CN104726609A - 一种轮状病毒的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种轮状病毒的检测试剂盒及其应用，涉及一种微生物的检测方法，特别是涉及一种用于检测轮状病毒的试剂盒。其目的是为了提供一种灵敏度高，使用简便，能直接快速检测粪便中轮状病毒的试剂盒及其应用。本发明的轮状病毒检测试剂盒包括：一对特异性的引物及TaqMan探针，还包括反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶，DEPC水。本发明的轮状病毒检测试剂盒用于检测轮状病毒。本发明的轮状病毒检测试剂盒特异性好，敏感性高，在样品模板浓度为每反应1个拷贝的质粒时也可以被检测到，使用操作简便。本发明用于轮状病毒的检测领域。

Description

一种轮状病毒的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物的检测方法，特别是涉及一种用于检测轮状病毒的试剂盒。
背景技术
轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，其主要感染小肠上皮细胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪-口途径，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水和电解质紊乱症状，如不及时纠正，可导致死亡。
轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴儿与幼儿腹泻的最重要病原，几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。然而，每一次感染后人体免疫力会逐渐增强，后续感染的影响就会减轻，因而成人就很少受到其影响。轮状病毒总共有七个种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的一种，而人类轮状病毒感染超过90％的案例也都是该种造成的。
目前主要是通过免疫学的方法对轮状病毒进行检测，但由于免疫学的方法灵敏度低，不能在发病早期就检测出轮状病毒，这样就会导致误诊，并增加了病人的负担；因此研发一种特异性好，灵敏度高，方法简单，耗时短，能直接快速检测粪便中轮状病毒的试剂盒会有很好的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好，灵敏度高，使用简便，能直接快速检测粪便中轮状病毒的试剂盒及其应用。根据轮状病毒的序列保守的VP6蛋白区域，使用Primer5.0软件设计了特异性引物，通过使用实时荧光定量PCR的方法，对轮状病毒的感染进行辅助诊断，以及轮状病毒的流行病学研究。
本发明一种轮状病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括一对引物和TaqMan探针；其中，所述的一对引物为引物1和引物2；所述引物1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述引物2的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；所述TaqMan探针的核苷酸序列如序列表 中序列3所示。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒，所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团Cy5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒，所述引物1、引物2和TaqMan探针的摩尔比为4:4:1。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒，其还包括反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶，DEPC水。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒，包括浓度为40μM的引物10.5μL，浓度为40μM的引物20.5μL，浓度为10μM的TaqMan探针0.5μL，2×反应缓冲液12.5μL，40×逆转录酶及DNA聚合酶混合物0.625μL，DEPC水5.375μL。
本发明一种轮状病毒的检测试剂盒的应用，其用于检测轮状病毒。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
一、提取样品RNA；
二、将样品RNA与权利要求1所述轮状病毒的检测试剂盒中的试剂混合；
三、按照以下条件进行反应：第一阶段48℃30min，第二阶段95℃10min，第三阶段95℃15s，60℃1min，扩增45个循环；
四、使用荧光定量PCR仪进行荧光信号采集。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒的应用，述步骤一中提取样品RNA的步骤为：取粪便标本0.5g，用磷酸盐缓冲液1:10稀释后，涡旋混匀，并4000rpm离心15min，收集上清液至无菌管中，用Trizol(Invitrogen公司产品)提取标本中的RNA；所提取的RNA溶于20μL DEPC水中。
进一步，本发明一种轮状病毒的检测试剂盒的应用，所述步骤二中样品与试剂的量为：样品RNA 5μL，40μM的引物10.5μL，浓度为40μM的引物20.5μL，浓度为10μM的TaqMan探针0.5μL，2×反应缓冲液12.5μL，40×逆转录酶及DNA聚合酶混合物0.625μL，DEPC水5.375μL。
本发明一种轮状病毒的检测试剂盒及其应用与现有技术不同之处在于：本发明的轮状病毒的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，使用简单方便，耗时短，不仅能够用于临床急性腹泻患者对轮状病毒感染的检测，也可用于轮状病毒感染流行病学的调查；在疫情暴发时能够提供快速特异的病原学依据。
下面结合附图对本发明的一种轮状病毒的检测试剂盒及其应用作进一步说明。
附图说明
图1为采用本发明的轮状病毒的检测试剂盒对不同浓度的轮状病毒阳性质粒进行检测的实时荧光定量PCR结果；
图2为采用本发明的轮状病毒的检测试剂盒对样品进行检测的实时荧光定量PCR结果。
具体实施方式
获取本发明中引物和探针的方法：使用Mega 5.0软件对在GenBank中现有轮状病毒的基因序列进行序列的生物信息学分析，通过同源性比较，寻找保守区域；应用ABI引物合成软件(Primer Express version 2.0，Applied Biosystems)设计了扩增保守区基因片段的引物及TaqMan探针；所设计的引物和探针均具有互补于轮状病毒基因的序列，应用NCBI/Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对所设计合成的引物及探针进行特异性及可用性检测，确保与其它病原体的核酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点；所以避免了轮状病毒检测的假阳性和假阴性的结果，提高了检测的可靠性和准确度。由Invitrogen公司合成，经PAGE纯化。
实施例1
为检测本发明中引物和TaqMan探针的敏感性，本实施例采用本发明的轮状病毒的检测试剂盒对轮状病毒阳性标本RNA进行检测，步骤如下：
一、以轮状病毒阳性的标本RNA为模板，应用所设计合成的引物(即本发明中的引物)扩增得到目的基因片段，纯化后将其克隆至pGEM-T载体(Invitrogen)。通过蓝白斑筛选、PCR鉴定等得到含有目的基因片段的阳性质粒DNA。通过丘比特双链DNA检测试剂盒(Quanti-iTTM dsDNA BR Assay kit)及丘比特荧光检测仪(the QubitTM fluorometer,2-100ng)(Invitrogen,Lot:55318A)对阳性质粒DNA进行定量。所得阳性质粒DNA的浓度为9.6×108拷贝数/微升，对其进行对数稀释，得到浓度分别为每微升100、101、102、103、104拷贝数的样品，分别标记为1、2、3、4、5。
二、配制反应体系：取40μM的引物10.5μL，浓度为40μM的引物20.5μL，浓度为10μM的TaqMan探针0.5μL，2倍浓度的反应缓冲液12.5μL，40×逆转录酶及DNA聚合酶混合物0.625μL，DEPC水8.375μL，混匀，分别加入1μL不同浓度的样品，并标号1、2、3、4、5。
三、按照以下条件进行反应：第一阶段48℃30min，第二阶段95℃10min，第三阶段 95℃15s，60℃1min，扩增45个循环；并在第三阶段进行荧光信号采集，结果如图1所示。
图1中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度，其中1为浓度100的样品检测的荧光信号，2为浓度101的样品检测的荧光信号，3为浓度102的样品检测的荧光信号，4为浓度103的样品检测的荧光信号，5为浓度104的样品检测的荧光信号，由图1可知，在样品模板为一个质粒的时候也可以被检测到，说明本发明的轮状病毒的检测试剂盒敏感性高。
实施例2
本实施例采用本发明的轮状病毒的检测试剂盒对待测样品进行检测，步骤如下：
一、提取样品RNA；取粪便标本0.5g，用磷酸盐缓冲液1:10稀释后，涡旋混匀，并4000rpm离心15min，收集上清液至无菌管中，用Trizol提取标本中的RNA；所提取的RNA溶于20μL DEPC水中；
二、向PCR管中加入40μM的引物10.5μL，浓度为40μM的引物20.5μL，浓度为10μM的TaqMan探针0.5μL，2倍浓度的反应缓冲液12.5μL，40×逆转录酶及DNA聚合酶混合物0.625μL，DEPC水5.375μL，然后将5μL样品RNA加入混合试剂中；
三、按照以下条件进行反应：第一阶段48℃30min，第二阶段95℃10min，第三阶段95℃15s，60℃1min，扩增45个循环；并在第三阶段进行荧光信号采集，结果见图2。
图2中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度，其中6为待测样品检测的荧光信号，由图2可知，本发明的轮状病毒的检测试剂盒能够检测到粪便样品中的轮状病毒。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种轮状病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括一对引物和TaqMan探针；其中，所述的一对引物为引物1和引物2；所述引物1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述引物2的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；所述TaqMan探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
2.根据权利要求1所述的轮状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团Cy5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
3.根据权利要求1所述的轮状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2和TaqMan探针的摩尔比为4:4:1。
4.根据权利要求1所述的轮状病毒的检测试剂盒，其特征在于：还包括反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶，DEPC水。
5.根据权利要求4所述的轮状病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括浓度为40μM的引物10.5μL，浓度为40μM的引物20.5μL，浓度为10μM的TaqMan探针0.5μL，2×反应缓冲液12.5μL，40×逆转录酶及DNA聚合酶混合物0.625μL，DEPC水5.375μL。
6.一种轮状病毒的检测试剂盒的应用，其特征在于：用于检测轮状病毒。
7.根据权利要求6所述的轮状病毒的检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
一、提取样品RNA；
二、将样品RNA与权利要求1所述轮状病毒的检测试剂盒中的试剂混合；
三、按照以下条件进行反应：第一阶段48℃30min，第二阶段95℃10min，第三阶段95℃15s，60℃1min，扩增45个循环；
四、使用荧光定量PCR仪进行荧光信号采集。
8.根据权利要求7所述的轮状病毒的检测试剂盒的应用，其特征在于：所述步骤一中提取样品RNA的步骤为：取粪便标本0.5g，用磷酸盐缓冲液1:10稀释后，涡旋混匀，并4000rpm离心15min，收集上清液至无菌管中，用Trizol提取标本中的RNA；所提取的RNA溶于20μL DEPC水中。
9.根据权利要求7所述的轮状病毒的检测试剂盒的应用，其特征在于：所述步骤二中样品与试剂的量为：样品RNA 5μL，40μM的引物10.5μL，浓度为40μM的引物20.5μL，浓度为10μM的TaqMan探针0.5μL，2倍浓度的反应缓冲液12.5μL，40×逆转录酶及DNA聚合酶混合物0.625μL，DEPC水5.375μL。
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