KR20140051494A

KR20140051494A - 이산화 지르코늄을 이용한 유전자 추출방법

Info

Publication number: KR20140051494A
Application number: KR1020120113682A
Authority: KR
Inventors: 김원일; 조용일; 허태영
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2014-05-02
Also published as: KR101502575B1

Abstract

본 발명은 생물학적 시료에 이산화 지르코늄을 첨가하여 유전자를 추출방법에 관한 것이다.

Description

이산화 지르코늄을 이용한 유전자 추출방법{Extraction method of pathogen by Zirconium dioxide}

본 발명은 높은 농도의 오염물질이 존재하여 기존의 추출법으로 유전자 추출이 어려운 가검물에서 다양한 미생물의 RNA 및 DNA를 이산화 지르코늄을 이용하여 효과적으로 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; 이하, 'PCR'이라 함)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다.

PCR-관련 기술들은 생물학과 의학의 연구 분야에서 다양한 응용과 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 타겟 서열의 검출, 역전사 효소 PCR (RT-PCR), 분별 디스플레이 (Differential Display) PCR (DD-PCR), 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), DNA 시퀀싱 및 PCR-관여 게놈 분석이 있다.

핵산 증폭은 상술한 바와 같이 널리 이용되고 있기 때문에, 핵산 증폭 방법을 개선하려는 연구들이 많이 이루어지고 있다. 이러한 연구들 중에서, Real-time PCR은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 cross-contamination을 감소시키며, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 한다.

하지만, 상기 중합효소 연쇄반응들도 유전자 추출이 어려운 분변, 정액, 구강액에 존재하는 바이러스, 세균 및 기생충을 동시 또는 순차적으로 추출하는 전처리 과정이 있어야 정확한 DNA 및 RNA 분석을 수행할 수 있다. 따라서, 높은 농도의 오염물질이 존재하는 분변, 정액 또는 구강액에 혼재하는 크기가 다양하고 구조막의 경도가 다른 바이러스, 세균 및 기생충을 동시 또는 순차적으로 큰 손실없이 각각의 유전자를 효과적으로 검출할 수 있는 방법이 필요하다.

따라서 본 발명은 유전자 추출이 어려운 가검물에서 다양한 크기의 유전자를 효과적으로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 생물학적 시료에 이산화 지르코늄을 첨가하여 유전자를 추출하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출방법에 관한 것이다.

상기 유전자 검출방법으로 검출되는 유전자는 서로 다른 경도의 구조막을 갖는 바이러스, 세균 및 기생충 충란을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함할 수 있다.

또한, 상기 검출되는 유전자가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타 바이러스(Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자일 수 있다.

또한, 상기 검출되는 유전자들이 동시 또는 순차적으로 검출될 수 있다.

본 발명은 유전자 검출방법에 관한 것으로서,

생물학적 시료에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 이용한 핵산 추출 단계; 및

중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 가검물에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 병원체 진단 방법을 제공한다.

본 발명은 높은 농도의 오염물질이 존재하여 유전자 추출이 어려운 분변, 정액 또는 구강액에 혼재하는 서로 다른 크기와 서로 다른 경도의 구조막을 갖는 바이러스, 세균 및 기생충을 동시 또는 순차적으로 각각의 유전자를 효과적으로 추출할 수 있는 유전자 검출방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 생물학적 시료에 이산화 지르코늄을 첨가하여 유전자를 추출하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출방법을 제공한다. 또한, 유전자 검출방법에 있어서 생물학적 시료에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 이용한 핵산 추출 단계; 및 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 생물학적 시료에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 0.1 ~ 0.7 g, 바람직하게는 0.2 ~ 0.6 g 첨가하여 유전자를 추출하는 유전자 검출방법을 제공한다. 또한 상기 이산화 지르코늄의 지름은 50 ~ 300 ㎛, 바람직하게는 100 ~ 200 ㎛를 갖는 것을 사용할 수 있다.

상기 이산화 지르코늄은 지르코니아 라고도 불리며 지르코늄의 산화물이며 흰색의 결정체이다. 화학식은 ZrO₂, 녹는점은 2,700℃이며 단사정계로 보기 드문 광물이다. 굴절률이 크고 녹는점이 높아서 내식성이 크다. 물에 녹지 않고, 황산 및 플루오린화수소산에 녹는다. 요업용으로 중요한 원료이며, 치과에서 사용하는 세라믹 재료 중 가장 강도가 높고 심미성이 뛰어나 치아를 대신하는 재료로도 이용되고 있다. 급격한 온도의 변화에 견디므로 급열·급랭의 기구류에도 사용된다. 다양한 크기와 색깔로 합성될 수 있으며 현재 인조 다이아몬드를 만드는 재료로 쓰이고 있다.

본 발명에서 사용되는 이산화 지르코늄은 이산화 지르코늄 그 자체를 사용할 수 있고, 이의 착물, 이의 유도체, 이의 변성체를 포함한다. 또한, 이산화 지르코늄은 비드, 분말 등 형태에 구애받지않고 사용 가능하나, 특히 비드 형상이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자 검출방법에 의해 추출되는 유전자가 서로 다른 경도의 구조막을 갖는 바이러스, 세균 및 기생충 충란을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 검출되는 유전자가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타 바이러스(Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자일 수 있다.

코로나 바이러스는 코감기 등 호흡기 질환을 일으키는 바이러스로, 2003년 3월 중순 처음으로 발생해 세계적으로 100명이 넘는 사망자와 3,000여 명의 환자를 발생시킨 중증급성호흡기증후군(사스:SARS)의 원인균이 신종(변종) 코로나 바이러스인 것으로 알려지면서 주목받기 시작하였다. 개기일식(皆旣日蝕) 때 태양의 광구(光球)가 달에 가려졌을 때 그 둘레에서 하얗게 빛나는 현상인 코로나 현상과 생김새가 비슷해 이런 이름이 붙었다. 코로나 바이러스는 개·돼지·소·조류 등 일부 동물의 경우에는 때로 발열·호흡곤란·구토·설사·탈수 등을 유발해 치명적인 병원균으로 작용하기도 한다. 또 전염성이 강하고 다른 병원균과 결합하는 능력이 뛰어나 증상을 더욱 악화시키는 바이러스로 알려져 있다. 이런 결합 능력을 이용해 사스를 유발하는 신종 코로나 바이러스 역시 동물의 몸속에 있던 코로나 바이러스가 변형되어 사람의 몸속으로 들어와 질병을 일으킨 것으로 전문가들은 추정하고 있다. 즉 높은 결합률이 평범한 코로나 바이러스를 치명적인 것으로 변화시켰다는 것이다.

로타 바이러스는 장염을 유발하는 바이러스로, 전자현미경으로 보면 수레바퀴모양이기 때문에 로타라는 이름이 붙었다. 국내에서는 원인을 몰라 오랫동안 가성 콜레라로 불렸다. 사람 및 동물에 널리 분포하며 주로 유아(幼兒) 및 신생동물의 구토 설사증의 원인 바이러스로 혈청형은 다수이다. 본 바이러스는 사람을 비롯해 많은 포유동물, 조류의 변에서 검출된다. 사람의 가성 콜레라를 비롯한 유아의 설사증, 새끼소의 설사, 마우스의 유행성 설사 등의 원인이 된다.

살모넬라는 티푸스성 질환을 일으키고 식중독의 원인이 되기도 한다. 병원성 장내 세균의 일종으로, 대장균군과 유사하고, 돼지 콜레라균, 게르트네르균, 쥐 티프스균 등이 이에 포함되었다. 이 균군은 장내세균과에 속해 여러 포유동물, 조류 등에 널리 분포한다. 사람의 식중독, 장염, 티푸스성질환의 원인균이다. 사람과 동물에 병리성이 있다. 발열 및 설사를 수반하는 급성 식중독을 일으킨다.

E. coli 대장균증은 Escherichia coli에 의한 장내 대장균증으로 개, 특히 강아지 설사의 원인 중의 하나로 보고, 개를 기르는 큰 사육장에서 자라는 강아지에게 특히 발병의 위험성이 크다.

크립토스포리듐(Cryptosporidium)은 사람이나 동물의 소화기, 호흡기에 기생하는 원생동물로 식수오염에 의한 집단발병원인으로 인정되면서 주목받기 시작했다. 특히 최근의 서울시 수돗물 바이러스 검출 논란과 더불어 크립토스포리디움에 대한 관심이 고조되고 있다. 기존의 정수장에서의 미생물관리는 지표세균인 대장균과 일반세균이 상시검사로 이루어져 왔다. 그러나 과거의 수인성병원균이 세균이던 발생양상이 바이러스, 원생동물 등 종류가 다른 병원성 미생물로 변화하고 있다. 크립토스포리디움은 기존의 정수과정에서는 대응하기 가장 어려운 대상이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 검출 방법으로 검출되는 유전자들이 동시 또는 순차적으로 검출될 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 분변, 정액 또는 구강액을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 오염물질의 높은 농도 때문에 유전자 추출이 어려운 시료였다. 하지만 본 발명의 유전자 검출방법으로 유전자들을 동시 또는 순차적으로 효과적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 유전자 검출방법은,

상기 생물학적 시료는 분변, 정액 또는 구강액을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 중합효소 연쇄반응은 리얼-타임 중합효소 연쇄반응 (real-time PCR), 멀티플렉스 리얼-타임 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 또는 리얼-타임 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행할 수 있다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; 이하 'PCR'이라 함)은 DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 방법으로 1985년 뮬리스(K. Mullis)에 의해 고안된 방법이다. 시료로 하는 DNA 중에서 목적하는 DNA 부분의 처음 쪽에 대응하는 프라이머(primer)와 끝쪽의 상보 사슬에 대응하는 프라이머를 화학적으로 합성한다. 이후 해리와 합성을 반복하여 목적으로 하는 DNA의 사슬 수를 증폭한다.

리얼-타임 중합효소 연쇄반응 (real-time PCR)은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다. 끝쪽에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR법에 비해서 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적은 장점이 있다.

리얼-타임 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR; real-time Reverse Transcription-PCR)은 mRNA에 대해 PCR을 적용하기 위한 방법을 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다. PCR에서 Taq DNA 중합효소는 RNA에는 작용하지 않으므로 RNA사슬의 PCR을 하려면 먼저 cDNA를 제작해야 한다. 즉, 역전사효소와 올리고(dT)시발체를 사용하여 역전사반응을 전단계로서 시행한다. RT-PCR은 유전자발현, 즉 mRNA가 발현하고 있는 지를 검색할 뿐 아니라 mRNA의 정량도 가능하다. 정량한 mRNA의 cDNA를 매개체에 이입시킨 후, T7 RNA중합효소를 사용하여 RNA화해서 농도정량의 기준으로 사용하면 높은 감도로 신속, 정확하게 정량할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 중합효소 연쇄반응에서 사용되는 프라이머(promer) 및 프로브(probe)가 하기 표 1에 기재된 프라이머 또는 프로브를 1종 이상 사용할 수 있다.

서열번호	프라이머 또는 프로브의 시퀀스(5'-3')
서열번호 1	GGNAGTCGTCARTGGTTCG
서열번호 2	TGCCATGTACAGCAGAGWTTTT
서열번호 3	CAYGTGGACGAGGGCAYGC
서열번호 4	TAGTAACCAGGCTGATGTCAATACC
서열번호 5	GCGGAAACCTAGTCGGAATA
서열번호 6	GGCTGACATTCTCGATC
서열번호 7	CAACATGGATGTCCTGTACTCCT
서열번호 8	CAACATGGATGTCCTGTATTCCT
서열번호 9	CAACATGGATGTCCTTTATTCCT
서열번호 10	CCTCCAGTTTGGAACTCATT
서열번호 11	CCCCCAGTTTGGAATTCATT
서열번호 12	CCTCCAGTTTGGAATTCATT
서열번호 13	CAAAAACTCTTAAAGATGCTAG
서열번호 14	CAAAAACTCTTAAAGATGCAAG
서열번호 15	CTATTAGTGGTCATGGCACTGTAG
서열번호 16	TTGTTTTCGCTAGGCAGTCATTA
서열번호 17	TTTTAAACTAAAACCAGCGCCCGGCA
서열번호 18	CCATGCTGTTCGATGAT
서열번호 19	TTACCGATAGCGGGAAAGG
서열번호 20	TTTGCACCACMGCCAGCCC
서열번호 21	AAATTGATACCGTTTGTCCTTCTG T
서열번호 22	GCATGTCGATTCTAATTCAGCT
서열번호 23	GCCATACATTGTTGTCCTGACAAATTGAA

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 검출되는 유전자가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타 바이러스(Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자일 수 있다.

또한, 상기 유전자들이 동시 또는 순차적으로 검출될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 가검물에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 첨가하는 병원체 진단 방법을 제공할 수 있다.

상기 가검물이 분변, 정액 또는 구강액일 수 있다.

상기 병원체가 호흡기성 병원체, 소화기성 병원체 및 감염 병원체를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상인 병원체일 수 있다.

상기 병원체가 서로 다른 크기의 바이러스, 세균 및 기생충을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상인 병원체일 수 있다.

상기 병원체가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타 바이러스 (Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 병원체일 수 있다.

또한, 상기 병원체가 동시 또는 순차적으로 진단될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 핵산 추출

243개의 소 분변 시료에 0.01 M의 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS, pH 7)를 첨가하여 30 %로 희석된 소 분변 샘플을 준비했다. 이후 소 분변 샘플을 100 xg로 1분 동안 원심분리한 후, 각각의 상층액 175 ㎕을 분리했다. 분리한 각각의 상층액은 200 ㎎의 이산화 지르코늄 비드(지름 150 ㎛)와 235 ㎕의 라이시스 버퍼(lysis buffer)가 포함된 튜브에 첨가했다.

상기 라이시스 버퍼는 0.2 M 트리스(tris)-HCl(pH 7.5), 0.5 M NaCl, 0.01 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 및 1% 도데실황산나트륨(sodium dodecylsulfate; SDS)이 혼합된 완충용액이다.

상기 튜브를 10분 동안 최대 속도로 조직 파쇄기(bead beater)를 이용하여 처리한 후 16,000 xg에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하여 새로운 튜브에 옮겼다. 상기 새로운 튜브는 다시 16,000 xg에서 6분 동안 추가로 원심분리한 후 115 ㎕의 상층액을 분리 수거했다. 상기 상층액은 96-웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)로 옮겼고 일루션 버퍼(elution buffer)와 씻는 과정을 거쳤다.

상기 일루션 버퍼와 씻는 과정은 90초 동안 씻는 과정을 2번 거치고 2분 동안 씻는 과정과 30초 동안 씻는 과정을 거친 후, 1분 동안 건조 및 3분 동안 용리(elution) 과정을 진행했다. 상기 일루션 버퍼에서의 핵산 추출과정은 -80℃에서 수행했다.

실시예 2. 멀티플렉스 리얼 -타임 PCR .

실시예 1에서 핵산 추출한 소 분변 샘플 243개를 멀티플렉스 리얼-타임 PCR 패널을 사용하여 유전자를 추출하였다.

멀티플렉스 리얼-타임 PCR 패널에 사용된 프라이머(primer)와 프로브(probe)는 하기 표 2에 나타냈다.

타겟 유전자	프라이머 또는 프로브 (5'/3' 레벨)	시퀀스(5'-3')	제품 크기 (bp)
소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV)	BVDV-F (fwd)	GGGNAGTCGTCARTGGTTCG	190
	BVDV-R (rev)	GTGCCATGTACAGCAGAGWTTTT
	BVDV probe (Cy5/BHQ2)	CCAYGTGGACGAGGGCAYGC
소 코로나 바이러스(Bovine Corona Virus; BCV)	BCoV-fwd	CTAGTAACCAGGCTGATGTCAATACC	87
	BCoV-rev	GGCGGAAACCTAGTCGGAATA
	BCoV-probe (FAM/MGB)	CGGCTGACATTCTCGATC
소 로타 바이러스 (Bovine Rota Virus; BRV)	BRV-fwd1	TCAACATGGATGTCCTGTACTCCT	155
	BRV-fwd2	TCAACATGGATGTCCTGTATTCCT
	BRV-fwd3	TCAACATGGATGTCCTTTATTCCT
	BRV-rev1	TCCTCCAGTTTGGAACTCATT
	BRV-rev2	TCCCCCAGTTTGGAATTCATT
	BRV-rev3	CCCTCCAGTTTGGAATTCATT
	BRV-probe1 (VIC/MGB)	TCAAAAACTCTTAAAGATGCTAG
	BRV-probe2 (VIC/MGB)	TCAAAAACTCTTAAAGATGCAAG
대장균증 E. coli K99+(K99)	K99-fwd	GCTATTAGTGGTCATGGCACTGTAG	80
	K99-rev	TTTGTTTTCGCTAGGCAGTCATTA
	K99-Probe (FAM/BHQ)	ATTTTAAACTAAAACCAGCGCCCGGCA
살모넬라 (salmonella)	Stn-fwd	GCCATGCTGTTCGATGAT	129
	Stn-rev	GTTACCGATAGCGGGAAAGG
	Stn-probe (Cy5/BHQ)	TTTTGCACCACMGCCAGCCC
크립토스포리듐(Cryptosporidium)	Crypto-fwd	CAAATTGATACCGTTTGTCCTTCTG T	151
	Crypto-rev	GGCATGTCGATTCTAATTCAGCT
	Crypto-probe (JOE/BHQ)	TGCCATACATTGTTGTCCTGACAAATTGAA

본 실시예의 멀리플렉스 리얼-타임 PCR 패널은 25㎕의 반응 부피에 AgPath-ID™ 멀티플렉스 RT-PCR(어플라이드 바이오시스템스사 제품) 키트(kit) 및 8 ㎕의 실시예 1의 핵산 추출 소 분변 샘플과 함께 최적화했다.

표 1의 모든 프라이머 및 프로브는 25 μM의 농도로 준비했고, 같은 부피의 프라이머 및 프로브는 각각의 타켓 유전자와 섞었다. 2개의 프라이머와 1개의 프로브는 소 설사병 바이러스, 소 코로나 바이러스, 대장균증 E. coli K99+, 살모넬라 또는 크립토스포리늄(즉, 각각의 소 코로나 바이러스 믹스, K99 믹스, 살로넬라 믹스 및 크립토스포리늄 믹스)에 대해서 하나의 튜브에서 섞었다. 3개의 포워드(forward) 프라이머, 3개의 리버스(reverse) 프라이머 및 2개의 프로브는 소 로타 바이러스와 혼합했다. 이후 2개의 PCR 반응을 진행했다. 하나는 PCR 반응은 소 코로나 바이러스 및 소 로타 바이러스 반응이고, 다른 하나는 박테리아/프로토조언(protozoan) 반응(대장균증 E. coli K99+, 살모넬라 및 크립토스포리늄)이다. 각각의 프라이머 및 프로브의 최종 농도는 0.2 μM을 사용하였다. 상기 PCR 증폭은 ABI 7500 Fast 리얼-타임 PCR 시스템에서 수행하였다. 반응 조건은 1) 45 ℃에서 10분 동안 리버스 전사 단계(이 과정은 박테리아/프로토조언 PCR은 생략됨), 2) 95 ℃에서 10분 동안 활성화 단계 및 3) 95 ℃ 15초, 60 ℃ 60초를 35번 반복 실행했다.

비교예 1. 소 설사병 바이러스 및 소 코로나 바이러스에 대한 리얼 -타임 RT - PCR

소 설사병 바이러스 및 소 코로나 바이러스 리얼-타임 RT-PCR은 송아지 설사를 진단하기 위해 일반적으로 사용되는 방법이다. RNA는 실시예 1과 동일한 243개의 소 분변 시료에서 MagMAX™바이럴 RNA 분리 키트(Isolation Kit)와 함께 추출했다. 본 비교예의 PCR은 반응 부피 25 ㎕에서 AgPath-ID™원스텝 RT-PCR(어플라이드 바이오시스템스사 제품) 키트(kit) 및 5 ㎕의 상기 추출 소 분변 시료와 함께 수행했다. 상기 RT-PCR에서 사용한 프라이머 및 프로브는 실시예 2에서 사용한 것과 동일하고(표 2 참고), 프라이머 또는 프로브의 최종 농도는 0.4 또는 0.2 μM을 사용했다. 상기 PCR 증폭은 ABI 7500 Fast 리얼-타임 PCR 시스템에서 수행하였다.

비교예 2. 소 로타 바이러스 항원-캡처 엘라이사( Enzyme - linked immunosorbent assay; ELISA )

243개의 소 분변 시료는 프라이머™ Rotaclone® 키트(kit)로 측정했다. 상기 시료는 450 nm에서 0.3 보다 작은 광학 밀도와 함께 수행했다.

비교예 3. 살로넬라의 분리 및 검증

243개의 소 분변 시료는 테트라티오네이트 배지(tetrathionate broth)에 접종되고 42 ℃에서 24시간 동안 농축했다. 농축된 소 분변 시료는 브릴리언트 그린 배지(brilliant green agar)에 노보비오신(novobiocin), 핵토엔 엔털익 배지(Hektoen enteric agar) 및 XLT4 배지와 함께 분주한 후 35 ~ 37 ℃에서 24시간 동안 배양했다. 상기 배양된 소 분변 시료는 브릴리언트 그린(핑크색), 핵토엔 엔털익(녹색 또는 검은색) 또는 XLT4(검은색)으로 계대배양하고 트렉 센시티트르® 그렘-네거티브 감정 패널(Trek Sensititre® Gram-Negative Identification panel)로 검증했다.

비교예 4. 대장균증 E. coli K99 +의 분리 및 검증

소 분변 시료 243개를 털기톨 7 배지(Tergitol 7 Agar)에 3페닐4졸륨염화물(triphenyltetrazolium chloride)과 함께 분주하고, 35 ~ 37 ℃에서 24시간 동안 배양했다. 대장균증 E. coli K99+는 종래의 생화학 튜브에서 계대배양한 후 클리글러 철 배지(Kligler’s Iron Agar), 심스 배지(Sims Agar) 및 요소 배지(Urea agar slants)에 접종하고 35 ~ 37 ℃에서 24시간 동안 배양했다. 상기 배양된 소 분변 시료는 상기 배양된 대장균증으로 검증했다.

비교예 5. 크립토스포리듐의 분리 및 검증

243개의 소 분변 시료 각각은 유리 슬라이드에 도말하고, 도말된 시료는 24 ℃에서 건조했다. 상기 건조된 시료는 10분 동안 메탄올에서 고정하고 카르볼푸크신(carbol fuchsin)에 1 ~ 2시간 동안 놓았다. 상기 시료는 물로 1분 동안 씻은 후 1% 산성 알코올에 빨간 용액이 나오지 않을 때까지 방치했다. 이후 상기 시료는 0.5 % 페스트 그린(fast green)에서 1분 동안 대비염색했다. 빨강 및 할로-쉐프드(halo-shaped) 접합자는 크립토스포리듐으로 검증됐다.

실험예 1. 기존 검출법과 본 발명의 유전자 검출법의 비교

상기 실시예 1 및 2에서 사용한 본 발명의 유전자 검출법과 상기 비교예 1 내지 5의 기존 유전자 검출법의 검출 결과를 비교, 분석하였다. 검출 결과는 하기 표 3과 같다.

기존의 검출법		멀티플렉스 리얼-타임 PCR (실시예 1 내지 2)		% 일치율
기존의 검출법		양성	음성	% 일치율
소 설사병 바이러스 RT-PCR (비교예 1)	양성	10	0	99% (241/243)
소 설사병 바이러스 RT-PCR (비교예 1)	음성	2	231	99% (241/243)
소 코로나바이러스 RT-PCR (비교예 1)	양성	42	0	95% (231/243)
소 코로나바이러스 RT-PCR (비교예 1)	음성	12	189	95% (231/243)
소 로타바이러스 Ag 엘라이사 (비교예 2)	양성	50	2	90% (218/243)
소 로타바이러스 Ag 엘라이사 (비교예 2)	음성	23	168	90% (218/243)
살모넬라 배양(비교예 3)	양성	33	3	97% (236/243)
살모넬라 배양(비교예 3)	음성	4	203	97% (236/243)
대장균증 E. coli K99+ 배양 (비교예 4)	양성	30	5	94% (229/243)
대장균증 E. coli K99+ 배양 (비교예 4)	음성	9	199	94% (229/243)
크립토스포리듐 현미경 실험 (비교예 5)	양성	31	2	93% (227/243)
크립토스포리듐 현미경 실험 (비교예 5)	음성	14	196	93% (227/243)

표 3에서 보는 바와 같이, 소 설사병 바이러스에 대한 본 발명의 멀티플렉스 리얼-타임 PCR과 RT-PCR을 수행한 결과 243개 중 본 발명은 241개의 일치를 보여 99%의 놀라운 일치율을 보였다. 또한, 소 코로나바이러스에 대한 본 발명의 멀티플렉스 리얼-타임 PCR과 RT-PCR의 유전자 검출 결과를 비교하면 243개 중 본 발명은 231개의 일치를 보여 95%의 뛰어나게 높은 일치율을 보였다. 그리고 소 로타바이러스에 대한 본 발명의 멀티플렉스 리얼-타임 PCR과 RT-PCR 검출 결과를 비교하면, 243개 중 본 발명은 218개를 일치시켜 90%의 높은 일치율을 보였다. 게다가 살모넬라에 대한 본 발명의 검출법과 기존 검출법의 검출 결과를 비교하면, 243개 중 본 발명의 검출법이 236개를 일치시켜 97%의 놀라운 일치율을 보였다. 또한, 대장균증 E. coli K99+에 대한 검출 결과를 비교하면, 본 발명의 검출법은 243개 중 229개를 일치시켜 94% 라는 상당히 높은 일치율을 보였다. 마지막으로 크립토스포리늄에 대한 검출 결과를 비교하면, 본 발명의 검출법은 243개 시료 중 227개를 일치시켜 93%의 높은 일치율을 확인하였다.

따라서, 기존 검출법과 본 발명의 유전자 검출법의 검출 결과를 비교한 결과, 기존 검출법과 같이 한 번에 하나의 타겟 유전자를 검출하는 것과 본 발명의 동시 유전자 검출법의 유전자 검출 결과가 90% 이상 일치율을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 표 3에서 확인되는 바와 같이, 기존 검출법에 비해 높은 민감성 및 특이성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 상기의 실시예 및 실험예를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 유전자 검출법은 기존 검출법보다 높은 항체 민감성 및 특이성을 보였으며, 기존 검출법으로 유전자 추출이 어려운 분변에서 서로 다른 크기 및 서로 다른 구조막 경도를 가지는 바이러스, 세균 및 기생충을 동시에 검출하는 것을 확인하였다. 또한, 기존 검출법이 한 번에 하나의 항체에 대한 검출을 수행했던 것에 비해, 본 발명의 유전자 검출법은 동시 또는 순차적으로 유전자를 검출할 수 있는 놀라운 장점을 확인하였다.

Claims

생물학적 시료인 분변, 정액 또는 구강액에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 첨가하여 유전자를 추출하는 것을 특징으로 하는 유전자 추출방법.
제 1항에 있어서, 상기 검출되는 유전자가 서로 다른 경도의 구조막을 갖는 바이러스, 세균 및 기생충 충란을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 검출하는 유전자 추출방법.
제 2항에 있어서, 상기 검출되는 유전자가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타바이러스(Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 검출하는 유전자 추출방법.
제 1항에 있어서, 상기 유전자들이 동시 또는 순차적으로 검출되는 것을 특징으로 하는 유전자 추출방법.
유전자 검출방법에 있어서,
생물학적 시료인 분변, 정액 또는 구강액에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 이용한 핵산 추출 단계; 및
중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출방법.
제 5항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응이 리얼-타임 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 멀티플렉스 리얼-타임 중합효소 연쇄반응(multiplex real-time PCR) 또는 리얼-타임 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 유전자 검출방법.
제 5항에 있어서, 상기 검출되는 유전자가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타바이러스(Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 검출하는 유전자 검출방법.
제 5항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자들이 동시 또는 순차적으로 검출되는 것을 특징으로 하는 유전자 검출방법.
가검물인 분변, 정액 또는 구강액에 이산화 지르코늄(ZrO₂; Zircoum dioxide; zirconia)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 병원체 진단 방법.
제 9항에 있어서, 상기 병원체가 호흡기성 병원체, 소화기성 병원체 및 감염 병원체를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 병원체 진단방법.
제 9항에 있어서, 상기 병원체가 서로 다른 크기의 바이러스, 세균 및 기생충을 포함하는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 병원체 진단방법.
제 11항에 있어서, 상기 병원체가 소 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV), 소 코로나바이러스(Bovine Corona Virus; BCV), 소 로타바이러스(Bovine Rota Virus; BRV), 살모넬라(salmonella), 대장균증 E. coli K99+ 및 크립토스포리듐(Cryptosporidium)를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 병원체인 것을 특징으로 하는 병원체 진단방법.
제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병원체가 동시 또는 순차적으로 진단되는 것을 특징으로 하는 병원체 진단방법.