CN101948908A - 一种区分dna与相应rna的核酸扩增检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属医学检测技术领域，具体为一种区分DNA与相应转录的RNA的核酸扩增检测方法，并提供相应的检测试剂盒。该试剂盒包括裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆转录缓冲液、逆转录酶系、结核DNA PCR反应液、结核RNA PCR反应液等。其中选用的引物分别针对结核杆菌染色体DNA的一段ITS序列或IS6110序列、核糖体RNA上的一段16Sr RNA的序列，探针最好为Tagman MGB探针，并选用不同的荧光素标记。本发明的试剂盒，含有UNG酶组分，可以判定每个细菌内含有16S r RNA的相对量，用来判断标本中的结核杆菌的生长情况以监测感染状态。本发明简便快捷，可专一性RNA及专一性DNA检测，为临床提供更全面的信息。

Description

一种区分DNA与相应RNA的核酸扩增检测方法和检测试剂盒

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种区分DNA与相应RNA的核酸扩增检测方法和检测试剂盒。

背景技术

结核病是严重影响人类健康的慢性消耗性传染病。由于移民、吸毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染、结核杆菌耐多药性及人畜共患传染病等因素，全球每1秒钟就有1个新感染者出现，每年新发结核病人达850-1000万，300万人死于结核病，且新的发病率有逐年增加的趋势。目前，全球约有10-20亿人感染结核菌。这给全球结核病防治工作提出了新的挑战。结核病的严峻形势促使全球基金机构和科学家探讨新的方法来诊断、预防和治疗结核病。结核病不仅已成为21世纪严重危害人类健康的公共卫生问题，而且也已成为严重的经济、社会、政治问题。WHO将结核病作为重点控制的传染病，1993年，WHO宣布“全球结核病处于紧急状态”；1998年，WHO再次指出：“遏制结核病行动刻不容缓”；2000年3月，WHO与WB在荷兰阿姆斯特丹召开“结核病控制与可持续发展部长会议”。全球80％结核病人在22个高负担国家，中国是22个结核病高负担国家之一，中国的结核病人仅次于印度居于第二位，结核病死亡占全球结核病死亡的1/4。我国目前有上亿人感染有结核分枝杆菌，结核病患者约600万人，每年因治疗不及时造成死亡的人数约25.6万余人。如果不尽快改进结核病的控制措施，将有2亿多人发展成活动性肺结核。

结核病是病原学清楚、治疗用药方案基本确定的一种疾病。结核分枝杆菌复合群(MTC)是结核病的元凶，分类学上归属分枝杆菌属(该属分为结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌三类150种以上)，该复合群包括人型结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)、非洲结核分枝杆菌(M.Africanum I、II，主要流行于非洲)、牛型结核分枝杆菌(M.Bovis)、卡介苗(M.Bovis BCG，为牛型结核分枝杆菌的减毒株，是活菌疫苗，接种量不当可致病)、田鼠分枝杆菌(M.Microti)、卡氏分枝杆菌(M.Canetti)等，均对抗结核药物敏感。非结核分枝杆菌(NTM)原称非典型分枝杆菌，也是广泛分布的环境分枝杆菌，为条件致病菌(对绝大多数正常人为非致病菌)，对常用的抗结核药物不敏感。

常用的结核病诊断方法为细菌学检查：(1)痰涂片镜检法：最普遍、最基本的细菌学检查方法，优点是简单、快速、廉价，当天出结果；缺点是无法辨别死菌活菌，敏感性低，通常需5000～10000条菌/ml才能够得到阳性结果，特异性差，抗酸杆菌均可着色，阳性只能说明“分枝杆菌属阳性”，需要进一步试验才可确定。有关镜检法的研究和评价很多，但由于显微形态学检测原理与方法学的限制，不可能出现突破性的进展。(2)痰常规培养法(罗氏培养基)：是鉴定死菌活菌的可靠方法，被誉为“金标准”。缺点是时间长，需8周才能报出结果，操作难于标准化，不同实验室报道阳性率差异较为显著；敏感性中等，一般认为大于100～1000条菌/ml才能够得到阳性结果；特异性中等，各种分枝杆菌均可生长，需结合药物敏感性试验和分枝杆菌菌种鉴定，才可确定是否为结核菌。(3)药物敏感性试验：用于鉴定结核菌对抗菌素药物的敏感性水平。这项试验通常是在痰结核菌培养的基础上进行的，故需时更长。(4)分枝杆菌菌种鉴定：是根据不同分枝杆菌的理化特性，以生物化学的方法为主。可以精确地鉴定分枝杆菌的不同菌种，但操作复杂，且个别试验使用的药品，有一定的危险性。(5)痰结核菌快培系统(仪器快速培养：BD公司的BACTECTB 460^TM system及BACTEC MGIT^TM 960 system)：20世纪70年代发展的一种新的结核病细菌学检查方法-痰结核菌快速培养、药敏系统。该方法将阳性检出时间较L-J法明显缩短，从常规培养的8周缩短到3-14d，且具有操作简便、自动化强、灵敏度高等优点，可以检测出大于100～1000条菌/ml，在结核病的细菌学诊断中起到了重要作用，促进了结核病细菌学诊断的发展。主要问题是仪器与试剂价格昂贵，检测时间仍然较长，结果可靠性与传统培养法相比仍存有争议等，还难以用作快速检测。(6)噬菌体生物扩增法：灵敏度较高，可达100条菌/ml，但与细菌培养相比，试验条件更为苛刻，检出率低，因此目前评价不高。

上述常规检测方法均因灵敏度低、特异性差、费时费力等诸多原因难以满足早期诊断与快速诊断的需要。近年来随着分子生物学技术的发展，核酸诊断尤其是荧光PCR(灵敏度一般为1-10条菌/ml)的广泛应用，使得结核病的快速准确诊断成为可能，已有获得SFDA医疗器械注册证的荧光PCR产品上市。目前评价较高的商售MTC核酸诊断试剂有三种，为Roche公司的TB Amplicor(采用PCR技术，检测TB的16S r DNA)、Gen-Probe公司的Amplified MTD(采用TMA技术检测TB的16S r RNA)、BD公司的BD ProbeTec ET(采用SDA方法扩增，发夹探针杂交技术检测TB的IS6110 DNA和16S rDNA)，其中Amplified MTD被业内公认为与细菌培养符合率最高的核酸试剂，也是当前评价最高的结核核酸诊断产品。一般认为与其检测对象为RNA而非DNA有关，因为DNA结构稳定，细菌死亡后可以在很长时间内仍为阳性，而PCR的灵敏度高，有痕量的菌体DNA残留，可测为阳性；RNA半衰期短，细菌死亡后，很快降解，与细菌的活性相关。简而言之，DNA检测不能区分死菌还是活菌，合适的RNA检测可以区分死活菌，DNA检测与RNA检测结核杆菌都有其相对的临床意义。然而，现有的结核诊断尚无一种同步检测其DNA与RNA的试剂，究其原因，在于缺乏一种核酸扩增方法可以同步特异检测其DNA与RNA，例如PCR方法，由于PCR无法直接对RNA进行扩增，需经一个逆转录(RT)过程，将RNA转成DNA后再行扩增，无法区分相应的DNA与RNA，比如RT-PCR法检测16Sr RNA时，其相应的16Sr DNA也被高效地扩增，无法区分检测的是DNA还是RNA。再如TMA方法，由于采用等温扩增技术，温度较低，染色体DNA没有变性，参与扩增的是单链RNA，因此，不能直接用作DNA检测，除非扩增前增加一步“高温变性”的步骤；另外，即使增加了热变性步骤，也无法区分DNA与RNA。单一性检测结核DNA或RNA的核酸试剂由于不能给出比痰培养更多的信息，专家认为核酸诊断并没有达到预期的效果，多数学者认为其诊断准确性还不如细菌培养，部分学者甚至并不认可荧光PCR的结果。

因此本领域迫切需要一种快速、准确、灵敏的核酸检测试剂，尤其是能够同步检测结核杆菌DNA与RNA的快速诊断试剂。针对上述情况，我们通过独特设计，建立了一种适合于国情的结核杆菌复合群DNA与RNA同步检测的新型荧光PCR方法和试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、检测速度快的能区分DNA和相应RNA的核酸扩增检测方法和检测试剂盒。

本发明包括提供一种操作简捷快速、可半自动化的总核酸(DNA和RNA)提取试剂，并提供一种通过实时荧光PCR法区分检测DNA与相应转录RNA的扩增试剂，并以结核病诊断为例，详述本发明的具体内容。就结核病的致病菌MTC来说，根据本发明的方法，可以得到结核患者标本中细胞质RNA和染色体DNA相对数量的双重信息，便于了解患者体内结核杆菌的生长繁殖状态，是死菌还是活菌，同时克服传统微生物检测及蛋白检测的缺陷和不足，而且弥补了现有国内外诊断产品的缺陷。就基因表达而言，可以借助本发明研究某个基因与其转录RNA的数量，从而在基因表达调控研究领域获得精准的数据。

本发明基本内容如下：

1.建立了一种专一检测RNA而不能混有其相应DNA信息的方法。本发明的发明人在长期实践中建立了一种专一检测单链RNA而不能检测其相应DNA的末端序列依赖TSD-RT-PCR方法，其特征是检测RNA的末端，或者说依赖于RNA末端的存在。原理类似于真核生物表达文库构建时采用的全长m RNA克隆的SMART技术，但有别于该技术(SMART是一种对未知序列的m RNA全长进行克隆为目标的扩增技术，而本技术是对已知全长序列的某基因进行表达研究)。具体如下(如附图1所示)：设计一条与检测RNA末端部分互补的辅助寡核苷酸，该寡核酸序列由位于5’端的S区与位于3’端的T区组成，其T区序列与检测靶RNA的末端互补，S区的序列与人工引物一致，S与T中间可隔几个碱基；人工引物是用作扩增的引物之一，其序列可由设计者自由引入。整个检测体系中含有RT引物、人工引物、辅助寡核酸、TaqMan探针等4种寡核酸。其中由RT引物与人工引物组成一对有效的扩增引物对；辅助寡核酸只用作逆转录后的延伸，PCR扩增前为UNG消化降解，不进入扩增检测环节，为防止辅助寡核酸自行延伸，将其3’端封闭或修饰其自由羟基；TaqMan-MGB探针用作扩增产物的检测。

具体步骤如下：

a)逆转录与RNA 5’末端转换模板合成：RT引物(16R)以16S rRNA为模板，在逆转录酶作用下延伸，当延伸至5’末端时，与反应体系中的辅助寡核苷酸杂交而通过SMART机制继续合成至辅助寡核苷酸的5’末端。

SMART为“Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript”的缩写，通常用在以微量mRNA为起始模板，逆转录后扩增得到全长cDNA的表达文库构建中。由于mRNA含有5’帽子结构与3’Poly A，在合成cDNA的反应中事先加入的3’末端带Oligo(dG)的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个(dC)，SMART引物的Oligo(dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。该技术实际上是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性。

类似地，本发明采用的辅助寡核苷酸其T区相当于Oligo(dG)，S区相当于SMART引物。当逆转录进行至16S r RNA的5’末端时，转录出的新生链可与预设的单链辅助寡核酸互补杂交，逆转录酶会自动转换模板，以该互补寡核酸作为延伸模板继续延伸cDNA单链，直到该互补寡核酸末端。不同之处在于，本辅助寡核苷酸的3’端采用生物素或其它修饰封闭掉可能的延伸反应，为不干扰后续PCR反应，将辅助寡核苷酸中的T以U代替，PCR开始前的UNG步骤将含U的辅助寡核苷酸清除。辅助寡核苷酸的S区序列可以自由设计，与用作扩增的“人工引物”序列一致。另外，由于原核细菌RNA的5’末端不含帽子结构，不能直接应用SMART技术扩增，而可以通过本设计方案进行有效扩增，更为重要的是，相应的16S rDNA由于不具备上述游离的5’末端而不能被有效扩增(如附图2所示)，所以本项发明为一种专一检测RNA末端而不能检测相应DNA的方法。

b)取上述步骤产生的新模板加入到荧光PCR体系中，体系中的UNG酶将辅助寡核苷酸消化。

c)由“逆转录引物16R”与“人工引物”组成的引物对新模板进行有效的PCR扩增。用设计于16S rRNA上的特异性TaqMan探针对扩增产物进行实时检测。

2.为了同步给出相应DNA的信息，提供结核分枝杆菌染色体核酸的数量，在RT-PCR体系中引入另一对引物，针对其染色体DNA，且该DNA序列不存在于MTC RNA中。16S-23S r DNAITS序列和插入序列IS6110序列是最佳的候选之一，因其不被转录，没有RNA阶段，类似于真核生物断裂基因中的内含子；更为合适地，IS6110序列和ITS序列均为MTC特异，可以区分于NTM及其它细菌，近年来有较多报道利用IS6110序列或ITS序列作为MTC的TaqMan探针法PCR特异检测，甚至用作与NTM鉴别检测。为此，本发明还公开了一种以MTC ITS或IS6110序列为靶基因的TaqMan或TaqMan MGB PCR法检测引物与探针，用以辅助前述发明的有效实施。

3.就结核核酸诊断而言，选择合适的检测靶基因尤为重要，以16s rRNA的5’端区域最为合适。由于16s rRNA在分支杆菌中的拷贝数为1000-10000copies/cell，因此选择16s rRNA作为靶序列容易获得很高的检测灵敏度，例如Gen-Probe公司的Amplified MTD就是以16s rRNA为TMA扩增的靶核酸，临床试验表明其检出率高于Roche的TB Amplicor，FDA批准其为唯一可用于涂阳标本与涂阴标本检测的试剂。但Amplified MTD也有缺陷，仅能检测16s rRNA而不能检测16s rDNA；TMA方法学限制，仅能定性检测而不用作定量检测；价格昂贵。

4.就16s rRNA靶序列而言，应选择合适类型的检测探针。设计专一性高的TaqMan MGB探针用作检测MTC的16S r RNA。核糖体是细菌唯一的细胞器，是蛋白质合成的场所。编码rRNA的基因是按5’16S-23S-5S 3’方式排列的，由两个非编码的间隔区序列(ITS)所分开。16S rDNA及23S rDNA序列均可作为一个较理想的分类学靶基因。此两段基因序列均由保守区和可变区组成，由于承担重要的生物学功能因而在进化压力下保持了高度的保守性，普遍存在于各种细菌细胞内，最能符合通用性的要求，常用于细菌同源性分析，是理想的引物和探针来源。16S rRNA及23SrRNA基因的保守区对真细菌界的所有细菌均具有同源性，所以要满足能够检测出所有病原菌的临床需要，可在该区选择探针和引物。而要检测特异的种，可以在16S rRNA基因的变异区中设计探针与引物：在变异区中，科、属、种间具备特征性变异，可根据需要设计不同分类等级特异的引物和探针，将病原菌鉴别开来，甚至能设计出型特异的探针。本发明人通过基因序列分析比较及临床试验验证，以16S r RNA为靶基因，设计出只检测结核复合群的引物和探针。由于可变区内其它非结核分支杆菌也有同源性较高的核酸序列，与结核复合群的核酸序列区别仅几个碱基，为了取得较高的分辨率和优秀的信噪比，选用了TaqMan MGB探针。MGB探针其显著优点是探针短，信噪比好；为非荧光淬灭基团，性能稳定而荧光干扰小；分辨率高，可以区分一个碱基(一个碱基不同即可引起Tm值的大幅降低如20℃，错配即可为阴性结果，被广泛用于基因的单碱基突变分析(SNP：Single Nucleotide Polymorphism，即单核苷酸多态性)；而常规的TaqMan探针具有一定的“容错”能力，单个甚至两个、三个碱基错配有可能不影响到检测，Tm相差不大，结果仍为阳性，如Yao Y(“Evaluation of minor groove binding probeand Taqman probe PCR assays：Influence of mismatches and template complexity onquantification”，Mol Cell Probes，2006)等人研究表明：TaqMan探针可以在高达五个碱基错配时仍有检测信号，而设计合理的MGB探针有一个碱基错配即无检测信号。通过设计合适的TaqMan MGB探针来区分结核分支杆菌复合体(MTC)和非结核分支杆菌(NTM)，保证NTM检测结果为阴性(引物可以扩增MTC和部分NTM)，MTC结果均为阳性。

5.本发明还提供了一种快速简捷的核酸提取试剂，以硅胶为吸附核酸的介质，简单、快速、方便、操作难度低。由胍盐组成的强力裂解液使待测样品中的细胞迅速裂解、蛋白变性、核酸释放，核酸酶被灭活。加入硅胶颗粒，核酸被吸附，经过洗涤液洗涤两次，吸附有核酸的硅胶颗粒直接用作逆转录，并在辅助寡核苷酸的作用下完成末端转换模板合成。提取试剂经过优化，对DNA与RNA均有相同的得率，经证实该试剂对于MTC DNA与RNA具有相同的提取效率，是一种纯化总核酸的提取试剂。

根据上述的发明所述，优选的特异性扩增检测MTC 16S r RNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

辅助寡核苷酸H1：

5’-ccg cag aac acg ggt tca utt tgt ttg gag agu ttg atc ctg gcu cag g-3’

SEQ ID NO：1；

人工引物AP1：5’-ccg cag aac acg ggt tca-3’       SEQ ID NO：2；

逆转录引物16R：5’-gcc ttg gta ggc cgt cac-3’    SEQ ID NO：3；

检测探针16P：R1-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ     SEQ ID NO：4。

根据上述的发明所述，优选的特异性扩增检测MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

ITSF：5’-acc tcc ttt cta agg agc acc a-3’       SEQ ID NO：5；

ITSR：5’-gat gct cgc aac cac tat cca-3’         SEQ ID NO：6；

ITSP：R1(R2)-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ            SEQ ID NO：7。

根据上述的发明所述，优选的特异性扩增检测MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

ISF：5’-ggg tag cag acc tca cct atg-3’           SEQ ID NO：8；

ISR：5’-cgt agg cgt cgg tga caa a-3’        SEQ ID NO：9；

ISP：R1(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ    SEQ ID NO：10。

上述探针中的R为荧光报告基团，如FAM、VIC、HEX、TET、JOE、CY3、CY5、NED、ROX等荧光基团，R1与R2分别代表两种荧光报告基团，其中的一种为FAM，另一种根据使用的荧光PCR仪拥有的第二检测波长而定。如ABI7500/7000等，R2优选为VIC；如MJOPTICON2，R2优选为HEX等，使用者可以根据需要选择合适的R2，使得同管PCR/RT-PCR的两种检测荧光均为仪器识别(有的仪器需要校正后方能使用)且无干扰。

基于上述核酸扩增检测方法，本发明还提供相应的核酸检测试剂盒。该核酸检测试剂盒核酸检测试剂盒包含裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆转录缓冲液、逆转录酶系、结核DNA PCR反应液、结核RNA PCR反应液和质控对照试剂；其中，所述裂解液为裂解细菌的硫氰酸胍溶液；所述核酸提取液为二氧化硅颗粒；所述PCR反应液含结核DNA/RNA引物、Taqman-MGB探针和dNTP、耐热聚合酶及缓冲盐溶液；所述逆转录酶系为多酶组份体系；所述质控对照试剂为选择使用，包括强阳性对照、弱阳性对照、活菌对照、死菌对照；所述阳性对照为含有结核核酸的一段DNA或RNA；所述活菌对照为卡介苗；所述死菌对照为灭活的卡介苗；

结合本发明提供的用于MTC RNA/DNA检测的引物、探针，本发明的试剂盒中的组分如下：

①裂解液：6M GTC、5％NP-40、5％Triton X-100、1％肌氨酸钠、50m  M  Tris-HCI(pH 6.0)

②核酸提取液：5％SILICA(sigma)

③溶菌酶溶液：500KU/ml溶菌酶50 mM Tris-HCI(p H7.5)

④逆转录缓冲液：RT Buffer中含1.6m M d NTPs，2mM DTT，4mM MgCl2，0.3μM逆转录引物即SEQ ID NO：3。

⑤逆转录酶系：1U/μl逆转录酶，5U/μl RNasin，0.5μM辅助寡核苷酸H1即SEQID NO：1。

⑥MTC-DNA PC R反应液：PCR Buffer中含0.8m M d NTPs，4mM MgCl2，0.1～

0.4μM引物探针组合SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7(或SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10组合)。

⑦MTC-RNA PC R反应液：PCR Buffer中含0.8m M d NTPs，4mM MgCl2，0.1～0.4μM引物探针组合SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4。

⑧强阳性对照：适量基因工程技术获得的DNA及其体外转录的RNA，溶于核酸稳定储存液。

⑨弱阳性对照：适量基因工程技术获得的DNA及其体外转录的RNA，溶于核酸稳定储存液。

⑩活菌对照(减毒株)：小于100ng/ml卡介苗，BSA、蔗糖、甘油，含有防腐剂的TE溶液。经定标后还可制成定量工作标准品。

死菌对照(减毒株)：小于100ng/ml灭活处理的卡介苗，BSA、蔗糖、甘油，含有防腐剂的TE溶液。经定标后还可制成定量工作标准品。

其中组分①～③为标本处理试剂(核酸提取)；组分④～⑦为核酸扩增检测试剂，④～⑦各组分中还包含常规使用的稳定剂和促进剂等。其余为质控对照试剂可根据实际应用情况选用。

检测流程：

A标本预处理

A.1痰液

A.1.1以清晨第一口痰为宜，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管中。

A.1.2痰液中加入2～3倍体积的液化剂(可选用1M NaOH)，振荡混匀，室温置15-30分钟液化。

A.1.3取液化后的标本1.0m1至1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟。

A.1.4去上清，沉淀加PBS 1ml，混匀，12000rpm离心5分钟。

A.1.5去上清，沉淀加PBS 1ml，混匀，12000rpm离心5分钟。

A.1.6去上清，沉淀中加PBS 80μl，混匀后备用。

A.2肺及支气管灌洗液、尿液、脑脊液、腹水等

A.2.1取液体1.0ml至1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟。

A.2.2去上清，沉淀加PBS 1ml，混匀，12000rpm离心5分钟。

A.2.3去上清，沉淀中加PBS 80μl，混匀后备用。

B.病毒核酸提取

B.1实验前准备

B.1.1将裂解液置70℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。

B.1.2配制洗涤液：取50ml Corning离心管，加入无水乙醇35ml，补纯化水至50ml，混匀后室温备用。

B.2实验步骤

B.2.1取步骤A预处理后的样本，作好标记；另取数个1.5ml离心管，分别加入80μl质控对照品，并作好标记。

B.2.2在上述样本管中加入20μl溶菌酶溶液，混匀后置37℃反应30分钟。

B.2.3分别加入200μl裂解液，盖上管盖，上下颠倒混匀或振荡混匀。

B.2.4分别加入20μl核酸提取液，盖上管盖，振荡混匀，室温5～10分钟。

B.2.5 2000～4000rpm×1min，去上清。

B.2.6分别加入500μl洗涤液，振荡混匀，使沉淀分散，充分悬起。

B.2.7 2000～4000rpm×1min，去上清。

B.2.8分别加入200μl洗涤液，振荡混匀，使沉淀分散，充分悬起。

B.2.9置4000rpm×1min，去上清，管壁不得残留液体。

B.2.10开盖后置60～80℃烘干5～10分钟，目测管内不残留任何液体且固体呈白色。

C.逆转录及末端交换模板合成

C.1逆转录反应液的配制：根据待检样品数按逆转录缓冲液∶逆转录酶系＝19∶1的体积比例配制逆转录反应液，混匀后离心，时间5~12秒。

C.2取步骤B.2.10中干燥后的沉淀管，加入20μl逆转录反应液。混匀后置42C反应30分钟完成逆转录及末端交换模板合成反应。

D.PCR扩增检测

D.1MTC-DNA PCR反应液、MTC-RNA PCR反应液室温下(例如15℃~30℃)融化混匀，低速离心，时间可为5~20秒。

D.2将其分别分装至PCR反应管中，每管28μl。

D.3加样：在装有PCR反应液的反应管中，用带滤芯吸头分别加入2μl步骤C.2的产物，即每个样品MTC-DNA PCR反应管中加2μl，MTC-RNA PCR反应管中加2μl，盖上管盖后转移到扩增检测区上机。

E.荧光PCR运行参数如下表所示(可参照各类仪器的操作软件自行设置)

本发明建立了一种全新的方法，基于16S r RNA的5’端的完整性检测，其原理类似于表达文库构建中的SMART技术。检测的是16S r RNA的末端序列，所以一旦细菌死亡，末端作为r RNA降解的敏感区域往往首先解体，故本试验可灵敏地反映细菌的生存状态。本发明的优点在于操作简捷、一次实验可同时提供MTC RNA与DNA的双重信息，具体到结核杆菌，还利于检测的定量及标准化问题，从而有利于临床全面分析，阐述如下：

本发明中专一性RNA检测选择的靶序列为16S rRNA，专一性DNA检测选择的靶序列为染色体DNA，而荧光PCR技术本身可以定量，可给出样本中rRNA与染色体DNA的拷贝数及其两者的相对量，可以提供结核患者全面的信息；另外由于痰液不同于血浆或血清等样品，采样无法标准化，同一患者同一采样时间内排痰，其痰量可多可少，甚至可为唾液、呼吸道不同深段的粘液，排出液的含菌量受各种复杂因素影响，甚至可能时阴时阳，菌量时多时少，所以定量其痰中含菌量就采样方法来讲缺乏意义，临床上也观察到病情进展与痰中含菌量并不相关。然而，当同一口痰液中的菌体DNA和rRNA可以检测并能定量的时候，其临床意义就不同了。首先，两者的相对量可以提供一种标准化的方法，仅仅检测DNA或RNA缺乏单个细胞的核酸信息，给出的是总核酸的数量，由于受取样方法影响而无法标化；当特异的染色体DNA与特异的核糖体RNA的数量可以同时获知的情况下，两者的相对量代表了每个细胞的核糖体绝对数量的平均值。这是一种标准化的检测方法，不受痰液的采集方法、采集时间、患者排痰状态等因素的影响。其次，样品中每个结核分枝杆菌的核糖体数量是代表其生长繁殖状态的最直接的指标，由于核糖体是负责蛋白质合成与初步加工的细胞器，代谢旺盛的细胞蛋白合成活跃，故其核糖体数量增加。根据报道，处在指数生长期的细菌中，每个细胞内大约有1000-50,000个核糖体，在体外培养的HeLa细胞中，核糖体的数目可达500万-1000万个；与之相反，休眠菌及频临死亡的细胞其核糖体数量锐减甚至完全解体。所以rRNA与染色体DNA的数量比例可能综合体现了患者感染状态、化疗效果等指标，比单一检测RNA或DNA的数量更有意义。

上述的创新点均未为结核核酸检测的研究学者所报道，市场上也未见此类产品。

附图说明

图1：专一性RNA检测的原理示意图。

图2：rRNA被检测而相应的rDNA不能检测的示意图。

图3：专一性RNA检测的验证。

图4：末端转换模板合成反应正确的测序验证。

图5结核国家考核盘的DNA检测图。

图6结核考核盘的rRNA检测图。

具体实施方式

实施例1专一性RNA检测的验证及末端转换模板合成的验证

来自上海生物制品所冻干卡介苗，复溶于1ml生理盐水，并用生理盐水10。

倍梯度稀释成系列浓度。1∶10、1∶100稀释浓度的卡介苗样品，取0.1ml经核酸提取试剂(柱膜法，Qiagen)提取纯化得到总核酸，使用KOH处理该总核酸(在核酸模板中加入KOH至终浓度为0.3M，37℃水解RNA 7天使RNA完全降解)，最后用1M盐酸中和pH值至中性，加水将其稀释约10倍(酸碱中和生成较高浓度的盐可能会给下游操作带来负面影响，为稳妥起见，将其稀释以降低模板中的盐浓度)后用乙醇沉淀染色体DNA，复溶于10mM Tris(pH 8.0)中。并用MTC DNA特异的荧光PCR验证其染色体DNA的存在，且浓度均大于10⁵拷贝/ml。上述未经KOH处理的核酸用作含有16S rRNA的对照。采用本发明之试剂④～⑦按前述流程进行检测，结果如附图3所示。由图可见，本发明的MTC-RNA反应液只能对16S rRNA检测而不能对16S rDNA进行有效检测，而MTC-DNA反应液只能对结核染色体DNA进行检测。

对阳性扩增产物进行测序(图谱如附图4所示)，结果表明，反应按预先设计方向进行，序列完全正确。

实施例2试剂盒的特异性(MTC特异)及灵敏度

以下分枝杆菌菌种多数来自生检所(中国药品生物制品检定所菌苗室)，包括：瘰疠分枝杆菌(M.scrofulaceum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansassi)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、淡黄色分枝杆菌(M.Flavescens)、鸟型分枝杆菌(M.avium)、海龟分枝杆菌(M.marinum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、苏加分枝杆菌(M.szulgai)、胃分枝杆菌(M.gastri)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、土分枝杆菌(M.terrae)、次要分枝杆菌(M.triviale)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenic)、人型结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型结核分枝杆菌(M.bovis)、卡介苗(M.bovisBCG)、猿分枝杆菌(M.simiae)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、M.chelorae.

另外，还检测了其它微生物如大肠杆菌、伤寒杆菌、奈瑟氏淋球菌、沙眼衣原体、HBV、HCV、HIV、HPV、AIV(H9)、NDV、EB等，来自于本公司研发中心的标本库与菌种库。

使用前述的引物探针组合，除属于MTC的菌种为阳性外，其余均为阴性。提示本项研究所设计的引物、探针组合均特异检测MTC，NTM及其它微生物无交叉干扰现象，对MTC的检测灵敏度为1～10条菌/ml(如附图5及附图6所示)。

实施例3试剂盒的同管检测及其应用

按前述本发明的实施方案，将引物探针组合SEQ ID NO：2、3、4及引物探针组合SEQ IDNO：8、9、10组装成一管，其TaqMan MGB探针的报告基团R1选择FAM而R2选择VIC/HEX，以实施例2中的标本提取物同管检测其染色体DNA(IS6110)及16S r RNA，结果与例2中的分管检测结果完全一致。

实施例4试剂盒的临床应用

来自上海肺科医院的临床痰液标本共计263例，其中涂阳标本134例，涂阴标本129例。采用本发明的试剂盒进行检测，与细菌培养比较研究。134份涂阳标本的检测结果如下：RNA检测为阳性101份，RNA检测为阴性33份；DNA检测为阳性132份，2份为阴性(该2份阴性样品其RNA检测也为阴性)。RNA检测与细菌培养的情况如表1所示，DNA检测与细菌培养的情况如表2所示：

表1 134例涂阳标本的rRNA检测与细菌培养结果

以细菌培养为结核诊断的“金标准”，本发明所建立rRNA检测方法的灵敏度为90.7％(97/107)，特异性为85.2％(23/27)，与细菌培养的总符合率为89.6％(120/134)。

表2134例涂阳标本的DNA检测与细菌培养结果

同上标准，本研究所建立DNA检测方法的灵敏度为100％(107/107)，特异性为7.4％(2/27)，与细菌培养的总符合率为81.3％(109/134)。

上述结果提示，采用本研究建立的方法检测涂阳标本时，以细菌培养“金

标准”为对照，RNA检测具有很好的阳性预示值(96％)，DNA检测具有很好的阴性预示值(100％)，说明RNA检测与DNA检测具备互补性，结合两者结果可为临床诊断提供更全面更准确的信息。

129例涂阴标本的检测结果如下：RNA检测为阳性32份，RNA检测为阴性97份；DNA检测为阳性125份，4份为阴性(该4份阴性样品其RNA检测也为阴性)。RNA检测与细菌培养的情况如表3所示，DNA检测与细菌培养的情况如表4所示：

表3 129例涂阴标本的rRNA检测与细菌培养结果

以细菌培养为诊断标准，本研究所建立rRNA检测方法在涂阴样品中的灵敏度为64.7％(22/34)，特异性为89.5％(85/95)，与细菌培养的总符合率为82.9％(107/129)。

表4 129例涂阴标本的DNA检测与细菌培养结果

同上标准，本研究所建立DNA检测方法在涂阴样品中的灵敏度为100％

(34/34)，特异性为4.2％(4/95)，与细菌培养的总符合率为29.5％(38/129)。

上述结果表明，采用本研究建立的方法检测涂阴标本时，r RNA检测与细菌

培养的总符合率较高，为82.9％，DNA检测尽管具备100％的阴性预示值，但在涂阴及涂阳的样品中的检测特异性都较差。

综合考虑涂阳与涂阴标本，就检测总符合率来看，263例临床标本rRNA的总符合率为86.3％(134例涂阳样品为89.6％、129例涂阴样品为82.9％)；染色体DNA的总符合率为55.9％(其中134例涂阳样品为81.3％、129例涂阴样品为29.5％)。实验数据提示在结核病诊断中，RNA检测比DNA检测更具临床意义。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无需过多实验即可对本发明所要求保护的项目的试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行描述，但并不构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明的有关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

序列表

5’ccg cag aac acg ggt tca utt tgt ttg gag agu ttg atc ctg gcu cag g3’

                                                            SEQ ID NO：1；

5’-ccg cag aac acg ggt tca-3’                             SEQ ID NO：2；

5’-gcc ttg gta ggc cgt cac-3’                             SEQ ID NO：3；

R1-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ                            SEQ ID NO：4；

ITSF：5’-acc tcc ttt cta agg agc acc a-3’                 SEQ ID NO：5；

ITSR：5’-gat gct cgc aac cac tat cca-3’                   SEQ ID NO：6；

ITSP：R1(R2)-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ                  SEQ ID NO：7；

ISF：5’-ggg tag cag acc tca cct atg-3’                    SEQ ID NO：8；

ISR：5’-cgt agg cgt cgg tga caa a-3’                      SEQ ID NO：9；

ISP：R1(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ                   SEQ ID NO：10。

Claims (7)

1.一种区分DNA与相应转录的RNA的核酸扩增检测方法，其特征在于设计一条与检测RNA末端部分互补的辅助寡核苷酸，该寡核酸序列由位于5’端的S区与位于3’端的T区组成，其T区序列与检测靶RNA的末端互补，S区的序列与人工引物一致，S与T中间可隔几个碱基；人工引物是用作扩增的引物之一，其序列可由设计者自由引入；整个检测体系中含有RT引物、人工引物、辅助寡核酸、TaqMan探针4种寡核酸；其中由RT引物与人工引物组成一对有效的扩增引物对；  辅助寡核酸只用作逆转录后的延伸，PCR扩增前为UNG消化降解，不进入扩增检测环节，为防止辅助寡核酸自行延伸，将其3’端封闭或修饰其自由羟基；TaqMan-MGB探针用作扩增产物的检测；

具体步骤如下：

a)逆转录与RNA 5’末端转换模板合成：RT引物(16R)以16S rRNA为模板，在逆转录酶作用下延伸，当延伸至5’末端时，与反应体系中的辅助寡核苷酸杂交而通过SMART机制继续合成至辅助寡核苷酸的5’末端；

b)取上述步骤产生的新模板加入到荧光PCR体系中，体系中的UNG酶将辅助寡核苷酸消化；

c)由“逆转录引物16R”与“人工引物”组成的引物对新模板进行有效的PCR扩增。用设计于16S rRNA上的特异性TaqMan探针对扩增产物进行实时检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在RT-PCR体系中引入另一对引物，16S-23S r DNA ITS序列和插入序列IS6110序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于选择16s rRNA的5’端区域为检测靶基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用Tagman MGB探针作为检测MTC的16srRNA的探针。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特异性扩增检测MTC 16S r RNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

辅助寡核苷酸H1：

5’-ccg cag aac acg ggt tca utt tgt ttg gag agu ttg atc ctg gcu cag g-3’

                                                            SEQ ID NO：1；

人工引物AP1：   5’-ccg cag aac acg ggt tca-3’             SEQ ID NO：2；

逆转录引物16R： 5’-gcc ttg gta ggc cgt cac-3’             SEQ ID NO：3；

检测探针16P：   R1-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ            SEQ ID NO：4；

特异性扩增检测MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

ITSF：  5’-acc tcc ttt cta agg agc acc a-3’  SEQ ID NO：5；

ITSR：  5’-gat gct cgc aac cac tat cca-3’    SEQ ID NO：6；

ITSP：  R1(R2)-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ   SEQ ID NO：7；

特异性扩增检测MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

ISF：  5’-ggg tag cag acc tca cct atg-3’    SEQ ID NO：8；

ISR：  5’-cgt agg cgt cgg tga caa a-3’      SEQ ID NO：9；

ISP：  R1(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ   SEQ ID NO：10；

上述探针中，R1与R2分别代表两种荧光报告基团，其中的一种为FAM，另一种根据使用的荧光PCR仪拥有的第二检测波长而定。

6.一种用于权利要求1所述检测方法的试剂盒，其特征在于核酸检测试剂盒包含裂解液、核酸提取液、溶菌酶溶液、逆转录缓冲液、逆转录酶系、结核DNA PCR反应液、结核RNA PCR反应液和质控对照试剂；其中，所述裂解液为裂解细菌的硫氰酸胍溶液；所述核酸提取液为二氧化硅颗粒；所述PCR反应液含结核DNA/RNA引物、Taqman-MGB探针和dNTP、耐热聚合酶及缓冲盐溶液；所述逆转录酶系为多酶组份体系；所述质控对照试剂为选择使用，包括强阳性对照、弱阳性对照、活菌对照、死菌对照；所述阳性对照为含有结核核酸的一段DNA或RNA；所述活菌对照为卡介苗；所述死菌对照为灭活的卡介苗。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于特异性扩增检测MTC 16S r RNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

辅助寡核苷酸H1：

5’-ccg cag aac acg ggt tca utt tgt ttg gag agu ttg atc ctg gcu cag g-3’

                                                            SEQ ID NO：1；

人工引物AP1：    5’-ccg cag aac acg ggt tca-3’            SEQ ID NO：2；

逆转录引物16R：  5’-gcc ttg gta ggc cgt cac-3’            SEQ ID NO：3；

检测探针16P：    R1-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ           SEQ ID NO：4；

特异性扩增检测MTC ITS DNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

ITSF：  5’-acc tcc ttt cta agg agc acc a-3’               SEQ ID NO：5；

ITSR：  5’-gat gct cgc aac cac tat cca-3’                 SEQ ID NO：6；

ITSP：  R1(R2)-aag aca tgc atc ccg t-MGB NFQ                SEQ ID NO：7；

特异性扩增检测MTC IS6110 DNA的引物、TaqMan MGB探针如下：

ISF：5’-ggg tag cag acc tca cct atg-3’                    SEQ ID NO：8；

ISR：  5’-cgt agg cgt cgg tga caa a-3’       SEQ ID NO：9；

ISP：  R1(R2)-tgt cga cct ggg cag g-MGB NFQ    SEQ ID NO：10；

上述探针中，R1与R2分别代表两种荧光报告基团，其中的一种为FAM，另一种根据使用的荧光PCR仪拥有的第二检测波长而定。

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