Przykład 1

I. Gen kodujący polimerazę, wektor ekspresyjny, system ekspresyjny

a) Gen kodujący polimerazę Pwo-NeqSSB

Sekwencję aminokwasową polimerazy Pwo-NeqSSB wydłużono o sekwencję domeny histydynowej niezbędnej do efektywnego oczyszczania polimerazy metodą metalopowinowactwa. Domena 6xHis przyłączona została na C-końcu polimerazy. Sekwencja nukleotydowa polimerazy została przedstawiona na SEQ ID 1.

b) Wektor ekspresyjny

Przy wyborze wektora do ekspresji enzymu kierowano się możliwością:

- selekcji antybiotykowej klonów

- przeprowadzenia klonowania i jego namnożenia w komórkach bakteryjnych - obecność promotora umożliwiającego łatwy sposób kontroli i indukcji ekspresji Wybrano wektor pET30EKLIC niosący gen oporności na kanamycynę, bakteryjne Ori replikacji oraz sekwencję promotora laktozowego T7 pozwalającą na indukcję ekspresji za pomocą IPTG. Wektor posiada miejsca rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych BamHI i Ndel, które tną DNA plazmidowe w dwóch miejscach dając dwa niekomplementarne lepkie końce niezbędne na etapie klonowania c) System ekspresyjny

Do ekspresji termostabilnej polimerazy fuzyjnej Pwo-NeqSSB wybrano system prokariotyczny - E. coli, który jest najczęściej stosowanym układem do nadprodukcji białek zarówno na skalę laboratoryjną jak i przemysłową. Wytypowano szczepy IP-Free dostępne przez firmę Promega: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS.

d) Zaprojektowanie starterów SEQ.ID 6

Polimeraz typu Phusion składa się z dwóch białek, które kodowane są przez dwa niezależne geny. Wymusza to zastosowanie metody klonowania, która umożliwi wklonowanie kilku fragmentów DNA jednocześnie. Zdecydowano skorzystać z metody Gibsona, która w jednej reakcji umożliwia wygenerowanie lepkich końców (egzonukleaza 5’^-3’), wydłużanie końców DNA (polimeraz DNA) oraz kowalencyjne połączenie dwóch końców DNA (ligaza DNA) kilku fragmentów jednocześnie. Zastosowano zestaw OverLap firmy A&A Biotechnology. Schemat klonowania przedstawia rysunek 3.

Przykład 2

II. Klonowanie polimerazy Pwo-Neq SSB

a) Amplifikacja produktów przeznaczonych do klonowania

Otrzymanie DNA insertu przeznaczonego do klonowania polegało na przeprowadzeniu dwóch niezależnych reakcji PCR. Pierwsza z reakcji amplifikacji pozwoliła na otrzymanie produktu o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji polimerazy DNA z dodatkową sekwencją łącznika oraz komplementarną do 11 początkowych nukleotydów białka NeqSSB na C-końcu. Drugi produkt zawierał sekwencję nukleotydową białka wiążącego DNA z dodatkowymi nukleotydami charakterystycznymi dla łącznika oraz 11 dodatkowymi nukleotydami komplementarnymi do końcowej sekwencji nukleotydowej polimerazy Pwo na N-końcu. Matrycę do reakcji PCR stanowiło wyizolowane genomowe DNA. Otrzymane produkty w dwóch powyższych reakcjach rozdzielono w żelu agarozowym z bromkiem etydyny i poddano izolacji z żelu z wykorzystaniem zestawu Gel-Out Concentrator (A&A Biotechnology). Wynik otrzymanych produktów po reakcji PCR przedstawia rysunek 4.

Produkty tych dwóch reakcji PCR posłużyły, jako inserty w reakcji Gibsona z wykorzystaniem zestawu OverLap Assembly mix (A&A Biotechnology).

b) Trawienie plazmidu pET30EKLIC

W celu zlinearyzowania plazmidu pET30EKLIC poddano go trawieniu enzymem BamHI i Ndel (NEB), który tnie w dwóch miejscach zostawiając niekomplementarne do siebie końce DNA. Reakcja trawienia DNA wektora prowadzona była przez 2 h w temperaturze 37°C z dodatkiem odpowiedniego buforu zalecanych przez producenta.

PL 241 698 Β1

Potrawiony plazmid poddano rozdziałowi elektroforetycznemu i wyizolowano zestawem Gel-Out Concentrator (A&A Biotechnology). Wynik trawienia przedstawia rysunek 5.

c) Reakcja składania genów

Reakcja Gibsona z wykorzystaniem zestawu OverLap Assembly mix prowadzona była w termocyklerze w 50°C przez 60 min. Skład mieszaniny znajduje się poniżej :

Składnik		Ilość [ml]
Bufor ‘ 5'-OvcrLap	.. Assembly	(A&A A - ~ - *
Biotechnology)	i u
Nukleotydy [10 mM]		2
Enzymy OvcrLap	Assembly	. (A&A 2 “ '
Biotechnology) ~ ;
Woda jałowa		3 ~~
ί Insert, I'[ 150ng/ml]		\ 3:.' - A ’
Insert II [150ng/ml]		3 - .......
[ Wektor [150ng/ml]		3
Objętość końcowa		20

Po reakcji mieszanina dodawana była do świeżo przygotowanych komórek kompetentnych E. coli TOP 10.

d) Transformacja komórek kompetentnych

Mieszaninę po reakcji Gibsona dodano do 100 ml komórek kompetentnych E. coli TOP 10. Otrzymaną mieszaninę inkubowano w lodzie przez 40 min. Po tym czasie inkubacji przeprowadzono szok termiczny polegający na umieszczeniu mieszaniny komórek na 60 s w term obłoku o temperaturze 42°C, a następnie 2 min inkubacji w lodzie. Po szoku termicznym komórki poddano 60 min inkubacji w 37°C z dodatkiem 600 ml LB. Po tym czasie komórki żwirowano (10 min, 1800 obr./min), odrzucono 500 ml przesączu, osad zawieszono w pozostałej ilości supernatantu i wysiano na płytki z podłożem LA z dodatkiem kanamycyny. Płytki inkubowano przez ok. 16 h w 37°C.

Przykład 3

III. Ekspresja i oczyszczanie polimerazy Pwo-Neq SSB

W celu uzyskania białka fuzyjnego Pwo-NeqSSB, komórki E. coli BL RIL poddano transformacji z użyciem DNA plazmidu rekombinantowego pET30-Pwo-NeqSSB i przeprowadzono produkcję pożądanych białek fuzyjnych. Hodowle z dodatkiem kanamycyny i chloramfenikolu prowadzono przez 16 h w 37°C, odmłodzono i po osiągnięciu przez hodowle OD600 = 0,5 dodano IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM. Po indukcji hodowle prowadzono jeszcze przez 5 h, po czym żwirowano (10 min, 5000 obr./min) i poddano oczyszczaniu metodą metalopowinowactwa. Rezultaty produkcji białek analizowano za pomocą białkowej elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) (rysunek 5). Masa molekularna białka obliczona przy pomocy programu komputerowego Expasy wynosiła 118,2 kDa:

Ilość aminokwasów: 1023

Masa molekularna: 118219.00

Teoretyczna wartość pl: 8.46

Wyniki rozdziałów elektroforetycznych przedstawiających stopień oczyszczenia i stężenie białek po każdym etapie oczyszczania przedstawia rysunek 6.

PL 241 698 B1

Przykład 4

IV. Aktywność i zastosowanie polimerazy Pwo-Neq SSB

1) Zastosowanie polimerazy w klasycznej reakcji PCR z detekcja w żelu agarozowym - target fragment plazmidowego DNA pUC19 o wielkości 1200 pz w różnym stężeniu jonów magnezu, Rys. 7.

2) Zastosowanie polimerazy w reakcji real-time PCR - identyfikacja genu S z wykorzystaniem różnych matryc RNA: totalnego RNA wirusa SARS-CoV-2, bezpośrednio z wymazu zainfekowanego wirusem oraz śliny z wirusem SARS- CoV-2.(Rys. 8-10).

Literatura:

[1] Vieille C, Burdette DS, Zeikus JG. Thermozymes. Biotechnol Annu Rev. 1996;2:1-83.

[2] Hamilton SC, Farchaus JW, Davis MC. DNA polymerases as engines for biotechnology. Biotechniques. 2001;31(2):370-6, 378-80, 382-3.

[3] Kim SW, Kim DU, Kim JK, Kang LW, Cho HS. Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. Int J Biol Macromol. 2008;42(4):356-61.

[4] Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, Imanaka T. Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. Appl Environ Microbiol. 1997;63(11):4504-10.

[5] Olszewski M, Balsewicz J, Nowak M, Maciejewska N, Cyranka-Czaja A, Zalewska-Piątek B, et al. Characterization of a Single-Stranded DNA-Binding-Like Protein from Nanoarchaeum equitans - Nucleic Acid Binding Protein with Broad Substrate Specificity. PLoS One. 2015; 10:e0126563.

[6] DNA Modifying enzymes.; Avaliable from:

https:/www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/0AA961B29E444AFBEDD5C4A904C76E6/Datacards or Manusals/ManualE2611 .pdf

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784

SEQUENCE LISTING <110> Instytut Biotechnologii i Medycyny Molekularnej <120> Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy.

< 150> PLP.436784 <151> 2021-01-27 < 160> 9 < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 < 211> 1023 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence

<220> <223> fusior	i 2 f	iroteins
<400> 1 Met Ile Leu	Asp	Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile
1 Arg Leu Phe	Lys	5 10 15 Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg
Thr Phe Arg	20 Pro	25 30 Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile
35 Glu Glu Val	Lys	40 45 Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg
50 Ile Val Asp	Val	55 60 Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile
65 Thr Val Trp	Lys	70 75 80 Leu Tyr Leu Glu His Pro Gin Asp Val Pro Thr Ile
Arg Glu Lys	Val	85 90 95 Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr
Asp Ile Pro	100 Phe	105 110 Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 Met Glu Gly	Glu	120 125 Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 Leu Tyr His	Glu	135 140 Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile
145 Ser Tyr Ala	Asp	150 155 160 Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
Asp Leu Pro	Tyr	165 170 175 Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys
Arg Phe Leu	180 Arg	185 190 Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr
195 Tyr Asn Gly	Asp	200 205 Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu
210		215 220

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784

Lys Leu Gly Ile 225

Met Gin Arg Ile

His Phe Asp Leu 26Θ

Tyr Thr Leu Glu 275

Lys Val Tyr Ala 290

Leu Glu Arg Val 3Θ5

Glu Leu Gly Lys

Val Gly Gin Pro 340

Val Glu Trp Phe 355

Pro Asn Lys Pro 370

Tyr Thr Gly Gly 385

Ile Val Tyr Leu

His Asn Val Ser 420

Asp Ile Ala Pro 435

Phe Ile Pro Ser 450

Lys Thr Lys Met 465

Asp Tyr Arg Gin

Tyr Tyr Gly Tyr 500

Ser Val Thr Ala 515

Leu Glu Glu Lys

S30

Leu Tyr Ala Thr 545

Ala Leu Glu Phe

Glu Leu Glu Tyr

580

Lys Arg Tyr Ala 595

Leu Glu Ile Val

610

Ala Arg Val Leu 625

Lys Leu Thr Ile Gly 230

Gly Asp Met Thr Ala 245

Tyr His Val Ile Thr

265

Ala Val Tyr Glu Ala 280

Asp Glu Ile Ala Lys 295

Ala Lys Tyr Ser Met 310

Glu Phe Leu Pro Met 325

Leu Trp Asp Val Ser 345

Leu Leu Arg Lys Ala 360

Ser Glu Glu Glu Tyr 375

Phe Val Lys Glu Pro 390

Asp Phe Arg Ala Leu 405

Pro Asp Thr Leu Asn

425

Gin Val Gly His Lys 440

Leu Leu Gly His Leu 455

Lys Glu Thr Gin Asp 470

Lys Ala Ile Lys Leu 485

Ala Lys Ala Arg Trp

505

Trp Gly Arg Lys Tyr 520

Phe Gly Phe Lys Val 535

Ile Pro Gly Gly Glu 550

Val Lys Tyr Ile Asn 565

Glu Gly Phe Tyr Lys

585

Val Ile Asp Glu Glu 600

Arg Arg Asp Trp Ser 615

Glu Thr Ile Leu Lys

630

Arg Asp Gly Ser Glu 235

Val Glu Val Lys Gly 250

Arg Thr Ile Asn Leu

270

Ile Phe Gly Lys Pro 285

Ala Trp Glu Ser Gly 300

Glu Asp Ala Lys Ala 315

Glu Ile Gin Leu Ser 330

Arg Ser Ser Thr Gly 350

Tyr Glu Arg Asn Glu 365

Gin Arg Arg Leu Arg 380

Glu Lys Gly Leu Trp 395

Tyr Pro Ser Ile Ile 410

Leu Glu Gly Cys Lys

430

Phe Cys Lys Asp Ile 445

Leu Glu Glu Arg Gin 46Θ

Pro Ile Glu Lys Ile 475

Leu Ala Asn Ser Phe 490

Tyr Cys Lys Glu Cys

510

Ile Glu Leu Val Trp 525

Leu Tyr Ile Asp Thr 540

Ser Glu Glu Ile Lys 555

Ser Lys Leu Pro Gly 570

Arg Gly Phe Phe Val

590

Gly Lys Val Ile Thr 605

Glu Ile Ala Lys Glu 620

His Gly Asp Val Glu 635

Pro Lys 240

Arg Ile 255 Pro Thr

Lys Glu

Glu Asn

Thr Tyr 320

Arg Leu 335 Asn Leu

Val Ala

Glu Ser

Glu Asn 400 Ile Thr 415 Asn Tyr

Pro Gly

Lys Ile

Leu Leu 480 Tyr Gly 495 Ala Glu

Lys Glu

Asp Gly

Lys Lys 560

Leu Leu 575 Thr Lys

Arg Gly

Thr Gin

Glu Ala 640

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784

Val

Arg

Ile Val

Lys 645

Glu

Val

Ile Gin Lys 650

Leu Ala Asn Tyr

Glu 655

He

Pro

Glu

Lys 660

Leu

Ala

Ile

Tyr

Glu 665

Gin

Ile

Thr

Arg

Pro 670

Leu

His

Glu

Tyr

Lys 675

Ala

Ile

Gly

Pro

His 680

Val

Ala

Val

Ala

Lys 685

Lys

Leu

Ala

Lys 690

Gly

Val

Lys

Ile

Lys 695

Pro

Gly

Met

Val

Ile 70Θ

Gly

Tyr

Ile

val

Leu 705

Arg

Gly

Asp

Gly

Pro 710

Ile

Ser

Asn

Arg

Ala 715

Ile

Leu

Ala

Glu

Glu 720

Tyr

Asp

Pro

Lys

Lys 725

His

Lys

Tyr

Asp

Ala 730

Glu

Tyr

Ile

Glu 735

Asn

Gin

Val

Leu

Pro 740

Ala

Val

Leu

Arg

Ile 745

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly 750

Tyr

Arg

Lys

Glu

Asp 755

Leu

Arg

Tyr

Gin

Lys 760

Thr

Arg

Gin

Val

Gly 765

Leu

Thr

Ser

Trp

Leu 770

Asn

Ile

Lys

Ser 775

Gly

Ser

Gly

Val 780

Asp

Glu

Glu 785

Leu

Ile

Gin

Leu

Ile 790

Ile

Glu

Lys

Thr

Gly 795

Lys

Ser

Arg

Glu

Glu 800

Ile

Glu

Lys

Met

Val 805

Glu

Lys

Ile

Lys 810

Ala

Phe

Asn

Leu 815

Ile

Ser

Arg

Gly 820

Ala

Leu

Val 825

Ala

Lys

Leu

Gly 830

Val

Leu

Tyr

Lys

Asn 835

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys 840

Lys

Ile

Gly

Glu

Leu 845

Glu

Ser

Trp

Glu

Tyr 850

Val

Lys

Val

Lys

Gly 855

Lys

Ile

Leu

Lys

Ser 860

Phe

Gly

Leu

Ile

Ser 865

Tyr

Ser

Lys

Gly

Lys 870

Phe

Gin

Pro

Ile

Ile 875

Leu

Gly

Asp

Glu

Thr 880

Gly

Thr

Ile

Lys

Ala 885

Ile

Trp

Asn

Thr 890

Asp

Lys

Glu

Leu

Pro 895

Glu

Asn

Thr

Val

Ile 900

Glu

Ala

Ile

Gly

Lys 905

Thr

Lys

Ile

Asn

Lys 910

Lys

Thr

Gly

Asn

Leu 915

Glu

Leu

His

Ile

Asp 920

Ser

Tyr

Lys

Ile

Leu 925

Glu

Ser

Asp

Leu

Glu 930

Ile

Lys

Pro

Gin

Lys 935

Gin

Glu

Phe

Val

Gly 940

Ile

Cys

Ile

Val

Lys 945

Tyr

Pro

Lys

Gin 950

Thr

Gin

Lys

Gly

Thr

Ile

Val

Ser

Lys

Ala 960

Ile

Leu

Thr

Ser

Leu 965

Asp

Arg

Glu

Leu

Pro 970

Val

Tyr

Phe

Asn 975

Asp

Phe

Asp

Trp

Glu 980

Ile

Gly

His

Ile

Tyr 985

Lys

Val

Tyr

Gly

Lys 990

Leu

Lys

Asn

Ile 995

Lys

Thr

Gly

Lys

He 1000

Glu

Phe

Ala

Asp 1005

Lys

Val

Glu

Ala 1010

Thr

Leu

Lys

Asp

Leu 1015

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly 1020

Glu

Ala

Asp

<210> 2 <211> 775 <212> PRT

PL 241 698 Β1 <213> Pyrococcus furiosus

IBiMM _seq_P.436784 <400> 2

Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile 15

Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly 20

Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala

3540

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly 5055

Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu 6570

Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu 85

Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro 100

Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr

115120

Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys 130135

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe

14515Θ

Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala 165

Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val 180

Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu

195200

Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe 210215

Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile 225230

Met Gin Arg Ile Gly Asp Met Thr 245

His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile 26Θ

Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu

275280

Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala 290295

Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser

305310

Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro 325

Val Gly Gin Pro Leu Trp Asp Val 340

Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys

355360

Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu

370375

Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile 1015

Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg 2530

Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile 45

Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg 60

Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile 7580

His Pro Gin Asp Val Pro Thr Ile 9095

Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr 105110

Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro 125

Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 140

Gly Lys Gly Pro ile Ile Met Ile 155160

Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile 170175

Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys 185190

Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr 205

Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu 220

Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 235240

Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 250255

Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 26527Θ

Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 285

Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn 300

Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr 315320

Met Glu Ile Gin Leu Ser Arg Leu 330335

Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 345350

Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala 365

Tyr Gin Arg Arg Leu Arg Glu Ser 380

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784

Tyr Thr	Gly	Gly	Phe Val Lys	Glu Pro Glu	Lys	Gly	Leu	Trp	Glu	Asn
385 Ile Val	Tyr	Leu	390 Asp Phe Arg	Ala Leu Tyr	395 Pro	Ser	Ile	Ile	Ile	400 Thr
His Asn	Val	Ser	405 Pro Asp Thr	410 Leu Asn Leu	Glu	Gly	Cys	Lys	415 Asn	Tyr
Asp Ile	Ala	420 Pro	Gin Val Gly	425 His Lys Phe	Cys	Lys	Asp	430 Ile	Pro	Gly
Phe Ile	435 Pro	Ser	Leu Leu Gly	440 His Leu Leu	Glu	Glu	445 Arg	Gin	Lys	Ile
450 Lys Thr	Lys	Met	455 Lys Glu Thr	Gin Asp Pro	Ile	460 Glu	Lys	Ile	Leu	Leu
465 Asp Tyr	Arg	Gin	470 Lys Ala Ile	Lys Leu Leu	475 Ala	Asn	Ser	Phe	Tyr	480 Gly
Tyr Tyr	Gly	Tyr	485 Ala Lys Ala	490 Arg Trp Tyr	Cys	Lys	Glu	Cys	495 Ala	Glu
Ser Val	Thr	500 Ala	Trp Gly Arg	505 Lys Tyr Ile	Glu	Leu	Val	510 Trp	Lys	Glu
Leu Glu	515 Glu	Lys	Phe Gly Phe	520 Lys Val Leu	Tyr	Ile	525 Asp	Thr	Asp	Gly
530 Leu Tyr	Ala	Thr	535 Ile Pro Gly	Gly Glu Ser	Glu	540 Glu	Ile	Lys	Lys	Lys
545 Ala Leu	Glu	Phe	550 Val Lys Tyr	Ile Asn Ser	555 Lys	Leu	Pro	Gly	Leu	560 Leu
Glu Leu	Glu	Tyr	565 Glu Gly Phe	570 Tyr Lys Arg	Gly	Phe	Phe	Val	575 Thr	Lys
Lys Arg	Tyr	580 Ala	Val Ile Asp	585 Glu Glu Gly	Lys	Val	Ile	590 Thr	Arg	Gly
Leu Glu	595 Ile	val	Arg Arg Asp	600 Trp Ser Glu	Ile	Ala	605 Lys	Glu	Thr	Gin
610 Ala Arg	Val	Leu	615 Glu Thr Ile	Leu Lys His	Gly	620 Asp	Val	Glu	Glu	Ala
625 Val Arg	Ile	Val	630 Lys Glu Val	Ile Gin Lys	635 Leu	Ala	Asn	Tyr	Glu	640 Ile
Pro Pro	Glu	Lys	645 Leu Ala Ile	650 Tyr Glu Gin	Ile	Thr	Arg	Pro	655 Leu	His
Glu Tyr	Lys	660 Ala	Ile Gly Pro	665 His Val Ala	Val	Ala	Lys	670 Lys	Leu	Ala
Ala Lys	675 Gly	Val	Lys Ile Lys	680 Pro Gly Met	Val	Ile	685 Gly	Tyr	Ile	Val
690 Leu Arg	Gly	Asp	695 Gly Pro Ile	Ser Asn Arg	Ala	70Θ Ile	Leu	Ala	Glu	Glu
705 Tyr Asp	Pro	Lys	710 Lys His Lys	Tyr Asp Ala	715 Glu	Tyr	Tyr	Ile	Glu	720 Asn
Gin Val	Leu	Pro	725 Ala Val Leu	730 Arg Ile Leu	Glu	Gly	Phe	Gly	735 Tyr	Arg
Lys Glu	Asp	740 Leu	Arg Tyr Gin	745 Lys Thr Arg	Gin	Val	Gly	750 Leu	Thr	Ser
Trp Leu 770	755 Asn	Ile	Lys Lys Ser 775	760			765

<210> 3

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> Linker <400> 3

Gly Ser Gly Gly Val Asp 1 5 <210> 4 <211> 242 <212> PRT <213> Bacteria <prokaryote>

<400> 4

Asp Glu Glu 1

Arg Glu Glu

Asn Leu Ile

Gly Val Leu 50

Glu Ser Trp 65

Gly Leu ile

Asp Glu Thr

Leu Pro Glu

115

Lys Lys Thr 130

Glu Ser Asp 145

Cys Ile Val

Ser Lys Ala

Phe Asn Asp 195

Lys Leu Lys 21Θ

Lys Val Glu 225 Ala Asp

Glu Leu ile	Gin	Leu	Ile	Ile 10
	5
Ile 20	Glu Lys	Met	Val	Glu 25	Glu
Ser	Arg Arg	Gly	Ala 40	Leu	Leu
Tyr	Lys Asn	Thr 55	Pro	Lys	Glu
Glu	Tyr Val 70	Lys	Val	Lys	Gly
Ser	Tyr Ser 85	Lys	Gly	Lys	Phe 90
Gly 100	Thr Ile	Lys	Ala	Ile 105	Ile
Asn	Thr Val	Ile	Glu 120	Ala	Ile
Gly	Asn Leu	Glu 135	Leu	His	Ile
Leu	Glu Ile 150	Lys	Pro	Gin	Lys
Lys	Tyr Pro 165	Lys	Lys	Gin	Thr 170
Ile 180	Leu Thr	Ser	Leu	ASp 185	Arg
Phe	Asp Trp	Glu	Ile 200	Gly	His
Lys	Asn Ile	Lys 215	Thr	Gly	Lys
Glu	Ala Thr 230	Leu	Lys	Asp	Leu

Glu	Lys	Thr	Gly	Lys 15	Ser
Lys	Ile	Lys	Ala 30	Phe	Asn
Leu	Val	Ala 45	Lys	Lys	Leu
Lys	Lys 60	Ile	Gly	Glu	Leu
Lys 75	Ile	Leu	Lys	Ser	Phe 80
Gin	Pro	Ile	Ile	Leu 95	Gly
Trp	Asn	Thr	Asp 110	Lys	Glu
Gly	Lys	Thr 125	Lys	Ile	Asn
Asp	Ser 140	Tyr	Lys	Ile	Leu
Gin 155	Glu	Phe	Val	Gly	Ile 160
Gin	Lys	Gly	Thr	Ile 175	Val
Glu	Leu	Pro	Val 190	Val	Tyr
Ile	Tyr	Lys 205	Val	Tyr	Gly
Ile	Glu 220	Phe	Phe	Ala	Asp
Lys 235	Ala	Phe	Lys	Gly	Glu 240

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784 <210> 5 <211> 8371 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> Recombinant plasmide pET30 EKLIC < 400> 5 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta540 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat600 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc720 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc840 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag1080 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg1260

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784

ttgtgagggt	aaacaactgg	cggtatggat	gcggcgggac	cagagaaaaa	tcactcaggg	2880
tcaatgccag	cgcttcgtta	atacagatgt	aggtgttcca	cagggtagcc	agcagcatcc	2940
tgcgatgcag	atccggaaca	taatggtgca	gggcgctgac	ttccgcgttt	ccagacttta	3000
cgaaacacgg	aaaccgaaga	ccattcatgt	tgttgctcag	gtcgcagacg	ttttgcagca	3060
gcagtcgctt	cacgttcgct	cgcgtatcgg	tgattcattc	tgctaaccag	taaggcaacc	3120
ccgccagcct	agccgggtcc	tcaacgacag	gagcacgatc	atgcgcaccc	gtggggccgc	3180
catgccggcg	ataatggcct	gcttctcgcc	gaaacgtttg	gtggcgggac	cagtgacgaa	3240
ggcttgagcg	agggcgtgca	agattccgaa	taccgcaagc	gacaggccga	tcatcgtcgc	3300
gctccagcga	aagcggtcct	cgccgaaaat	gacccagagc	gctgccggca	cctgtcctac	3360
gagttgcatg	ataaagaaga	cagtcataag	tgcggcgacg	atagtcatgc	cccgcgccca	3420
ccggaaggag	ctgactgggt	tgaaggctct	caagggcatc	ggtcgagatc	ccggtgccta	3480
atgagtgagc	taacttacat	taattgcgtt	gcgctcactg	cccgctttcc	agtcgggaaa	3540
cctgtcgtgc	cagctgcatt	aatgaatcgg	ccaacgcgcg	gggagaggcg	gtttgcgtat	3600
tgggcgccag	ggtggttttt	cttttcacca	gtgagacggg	caacagctga	ttgcccttca	3660
ccgcctggcc	ctgagagagt	tgcagcaagc	ggtccacgct	ggtttgcccc	agcaggcgaa	3720
aatcctgttt	gatggtggtt	aacggcggga	tataacatga	gctgtcttcg	gtatcgtcgt	3780
atcccactac	cgagatgtcc	gcaccaacgc	gcagcccgga	ctcggtaatg	gcgcgcattg	3840
cgcccagcgc	catctgatcg	ttggcaacca	gcatcgcagt	gggaacgatg	ccctcattca	3900
gcatttgcat	ggtttgttga	aaaccggaca	tggcactcca	gtcgccttcc	cgttccgcta	3960
tcggctgaat	ttgattgcga	gtgagatatt	tatgccagcc	agccagacgc	agacgcgccg	4020
agacagaact	taatgggccc	gctaacagcg	cgatttgctg	gtgacccaat	gcgaccagat	4080
gctccacgcc	cagtcgcgta	ccgtcttcat	gggagaaaat	aatactgttg	atgggtgtct	4140
ggtcagagac	atcaagaaat	aacgccggaa	cattagtgca	ggcagcttcc	acagcaatgg	4200
catcctggtc	atccagcgga	tagttaatga	tcagcccact	gacgcgttgc	gcgagaagat	4260
tgtgcaccgc	cgctttacag	gcttcgacgc	cgcttcgttc	taccatcgac	accaccacgc	4320
tggcacccag	ttgatcggcg	cgagatttaa	tcgccgcgac	aatttgcgac	ggcgcgtgca	4380

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980 gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040 ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgat tttagatgtg gattacataa 5100 ctgaagaagg aaaacctgtt attaggctat tcaaaaaaga gaacggaaaa tttaagatag 5160 agcatgatag aacttttaga ccatacattt acgctcttct cagggatgat tcaaagattg 5220 aagaagttaa gaaaataacg ggggaaaggc atggaaagat tgtgagaatt gttgatgtag 5280 agaaggttga gaaaaagttt ctcggcaagc ctattaccgt gtggaaactt tatttggaac 5340 atccccaaga tgttcccact attagagaaa aagttagaga acatccagca gttgtggaca 54Θ0 tcttcgaata cgatattcca tttgcaaaga gatacctcat cgacaaaggc ctaataccaa 5460 tggaggggga agaagagcta aagattcttg ccttcgatat agaaaccctc tatcacgaag 5520 gagaagagtt tggaaaaggc ccaattataa tgattagtta tgcagatgaa aatgaagcaa 5580 aggtgattac ttggaaaaac atagatcttc catacgttga ggttgtatca agcgagagag 5640 agatgataaa gagatttctc aggattatca gggagaagga tcctgacatt atagttactt 5700 ataatggaga ctcattcgac ttcccatatt tagcgaaaag ggcagaaaaa cttgggatta 5760 aattaaccat tggaagagat ggaagcgagc ccaagatgca gagaataggc gatatgacgg 5820 ctgtagaagt caagggaaga atacatttcg acttgtatca tgtaataaca aggacaataa 5880 atctcccaac atacacacta gaggctgtat atgaagcaat ttttggaaag ccaaaggaga 5940

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784 aggtatacgc cgacgagata gcaaaagcct gggaaagtgg agagaacctt gagagagttg 6000 ccaaatactc gatggaagat gcaaaggcaa cttatgaact cgggaaagaa ttccttccaa 6060 tggaaattca gctttcaaga ttagttggac aacctttatg ggatgtttca aggtcaagca 6120 cagggaacct tgtagagtgg ttcttactta ggaaagccta cgaaagaaac gaagtagctc 6180 caaacaagcc aagtgaagag gagtatcaaa gaaggctcag ggagagctac acaggtggat 6240 tcgttaaaga gccagaaaag gggttgtggg aaaacatagt atacctagat tttagagccc 6300 tatatccctc gattataatt acccacaatg tttctcccga tactctaaat cttgagggat 6360 gcaagaacta tgatatcgct cctcaagtag gccacaagtt ctgcaaggac atccctggtt 6420 ttataccaag tctcttggga catttgttag aggaaagaca aaagattaag acaaaaatga 6480 aggaaactca agatcctata gaaaaaatac tccttgacta tagacaaaaa gcgataaaac 6540 tcttagcaaa ttctttctac ggatattatg gctatgcaaa agcaagatgg tactgtaagg 6600 agtgtgctga gagcgttact gcctggggaa gaaagtacat cgagttagta tggaaggagc 6660 tcgaagaaaa gtttggattt aaagtcctct acattgacac tgatggtctc tatgcaacta 6720 tcccaggagg agaaagtgag gaaataaaga aaaaggctct agaatttgta aaatacataa 6780 attcaaagct ccctggactg ctagagcttg aatatgaagg gttttataag aggggattct 6840 tcgttacgaa gaagaggtat gcagtaatag atgaagaagg aaaagtcatt actcgtggtt 6900 tagagatagt taggagagat tggagtgaaa ttgcaaaaga aactcaagct agagttttgg 6960 agacaatact aaaacacgga gatgttgaag aagctgtgag aatagtaaaa gaagtaatac 7020 aaaagcttgc caattatgaa attccaccag agaagctcgc aatatatgag cagataacaa 7080 gaccattaca tgagtataag gcgataggtc ctcacgtagc tgttgcaaag aaactagctg 7140 ctaaaggagt taaaataaag ccaggaatgg taattggata catagtactt agaggcgatg 7200 gtccaattag caatagggca attctagctg aggaatacga tcccaaaaag cacaagtatg 7260 acgcagaata ttacattgag aaccaggttc ttccagcggt acttaggata ttggagggat 7320 ttggatacag aaaggaagac ctcagatacc aaaagacaag acaagtcggc ctaacttcct 7380 ggcttaacat taaaaaatcc ggaagcggag gggtcgacga tgaagaggaa ctaatacaac 7440 taataataga aaaaactggc aaatctcgag aggaaataga aaaaatggtg gaagaaaaaa 7500

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784

ttaaagcttt	taacaattta	atatctcgta	ggggggcttt	actattagta	gcaaaaaaac	7560
ttggtgtttt	gtataaaaac	actccgaaag	agaaaaaaat	tggcgaatta	gaaagctggg	7620
aatatgtaaa	agtaaagggc	aaaattctca	aatcttttgg	attaattagt	tattcgaaag	7680
ggaaattcca	acctattatt	ttaggagacg	aaaccggtac	tattaaagct	attatttgga	7740
ataccgataa	agaattacct	gaaaacactg	taatagaagc	tattgggaaa	accaaaatta	7800
ataagaaaac	tggcaattta	gaattacata	tagacagtta	taaaatttta	gaaagcgatt	7860
tagagataaa	accccaaaag	caagaatttg	ttgggatttg	catagttaaa	tatccaaaaa	7920
aacaaaccca	aaaaggcaca	atagtatcga	aagcaatttt	aactagctta	gatagggaat	7980
tgcctgtagt	atatttcaac	gattttgatt	gggaaatagg	ccatatatat	aaagtatatg	8040
gaaagcttaa	gaaaaacata	aaaactggta	aaatagaatt	tttcgctgac	aaagttgagg	8100
aagcaacatt	aaaagatcta	aaagctttta	aaggagaggc	cgattgacac	caccaccacc	8160
accactaggg	atccgaattc	gagctccgtc	gacaagcttg	cggccgcact	cgagcaccac	8220
caccaccacc	actgagatcc	ggctgctaac	aaagcccgaa	aggaagctga	gttggctgct	8280
gccaccgctg	agcaataact	agcataaccc	cttggggcct	ctaaacgggt	cttgaggggt	8340
tttttgctga	aaggaggaac	tatatccgga	t			8371

<210> 6 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> donic primer <400> 6 aactttaaga aggagatata catatgattt tagatgtgga ttacataact gaagaag 57 <21B> 7 <211> 49 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> donic primer

PL 241 698 Β1

IBiMM _seq_P.436784 <400> 7 tcgtcgaccc ctccgcttcc ggatttttta atgttaagcc aggaagtta 49 <210> 8 <211> 51 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> donic primer <400> 8 ccggaagcgg aggggtcgac gatgaagagg aactaataca actaataata g 51 <210> 9 <211> 78 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> donic primer < 400> 9 gcaagcttgt cgacggagct cgaattcgga tccttagtgg tggtggtggt ggtgtcaatc 60 ggcctctcct ttaaaagc 78

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ. ID 1.
2. Sposób klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o SEQ.ID 1, znamienny tym, że otrzymuje się DNA insertu przeznaczonego do klonowania, które polega na przeprowadzeniu dwóch niezależnych reakcji PCR:

- w pierwszej reakcji amplifikacji otrzymuje się produkt o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji genu kodującego polimerazę DNA Pwo z dodatkową sekwencją łącznika oraz komplementarną do 11 początkowych nukleotydów białka NeqSSB na C-końcu;

- drugi produkt zawiera sekwencję nukleotydową genu kodującego białko NeqSSB wiążącego DNA z dodatkowymi nukleotydami charakterystycznymi dla łącznika oraz 11 dodatkowymi nukleotydami komplementarnymi do końcowej sekwencji nukleotydowej polimerazy Pwo na N-końcu;

- matrycę do reakcji PCR stanowi wyizolowane genom owe DNA,

- otrzymane produkty w dwóch powyższych reakcjach rozdziela się w żelu agarozowym z bromkiem etydyny i poddaje się izolacji z żelu.
3. Sposób według zastrz.2, znamienny tym, że produkty dwóch reakcji PCR służą, jako inserty w reakcji Gibsona, gdzie:

- Trawienie plazmidu pET30EKLIC

PL 241 698 B1

- w celu zlinearyzowania plazmidu pET30EKLIC poddaje się go trawieniu enzymem BamHI i Ndel (NEB), które tną w dwóch miejscach zostawiając niekomplementarne do siebie końce DNA,

- reakcję trawienia DNA wektora prowadzi się przez 2 h w temperaturze 37°C z dodatkiem odpowiedniego buforu,

- potrawiony plazmid poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu i izoluje się;

- Reakcja składania genów

- reakcja Gibsona prowadzi się w termocyklerze w 50°C przez 60 min, gdzie mieszanina zawiera bufor, nukleotydy, enzymy, wodę jałową, insert I, Insert II, wektor,

- po reakcji mieszanina dodaje się do świeżo przygotowanych komórek kompetentnych E. coli TOP10,

- otrzymaną mieszaninę inkubuje się w lodzie przez 40 min, po tym czasie inkubacji przeprowadza się szok termiczny polegający na umieszczeniu mieszaniny komórek na 60 s w termobloku o temperaturze 42°C, a następnie 2 min inkubacji w lodzie, po szoku termicznym komórki poddaje się 60 min inkubacji w 37°C z dodatkiem 600 ml LB, po tym czasie komórki wiruje się (10 min, 1800 obr./min), odrzucono 500 ml przesączu, osad zawieszono w pozostałej ilości supernatantu i wysiano na płytki z podłożem LA z dodatkiem kanamycyny, płytki inkubowano przez ok. 16 h w 37°C.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w celu uzyskania białka fuzyjnego Pwo-NeqSSB, komórki E. coli BL RIL poddaje się transformacji z użyciem DNA plazmidu rekombinantowego pET30-Pwo-NeqSSB i przeprowadza się produkcję pożądanych białek fuzyjnych, hodowle z dodatkiem kanamycyny i chloramfenikolu prowadzi się przez 16 h w 37°C, odmłodzono i po osiągnięciu przez hodowle OD600 = 0,5 dodaje się IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM; po indukcji hodowle prowadzi się jeszcze przez 5h, po czym wiruje się (10 min, 5000 obr./min) i poddaje się oczyszczaniu metodą metalopowinowactwa; rezultaty produkcji białek analizuje się za pomocą białkowej elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących.
5. Wyizolowany plazmid rekombinantowy, znamienny tym, że obejmuje fragment nukleotydowej sekwencji białka kodujące polimerazę Pwo-NeqSSB od 5076 do 8168 z plazmidu pET30EKLIC o SEQ.ID.5.
6. Wyizolowany plazmid pET30-Pwo-NeqSSB o sekwencji SEQ.ID.5.
7. Startery do klonowania polimerazy Pwo-NeqSSB o sekwencjach SEQ.ID.6-9.
8. Polimeraza Pwo-NeqSSB o SEQ.ID do zastosowania do powielania specyficznych sekwencji wirusa SARS CoV-2.