KR20170079023A

KR20170079023A - 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170079023A
Application number: KR1020150189125A
Authority: KR
Inventors: 백계승; 정경출
Original assignee: 주식회사 노블바이오
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-07-10
Also published as: KR101777168B1

Abstract

본 발명은 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 트리스 버퍼, EGTA, β-메캅토에탄올, 사르코실(sarkosyl) 및 트레할로스(trehalose)를 유효성분으로 포함하는, 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 수송 배지 조성물은 검체의 수송 이후 별도의 용해 과정이 필요없어 검체의 분석기간이 단축되는 효과가 있으며, 수송 도중에도 조성물 내 유효성분들에 의해 핵산의 실온 보존력이 증가된 조성물로서, 추후 분자진단산업 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도{Specimen transport medium composition for extracting nucleic acid without additional cell lysis step and uses thereof}

본 발명은 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

분자 진단(molecular diagnostics)이란, 분자생물학 기술을 이용하여 DNA, RNA 등 분자 수준의 바이오마커를 검출하는 것으로서, 기존의 배양 검사나 면역학적 진단보다 정확하고 검사 시간이 짧으며, 민감도가 높아 미량의 시료도 진단이 가능한 장점이 있다. 이로 인해 현재 다양한 진단 분야에서 분자 진단법이 활용되고 있으며 그 비중은 점점 높아지고 있는 추세이다. 이러한 분자 진단의 활용 분야는 감염 확인, 유전자 검사(genetic analysis) 및 약물유전학 검사(pharmacogenetics test) 등이 있다. 분자 진단에 사용되는 기술로는 중합효소연쇄반응(PCR), 염기서열분석(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray) 등이 있는데, 이 중에서 표적 유전자를 선택적으로 증폭하여 검출하는 PCR 기술이 가장 많이 사용되고 있으며, 특히 실시간으로 표적 유전자의 증폭을 확인하는 real-time PCR이 매우 폭넓게 활용되고 있다.

정확하고 재현성있는 분자 진단을 위해서는 효과적인 시료 채취와 분석실까지 채취한 시료의 안전한 수송 및 보관이 매우 중요하다. 그럼에도 불구하고, 다양한 조건과 부위별 시료 채취도구의 개발, 안정적인 시료의 수송 및 장기 보관이 가능한 수송배지에 대한 연구개발은 미비한 실정이며, 현 수송배지는 시료가 채취됨과 동시에 냉장조건에서 이동해야하고, 장시간 핵산 보존 기능이 없어 시료의 손상이 있을 수 있는 문제점이 있다. 또한, 대부분의 국내 연구소는 다국적기업의 수입 제품에 의존하고 있어 국내 환경 및 실정에 맞는 최적의 수송 배지의 개발이 요구되는 상황이다.

이에 본 발명자들은 시료 채취 후 실온으로 운반되어도 분자 진단이 가능하며, 수송되는 과정 중에 시료의 용해가 일어나도록 하여 분석실에서 별도의 시료 용해 과정 없이 핵산 추출이 가능한 수송 배지를 개발하였다.

한편, 한국등록특허 제0426544호에는 '혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법 및 그 방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1501566호에는 '과니디움 티오시아네이트와 트리톤 X-100을 이용한 신체체액 mRNA 보존용 조성물 및 이를 이용한 신체체액 종양마커 mRNA 보존방법 및 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 특정 농도의 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 트리스 버퍼, EGTA, β-메캅토에탄올(mercaptoethanol), 사르코실(sarkosyl) 및 트레할로스(trehalose)를 유효성분으로 포함하는 검체 수송 배지 조성물을 개발하였고, 상기 배지 조성물을 이용하여 인간 구강상피세포를 검체로하여 별도의 세포 용해 과정 없이 순도 높은 핵산(DNA 및 RNA)을 추출함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 5.5~6.5M 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 0.15~0.25M 트리스 버퍼, 0.015~0.025M EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 9.5~10.5 %(v/v), 사르코실(sarkosyl) 0.7~0.8 %(w/v) 및 트레할로스(trehalose) 2.5~5 %(w/v)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 검체로부터 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물은 검체의 운반 과정에서 검체가 용해되는 조성물로서, 수송 이후 별도의 용해 과정이 필요없어 핵산의 추출 시간이 단축되고 이로 인해 검체의 분석기간이 단축되는 효과가 있으며, 수송 도중 조성물 내로 핵산이 용출되었을 경우에도 조성물 내 유효성분들에 의해 핵산의 실온 보존력이 증가된 조성물로서, DNA는 실온에서 3일간, RNA는 실온에서 2일간 보관해도 핵산이 안정적으로 보존되어 국내 실정에 적합한 수송 배지 조성물이므로, 추후 분자진단산업 분야에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 수송 배지의 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate) 농도별 게노믹 DNA 추출 결과이다.
도 2는 수송 배지의 구아니딘 티오시아네이트 농도별 RNA 추출 결과이다.
도 3은 수송 배지의 β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 농도별 게노믹 DNA 추출 결과이다.
도 4는 수송 배지의 β-메캅토에탄올 농도별 RNA 추출 결과이다.
도 5는 수송 배지의 트레할로스(trehalose) 농도별 게노믹 DNA 추출 결과이다.
도 6은 수송 배지의 트레할로스 농도별 RNA 추출 결과이다.
도 7은 최적 조건의 수송 배지를 이용하여 구강상피세포로부터 DNA를 추출한 후 PCR을 수행한 결과이다.
도 8은 최적 조건의 수송 배지를 이용하여 구강상피세포로부터 RNA를 추출한 후 PCR을 수행한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5.5~6.5M 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 0.15~0.25M 트리스 버퍼, 0.015~0.025M EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 9.5~10.5 %(v/v), 사르코실(sarkosyl) 0.7~0.8 %(w/v) 및 트레할로스(trehalose) 2.5~5 %(w/v)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 용해(lysis) 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 구아니딘 티오시아네이트는 세포벽 용해 물질로서, 여러 가지 단백질을 변성시킬 수 있다. 세포벽 용해 물질로는 구아니딘 히드로클로리드(guanidine hydrochloride), 염화리튬(lithium chloride) 및 DTT(dithiothreitol) 등이 있으나, 본 발명은 구아니딘의 높은 산화력으로 인하여 미생물과 바이러스의 세포벽 그리고 외부 보호 단백질 층을 파괴하고 불활성화시켜 감염원에 의한 감염 가능성을 대폭 낮추고 용액으로 용출된 핵산을 신속하고 간편하게 추출 및 정제할 수 있는 구아니딘 티오시아네이트를 선택하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검체 수송 배지 조성물 내 구아니딘 티오시아네이트의 농도는 DNA 추출의 경우에는 4~6M, RNA 추출의 경우에는 1M~6M일 수 있으나, 순도 높은 핵산을 추출하기 위해서는 바람직하게는 5.5~6.5M의 농도일 수 있고, 더욱 바람직하게는 6M의 농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 β-메캅토에탄올은 단백질의 3차 구조를 깰 때 많이 사용하는 환원제로서, 이황화결합(disulfide bond, S-S bond)을 끊는 작용을 하며, 조성물 내 환원 조건을 만들어 핵산가수분해효소(nuclease)의 활성을 최소화시키는 작용을 한다. 또한, β-메캅토에탄올은 세포 용해 작용을 보조한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검체 수송 배지 조성물 내 β-메캅토에탄올의 함량은 4~10 %(v/v) 일 수 있으나, 순도 높은 핵산을 추출하기 위해서는 바람직하게는 9.5~10.5 %(v/v) 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 %(v/v)의 함량일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

트리스는 수송 배지 조성물의 pH를 안정화시키는 버퍼(완충 용액)으로서, 핵산 물질의 안정화에도 기여한다. 본 발명의 트리스 버퍼 외에도 수송 배지 조성물의 버퍼 후보 물질로는 CAPS(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), CAPSO(3-(Cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid), EPPS(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinepropanesulfonic acid), MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), TAPS(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid), TAPSO(2-Hydroxy-3-[tris(hydroxymethyl)methylamino]-1-propanesulfonic acid), TES(2-[(2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethanesulfonic acid) 및 PBS(Phosphate Buffered Saline) 등이 있을 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검체 수송 배지 조성물에서 트리스 버퍼의 농도는 바람직하게는 0.15~0.25M 일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.2M 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 트리스 버퍼의 pH는 DNA 추출의 경우에는 pH 8, RNA 추출의 경우에는 pH 4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)는 세포 용해 시 노출되는 핵산분해효소 또는 단백질분해효소의 불활성화에 기여하는 킬레이트제로서, "킬레이트제"란 금속이온에 배위하여 안정된 킬레이트 화합물을 형성하는 다좌 배위자의 이온이나 분자를 말한다. 킬레이트제의 금속에 대한 특이성 및 친화성은 다양하며, 화학적 성질에 의해 수용성과 지용성(혹은 불용성)으로 분류된다. 수용성 킬레이트제는 침전을 생성하는 경우 없이 유리금속이온의 성질을 차폐하기 때문에 금속이온에서 빠질 수 없는 효소반응의 정지나 활성산소에 의한 산화방지 등에 이용된다. 이러한 킬레이트제의 종류로는 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), CDTA(1,2-Diaminocyclohexane Tetraacetic acid), DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), NTA(N,N-Bis(carboxymethyl)glycine) 및 TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검체 수송 배지 조성물에서 EGTA의 농도는 바람직하게는 0.015~0.025M 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.02M 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 상기 트레할로스는 세포에 존재하는 핵산의 구조적 안정화에 기여하는 물질로서 핵산 안정제로 작용한다. 트레할로스 외 핵산 안정제로 사용 가능한 물질은 히드록시엑토인(hydroxyectoine), 엑토인(ectoine), 베타인(betaine), 사르코신(sarcosine), 글리콜산(glycolic acid), 호모엑토인(homoectoine), L-카르니틴(carnitine), N,N-디메틸글리신(dimethylglycine), 글리세롤 포스페이트(glycerol phosphate), 트리신(tricine), 및 타르타르산(tartaric acid) 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검체 수송 배지 조성물에서 트레할로스의 함량은 2.5~5 %(w/v)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 %(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 사르코실은 소듐 라우로일 사르코시네이트(sodium lauroyl sarcosinate)의 상표명으로, 음이온성 계면활성제이다. 사르코실은 SDS(sodium dodecyl sulfate)보다 고염농도에서 용해도가 크고 계면활성제로서의 작용이 약하기 때문에 고염도보다 부드러운 처리가 필요한 경우 SDS 대용으로 주로 사용된다. 본 발명에서는 상기 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate) 및 β-메캅토에탄올(mercaptoethanol)과 함께 세포벽의 분해를 보조하기 위해 사용되었다.

사르코실 외에 계면활성제로 사용가능한 물질은 Span 20, Span 40, Span 60, Span 65, Span 80, Span 85 등(나카라이테스크사 제품명)의 d-소르비톨의 지방산에스테르, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 81, Tween 85 등(나카라이테스크사 제품명)의 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르, Triton X-100 등(나카라이테스크사 제품명)의 폴리옥시에틸렌글리콜-t-옥틸페닐에테르 및 SDS 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검체 수송 배지 조성물에서 사르코실의 함량은 0.7~0.8 %(w/v)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.75 %(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 핵산은 DNA(디옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산) 중 어느 것이어도 무방하다. DNA는 RNA 보다 구조적으로 안정한 물질이지만, 장시간 실온에서 보관하게 되면 분해가 된다. 본 발명의 검체 수송 배지는 DNA 안정화 뿐만 아니라, DNA를 분해시키는 DNase 활성을 억제시켜 DNA를 실온에서도 3일간 보관할 수 있다. 또한, RNA를 분해하는 RNase는 사람의 손이나 얼굴 등에 다량 존재하여 완전히 제거하기가 어려운 문제가 있어, 반드시 -70℃ 이하에서 보관하여야 하는 번거로움이 있으나, 본 발명의 검체 수송 배지는 RNA 안정화 뿐만 아니라, RNase 활성을 억제시켜 RNA를 실온에서도 2일간 보관할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 검체 수송 배지 조성물에 있어서, 상기 검체는 인체, 동물 및 환경 분야 유래의 동물세포, 미생물 또는 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 실시예에 따른 검체 수송 배지 조성물은 구체적으로는, 6M 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 0.2M 트리스 버퍼, 0.02M EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 10%(v/v), 사르코실(sarkosyl) 0.75 %(w/v) 및 트레할로스(trehalose) 5 %(w/v)를 포함하는, 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출할 수 있는 조성물이다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 이용하여 검체로부터 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, (a) 본 발명의 검체 수송 배지 조성물에 진단하고자 하는 시료를 넣어 수송하는 단계; 및 (b) 수송된 상기 (a) 단계의 시료가 첨가된 검체 수송 배지 조성물에 에탄올을 처리하여 핵산을 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a) 단계의 시료의 수송은 실온에서 2~3일간 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. DNA는 실온에서 3일간, RNA는 실온에서 2일간 보관해도 핵산이 잘 보존되었으므로 핵산을 포함하는 시료의 수송 기간은 DNA의 경우에는 3일까지, RNA의 경우에는 2일까지가 적합할 수 있다.

본 발명의 상기 핵산은 DNA 및 RNA 중 어느 것이어도 무방하다. 세포에는 이들의 핵산이 포함되어 있기 때문에, 그 중의 표적 핵산을 본 발명의 핵산 추출방법으로 추출할 수 있게 된다. 이때, 세포의 종류는 한정되는 것이 아니며, 동물세포, 식물세포, 미생물 세포 등의 모든 세포를 대상으로 할 수 있다. 본 핵산 추출방법에 이용하는 시료로서는 세포를 포함하는 생체유래 시료가 적합하지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 생체에서 유래하지 않는 시료에도 본 핵산 추출방법을 적용하는 것은 가능하다. 생체에서 유래하지 않는 시료로는, 예를 들어, 세포를 포함하는 식품재료, 흙, 물, 섬유, 먼지 등을 들 수 있다. 생체유래 시료로는 동물 및 식물의 생체 구성성분을 적절하게 이용할 수 있다. 인간을 포함하는 동물유래의 시료로는, 예를 들어, 혈액, 조직액, 림프액, 뇌척수액, 고름, 점액, 콧물, 객담, 소변, 대변, 복수 등의 체액류, 피부, 폐, 간, 점액, 각종 장기, 뼈 등의 조직과 비강, 기관지, 피부, 각종 장기 등을 세정한 후의 세정액을 들 수 있다. 그리고 인간의 경우는 투석 배액도 시료로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 추출방법의 표적으로 하는 핵산은 시료에 포함되는 세포 고유의 핵산에 한정되지 않고, 세포에 감염된 바이러스의 핵산이나, 세포가 탐식한 미생물 등의 핵산에도 적용할 수 있다. 따라서, 감염증 환자의 탐식세포(백혈구 등)를 포함하는 생체유래 시료도 본 발명의 핵산 추출방법의 시료로 적합하다.

기존의 핵산 추출 방법들은 여러 가지 용액을 사용하여 세포를 용해하는 단계, 용해 후 단백질을 제거하는 단계 등으로 나뉘어져 있고, 단백질 제거 단계에서는 반응 효소를 처리하여 일정 시간 효소 활성을 보이도록 반응시키는 단계들이 포함되어 있어서 시간이 많이 소요되며, 여러 단계를 거쳐야 하므로 불순물의 오염 가능성이 증가하고 반복적인 실험을 수행할 시에 재현성 있는 결과를 얻는데 어려움이 있었다. 하지만 본 발명에 따른 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물을 이용한 핵산 추출방법은 하나의 조성물을 가지고 세포 용해와 단백질 제거, 및 핵산 추출을 동시에 가능하게 함으로써 핵산을 추출하는 단계를 줄이는 동시에 핵산을 추출하는데 소요되는 시간을 줄일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물을 유효성분으로 포함하는, 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는, 본 발명의 조성물 외에 핵산을 포함하는 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 기본적인 요소들을 포함하는 패키징된 조합일 수 있다. 그 요소들로는 버퍼용액의 컨테이너, 알코올, 세척버퍼, 정제수 및 하나 이상의 스핀 컬럼(spin column) 등이 있다. 또한, 상기 키트는 추출한 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭용 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 핵산 증폭용 조성물은 핵산 증폭반응 버퍼, 디옥시리보뉴클레오티드(dNTP), 염화마그네슘(MgCl₂), 중합효소 및 정제수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 추출 키트는 별도의 세포 용해 과정이 필요없는 검체 수송 배지 조성물을 유효성분으로 포함하고 있어 작업의 간단화를 도모할 수 있고, 작업시간을 단축할 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 실험 재료

구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 트리스(Tris), EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol), 사르코실(sarkosyl) 및 트레할로스(trehalose)는 Sigma-aldrich(미국)사의 제품을 구매하여 사용하였다.

2. DNA 추출 방법

인간 구강상피세포를 채취하고 검체 수송 배지를 이용하여 실온에서 3일간 보관한 후 DNA를 추출하였다. 추출방법은 간단하게, 상기 수송 배지 2㎖에 96~100% 에탄올을 210㎕ 주입하고, 이를 멤브레인 필터(membrane filter) 튜브로 옮긴 후 10,000rpm에서 30초간 원심분리한 뒤 분리된 용액을 제거하였다. 그 후 멤브레인 필터 튜브에 세척버퍼 500㎕를 주입하고 10,000rpm에서 30초간 원심분리한 뒤 분리된 용액을 제거하고, 세척버퍼 600㎕를 재주입하고 10,000rpm에서 30초간 원심분리한 뒤 분리된 용액을 제거하였다. 최종적으로 50㎕의 멸균 증류수를 멤브레인 필터 튜브에 주입하고 상온에서 1분간 방치한 후 10,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

3. RNA 추출 방법

인간 구강상피세포를 채취하고 검체 수송 배지를 이용하여 실온에서 2일간 보관한 후 RNA를 추출하였다. 추출방법은 간단하게, 상기 수송 배지 2㎖에 70% 에탄올을 210㎕ 주입하고, 이를 멤브레인 필터(membrane filter) 튜브로 옮긴 후 10,000rpm에서 30초간 원심분리한 뒤 분리된 용액을 제거하였다. 그 후 멤브레인 필터 튜브에 세척버퍼 700㎕를 주입하고 10,000rpm에서 30초간 원심분리한 뒤 분리된 용액을 제거하고, 세척버퍼 500㎕를 재주입하고 10,000rpm에서 30초간 원심분리한 뒤 분리된 용액을 제거하였다. 최종적으로 50㎕의 멸균 증류수를 멤브레인 필터 튜브에 주입하고 상온에서 1분간 방치한 후 10,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 추출된 RNA는 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

4. 중합효소연쇄반응(PCR)

추출한 핵산(DNA 또는 RNA)을 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. DNA 증폭에는 EBV 정방향 프라이머(5'-TTCCACCAATACATGAACC-3'; 서열번호 1) 및 EBV 역방향 프라이머(5'-TGGCAAAGTGGAGCAA-3'; 서열번호 2)를, RNA 증폭에는 GAPDH 정방향 프라이머(5'-TGTTGCVATCAATGACCCCTT-3'; 서열번호 3) 및 GAPDH 역방향 프라이머(5'-CTCCACGAVGTACTCAGCG-3'; 서열번호 4)를 이용하였다.

DNA 증폭을 위한 PCR 반응물은 DNA 1㎕, 2X PCR premixture(MyTaq^TM HS Red mix, Bioline, 영국) 10㎕, 10pmole/㎕ 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 1㎕ 및 증류수 7㎕를 혼합하여 사용하였고, PCR 반응조건은 다음과 같다: 초기변성 단계 94℃, 5분 1회; 변성 단계 94℃, 1분, 결합 단계 55℃, 1분 30초 및 신장 단계 72℃, 2분 총 40회; 최종 신장 72℃, 7분.

RNA 증폭을 위한 PCR 반응물은 RNA 1㎕, 2X One-step Mix(SensiFAST^TMSYBR No-Rox One-strp kit, Bioline, 영국) 10㎕, 10pmole/㎕ 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 1㎕, 0.2U RTase(SensiFAST^TMSYBR No-Rox One-strp kit) 0.2㎕, RNase 저해제 0.4㎕ 및 증류수 6.4㎕를 혼합하여 사용하였고, PCR 반응조건은 다음과 같다: 역전사 단계 42℃, 20분 및 95℃, 5분; 변성 단계 95℃, 30초, 결합 단계 55℃, 30초 및 신장 단계 72℃, 1분 총 35회; 최종 신장 72℃, 5분.

PCR 증폭산물들은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, EtBr로 염색한 후 관찰하였다.

실시예 1. 핵산 추출을 위한 검체 수송 배지 제조

본 발명의 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지는 그 구성성분으로서 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 트리스 버퍼(pH 8.0), EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol), 사르코실(sarkosyl) 및 트레할로스(trehalose)를 선정하였으며, 상기 성분 중 트리스 버퍼는 0.2M, EGTA는 0.02M, 사르코실은 0.75 %(w/v)로 하였으며, 나머지 성분인 구아니딘 티오시아네이트, β-메캅토에탄올 및 트레할로스는 하기 실시예에서 최적의 농도를 결정하였다.

실시예 2. 핵산 추출을 위한 구아니딘 티오시아네이트( guanidine thiocyanate) 농도 최적화

구아니딘 티오시아네이트는 세포벽 용해 물질로서, 세포의 모든 물질을 용액에 노출시키는 기능을 한다. 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 개발에 있어, 구아니딘 티오시아네이트의 최적 농도를 찾고자 1M, 2M, 4M 및 6M 농도의 구아니딘 티오시아네이트를 포함하는 수송 배지를 제작하여, 인간 구강상피세포로부터 핵산을 추출하여 결과를 살펴보았다.

그 결과, DNA의 경우, 4M 및 6M 농도의 구아니딘 티오시아네이트를 포함하는 수송 배지를 이용한 경우에 DNA의 밴드를 겔 상에서 확인할 수 있었다. 하지만, 추출한 DNA의 순도를 A260/280 비율로 확인한 결과, 6M 농도의 구아니딘 티오시아네이트를 포함하는 수송 배지를 이용하여 추출한 DNA의 순도가 보다 높음을 확인할 수 있었다(도 1). 반면, RNA 추출의 경우는 1M, 2M, 4M 및 6M 농도의 구아니딘 티오시아네이트를 사용한 모든 경우에서 A260/280 비율이 1.80 이상으로 나타나 순도 높은 RNA를 추출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 하지만, 1M과 6M의 구아니딘 티오시아네이트의 경우 추출된 RNA의 양이 3배 이상 차이남을 알 수 있었다(도 2).

상기의 결과들을 통해, 본 발명의 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지의 구아니딘 티오시아네이트의 최적 농도는 6M로 결정하였다.

실시예 3. 핵산 추출을 위한 β- 메캅토에탄올 ( mercaptoethanol ) 농도 최적화

β-메캅토에탄올의 최적 농도를 찾고자 1%, 2%, 4%, 6%, 8% 및 10%의 β-메캅토에탄올을 포함하는 수송 배지를 제작하여, 인간 구강상피세포로부터 핵산을 추출하여 결과를 살펴보았다.

그 결과, DNA의 경우, 4%, 6%, 8% 및 10%의 β-메캅토에탄올을 포함하는 수송 배지를 사용한 경우에 시료로부터 DNA가 추출됨을 확인할 수 있었다. 하지만, 추출한 DNA의 순도를 A260/280 비율로 확인한 결과, 4%, 6% 및 8%의 β-메캅토에탄올을 포함하는 수송 배지를 사용한 경우에는 DNA의 순도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 3). RNA의 경우 역시, 4%, 6%, 8% 및 10%의 β-메캅토에탄올을 포함하는 수송 배지를 사용한 경우에 시료로부터 RNA가 추출됨을 확인할 수 있었지만, 추출된 RNA의 순도는 10%의 β-메캅토에탄올을 포함하는 수송 배지를 사용한 경우가 가장 높은 것으로 확인되어(도 4), 본 발명의 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지의 β-메캅토에탄올의 최적 농도는 10%로 결정하였다.

실시예 4. 핵산 보존을 위한 트레할로스 ( trehalose ) 농도 최적화

트레할로스의 최적 농도를 찾고자 2.5% 및 5%의 트레할로스를 포함하는 수송 배지를 제작하여, 인간 구강상피세포로부터 핵산을 추출하여 결과를 살펴보았다.

그 결과, DNA 및 RNA 모두 트레할로스의 무첨가와 2.5% 및 5% 첨가의 경우에서 각각의 핵산이 확인되었다(도 5 및 도 6). 트레할로스의 경우, 핵산 안정제로서 일주일 이상의 장기간 시료 보관 시에 핵산 안정제로서의 우수한 기능을 확인할 수 있으나, 본 발명의 결과에서는 시료를 상온에서 2-3일동안만 두었기때문에, 수송 배지 조성물 내 트레할로스의 첨가 유무에 상관없이 결과 차이가 크지 않은 것으로 확인되었다. 하지만, 10%의 트레할로스를 포함하는 수송 배지를 제작하였을 때 수송 배지 내에 결정이 발생하여 배지 조성물로 적합하게 사용할 수 없었기에, 트레할로스의 농도를 최종 5%로 결정하였다.

실시예 5. 최적화된 수송 배지 조성물을 이용한 검체의 핵산( DNA 및 RNA ) 추출 및 이의 분석

상기 실시예들을 통해 각 성분들의 농도 최적화를 맞춘 수송 배지 조성물(6M 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 0.2M 트리스 버퍼, 0.02M EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 10%(v/v), 사르코실(sarkosyl) 0.75 %(w/v) 및 트레할로스(trehalose) 5 %(w/v))을 이용하여 인간 구강상피세포로부터 핵산을 추출하고, 추출된 핵산을 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 7 및 도 8에서 확인되는 것처럼 표적한 유전자의 단편들이 깨끗하게 증폭되었음을 알 수 있었다.

이상의 결과들을 통해, 본 발명의 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지가 분자 진단 시료의 용해 기능뿐만 아니라, 핵산 실온 보존력이 우수함을 확인할 수 있었다.

<110> Noblebio Co., Ltd. <120> Specimen transport medium composition for extracting nucleic acid without additional cell lysis step and uses thereof <130> PN15437 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttccaccaat acatgaacc 19 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tggcaaagtg gagcaa 16 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgttgcvatc aatgacccct t 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctccacgavg tactcagcg 19

Claims

5.5~6.5M 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 0.15~0.25M 트리스 버퍼, 0.015~0.025M EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 9.5~10.5 %(v/v), 사르코실(sarkosyl) 0.7~0.8 %(w/v) 및 트레할로스(trehalose) 2.5~5 %(w/v)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 검체는 동물세포, 미생물 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물.
제1항에 있어서, 6M 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 0.2M 트리스 버퍼, 0.02M EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) 10 %(v/v), 사르코실(sarkosyl) 0.75 %(w/v) 및 트레할로스(trehalose) 5 %(w/v)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 검체 수송 배지 조성물.
(a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 검체 수송 배지 조성물에 진단하고자 하는 시료를 넣어 수송하는 단계; 및
(b) 수송된 상기 (a) 단계의 시료가 첨가된 검체 수송 배지 조성물에 에탄올을 처리하여 핵산을 정제하는 단계를 포함하는, 검체로부터 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하는 방법.
제4항에 있어서, (a) 단계의 시료의 수송은 실온에서 2~3일간 수행되는 것을 특징으로 하는 검체로부터 별도의 세포 용해 과정 없이 핵산을 추출하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 검체 수송 배지 조성물을 유효성분으로 포함하는, 별도의 세포 용해(lysis) 과정 없이 핵산을 추출하기 위한 키트.