JP4228688B2 - Ｄｎａ遊離方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、特に硬組織（体毛、爪、骨等）由来の生体試料から核酸を遊離させる方法及びこれに用いられるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学、臨床診断、法医学等の分野に於いては、遺伝情報の解析，遺伝子疾患・ウイルス性疾患等の診断・原因究明，或いは個人識別・親子鑑定・犯罪鑑識等、種々の目的で、各種試料からの核酸鎖の遊離（抽出）及びその分析が広く行われている。
【０００３】
従来、核酸を遊離（抽出）する方法としては、例えば試料を物理的に、又は界面活性剤等で処理して破壊後、核酸を遊離（抽出）する方法（例えば、非特許文献１、非特許文献２等）、例えば界面活性剤，塩の存在下に、試料を蛋白質分解酵素で処理して核酸を遊離（抽出）する方法（例えば、特許文献１等）や還元剤，界面活性剤，キレート剤，タンパク質変性剤から選ばれる１種、塩及び共沈剤の存在下に、試料をタンパク質分解酵素で処理して破壊後、核酸を遊離（抽出）する方法（例えば、特許文献２等）等が知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの方法は、何れも核酸の収率が十分と言えるものではない。
特に、これらの方法は、血清、血漿等の血液成分を対象試料とするものであり、法医学分野等に於いて行われているような硬組織（例えば体毛や爪或いは骨等）を対象試料とした場合には、血液成分に比べて核酸の収率が著しく低下し、後の分析に耐えられる程の十分量の核酸を得ることができないという欠点や核酸を遊離（抽出）するために長い時間を必要とするという欠点等を有している。
【０００５】
【非特許文献１】
生化学実験講座２，「核酸の化学 Ｉ」，７４〜８０頁，２６２〜２７０頁，１９７５年，東京化学同人
【非特許文献２】
「遺伝子操作マニュアル」，２０〜２３頁，１９８５年，講談社
【特許文献１】
特開平６−２０５６７６号公報（請求項１、０００６〜０００７段落、０００９段落）
【特許文献２】
特開平７−２３６４９９９号公報（請求項１〜９、００１３段落）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記欠点を解消し、核酸を高収率且つ簡便に遊離させる方法及びそれに用いられるキットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成よりなる。
【０００８】
（１）硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることを特徴とする、当該試料から核酸を遊離させる方法（以下、本発明の遊離方法１と略記する。）。
【０００９】
（２）生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させることを特徴とする、当該試料から核酸を遊離させる方法（以下、本発明の遊離方法２と略記する。）。
【００１０】
（３）▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬、並びに▲３▼プロテイナーゼＫを含む試薬、若しくは▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物を含む試薬、▲３▼塩化カリウムを含む試薬、並びに▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬、とを組み合わせてなる生体試料から核酸を遊離させるためのキット。
【００１１】
即ち、本発明者等は、生体試料、特に硬組織（体毛、爪、骨等）由来の生体試料から、核酸を高収率且つ簡便に遊離させる方法について鋭意研究の結果、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることにより、今まで困難であった硬組織由来の生体試料から、高収率且つ簡便に核酸を遊離させることができること、また、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させることにより、生体試料からより高収率且つ簡便に核酸を遊離させることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明に於いて、塩化カリウムの使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されない。
具体的には、例えば試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中に、下限が通常20mM以上、好ましくは30mM以上、より好ましくは50mM以上の濃度添加される。上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中に、通常200mM以下、好ましくは150mM以下、より好ましくは100mM以下、特に好ましくは80以下の濃度添加される。
【００１３】
本発明に於いて用いられる陰イオン界面活性剤としては、カルボン酸類、スルホン酸類、硫酸エステル類、リン酸エステル類、コール酸類又はこれらの塩等が挙げられる。
カルボン酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等が挙げられ、具体的には、例えばオレイン酸、ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。
スルホン酸類としては、アルキルベンゼンスルホン酸（例えばラウリルベンゼンスルホン酸等）、ナフタレンスルホン酸（例えばジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等）、スルホコハク酸（例えばジオクチルスルホコハク酸等）等が挙げられ、具体的には、例えばラウリルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。
硫酸エステル類としては、高級アルコール硫酸エステル（例えばラウリル硫酸エステル等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル（例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステル等）等が挙げられ、具体的には、例えばラウリル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム：ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
リン酸エステル類としては、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等が挙げられ、具体的には、例えばモノステアリルリン酸、モノラウリルリン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。
コール酸類としては、コール酸、コール酸誘導体（例えばデオキシコール酸等）等が挙げられ、具体的には、例えばコール酸、デオキシコール酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
上記した陰イオン性界面活性剤のなかでも、カルボン酸類、硫酸エステル類、コール酸類及びこれらの塩が好ましく、特に硫酸エステル類の塩、なかでも高級アルコール硫酸エステルの塩が好ましい。具体的には、ラウロイルサルコシンナトリウム、ＳＤＳ及びコール酸ナトリウムが好ましく、特にＳＤＳが好ましい。本発明に於いて、上記した如き陰イオン性界面活性剤の使用量としては、用いられる陰イオン性界面活性剤の種類や試料の種類によって異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
このような使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常0.02％（w/v）以上、好ましくは0.03％（w/v）以上、より好ましくは0.04％（w/v）以上であり、上限は通常0.15％（w/v）以下、好ましくは0.1％（w/v）以下、より好ましくは0.1％（w/v）未満、更に好ましくは0.08％（w/v）以下、特に好ましくは0.06％（w/v）以下である。
【００１４】
本発明に於いて用いられるチオール化合物としては、例えばジチオトレイトール（以下、ＤＴＴと略記する。）、β−メルカプトエタノール（以下、βＭＥと略記する。）、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、還元型グルタチオン、ジチオエリトリトール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、２−メルカプトエタンスルホン酸、メルカプトコハク酸、１−チオ−β−Ｄ−グルコース二ナトリウム塩二水和物、４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプトピリミジン一水和物、２−アミノ−６−メルカプトプリンリボサイド水和物、チオフェノール、２−チオウラシル等が挙げられる。
なかでも、ＤＴＴ、βＭＥが好ましい。
本発明に於いて、上記したチオール化合物の使用量としては、用いられるチオール化合物の種類によって異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
このような使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常9.5mM以上、好ましくは20mM以上、より好ましくは38mM以上、更に好ましくは45mM以上であり、上限は通常１Ｍ以下、好ましくは750mM以下、より好ましくは500mM以下、更に好ましくは300mM以下である。
具体的には、例えばＤＴＴを用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常9.5mM以上、好ましくは20mM以上、より好ましくは38mM以上であり、上限は通常100mM以下、好ましくは75mM以下、より好ましくは50mM以下である。
また、例えばβＭＥを用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常100mM以上、好ましくは150mM以上、より好ましくは200mM以上、更に好ましくは300mM以上であり、上限は通常１Ｍ以下、好ましくは750mM以下、より好ましくは500mM以下である。
【００１５】
先ず、本発明の遊離方法１について以下に述べる。
【００１６】
本発明の遊離方法１は、硬組織由来の生体試料を対象とするものであり、当該生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の遊離方法１に於いて、硬組織としては、例えば爪、体毛、骨、歯等が挙げられ、通常爪、体毛等に由来する生体試料が用いられる。
尚、本発明の遊離方法１は、上記した如き硬組織以外の軟組織（例えば臓器、皮膚、血液，唾液等の体液等）、血痕、唾液斑或いはウイルス、細菌、培養細胞、植物・動物由来の試料に於いても使用可能である。
また、上記した如き生体試料の使用量としては、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、また、用いられる試料の種類によっても異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、特に限定されない。
具体的には、例えば試料として体毛を用いる場合には、体毛とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液に完全に浸る程度の長さとした体毛を、通常10cm以下、好ましくは４cm以下、より好ましくは３cm以下、特に好ましくは２cm以下であり、下限は通常0.2cm以上、好ましくは0.5cm以上である。尚、通常は上記した如き量の体毛を１cm程度の大きさに切断して用いる。また、多量の体毛を試料とした場合、体毛に含まれるメラニン等がポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を阻害することがあるので、本発明の遊離方法１を実施した後に、得られた核酸をＰＣＲ反応に共する場合には注意が必要である。
例えば試料として爪を用いる場合には、通常2mg以下、好ましくは1.5mg以下、より好ましくは１mg以下の範囲から適宜使用され、下限は通常0.2mg以上、好ましくは0.5mg以上である。尚、爪を試料とする場合、爪の溶解度、換言すれば、爪から遊離される核酸の回収率はプロテイナーゼＫと反応させる際の爪の大きさに依存し、大きくなるに従って溶解度（回収率）が低下するので、上記範囲から選ばれる量の爪をより細かく切断（通常0.5mm×1mm程度以下に切断）してプロテイナーゼＫとの反応に共することが好ましい。
【００１８】
本発明の遊離方法１に於いて、プロテイナーゼＫの使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常10μg／ml以上、好ましくは50μmg／ml以上、より好ましくは70μg／ml以上、特に好ましくは100μg／ml、更に好ましくは150μg／ml以上であり、上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常５mg／ml以下、好ましくは2.5mg／ml以下、より好ましくは1.5mg／ml以下、更に好ましくは1.0mg／ml以下である。
具体的には、例えば試料として体毛を用いる場合、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常10μg／ml以上、好ましくは50μmg／ml以上、より好ましくは70μg／ml以上、特に好ましくは100μg／ml、更に好ましくは150μg／ml以上である。上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常2.5mg／ml以下、好ましくは1.5mg／ml以下、より好ましくは1.0mg／ml以下である。
また、試料として爪を用いる場合、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常10μg／ml以上、好ましくは50μmg／ml以上、より好ましくは70μg／ml以上、特に好ましくは100μg／ml、更に好ましくは150μg／ml以上である。上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常2.5mg／ml以下、好ましくは1.5mg／ml以下、より好ましくは1.0mg／ml以下である。
尚、試料として爪等の比較的固いものを用いる場合は、核酸の回収率を上げることが可能となるので、後述するように、最終反応液中のプロテイナーゼＫの濃度が上記した如き範囲から選ばれる量となるようにプロテイナーゼＫを数回に分けて添加しながら試料と反応させることが好ましい。
【００１９】
尚、本発明の遊離方法１に於いて使用される塩化カリウムの使用量、好ましい態様、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の具体例、好ましい態様、使用量等は上記した通りであるが、特に陰イオン性界面活性剤としては、例えば試料として体毛を用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常0.02％（w/v）以上、好ましくは0.03％（w/v）以上、より好ましくは0.04％（w/v）以上の範囲から、上限は通常0.1％（w/v）未満、好ましくは0.08％（w/v）以下、より好ましくは0.06％（w/v）以下、更に好ましくは0.05％（w/v）以下の範囲から適宜選択して使用されるが好ましい。また、例えば試料として爪を用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常0.02％（w/v）以上、好ましくは0.03％（w/v）以上、より好ましくは0.04％（w/v）以上の範囲から、上限は通常0.15％（w/v）以下、好ましくは0.1％（w/v）以下、より好ましくは0.1％（w/v）未満、更に好ましくは0.08％（w/v）以下の範囲から適宜選択して使用されるのが好ましい。
【００２０】
本発明の遊離方法１は、上記した如き硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液（反応液）を調製し、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下、該生体試料にプロテイナーゼＫを作用（反応）させることにより実施することができる。
【００２１】
上記に於いて、硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液を調製する方法としては、最終的にこれら各成分を含有する溶液が得られる方法であれば良く、特に限定されない。
最も一般的な方法としては、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液（反応液）に、硬組織由来の生体試料を添加する方法、硬組織由来の生体試料に、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液（反応液）を添加する方法等が挙げられる。
また、硬組織由来の生体試料に、プロテイナーゼＫを含有する水溶液、塩化カリウムを含有する水溶液、陰イオン界面活性剤を含有する水溶液及びチオール化合物を含有する水溶液を夫々別々に添加しても良い。
更に、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物のうちの１種以上を含有する水溶液２種以上を、硬組織由来の生体試料に夫々別々に添加しても良く、このような方法としては、先ず硬組織由来の生体試料に陰イオン界面活性剤を含有する水溶液（溶解液）を添加するか、或いは陰イオン界面活性剤を含有する水溶液（溶解液）に硬組織由来の生体試料を添加するかして、硬組織由来の生体試料と陰イオン界面活性剤とを含有する溶液を調製し、次いで、当該溶液に更に塩化カリウム及びチオール化合物を含有する水溶液、並びにプロテイナーゼＫを含有する水溶液を順次添加混合する方法が好ましい。
上記方法に於いて、各水溶液中の各成分の使用濃度は、最終的な反応液（硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物を含有する溶液）中の濃度が上記した如き範囲から選ばれるように、各溶液の使用量を考慮に入れて適宜決定すればよい。
【００２２】
本発明の遊離方法１に於ける反応条件は、以下の通りである。
例えば、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応温度としては、下限は通常37℃以上、好ましくは40℃以上、より好ましくは55℃以上であり、上限は通常70℃以下、好ましくは65℃以下、より好ましくは60℃以下である。
試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応時間としては、反応温度や試料の種類・量等によって左右されるが、一般的には下限が通常10分以上、好ましくは20分以上、上限が通常36時間以下、好ましくは24時間以下の範囲から適宜選択され、例えば試料として体毛を使用する場合には、下限は通常10分以上、好ましくは20分以上であり、上限は通常140分以下、好ましくは90分以下、より好ましくは70分以下、更に好ましくは40分以下であり、例えば試料として爪を使用する場合には、下限が通常２時間以上、好ましくは４時間以上、より好ましくは６時間以上であり、上限が通常36時間以下、好ましくは24時間以下、より好ましくは18時間以下である。
また、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際のpHとしては、プロテイナーゼＫの活性に悪影響を及ぼさないpHであればよく、特に限定されないが、具体的には、下限は通常pH7.5以上、好ましくはpH8.0以上、より好ましくはpH8.2以上、特に好ましくはpH8.3以上であり、下限は通常pH12以下、好ましくはpH10以下、より好ましくはpH９以下である。
【００２３】
本発明の遊離方法１に於いては、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際のpHを上記した如き範囲に保つために緩衝剤を使用することができる。
このような緩衝剤としては、上記した如き反応温度に於いて上記した如きpH範囲で緩衝能を有するものであれば良く、特に限定されないが、例えばN-（2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸（ACES）、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸（BES）、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPS）、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPSO）、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸（CHES）、3-［N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ］-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、3-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（EPPS）、2-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］エタンスルホン酸（HEPES）、2-ヒドロキシ-3-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（HEPPSO）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）、ピペラジン-1,4-ビス（2-エタンスルホン酸）（PIPES）、ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）（POPSO）、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）、2-ヒドロキシ-N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPSO）、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-2-アミノエタンスルホン酸（TES）、N-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Tricine）、Bis-trisプロパン、コラミンクロリド、グリシン・アミド等のグッド緩衝剤、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（tris）、グリシルグリシン等の緩衝剤が挙げられる。
これらのなかでも好ましい緩衝剤としては、60℃に於けるpKaが下限としては通常6.50以上、好ましくは7.00以上、より好ましくは7.20以上、更に好ましくは7.30以上であり、上限としては通常13.00以下、好ましくは11.00以下、より好ましくは10.00以下、更に好ましくは9.50以下である緩衝剤が挙げられる。
具体的には、例えばBES〔pKa(60℃)：6.51〕、TES〔pKa(60℃)：6.70〕、HEPES〔pKa(60℃)：6.99〕、Tris〔pKa(60℃)：7.06〕、グリシン・アミド〔pKa(60℃)：7.04〕、HEPPS〔pKa(60℃)：7.72〕、Tricine〔pKa(60℃)：7.31〕、Bicine〔pKa(60℃)：7.63〕、CHES〔pKa(60℃)：9.14〕、CAPS〔pKa(60℃)：10.04〕、グリシルグリシン〔pKa(60℃)：7.28〕等の60℃に於けるpKaが6.50以上である緩衝剤が好ましく、例えばTris、グリシン・アミド、HEPPS、Tricine、Bicine、CHES、CAPS、グリシルグリシン等の60℃に於けるpKaが7.00以上である緩衝剤がより好ましく、例えばHEPPS、Tricine、Bicine、CHES、CAPS、グリシルグリシン等の60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤が特に好ましく、例えばHEPPS、Tricine、Bicine、CHES等の60℃に於けるpKaが7.30以上、9.50以下である緩衝剤が更に好ましい。これらのなかでも最も好ましくはTricineである。
また、上記した如き緩衝剤のうち、上記した如き性質を有し、且つΔpKa／℃が通常−0.030以下、好ましくは−0.025以下の緩衝剤を使用すれば、常温から酵素反応を行うための温度上昇に伴うpH変動を減少させることにより、高収率に核酸を遊離させることができる。
このような緩衝剤としては、例えばHEPPS〔ΔpKa／℃：−0.007〕、Tricine〔ΔpKa／℃：−0.021〕、Bicine〔ΔpKa／℃：−0.018〕、CHES〔ΔpKa／℃：−0.009〕、CAPS〔ΔpKa／℃：−0.009〕が挙げられ、なかでもTricineが最も好ましい。
上記した如き緩衝剤の使用量としては、用いられる緩衝剤の種類等により異なるため一概には言えないが、上記した如き反応温度に於いて上記した如きpH範囲を保持し得る量（上記した如きpH範囲に於いて緩衝能が得られるような量）であれば良く、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常１mM以上、好ましくは５mM以上、より好ましくは９mM以上、更に好ましくは9.5mM以上であり、上限は通常500mM以下、好ましくは250mM以下、より好ましくは100mM以下、更に好ましくは50mM以下である。
尚、本発明の遊離方法１に於いて上記した如き緩衝剤を使用するには、硬組織由来の生体試料にプロテイナーゼＫを作用させる際に、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物と同時に緩衝剤を共存させれば良く、前述した如き硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液を調製する方法に準じて行えばよい。即ち、最終的に、硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤を含有する溶液が得られる方法であればよく、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤の全てを含有する水溶液（反応液）に硬組織由来の生体試料を添加するか、硬組織由来の生体試料を当該反応液に添加する方法、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤を別々に含有する水溶液を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法、或いはプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤のうち１種以上を含有する水溶液２種以上を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法等が挙げられる。尚、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、緩衝剤のうちの１種以上を含有する水溶液２種以上を、硬組織由来の生体試料に夫々別々に添加する方法としては、先ず硬組織由来の生体試料に陰イオン界面活性剤及び緩衝剤を含有する水溶液（溶解液）を添加するか、或いは陰イオン界面活性剤及び緩衝剤を含有する水溶液（溶解液）に硬組織由来の生体試料を添加するかして、硬組織由来の生体試料と陰イオン界面活性剤及び緩衝剤とを含有する溶液を調製し、次いで、当該溶液に更に塩化カリウム及びチオール化合物を含有する水溶液、並びにプロテイナーゼＫを含有する水溶液を順次添加混合する方法が好ましい。
上記方法に於いて、各溶液中の緩衝剤の使用濃度及びpHは、最終的な反応液（硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤を含有する溶液）中の濃度及びpHが上記した如き範囲から選ばれるように、各溶液の使用量を考慮に入れて適宜決定すればよい。
【００２４】
本発明の遊離方法１に於いては、上記した如きプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物以外に、更に、通常この分野で使用される試薬類、例えばキレート剤等を共存させても良い。
即ち、硬組織由来の生体試料を、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物、要すればキレート剤の存在下、プロテイナーゼＫと反応させてもよい。
【００２５】
キレート剤としては、通常この分野で用いられるものであれば良く、特に限定されないが、二価の金属イオンをキレートし得る能力を有するものが好ましい。より具体的には、例えばヒドロキシ基を有していてもよいアルキルイミノポリカルボン酸〔ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）等〕、ニトリロポリカルボン酸〔ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）等〕、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基又はヒドロキシアラルキル基を有していてもよいモノ又はポリアルキレンポリアミンポリカルボン酸〔エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸二塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、1,6-ヘキサメチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（ＨＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸（ＤＴＰＡ）、N,N-ビス（2-ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン-N,N-二酢酸（ＨＢＥＤ）等〕、ポリアミノアルカンポリカルボン酸〔ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ、）、trans-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等〕、ポリアミノアルカノールポリカルボン酸〔ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）等〕、ヒドロキシアルキルエーテルポリアミンポリカルボン酸〔グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）等〕等の分子中に１〜４個の窒素原子と２〜６個のカルボキシル基を有する含窒素ポリカルボン酸類、例えばアミノポリ（アルキルホスホン酸）〔アミノトリス（メチレンホスホン酸）等〕、ニトリロポリ（アルキルホスホン酸）〔ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）等〕、モノ又はポリアルキレンポリアミンポリ（アルキルホスホン酸）〔エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、エチレンジアミン-N,N'-ビス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＤＰＯ）、イソプロピレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-ペンタ（メチレンホスホン酸）、エチレンジアミンビス（メチレンホスホン酸）、ヘキセンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）等〕、アルキルアミノポリ（アルキルホスホン酸）〔エチルアミノビス（メチレンホスホン酸）、ドデシルアミノビス（メチレンホスホン酸）等〕等の分子中に１〜３個の窒素原子と２〜５個のホスホン酸基を有する含窒素ポリホスホン酸類、例えばメチルジホスホン酸、エチリデンジホスホン酸、1-ヒドロキシエチリデン-1,1'-ジホスホン酸（ＨＥＤＰＯ）、1-ヒドロキシプロピリデン-1,1'-ジホスホン酸、1-ヒドロキシブチリデン-1,1'-ジホスホン酸等のヒドロキシ基を有していてもよいアルカンポリホスホン酸類、例えばジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）等が挙げられ、なかでもＥＤＴＡが好ましい。
また、上記した如きキレート剤の使用量としては、用いられるキレート剤の種類により異なるため一概には言えないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常１mM以上、好ましくは３mM以上、より好ましくは５mM以上、更に好ましくは７mM以上、特に好ましくは９mM以上であり、上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常200mM以下、好ましくは100mM以下、より好ましくは50mM以下、更に好ましくは25mM以下、特に好ましくは10mM以下である。
【００２６】
上記に於いて、キレート剤を共存させる方法としては、硬組織由来の生体試料にプロテイナーゼＫを作用させる際に、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物（要すれば緩衝剤）と同時にキレート剤を共存させれば良く、前述した如き硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物（要すれば緩衝剤）とを含有する水溶液を調製する方法に準じて行えばよい。即ち、最終的に、硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する溶液が得られる方法であればよく、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤の全てを含有する水溶液（反応液）に硬組織由来の生体試料を添加するか、硬組織由来の生体試料を当該反応液に添加する方法、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を別々に含有する水溶液を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法、或いはプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤のうち１種以上を含有する水溶液２種以上を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法等が挙げられる。
尚、このような方法のうち、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤のうちの１種以上を含有する水溶液２種以上を、硬組織由来の生体試料に夫々別々に添加する方法としては、先ず硬組織由来の生体試料に陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する水溶液（溶解液）を添加するか、或いは陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する水溶液（溶解液）に硬組織由来の生体試料を添加するかして、硬組織由来の生体試料と陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）及びキレート剤とを含有する溶液を調製し、次いで、当該溶液に更に塩化カリウム及びチオール化合物を含有する水溶液、並びにプロテイナーゼＫを含有する水溶液を順次添加混合する方法が好ましい。
上記方法に於いて、各溶液中のキレート剤の使用濃度は、最終的な反応液（硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する溶液）中の濃度が上記した如き範囲から選ばれるように、各溶液の使用量を考慮に入れて適宜決定すればよい。
【００２７】
本発明の遊離方法１を実施するには、例えば以下の通り行えばよい。
即ち、適当な大きさに切断した硬組織由来の生体試料をテストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）含有水溶液、適当量のチオール化合物及び塩化カリウム含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ含有水溶液を、これら溶液の全体量として当該試料が浸漬し得る程度の量夫々加え、当該溶液（反応液）を、例えば下限37℃以上、上限70℃以下、下限pH7.5以上、下限12以下の条件下で下限10分以上、上限36時間以下反応させればよい。
尚、上記に於いては、陰イオン界面活性剤（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）含有水溶液、チオール化合物及び塩化カリウム含有水溶液、プロテイナーゼＫ含有水溶液を別々の溶液として、当該試料に夫々添加しているが、当該試料に添加する前に、これら溶液を予め混合して１つの溶液とし、これを当該試料に添加しても良い。
また、試料として爪等の比較的固いものを用いる場合には、プロテイナーゼＫを数回に分けて反応液に追加添加して試料と反応させれば、核酸の回収率を上げることが可能となる。このような方法を実施する際の追加回数、追加する際のプロテイナーゼＫの濃度、反応時間等については特に制限はないが、例えば初めに試料とプロテイナーゼＫとを反応させた後、１乃至５時間毎に１乃至５回プロテイナーゼＫを追加添加すればよく、その際の使用濃度としては、使用するプロテイナーゼＫの総量（初めに試料と反応させたプロテイナーゼＫの量＋追加添加したプロテイナーゼＫの量）が、前述した如き濃度範囲となるように、夫々の場合（初めに試料と反応させる際及び追加添加する際）で使用されるプロテイナーゼＫの量を適宜選択すればよい。
更に、上記したようにプロテイナーゼＫを追加添加する場合には、チオール化合物（要すれば塩化カリウム）も併せて追加添加するのが好ましい。チオール化合物（要すれば塩化カリウム）を添加するには、プロテイナーゼＫ含有水溶液中にこれらを共存させておき、プロテイナーゼＫと同時に追加添加しても、また、追加添加するプロテイナーゼＫ含有水溶液とは別の溶液としてプロテイナーゼＫとは別に追加添加しても良い。尚、当該チオール化合物（要すれば塩化カリウム）の追加添加は、プロテイナーゼＫを追加添加する毎に併せて行う必要はなく、追加添加する際のチオール化合物や塩化カリウムの量は、前述した濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００２８】
以下に、体毛又は爪を試料として用いる場合の本発明の遊離方法１を具体的に説明する。
【００２９】
〔体毛を試料とする場合〕
例えば１cm以下に切断した体毛を適当量（４cm以下）テストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.01％以上、0.2％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（0.2mg／ml以上、2.5mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として体毛が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で10分以上、140分以下反応させればよい。
尚、上記方法に於いて、不溶物が存在する場合等には、必要に応じて常法に従って遠心分離処理（例えば通常5000rpm以上、好ましくは10000rpm以上、通常20000rpm以下、好ましくは15000rpm以下で、通常30秒以上、好ましくは１分以上、通常５分以下、好ましくは２分以下）を行い、上清を採取することにより当該不溶物を除去することができる。
【００３０】
〔爪を試料とする場合〕
例えば0.5mm×1mm以下に切断した爪を適当量（2mg以下）テストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.02％以上、0.5％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（0.3mg／ml以上、５mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として試料の爪が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で２時間以上、36時間以下反応させればよい。
尚、上記方法に於いて、プロテイナーゼＫを一度に添加して試料と反応させているが、0.5mg以上の爪を試料とする場合、及び１mgの爪を試料とする場合には、夫々以下のようにプロテイナーゼＫを数回に分けて添加して試料と反応させることにより、より効率よく核酸を遊離することができる。
即ち、0.5mg以上の爪を試料とする場合は、例えば0.5mm×1mm以下に切断した爪をテストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.02％以上、0.5％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／３量：0.１mg／ml以上、1.67mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として試料の爪が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で４時間反応させた後、これに適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／３量：0.１mg／ml以上、1.67mg／ml以下）含有水溶液を追加添加して更に４時間反応させる。次いで、再度適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／３量：0.１mg／ml以上、1.67mg／ml以下）含有水溶液を追加添加して終夜（１２〜１８時間）反応させればよい。（尚、プロテイナーゼＫ含有溶液の添加は計３回となる。）
また、１mg以上の爪を試料とする場合は、例えば0.5mm×1mm以下に切断した爪をテストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.02％以上、0.5％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／４量：0.075mg／ml以上、1.25mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として試料の爪が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で３時間反応させる。次いで、これに適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／４量：0.075mg／ml以上、1.25mg／ml以下）含有水溶液を追加添加して更に３時間反応させる。この操作を再度行った後、再度適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／４量：0.075mg／ml以上、1.25mg／ml以下）含有水溶液及び適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液を追加添加して終夜（１２〜１８時間）反応させればよい。（尚、プロテイナーゼＫ含有溶液の添加は計４回となる。）
尚、上記方法に於いては、必要に応じて常法に従って遠心分離処理（例えば通常5000rpm以上、好ましくは10000rpm以上、通常20000rpm以下、好ましくは15000rpm以下で、通常30秒以上、好ましくは１分以上、通常５分以下、好ましくは２分以下）を行い、上清を採取してもよい。
【００３１】
上記した如き本発明の遊離方法１で遊離された核酸鎖は、そのまま各種核酸鎖分析等の試料として使用することも可能であり、また、これを更に、この分野で通常使用されている方法によって核酸鎖を採取・精製する際の試料とすることも可能である。
【００３２】
次ぎに、本発明の遊離方法２について以下に述べる。
【００３３】
本発明の遊離方法２は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させることを特徴とするものである。
即ち、本発明の遊離方法２は、60℃に於けるpKaが7.20以上の緩衝剤を用いることにより、常温から酵素反応を行うために温度を上昇させた場合、上記した如きプロテイナーゼＫの安定pH領域或いは最適pH付近での緩衝能を十分に保持し得る。換言すれば、このような緩衝剤を用いることにより、酵素反応を行う温度（反応温度）に於いて、試料とプロテイナーゼＫとの反応の際のpHを上記した如きプロテイナーゼＫの安定pH領域或いは最適pH付近に保つことができる。その結果、プロテイナーゼＫの活性を十分に引き出すことができ、常法に比べ高収率に核酸を遊離させることができるのである。
【００３４】
本発明の遊離方法２に於いて、用いられる生体試料としては特に限定されないが、例えば各種臓器、皮膚、血液，唾液等の体液等（軟組織）、血痕、唾液斑或いはウイルス、細菌、培養細胞、植物・動物由来の試料等が挙げられる。尚、本発明の遊離方法２は、硬組織（例えば爪、体毛、骨、歯等）に由来する生体試料に於いても使用可能である。
また、上記した如き生体試料の使用量としては、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、また、用いられる試料の種類によっても異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、特に限定されない。
【００３５】
本発明の遊離方法２に於いて用いられる60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤としては、60℃に於けるpKaが7.20以上のものであれば良く、特に限定されない。また、なかでも60℃に於けるpKaが7.30以上のものを使用するのが好ましい。また、上限としては通常13.00以下、好ましくは11.00以下、より好ましくは10.00以下、更に好ましくは9.50以下である。
このような緩衝剤の具体例としては、前述した如き本発明の遊離方法１と同様である。
本発明の遊離方法２に於いては、常温から酵素反応を行うための温度上昇に伴うpH変動を減少させることにより、高収率に核酸を遊離させることができるため、上記した如き性質を有し、且つΔpKa／℃が通常−0.030以下、好ましくは−0.025以下の緩衝剤を使用するのが好ましい。
このような緩衝剤としては、例えばHEPPS〔ΔpKa／℃：−0.007〕、Tricine〔ΔpKa／℃：−0.021〕、Bicine〔ΔpKa／℃：−0.018〕、CHES〔ΔpKa／℃：−0.009〕、CAPS〔ΔpKa／℃：−0.009〕が挙げられ、なかでもTricineが最も好ましい。
また、上記した如き緩衝剤の使用量も、前述した如き本発明の遊離方法１と同様である。
【００３６】
また、本発明の遊離方法２に於いて用いられる塩化カリウムの使用量、好ましい態様、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の具体例、使用量、好ましい態様等は上記で述べた通りであり、また、プロテイナーゼＫの使用量、好ましい態様等は、上記した如き本発明の遊離方法１と同様である。
【００３７】
本発明の遊離方法２は、上記した如き生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤とを含有する水溶液（反応液）を調製し、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下、該生体試料にプロテイナーゼＫを作用（反応）させることにより実施することができる。
尚、上記に於いて、水溶液（反応液）を調製する方法は上記した如き本発明の遊離方法１に準じてこれを行えばよい。
【００３８】
また、本発明の遊離方法２に於ける反応条件、即ち、反応温度、反応時間、反応pH等は、本発明の遊離方法１と同様である。
【００３９】
本発明の遊離方法２に於いても、更に、通常この分野で使用される試薬類、例えばキレート剤等を共存させても良く、キレート剤の具体例、好ましい態様及び使用量等は上記した如き本発明の遊離方法１と同様であり、キレート剤を共存させる方法も上記した如き本発明の遊離方法１に準じて行えばよい。
【００４０】
本発明の遊離方法２を実施するには、通常この分野で行われている方法に準じて実施すればよい。
尚、生体試料として体毛又は爪を試料として用いる場合は、上記した如き本発明の遊離方法１と同様に実施すればよく、また、これら以外の生体試料〔例えば各種臓器、皮膚、血液，唾液等の体液等（軟組織）、ウイルス、細菌、培養細胞、植物・動物由来の試料等〕を試料とする場合は、自体公知の方法に準じて実施すればよい。
【００４１】
以下に、血痕、唾液斑を試料として用いる場合の本発明の遊離方法２を具体的に説明する。
【００４２】
例えば先ず、血痕又は唾液斑が付着している部分に生理食塩水を滴下し、血痕又は唾液斑中の血液又は唾液成分を当該生理食塩水中に溶解又は懸濁させる。当該生理食塩水を回収し、ガーゼ、紙（和紙）等の吸収性担体に塗布した後、当該吸収性担体の生理食塩水塗布部位を切り取る。次いで当該切り取り片を適当量（４cm以下）テストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.01％以上、0.2％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（0.2mg／ml以上、2.5mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として切り取り片が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で10分以上、140分以下反応させればよい。
尚、上記方法に於いて、使用した吸収性担体を、例えばピンセット等で除去するか、或いは必要に応じて常法に従って遠心分離処理（例えば通常5000rpm以上、好ましくは10000rpm以上、通常20000rpm以下、好ましくは15000rpm以下で、通常30秒以上、好ましくは１分以上、通常５分以下、好ましくは２分以下）を行い、上清を採取することにより除去することができる。
【００４３】
上記した如き本発明の遊離方法２で遊離された核酸鎖は、そのまま各種核酸鎖分析等の試料として使用することも可能であり、また、これを更に、この分野で通常使用されている方法によって核酸鎖を採取・精製する際の試料とすることも可能である。
【００４４】
上記した如き本発明の遊離方法１又は２を実施した後、即ち、試料とプロテイナーゼＫとを反応させた後（要すれば、反応後、更に遠心分離処理等を行って上清を採取した後）に、更に核酸を沈澱させる処理を行って、当該沈澱を採取することにより、遊離した核酸を精製・採取することができる。
【００４５】
本発明に於いて、核酸を沈澱させる処理としては、この分野で核酸を沈澱させるために行われている方法であればよく、特に限定されない。
このような方法としては、例えばアルコール沈澱法、塩化セシウム密度勾配遠心法（超遠心法）等が挙げられ、アルコール沈澱法が好ましい。
用いられるアルコール類としては、核酸を特異的に沈澱し得る性質を有するものであれば良く、特に限定されないが、具体的には例えばイソプロパノール、エタノール等の低級アルコール類が挙げられ、特にイソプロパノールが好ましい。また、後述するようにカオトロピック剤としてヨウ化ナトリウムを用いる場合には、特にイソプロパノールを用いて核酸の沈澱を行うことがより好ましい。
これらアルコール類の使用濃度としては、核酸を溶液から沈澱し得るような濃度であればよく、特に限定されないが、例えばイソプロパノールを用いる場合には、イソプロパノールの最終濃度（核酸とイソプロパノールとを接触させる際の溶液中の濃度）が通常40％以上、好ましくは50％以上となるように、本発明の遊離方法１又は２によって得られた溶液中に添加され、また、エタノールを用いる場合には、エタノールの最終濃度（核酸とエタノールとを接触させる際の溶液中の濃度）が通常60％以上、好ましくは70％以上の範囲で用いられる。
【００４６】
上記した如き方法を実施するには、例えば以下の如く行えばよい。
【００４７】
即ち、前述した如き本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液〔即ち、硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、塩化カリウム（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）の存在下に反応させて得られた溶液、又は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させて得られた溶液、或いはこれら溶液に遠心分離処理等を行って得られた上清〕に、適当量のアルコール類を添加し（例えばイソプロパノールの場合、最終濃度として通常40％以上、好ましくは50％以上となるような量、エタノールの場合、最終濃度として通常60％以上、好ましくは70％以上となるような量）、混合する。混合後、必要応じてこれを静置してもよい。
尚、ここで核酸を沈澱させ易くするため、例えばＮａＣｌ、酢酸ナトリウム等の塩類をアルコール類と共に適宜加えても良く、また、通常この分野で用いられている共沈剤の存在下に核酸を沈澱させても良い。更に、同様の目的で、遊離した核酸を含有する溶液とアルコール類とを混合した後−80℃〜４℃の低温で冷却しても良い。
混合後（要すれば静置後）、遠心分離処理し、核酸を沈澱させた後、上清を除き、得られた沈澱に、例えば通常20％以上、好ましくは30〜50％、より好ましくは40％のイソプロパノール溶液、又は通常50％以上、好ましくは60〜80％、より好ましくは70％のエタノール溶液等を適当量添加して洗浄する。
尚、当該洗浄は上記したイソプロパノール溶液及びエタノール溶液の何れかのみを用いて行っても良いが、好ましくはこれらの溶液を組み合わせて洗浄を行う（どちらかの溶液を用いて洗浄を行った後、続けて別の溶液を用いて洗浄を行う）のが好ましい。
洗浄後、遠心分離処理によって上清を除いた後、得られた核酸沈澱を加温や減圧等の常法により乾燥処理すれば、目的の核酸を得ることができる。
尚、上記方法で得られた核酸を、各種核酸鎖分析（例えばPCR法による遺伝子分析等）等の試料として使用する場合には、これを更にこの分野で通常使用されている方法、例えばＴＥ緩衝液（10mM Tris−塩酸緩衝液、１mM EDTA含有、pH8.0）等の通常この分野で用いられている緩衝液等に再溶解したものを使用するのが望ましい。尚、目的の核酸がDNAである場合には、再溶解された核酸溶液にRNase等を添加・反応させて共存するRNAを消化する方法等で核酸を更に精製しても、また、目的の核酸がRNAである場合には、再溶解された核酸溶液にDNase等を添加・反応させて共存するDNAを消化する方法等で核酸を更に精製してもよい。
【００４８】
上記方法に於いて用いられる共沈剤としては、通常この分野で用いられているものであれば良く、得に限定されないが、例えばグリコーゲン、デキストラン等の高分子多糖類、例えばトランスファーＲＮＡ等が挙げられる。なかでもグリコーゲン、デキストラン等の高分子多糖類が好ましく、グリコーゲンが特に好ましい。
また、上記した如き共沈剤の存在下に核酸を沈澱させる方法としては、核酸を沈澱させる際に、最終的に共沈剤を存在させ得る方法であれば良く、本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液に、アルコール類を添加する前、又はアルコール類を添加するのと同時或いは添加後に、共沈剤を含有する水溶液を遊離した核酸を含有する溶液に添加すればよい。なかでも、本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液に、アルコール類を添加する前に、共沈剤を含有する水溶液を添加しておいたほうが好ましい。
共沈剤の使用量としては、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すれば良く、特に限定されない。
【００４９】
上記した如き本発明の遊離方法１又は２を実施した後、即ち、試料とプロテイナーゼＫとを反応させた後（要すれば、反応後、更に遠心分離処理等を行って上清を採取した後）に、更に核酸を抽出する処理を行い、その後、更に核酸を沈澱させる処理を行って、当該沈澱を採取することにより、共存する不純物を除去することができる。
【００５０】
本発明に於いて、核酸を抽出する処理としては、この分野で通常行われている方法であればよく、特に限定されない。
このような方法としては、例えばフェノール、クロロホルム、フェノール−クロロホルム、クロロホルムとその他の有機溶媒の混合物を用いる方法やカオトロピック剤を用いる方法等の共存するタンパク質を変性溶解処理する方法、例えばガラス等のシリカ表面への固相吸着等の方法及び陰イオン交換体等のフィルターを用いる方法等が挙げられるが、なかでもカオトロピック剤を用いる方法は、フェノール・クロロホルム等の（水飽和フェノールやクロロホルム）有機溶媒を用いる代わりにカオトロピック剤を使用することにより、その後の有機溶媒を除去する過程を省略することができ、また、特別な装置等も必要としないので好ましい。
カオトロピック剤としては、一般にカオトロピック剤として知られているような、水溶液に添加した際にカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生成し、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばヨウ化アルカリ、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸のアルカリ金属塩、トリクロロ酢酸のアルカリ金属塩、及びチオシアン酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。これらアルカリ金属塩或いはヨウ化アルカリに於けるアルカリ金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。なかでも、ヨウ化アルカリが好ましく、ヨウ化ナトリウムが特に好ましい。
これらカオトロピック剤の使用濃度は、用いるカオトロピック剤の種類により異なるが、一般的にカオトロピック剤の最終濃度（核酸とカオトロピック剤とを接触させる際の溶液中の濃度）が下限として通常95Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、より好ましくは２Ｍ以上、上限として通常７Ｍ以下、好ましくは５Ｍ以下、より好ましくは３Ｍ以下の範囲で用いられる。特にヨウ化ナトリウムを使用する場合には、下限として通常95Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、より好ましくは２Ｍ以上、上限として通常７Ｍ以下、好ましくは５Ｍ以下、より好ましくは３Ｍ以下の範囲となるように使用するのが好ましい。
【００５１】
本発明の方法に於いて、カオトロピック剤を用いる方法としては、上記した如き本発明の遊離方法１又は２により得られた核酸〔即ち、硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、塩化カリウム（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）の存在下に反応させて得られた溶液、又は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させて得られた溶液、或いはこれら溶液に遠心分離処理等を行って得られた上清〕とカオトロピック剤とを接触させ得る方法であれば良く、通常は本発明の遊離方法１又は２で得られた核酸を含有する溶液に、上記した如き濃度範囲のカオトロピック剤を含有する水溶液を添加すればよい。
尚、当該カオトロピック剤を含有する水溶液中には、前述した如きグッドの緩衝剤、Tris緩衝剤、グリシン、リン酸塩、クエン酸塩等、通常この分野で用いられる緩衝剤を共存させても良い。また、その使用濃度も通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すれば良く、通常１〜500mM、好ましくは10〜200mM、より好ましくは10〜100mMの範囲で用いられる。
また、カオトロピック剤を含有する水溶液のpHとしては、核酸の遊離を妨げない範囲であれば特に限定されないが、通常２〜12、好ましくは７〜９の範囲から適宜選択される。
更に、核酸とカオトロピック剤とを接触させる際には、例えばEDTAに代表される上記した如きキレート剤等の核酸分解酵素（例えばDNase、RNase等）の阻害剤の共存下でこれを行うことが好ましい。尚、本発明に於いては、カオトロピック剤を含有する水溶液中にキレート剤を含有させておくことが好ましいが、本発明の遊離方法１又は２でキレート剤を用いた場合であって、核酸とカオトロピック剤とを接触させる際に十分な核酸分解酵素阻害作用を得られる量のキレート剤が存在している場合には、核酸とカオトロピック剤とを接触させる際に、特にキレート剤を添加しなくてもよい。また、キレート剤の使用量としては、核酸分解酵素を阻害し得る量であれば良く特に限定されないが、通常核酸とカオトロピック剤とを接触させる際の溶液中の濃度として、通常１〜200mMの範囲から適宜選択される。
【００５２】
上記した如き方法を実施するには、例えば以下の如く行えばよい。
【００５３】
即ち、前述した如き本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液〔即ち、硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、塩化カリウム（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）の存在下に反応させて得られた溶液、又は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させて得られた溶液、或いはこれら溶液に遠心分離処理等を行って得られた上清〕に、適当量のカオトロピック剤（要すれば緩衝剤又は／及びキレート剤）を含有する水溶液を添加して（下限として通常0.5Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、より好ましくは２Ｍ以上、上限として通常７Ｍ以下、好ましくは５Ｍ以下、より好ましくは３Ｍ以下）当該溶液とカオトロピック剤とを接触させる。その後、更に適当量のアルコール類を添加し（例えばイソプロパノールの場合、最終濃度として通常40％以上、好ましくは50％以上となるような量、エタノールの場合、最終濃度として通常60％以上、好ましくは70％以上となるような量）、混合する。混合後、必要応じてこれを静置してもよい。尚、ここで核酸を沈澱させ易くするため、例えばＮａＣｌ、酢酸ナトリウム等の塩類をアルコール類と共に適宜加えても良く、また、通常この分野で用いられている共沈剤の存在下に核酸を沈澱させても良い。更に、同様の目的で、遊離した核酸を含有する溶液とアルコール類とを混合した後−80℃〜４℃の低温で冷却しても良い。
混合後（要すれば静置後）、遠心分離処理し、核酸を沈澱させた後、上清を除き、得られた沈澱に、例えば通常20％以上、好ましくは30〜50％、より好ましくは40％のイソプロパノール溶液、又は通常50％以上、好ましくは60〜80％、より好ましくは70％のエタノール溶液等を適当量添加して洗浄する。
尚、当該洗浄は上記したイソプロパノール溶液及びエタノール溶液の何れかのみを用いて行っても良いが、好ましくはこれらの溶液を組み合わせて洗浄を行う（どちらかの溶液を用いて洗浄を行った後、続けて別の溶液を用いて洗浄を行う）のが好ましい。
遠心分離処理によって上清を除いた後、得られた核酸沈澱を加温や減圧等の常法により乾燥処理すれば、目的の核酸を得ることができる。
尚、上記方法で得られた核酸を、各種核酸鎖分析（例えばPCR法による遺伝子分析等）等の試料として使用する場合には、これを更にこの分野で通常使用されている方法、例えばＴＥ緩衝液（10mM Tris−塩酸緩衝液、１mM EDTA含有、pH8.0）等の通常この分野で用いられている緩衝液等に再溶解したものを使用するのが望ましい。尚、目的の核酸がDNAである場合には、再溶解された核酸溶液にRNase等を添加・反応させて共存するRNAを消化する方法等で核酸を更に精製しても、また、目的の核酸がRNAである場合には、再溶解された核酸溶液にDNase等を添加・反応させて共存するDNAを消化する方法等で核酸を更に精製してもよい。
【００５４】
上記方法に於いて用いられる共沈剤の具体例、好ましい態様、使用濃度等は前述した通りであり、また、使用方法は、アルコール類を添加する前、又はアルコール類を添加するのと同時或いは添加後に、共沈剤を含有する水溶液を添加して、核酸と接触させれば良い。換言すれば、カオトロピック剤を含有する水溶液を添加して核酸をカオトロピック剤と接触させる前、又は接触させると同時或いは接触させた後に、共沈剤を含有する水溶液を添加して核酸を共沈剤と接触させれば良い。なかでも、上記方法に於いては、カオトロピック剤を核酸と接触させると同時或いは接触させた後に、共沈剤を核酸に接触させのが好ましく、特に、カオトロピック剤を含有する水溶液中に当該共沈剤を含有させておけば、操作をより簡便にし得る等の理由から、カオトロピック剤と共沈剤とを同時に核酸に接触させるのがより好ましい。
また、上記方法に於いては、核酸を含有する溶液にカオトロピック剤（要すれば緩衝剤、キレート剤、共沈剤）を含有する水溶液を添加した後、続けてアルコール類を添加するものであり、カオトロピック剤の反応に特別な反応時間や反応温度（通常は常温で行う）等を必要とするものではない。
【００５５】
本発明の核酸を遊離させるためのキットは、上記した如き本発明の方法を効果的に実施するために使用されるもので、（ｉ）▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬、並びに▲３▼プロテイナーゼＫを含む試薬、若しくは（ｉｉ）▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物を含む試薬、▲３▼塩化カリウムを含む試薬、並びに▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬、とを組み合わせてなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例等については先に述べた通りである。
尚、上記した如き本発明のキットに於いて、各成分を含む試薬は、前述した如き濃度範囲から選ばれる量を含有する水溶液等の溶液状態のものでも、また、当該濃度範囲から選ばれる量を含有する凍結乾燥状態又は乾燥状態のものでも良く、試薬形態については特に限定されない。尚、試薬形態が凍結乾燥状態又は乾燥状態である場合には、必要に応じてそれを溶解するための溶液と組み合わせても良い。
特に、本発明のキットの各試薬のうち、チオール化合物を含む試薬及びプロテイナーゼＫを含む試薬は凍結乾燥状態とする方が、チオール化合物及びプロテイナーゼＫを安定に保つことができるので好ましい。
【００５６】
本発明のキットは、本発明の方法に適用されるものであり、各試薬を混合させた際のpHが、前述した如きpH範囲、即ち、具体的には、下限が通常pH7.5以上、好ましくはpH8.0以上、より好ましくはpH8.2以上、特に好ましくはpH8.3以上、下限が通常pH12以下、好ましくはpH10以下、より好ましくはpH９以下の範囲となるように適宜調整されたものである。
【００５７】
本発明のキットに於いては、各試薬を混合させた際のpHを上記した如き範囲とするために、緩衝剤を用いることができる。
このような緩衝剤の具体例、好ましい態様等は前述した通りであるが、HEPPS、Tricine、Bicine、CHES、CAPS、グリシルグリシン等の60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤が特に好ましく、HEPPS、Tricine、Bicine、CHES等の60℃に於けるpKaが7.30以上、9.50以下である緩衝剤が更に好ましく、なかでもTricineが最も好ましい。
尚、緩衝剤は、各試薬を混合させた際のpHを上記した如き範囲とすることができるのであれば、各試薬の夫々全てに含有させても、また、何れかの試薬にのみ含有させておいても、或いは上記した如き本発明の各試薬とは別の試薬としても良く、特に制限はない。
特に、本発明のキットに於いては、陰イオン界面活性剤を含有する試薬中に含有させておくのが好ましい。
【００５８】
本発明のキットに於いては、上記した如きプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物以外に、更に、通常この分野で使用される試薬類、例えばキレート剤等を組み合わせても良い。
このようなキレート剤の具体例、好ましい態様等は前述した通りであるが、EDTAが好ましい。
尚、キレート剤は、各試薬の夫々全てに含有させても、また、何れかの試薬にのみ含有させておいても、或いは上記した如き本発明の各試薬とは別の試薬としても良く、特に制限はない。
特に、本発明のキットに於いては、陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）を含有する試薬中に含有させておくのが好ましい。
【００５９】
以下に、本発明のキットの一例を具体的に示す。
▲１▼陰イオン界面活性剤、緩衝剤及びキレート剤を含む試薬
▲２▼チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬
▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬
【００６０】
以下に、本発明のキットの他の一例を具体的に示す。
▲１▼陰イオン界面活性剤、緩衝剤及びキレート剤を含む試薬（水溶液）
▲２▼チオール化合物を含む試薬（凍結乾燥状態）
▲３▼塩化カリウムを含む試薬（水溶液）
▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬（凍結乾燥状態）
【００６１】
本発明のキットには、更に、上記した如き核酸を抽出する処理する方法に於いて用いられる試薬、例えばフェノール、クロロホルム、フェノール−クロロホルム、クロロホルムとその他の有機溶媒の混合物やカオトロピック剤等のタンパク質変性溶解剤を含む試薬を組み合わせても良い。なかでも、カオトロピック剤を含む試薬を組み合わせることが好ましい。
また、当該カオトロピック剤を含む試薬中には、前述した如き緩衝剤、キレート剤等の核酸分解酵素の阻害剤等を共存させても良い。
このようなカオトロピック剤を含む試薬のpHは、前述した通り、通常２〜12、好ましくは７〜９である。
更に、当該カオトロピック剤を含む試薬中には、更に共沈剤を含有させることもできる。
尚、カオトロピック剤、緩衝剤、キレート剤、共沈剤等の好ましい態様、具体例等については先に述べた通りであるが、カオトロピック剤としてはヨウ化ナトリウムが好ましく、緩衝剤としてはTris緩衝剤が好ましい。また、キレート剤としてはEDTAが好ましく、共沈剤としてはグリコーゲンが好ましい。
また、当該カオトロピック剤を含む試薬の形態は、特に限定されず、水溶液等の溶液状態のものでも、また、凍結乾燥状態又は乾燥状態のものでも良く、試薬形態が凍結乾燥状態又は乾燥状態である場合には、必要に応じてそれを溶解するための溶液と組み合わせても良い。
【００６２】
本発明のキットには、更に、上記した如き核酸を沈澱させる処理に於いて用いられる試薬を組み合わせても良い。このような試薬としては、例えばイソプロパノール、エタノール等の低級アルコール類が挙げられ、特にイソプロパノールが好ましい。
尚、使用濃度等については先に述べた通りである。
【００６３】
また更に、本発明のキットには、核酸を沈澱させる処理により得られた核酸沈澱を洗浄するために用いられる、アルコール類を含む水溶液１種以上を組み合わせても良い。このようなアルコール類としては、イソプロパノール、エタノール等が好ましい。なかでも、イソプロパノールを含む水溶液及びエタノールを含む水溶液の２種の水溶液を組み合わせるのが好ましい。
尚、使用濃度等については先に述べた通りである。
【００６４】
本発明のキットは、例えば下記の如き構成からなるものが好ましい。
▲１▼陰イオン界面活性剤、緩衝剤及びキレート剤を含む試薬（水溶液）
▲２▼チオール化合物を含む試薬（凍結乾燥状態）
▲３▼塩化カリウムを含む試薬（水溶液）
▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬（凍結乾燥状態）
▲５▼カオトロピック剤及び共沈剤を含む試薬（水溶液）
▲６▼40％イソプロパノール溶液からなる試薬
▲７▼70％エタノール溶液からなる試薬
尚、▲５▼の試薬中には、更に緩衝剤及びキレート剤を含有させておくのが好ましい。また、上記▲１▼〜▲７▼の試薬の他に、核酸を沈澱させるためのアルコール類からなる試薬を組み合わせても良い。
【００６５】
本発明の方法及び試薬を用いて得られた遊離された核酸は、遺伝子工学、臨床診断、法医学等の分野に於ける、遺伝情報の解析，遺伝子疾患・ウイルス性疾患等の診断・原因究明，或いは個人識別・親子鑑定・犯罪鑑識等の各種分析（例えばサザンブロッティング法やPCR法を利用する方法等）に用いられる試料として用いることができる。
なかでも、DNAタイピング法やDNAフィンガープリント法（例えばPCR-RFLP法、PCR-SSOP法、PCR-LIPA法、PCR-SSCP法、PCR-SSP法、PCR-CFLP法、PCR-RAPD法、PCR-RDA法、RNaseプロテクション法、DGGE法、TGGE法）に於いて有用に用いられる。
【００６６】
以下に、実験例、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００６７】
【実施例】
実施例．１ 塩の違いによる試料の溶解性の変化
１cmに切断した毛髪１本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で75分間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 0.05％
・ＤＴＴ 45mM
・所定の塩 所定濃度
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表１に示す。
尚、表中の溶解性判定に於ける記号は夫々以下のことを示す。
−：反応前後で変化なし。
±：反応前後で変化有り。（試料が軟化する。）
＋：若干溶解が認められる。（試料が小さくなる。）
＋＋：溶解が認められる。（試料がかなり小さくなる。）
＋＋＋：強い溶解が認められる。〔試料が小片（バラバラ）になる。〕
＋＋＋＋：著しい溶解が認められる。（試料が粒状になる。）
○：完全に溶解する。
【００６８】
【表１】
【００６９】
表１の結果から明らかなように、ＫＣｌは、ＮａＣｌに比べ、毛髪に対してかなり強い溶解力を有していることが判る。
【００７０】
実施例．２ 塩化カリウム濃度と試料の溶解性との関係
１cmに切断した毛髪３本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で55分間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 0.05％
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 所定濃度
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表２に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００７１】
【表２】
【００７２】
表２から明らかなように、ＫＣｌは、20mM以上の濃度から強い溶解力を示すようになり、50mM以上の濃度ではその溶解力に殆ど差が認められないこと、即ち、これ以上の濃度では溶解力の濃度依存性が殆どないことが判る。
【００７３】
実施例．３ 界面活性剤の違いによる試料の溶解性の変化
１cmに切断した毛髪２本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・所定の界面活性剤 所定濃度
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 75mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表３に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００７４】
【表３】
【００７５】
表３から明らかなように、ラウリルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤は強い溶解力を示すのに対して、陽イオン界面活性剤である臭化セチルトリメチルアンモニウムは試料を殆ど溶解し得ないことが判る。即ち、本発明に用いられる界面活性剤としては陰イオン界面活性剤が極めて有用であることが示唆される。
【００７６】
実施例．４ 界面活性剤濃度と試料の溶解性及びＤＮＡ収量との関係
１cmに切断した毛髪１本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 所定濃度
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 75mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表４に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００７７】
【表４】
【００７８】
表４から明らかなように、ＳＤＳは何れの濃度に於いても溶解性を示すものの、至適濃度が存在することが判る。特に、0.1％以上の濃度を用いると、その溶解力が著しく低下してくることが判る。即ち、本発明に於いては、界面活性剤を0.02％〜0.1％未満の濃度範囲、好ましくは0.02％〜0.06％の濃度範囲で用いればより効果的に試料を溶解し得ること、特に0.03％〜0.05％の濃度範囲で界面活性剤を用いた場合試料の溶解性が著しく強いことが判る。
【００７９】
実施例．５ 界面活性剤濃度と試料の溶解性との関係
0.5cm×１cmに切断した爪 １個を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を240μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 所定濃度
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 100mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の爪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表５に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００８０】
【表５】
【００８１】
表５から明らかなように、試料として爪を用いた場合でも、ＳＤＳは何れの濃度に於いても溶解性を示すものの、至適濃度が存在することが判る。即ち、本発明に於いて爪を試料として用いた場合には、界面活性剤を0.02％〜0.15％の濃度範囲、好ましくは0.03％〜0.1％未満の濃度範囲で用いればより効果的に試料を溶解し得ること、特に0.05％〜0.08％の濃度範囲で界面活性剤を用いた場合試料の溶解性が著しく強いことが判る。
【００８２】
実施例．６ チオール化合物の種類及び濃度と試料の溶解性との関係
１cmに切断した毛髪１本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 0.05％
・所定のチオール化合物 所定濃度
・ＫＣｌ 75mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
チオール化合物としてＤＴＴを用いた場合の結果を表６に、また、チオール化合物としてβＭＥを用いた場合の結果を表７に夫々示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００８３】
【表６】
【００８４】
【表７】
【００８５】
表６から明らかなように、ＤＴＴは9.5mM〜100mMの濃度範囲に於いて強い溶解力を有することが判る。特に38mM〜50mMの濃度範囲に於いては著しい溶解力を有していることが判る。
また、表７から明らかなように、βＭＥは100mM〜1000mMの濃度範囲に於いて強い溶解力を有することが判る。特に200mM〜750mMの濃度範囲に於いては著しい溶解力を有していることが判る。
以上のことから、チオール化合物の種類によって至適濃度は多少異なるものの、本発明に於いてチオール化合物が有用であることが示唆される。
【００８６】
実施例．７ 毛髪からのＤＮＡの採取
下記毛髪試料を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を190μl、下記組成からなるＤＴＴ溶液を10μl及び10mg/mlプロテイナーゼＫ含有溶液（ＰＫ溶液）を10μl加えた後、55℃で40分間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した後、15,000rpmで１分間遠心分離処理し、上清200μlを別のマイクロ遠沈管に移した。その上清にヨウ化ナトリウム溶液〔7.62Ｍ ヨウ化ナトリウム、20mM ＥＤＴＡ及び90μg/mlグリコーゲン含有40mM Tris-HCl（pH8.0）〕を250μl及びイソプロパノールを450μl加え、攪拌した後15,000rpmで10分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に、40％イソプロパノール溶液を１ml加えて攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に70％エタノール溶液を１ml加えて更に攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除き、乾燥処理して目的の核酸を得た。最後に、得られた核酸を25μlのＴＥ緩衝液〔１mM ＥＤＴＡ含有10mM Tris-HCl（pH8.0）〕に再溶解してＤＮＡサンプルとした。
（試料）
・抜去毛（毛根部）：５mm×１本
・脱落毛（毛根部）：５mm×１本
（溶解液）
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10.5mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10.5mM
・ＳＤＳ 0.053％
（ＤＴＴ溶液）
・ＤＴＴ 0.9Ｍ
・ＫＣｌ 1.5Ｍ
【００８７】
得られたＤＮＡサンプルは、自体公知の吸光度法（A260法）及び電気泳動法（「増補版 ラボマニュアル遺伝子工学」，３４〜３５頁，平成２年６月３０日発行，丸善株式会社に記載の「光学的方法」及び「電気泳動で調べる方法」）に従ってＤＮＡ収量を確認した。
その結果を表８に示す。
また、従来法として、上記試料を用いて平野等の方法（「毛髪，および爪からの迅速なＤＮＡ抽出法」，ＤＮＡ多型Ｖｏｌ.６ ＤＮＡ多型のさらなる展開，７６〜８０頁，１９９８年７月３１日発行，株式会社東洋書店）に従って、これを行った。
その結果を、表８に併せて示す。
〔結果〕
【００８８】
【表８】
【００８９】
表８の結果から明らかなように、本発明方法は従来法に比べてＤＮＡ収量が多いことが判る。即ち、本発明の方法により、容易に且つ効率よく毛髪から核酸を遊離し得ることが判る。
【００９０】
実施例．８ 毛髪からのＤＮＡの採取
下記毛髪試料を用いた以外は、実施例．７と同じ試薬を用い、同じ操作を行って、ＤＮＡサンプルを得た。
（試料）
女性２名（Ａ、Ｂ）及び男性３名（Ａ、Ｂ、Ｃ）から得た以下の長さの毛髪（毛幹部）を試料とした。
・５mm（５mm×１本）
・1.0cm（５mm×２本）
・1.5cm（５mm×３本）
得られたＤＮＡサンプルのうち２μlについて、ＰＣＲ法によりミトコンドリアＤＮＡ高変位領域Ｉの増幅反応を行い、ＰＣＲ法用サンプルとしての良否を検討した。尚、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄを用いて常法に従い、以下の条件により行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エチジウムブロマイド0.5μg/mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液〔１mm ＥＤＴＡ含有0.04Ｍ Tris-酢酸緩衝液（pH7.8）〕を用いて作製した1.5％アガロースゲルを使用して100Ｖ定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶを使用してＤＮＡを蛍光検出した。
その結果を図１に示す。
（ＰＣＲ条件）
・Forwardプライマー（合成）：5'-TACTTGACCACCTGTAGTAC-3'（配列番号：１）
・Reverseプライマー（合成）：5'-TAGTTTCACGGAGGATGGTG-3'（配列番号：２）
・95℃11分間；95℃30秒間，52℃30秒間，72℃45秒間、45回；72℃７分間
【００９１】
尚、図１中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：分子量マーカー〔φＸ１７４ HaeIII消化産物、TAKARA社製〕
・レーン２：女性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン７：女性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１０：男性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１１：男性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１２：男性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１３：男性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１４：男性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１５：男性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１６：男性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１７：陽性コントロール〔常法により血液から採取したゲノムＤＮＡ〕
・レーン１８：陰性コントロール〔ＤＮＡサンプルの代わりに蒸留水を用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行ったもの〕
また、図１中、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
【００９２】
〔結果〕
図１から明らかなように、性別を問わずいずれの場合でもミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅断片が認められ、本発明の方法により得られた核酸は、支障無くＰＣＲ法のサンプルとして使用し得ることが判る。
即ち、本発明の方法により得られた核酸は、メラニン等のＰＣＲ反応阻害物質の混入が殆どなく、ＰＣＲ法のサンプルとして良好に用いることができることが判る。
また、得られたＰＣＲ増幅産物は、その後のシークエンス解析に於いて、質・量共に良好なサンプルとなり得ることが示唆される。
【００９３】
実施例．９ 毛髪からのＤＮＡの採取
下記毛髪試料を用いた以外は、実施例．８と同じ試薬を用い、同じ操作を行って、ＤＮＡサンプルを得た。
（試料）
女性２名（Ｃ、Ｄ）及び男性１名（Ｄ）から得た以下の長さの毛髪（毛幹部）を試料とした。
・５mm（５mm×１本）
・1.0cm（これは５mm×２本）
・1.5cm（これは５mm×３本）
得られたＤＮＡサンプルのうち２μlについて、ＰＣＲ法によりアメロゲニン遺伝子の増幅反応を行い、ＰＣＲ法用サンプルとしての良否を検討した。尚、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄを用いて常法に従い、以下の条件により行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エチジウムブロマイド0.5μg/mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液〔１mm ＥＤＴＡ含有0.04Ｍ Tris-酢酸緩衝液（pH7.8）〕を用いて作製した4.0％アガロースゲルを使用して100Ｖ定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶを使用してＤＮＡを蛍光検出した。
その結果を図２に示す。
（ＰＣＲ条件）
・Forwardプライマー（合成）：5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3'（配列番号：３）
・Reverseプライマー（合成）：5'-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3'（配列番号：４）
・95℃11分間；95℃30秒間，67℃30秒間，72℃30秒間、45回；72℃７分間
【００９４】
尚、図２中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：女性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン２：女性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン７：男性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
また、図２中、「→」はＸ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（106bp）を、「⇒」はＹ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（112bp）を夫々示す。
【００９５】
〔結果〕
図２から明らかなように、本発明の方法により、Ｘ染色体由来のアメロゲニン遺伝子及びＹ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅断片が認められ、本発明の方法により得られた核酸は、支障無くＰＣＲ法のサンプルとして使用し得ることが判る。
即ち、本発明の方法により得られた核酸は、これをＰＣＲ法のサンプルとして用いた場合、１細胞中に数百コピー存在するミトコンドリアＤＮＡだけでなく、１細胞中に１コピーしか存在しないアメロゲニン遺伝子をも良好に増幅し得ることが判る。
以上のことから、本発明の方法により得られた核酸は、ゲノムＤＮＡのローカスを増幅するためのＰＣＲ法用サンプルとしても使用可能であることが示唆される。
【００９６】
実施例．１０ 爪からのＤＮＡの採取
下記爪試料を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を190μl、下記組成からなるＤＴＴ溶液を10μl及び10mg/mlプロテイナーゼＫ含有溶液（ＰＫ溶液）を10μl加えた後、55℃で加熱した。加熱開始から４時間毎に、更にＰＫ溶液10μlを２回追加添加し（計３回）、終夜（加熱開始から16時間）に渡り加熱を続けた。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した後、ヨウ化ナトリウム溶液〔7.62Ｍ ヨウ化ナトリウム、20mM ＥＤＴＡ及び90μg/mlグリコーゲン含有40mM Tris-HCl（pH8.0）〕を250μl及びイソプロパノールを480μl加え、攪拌した後15,000rpmで10分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に、40％イソプロパノール溶液を１ml加えて攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に70％エタノール溶液を１ml加えて更に攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除き、乾燥処理して目的の核酸を得た。最後に、得られた核酸を30μlのＴＥ緩衝液〔１mM ＥＤＴＡ含有10mM Tris-HCl（pH8.0）〕に再溶解してＤＮＡサンプルとした。
（試料）
・爪：１×２mm １片（約１mg）
・爪：１×１mm ５片（約2.5mg）
（溶解液）
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10.5mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10.5mM
・ＳＤＳ 0.053％
（ＤＴＴ溶液）
・ＤＴＴ 0.9Ｍ
・ＫＣｌ 1.5Ｍ
得られたＤＮＡサンプルは、実施例．７の方法に従ってそのＤＮＡ収量を確認した。
その結果を表９に示す。
また、従来法として、上記と同じ試料を１×１mm 10片（約５mg）又は１×１mm 20片（約10mg）用いてTahir等の方法〔J. Forensic Sci., 40, 634-636, (1995)〕に従って、これを行った。
その結果を、表９に併せて示す。
〔結果〕
【００９７】
【表９】
【００９８】
表９の結果から明らかなように、本発明方法は従来法に比べて試料の量が少ないにも拘わらず、得られるＤＮＡ収量が多いことが判る。即ち、本発明の方法により、従来法では困難であった爪から容易に且つ効率よく核酸を遊離し得ることが判る。
【００９９】
実施例．１１ 爪からのＤＮＡの採取
下記爪試料を用いた以外は、実施例．１０と同じ試薬を用い、同じ操作を行って、ＤＮＡサンプルを得た。
（試料）
男性３名（Ｅ、Ｆ、Ｇ）から得た以下の大きさの爪を試料とした。
・爪：１×２mm １片
得られたＤＮＡサンプルのうち２μlについて、ＰＣＲ法によりミトコンドリアＤＮＡ高変位領域Ｉの増幅反応を行い、ＰＣＲ法用サンプルとしての良否を検討した。尚、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄを用いて常法に従い、以下の条件により行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エチジウムブロマイド0.5μg/mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液〔１mm ＥＤＴＡ含有0.04Ｍ Tris-酢酸緩衝液（pH7.8）〕を用いて作製した1.5％アガロースゲルを使用して100Ｖ定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶを使用してＤＮＡを蛍光検出した。
その結果を図３に示す。
（ＰＣＲ条件）
・Forwardプライマー（合成）：5'-TACTTGACCACCTGTAGTAC-3'（配列番号：１）
・Reverseプライマー（合成）：5'-TAGTTTCACGGAGGATGGTG-3'（配列番号：２）
・95℃11分間；95℃30秒間，52℃30秒間，72℃45秒間、45回；72℃７分間
尚、図３中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：男性Ｅの爪を試料とした場合の結果
・レーン２：男性Ｆの爪を試料とした場合の結果
・レーン３：男性Ｇの爪を試料とした場合の結果
また、図３中、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
【０１００】
〔結果〕
図３から明らかなように、いずれの場合でもミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅断片が認められ、本発明の方法により得られた核酸は、支障無くＰＣＲ法のサンプルとして使用し得ることが判る。
また、得られたＰＣＲ増幅産物は、その後のシークエンス解析に於いて、質・量共に良好なサンプルとなり得ることが示唆される。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明は、核酸を高収率且つ簡便に遊離させる方法及びそれに用いられるキットを提供するものであり、本発明によれば、生体試料、特に硬組織（体毛、爪、骨等）由来の生体試料から、核酸を高収率且つ簡便に遊離させることが可能となる。
【０１０２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例．８で得られたＤＮＡサンプルをポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）で増幅した後に、アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【図２】実施例．９で得られたＤＮＡサンプルをポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）で増幅した後に、アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【図３】実施例．１１で得られたＤＮＡサンプルをポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）で増幅した後に、アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【符号の説明】
図１に於いて、図中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：分子量マーカー〔φＸ１７４ HaeIII消化産物、TAKARA社製〕
・レーン２：女性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン７：女性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１０：男性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１１：男性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１２：男性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１３：男性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１４：男性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１５：男性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１６：男性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１７：陽性コントロール〔常法により血液から採取したゲノムＤＮＡ〕
・レーン１８：陰性コントロール〔ＤＮＡサンプルの代わりに蒸留水を用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行ったもの〕
また、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
図２に於いて、図中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：女性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン２：女性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン７：男性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
また、「→」はＸ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（106bp）を、「⇒」はＹ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（112bp）を夫々示す。
図３に於いて、図中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：男性Ｅの爪を試料とした場合の結果
・レーン２：男性Ｆの爪を試料とした場合の結果
・レーン３：男性Ｇの爪を試料とした場合の結果
また、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
【０１０３】
【配列表】
【０００１】
本発明は、生体試料、特に硬組織（体毛、爪、骨等）由来の生体試料から核酸を遊離させる方法及びこれに用いられるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学、臨床診断、法医学等の分野に於いては、遺伝情報の解析，遺伝子疾患・ウイルス性疾患等の診断・原因究明，或いは個人識別・親子鑑定・犯罪鑑識等、種々の目的で、各種試料からの核酸鎖の遊離（抽出）及びその分析が広く行われている。
【０００３】
従来、核酸を遊離（抽出）する方法としては、例えば試料を物理的に、又は界面活性剤等で処理して破壊後、核酸を遊離（抽出）する方法（例えば、非特許文献１、非特許文献２等）、例えば界面活性剤，塩の存在下に、試料を蛋白質分解酵素で処理して核酸を遊離（抽出）する方法（例えば、特許文献１等）や還元剤，界面活性剤，キレート剤，タンパク質変性剤から選ばれる１種、塩及び共沈剤の存在下に、試料をタンパク質分解酵素で処理して破壊後、核酸を遊離（抽出）する方法（例えば、特許文献２等）等が知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの方法は、何れも核酸の収率が十分と言えるものではない。
特に、これらの方法は、血清、血漿等の血液成分を対象試料とするものであり、法医学分野等に於いて行われているような硬組織（例えば体毛や爪或いは骨等）を対象試料とした場合には、血液成分に比べて核酸の収率が著しく低下し、後の分析に耐えられる程の十分量の核酸を得ることができないという欠点や核酸を遊離（抽出）するために長い時間を必要とするという欠点等を有している。
【０００５】
【非特許文献１】
生化学実験講座２，「核酸の化学 Ｉ」，７４〜８０頁，２６２〜２７０頁，１９７５年，東京化学同人
【非特許文献２】
「遺伝子操作マニュアル」，２０〜２３頁，１９８５年，講談社
【特許文献１】
特開平６−２０５６７６号公報（請求項１、０００６〜０００７段落、０００９段落）
【特許文献２】
特開平７−２３６４９９９号公報（請求項１〜９、００１３段落）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記欠点を解消し、核酸を高収率且つ簡便に遊離させる方法及びそれに用いられるキットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成よりなる。
【０００８】
（１）硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることを特徴とする、当該試料から核酸を遊離させる方法（以下、本発明の遊離方法１と略記する。）。
【０００９】
（２）生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させることを特徴とする、当該試料から核酸を遊離させる方法（以下、本発明の遊離方法２と略記する。）。
【００１０】
（３）▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬、並びに▲３▼プロテイナーゼＫを含む試薬、若しくは▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物を含む試薬、▲３▼塩化カリウムを含む試薬、並びに▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬、とを組み合わせてなる生体試料から核酸を遊離させるためのキット。
【００１１】
即ち、本発明者等は、生体試料、特に硬組織（体毛、爪、骨等）由来の生体試料から、核酸を高収率且つ簡便に遊離させる方法について鋭意研究の結果、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることにより、今まで困難であった硬組織由来の生体試料から、高収率且つ簡便に核酸を遊離させることができること、また、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させることにより、生体試料からより高収率且つ簡便に核酸を遊離させることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明に於いて、塩化カリウムの使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されない。
具体的には、例えば試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中に、下限が通常20mM以上、好ましくは30mM以上、より好ましくは50mM以上の濃度添加される。上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中に、通常200mM以下、好ましくは150mM以下、より好ましくは100mM以下、特に好ましくは80以下の濃度添加される。
【００１３】
本発明に於いて用いられる陰イオン界面活性剤としては、カルボン酸類、スルホン酸類、硫酸エステル類、リン酸エステル類、コール酸類又はこれらの塩等が挙げられる。
カルボン酸類としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等が挙げられ、具体的には、例えばオレイン酸、ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。
スルホン酸類としては、アルキルベンゼンスルホン酸（例えばラウリルベンゼンスルホン酸等）、ナフタレンスルホン酸（例えばジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等）、スルホコハク酸（例えばジオクチルスルホコハク酸等）等が挙げられ、具体的には、例えばラウリルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。
硫酸エステル類としては、高級アルコール硫酸エステル（例えばラウリル硫酸エステル等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル（例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステル等）等が挙げられ、具体的には、例えばラウリル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム：ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
リン酸エステル類としては、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等が挙げられ、具体的には、例えばモノステアリルリン酸、モノラウリルリン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。
コール酸類としては、コール酸、コール酸誘導体（例えばデオキシコール酸等）等が挙げられ、具体的には、例えばコール酸、デオキシコール酸等が挙げられる。
また、これらの塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、具体的には、例えばコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
上記した陰イオン性界面活性剤のなかでも、カルボン酸類、硫酸エステル類、コール酸類及びこれらの塩が好ましく、特に硫酸エステル類の塩、なかでも高級アルコール硫酸エステルの塩が好ましい。具体的には、ラウロイルサルコシンナトリウム、ＳＤＳ及びコール酸ナトリウムが好ましく、特にＳＤＳが好ましい。本発明に於いて、上記した如き陰イオン性界面活性剤の使用量としては、用いられる陰イオン性界面活性剤の種類や試料の種類によって異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
このような使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常0.02％（w/v）以上、好ましくは0.03％（w/v）以上、より好ましくは0.04％（w/v）以上であり、上限は通常0.15％（w/v）以下、好ましくは0.1％（w/v）以下、より好ましくは0.1％（w/v）未満、更に好ましくは0.08％（w/v）以下、特に好ましくは0.06％（w/v）以下である。
【００１４】
本発明に於いて用いられるチオール化合物としては、例えばジチオトレイトール（以下、ＤＴＴと略記する。）、β−メルカプトエタノール（以下、βＭＥと略記する。）、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、還元型グルタチオン、ジチオエリトリトール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、２−メルカプトエタンスルホン酸、メルカプトコハク酸、１−チオ−β−Ｄ−グルコース二ナトリウム塩二水和物、４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メルカプトピリミジン一水和物、２−アミノ−６−メルカプトプリンリボサイド水和物、チオフェノール、２−チオウラシル等が挙げられる。
なかでも、ＤＴＴ、βＭＥが好ましい。
本発明に於いて、上記したチオール化合物の使用量としては、用いられるチオール化合物の種類によって異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
このような使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常9.5mM以上、好ましくは20mM以上、より好ましくは38mM以上、更に好ましくは45mM以上であり、上限は通常１Ｍ以下、好ましくは750mM以下、より好ましくは500mM以下、更に好ましくは300mM以下である。
具体的には、例えばＤＴＴを用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常9.5mM以上、好ましくは20mM以上、より好ましくは38mM以上であり、上限は通常100mM以下、好ましくは75mM以下、より好ましくは50mM以下である。
また、例えばβＭＥを用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常100mM以上、好ましくは150mM以上、より好ましくは200mM以上、更に好ましくは300mM以上であり、上限は通常１Ｍ以下、好ましくは750mM以下、より好ましくは500mM以下である。
【００１５】
先ず、本発明の遊離方法１について以下に述べる。
【００１６】
本発明の遊離方法１は、硬組織由来の生体試料を対象とするものであり、当該生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の遊離方法１に於いて、硬組織としては、例えば爪、体毛、骨、歯等が挙げられ、通常爪、体毛等に由来する生体試料が用いられる。
尚、本発明の遊離方法１は、上記した如き硬組織以外の軟組織（例えば臓器、皮膚、血液，唾液等の体液等）、血痕、唾液斑或いはウイルス、細菌、培養細胞、植物・動物由来の試料に於いても使用可能である。
また、上記した如き生体試料の使用量としては、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、また、用いられる試料の種類によっても異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、特に限定されない。
具体的には、例えば試料として体毛を用いる場合には、体毛とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液に完全に浸る程度の長さとした体毛を、通常10cm以下、好ましくは４cm以下、より好ましくは３cm以下、特に好ましくは２cm以下であり、下限は通常0.2cm以上、好ましくは0.5cm以上である。尚、通常は上記した如き量の体毛を１cm程度の大きさに切断して用いる。また、多量の体毛を試料とした場合、体毛に含まれるメラニン等がポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を阻害することがあるので、本発明の遊離方法１を実施した後に、得られた核酸をＰＣＲ反応に共する場合には注意が必要である。
例えば試料として爪を用いる場合には、通常2mg以下、好ましくは1.5mg以下、より好ましくは１mg以下の範囲から適宜使用され、下限は通常0.2mg以上、好ましくは0.5mg以上である。尚、爪を試料とする場合、爪の溶解度、換言すれば、爪から遊離される核酸の回収率はプロテイナーゼＫと反応させる際の爪の大きさに依存し、大きくなるに従って溶解度（回収率）が低下するので、上記範囲から選ばれる量の爪をより細かく切断（通常0.5mm×1mm程度以下に切断）してプロテイナーゼＫとの反応に共することが好ましい。
【００１８】
本発明の遊離方法１に於いて、プロテイナーゼＫの使用量としては、試料を十分に溶解し得る量、換言すれば、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析等に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、特に限定されないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常10μg／ml以上、好ましくは50μmg／ml以上、より好ましくは70μg／ml以上、特に好ましくは100μg／ml、更に好ましくは150μg／ml以上であり、上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常５mg／ml以下、好ましくは2.5mg／ml以下、より好ましくは1.5mg／ml以下、更に好ましくは1.0mg／ml以下である。
具体的には、例えば試料として体毛を用いる場合、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常10μg／ml以上、好ましくは50μmg／ml以上、より好ましくは70μg／ml以上、特に好ましくは100μg／ml、更に好ましくは150μg／ml以上である。上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常2.5mg／ml以下、好ましくは1.5mg／ml以下、より好ましくは1.0mg／ml以下である。
また、試料として爪を用いる場合、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常10μg／ml以上、好ましくは50μmg／ml以上、より好ましくは70μg／ml以上、特に好ましくは100μg／ml、更に好ましくは150μg／ml以上である。上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常2.5mg／ml以下、好ましくは1.5mg／ml以下、より好ましくは1.0mg／ml以下である。
尚、試料として爪等の比較的固いものを用いる場合は、核酸の回収率を上げることが可能となるので、後述するように、最終反応液中のプロテイナーゼＫの濃度が上記した如き範囲から選ばれる量となるようにプロテイナーゼＫを数回に分けて添加しながら試料と反応させることが好ましい。
【００１９】
尚、本発明の遊離方法１に於いて使用される塩化カリウムの使用量、好ましい態様、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の具体例、好ましい態様、使用量等は上記した通りであるが、特に陰イオン性界面活性剤としては、例えば試料として体毛を用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常0.02％（w/v）以上、好ましくは0.03％（w/v）以上、より好ましくは0.04％（w/v）以上の範囲から、上限は通常0.1％（w/v）未満、好ましくは0.08％（w/v）以下、より好ましくは0.06％（w/v）以下、更に好ましくは0.05％（w/v）以下の範囲から適宜選択して使用されるが好ましい。また、例えば試料として爪を用いる場合には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、下限は通常0.02％（w/v）以上、好ましくは0.03％（w/v）以上、より好ましくは0.04％（w/v）以上の範囲から、上限は通常0.15％（w/v）以下、好ましくは0.1％（w/v）以下、より好ましくは0.1％（w/v）未満、更に好ましくは0.08％（w/v）以下の範囲から適宜選択して使用されるのが好ましい。
【００２０】
本発明の遊離方法１は、上記した如き硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液（反応液）を調製し、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下、該生体試料にプロテイナーゼＫを作用（反応）させることにより実施することができる。
【００２１】
上記に於いて、硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液を調製する方法としては、最終的にこれら各成分を含有する溶液が得られる方法であれば良く、特に限定されない。
最も一般的な方法としては、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液（反応液）に、硬組織由来の生体試料を添加する方法、硬組織由来の生体試料に、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液（反応液）を添加する方法等が挙げられる。
また、硬組織由来の生体試料に、プロテイナーゼＫを含有する水溶液、塩化カリウムを含有する水溶液、陰イオン界面活性剤を含有する水溶液及びチオール化合物を含有する水溶液を夫々別々に添加しても良い。
更に、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物のうちの１種以上を含有する水溶液２種以上を、硬組織由来の生体試料に夫々別々に添加しても良く、このような方法としては、先ず硬組織由来の生体試料に陰イオン界面活性剤を含有する水溶液（溶解液）を添加するか、或いは陰イオン界面活性剤を含有する水溶液（溶解液）に硬組織由来の生体試料を添加するかして、硬組織由来の生体試料と陰イオン界面活性剤とを含有する溶液を調製し、次いで、当該溶液に更に塩化カリウム及びチオール化合物を含有する水溶液、並びにプロテイナーゼＫを含有する水溶液を順次添加混合する方法が好ましい。
上記方法に於いて、各水溶液中の各成分の使用濃度は、最終的な反応液（硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物を含有する溶液）中の濃度が上記した如き範囲から選ばれるように、各溶液の使用量を考慮に入れて適宜決定すればよい。
【００２２】
本発明の遊離方法１に於ける反応条件は、以下の通りである。
例えば、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応温度としては、下限は通常37℃以上、好ましくは40℃以上、より好ましくは55℃以上であり、上限は通常70℃以下、好ましくは65℃以下、より好ましくは60℃以下である。
試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応時間としては、反応温度や試料の種類・量等によって左右されるが、一般的には下限が通常10分以上、好ましくは20分以上、上限が通常36時間以下、好ましくは24時間以下の範囲から適宜選択され、例えば試料として体毛を使用する場合には、下限は通常10分以上、好ましくは20分以上であり、上限は通常140分以下、好ましくは90分以下、より好ましくは70分以下、更に好ましくは40分以下であり、例えば試料として爪を使用する場合には、下限が通常２時間以上、好ましくは４時間以上、より好ましくは６時間以上であり、上限が通常36時間以下、好ましくは24時間以下、より好ましくは18時間以下である。
また、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際のpHとしては、プロテイナーゼＫの活性に悪影響を及ぼさないpHであればよく、特に限定されないが、具体的には、下限は通常pH7.5以上、好ましくはpH8.0以上、より好ましくはpH8.2以上、特に好ましくはpH8.3以上であり、下限は通常pH12以下、好ましくはpH10以下、より好ましくはpH９以下である。
【００２３】
本発明の遊離方法１に於いては、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際のpHを上記した如き範囲に保つために緩衝剤を使用することができる。
このような緩衝剤としては、上記した如き反応温度に於いて上記した如きpH範囲で緩衝能を有するものであれば良く、特に限定されないが、例えばN-（2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸（ACES）、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸（BES）、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPS）、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPSO）、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸（CHES）、3-［N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ］-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、3-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（EPPS）、2-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］エタンスルホン酸（HEPES）、2-ヒドロキシ-3-［4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（HEPPSO）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）、ピペラジン-1,4-ビス（2-エタンスルホン酸）（PIPES）、ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）（POPSO）、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）、2-ヒドロキシ-N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPSO）、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-2-アミノエタンスルホン酸（TES）、N-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Tricine）、Bis-trisプロパン、コラミンクロリド、グリシン・アミド等のグッド緩衝剤、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（tris）、グリシルグリシン等の緩衝剤が挙げられる。
これらのなかでも好ましい緩衝剤としては、60℃に於けるpKaが下限としては通常6.50以上、好ましくは7.00以上、より好ましくは7.20以上、更に好ましくは7.30以上であり、上限としては通常13.00以下、好ましくは11.00以下、より好ましくは10.00以下、更に好ましくは9.50以下である緩衝剤が挙げられる。
具体的には、例えばBES〔pKa(60℃)：6.51〕、TES〔pKa(60℃)：6.70〕、HEPES〔pKa(60℃)：6.99〕、Tris〔pKa(60℃)：7.06〕、グリシン・アミド〔pKa(60℃)：7.04〕、HEPPS〔pKa(60℃)：7.72〕、Tricine〔pKa(60℃)：7.31〕、Bicine〔pKa(60℃)：7.63〕、CHES〔pKa(60℃)：9.14〕、CAPS〔pKa(60℃)：10.04〕、グリシルグリシン〔pKa(60℃)：7.28〕等の60℃に於けるpKaが6.50以上である緩衝剤が好ましく、例えばTris、グリシン・アミド、HEPPS、Tricine、Bicine、CHES、CAPS、グリシルグリシン等の60℃に於けるpKaが7.00以上である緩衝剤がより好ましく、例えばHEPPS、Tricine、Bicine、CHES、CAPS、グリシルグリシン等の60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤が特に好ましく、例えばHEPPS、Tricine、Bicine、CHES等の60℃に於けるpKaが7.30以上、9.50以下である緩衝剤が更に好ましい。これらのなかでも最も好ましくはTricineである。
また、上記した如き緩衝剤のうち、上記した如き性質を有し、且つΔpKa／℃が通常−0.030以下、好ましくは−0.025以下の緩衝剤を使用すれば、常温から酵素反応を行うための温度上昇に伴うpH変動を減少させることにより、高収率に核酸を遊離させることができる。
このような緩衝剤としては、例えばHEPPS〔ΔpKa／℃：−0.007〕、Tricine〔ΔpKa／℃：−0.021〕、Bicine〔ΔpKa／℃：−0.018〕、CHES〔ΔpKa／℃：−0.009〕、CAPS〔ΔpKa／℃：−0.009〕が挙げられ、なかでもTricineが最も好ましい。
上記した如き緩衝剤の使用量としては、用いられる緩衝剤の種類等により異なるため一概には言えないが、上記した如き反応温度に於いて上記した如きpH範囲を保持し得る量（上記した如きpH範囲に於いて緩衝能が得られるような量）であれば良く、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常１mM以上、好ましくは５mM以上、より好ましくは９mM以上、更に好ましくは9.5mM以上であり、上限は通常500mM以下、好ましくは250mM以下、より好ましくは100mM以下、更に好ましくは50mM以下である。
尚、本発明の遊離方法１に於いて上記した如き緩衝剤を使用するには、硬組織由来の生体試料にプロテイナーゼＫを作用させる際に、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物と同時に緩衝剤を共存させれば良く、前述した如き硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物とを含有する水溶液を調製する方法に準じて行えばよい。即ち、最終的に、硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤を含有する溶液が得られる方法であればよく、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤の全てを含有する水溶液（反応液）に硬組織由来の生体試料を添加するか、硬組織由来の生体試料を当該反応液に添加する方法、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤を別々に含有する水溶液を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法、或いはプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤のうち１種以上を含有する水溶液２種以上を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法等が挙げられる。尚、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、緩衝剤のうちの１種以上を含有する水溶液２種以上を、硬組織由来の生体試料に夫々別々に添加する方法としては、先ず硬組織由来の生体試料に陰イオン界面活性剤及び緩衝剤を含有する水溶液（溶解液）を添加するか、或いは陰イオン界面活性剤及び緩衝剤を含有する水溶液（溶解液）に硬組織由来の生体試料を添加するかして、硬組織由来の生体試料と陰イオン界面活性剤及び緩衝剤とを含有する溶液を調製し、次いで、当該溶液に更に塩化カリウム及びチオール化合物を含有する水溶液、並びにプロテイナーゼＫを含有する水溶液を順次添加混合する方法が好ましい。
上記方法に於いて、各溶液中の緩衝剤の使用濃度及びpHは、最終的な反応液（硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び緩衝剤を含有する溶液）中の濃度及びpHが上記した如き範囲から選ばれるように、各溶液の使用量を考慮に入れて適宜決定すればよい。
【００２４】
本発明の遊離方法１に於いては、上記した如きプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物以外に、更に、通常この分野で使用される試薬類、例えばキレート剤等を共存させても良い。
即ち、硬組織由来の生体試料を、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物、要すればキレート剤の存在下、プロテイナーゼＫと反応させてもよい。
【００２５】
キレート剤としては、通常この分野で用いられるものであれば良く、特に限定されないが、二価の金属イオンをキレートし得る能力を有するものが好ましい。より具体的には、例えばヒドロキシ基を有していてもよいアルキルイミノポリカルボン酸〔ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）等〕、ニトリロポリカルボン酸〔ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）等〕、ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基又はヒドロキシアラルキル基を有していてもよいモノ又はポリアルキレンポリアミンポリカルボン酸〔エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸二塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、1,6-ヘキサメチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（ＨＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸（ＤＴＰＡ）、N,N-ビス（2-ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン-N,N-二酢酸（ＨＢＥＤ）等〕、ポリアミノアルカンポリカルボン酸〔ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ、）、trans-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸（ＣｙＤＴＡ）等〕、ポリアミノアルカノールポリカルボン酸〔ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）等〕、ヒドロキシアルキルエーテルポリアミンポリカルボン酸〔グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）等〕等の分子中に１〜４個の窒素原子と２〜６個のカルボキシル基を有する含窒素ポリカルボン酸類、例えばアミノポリ（アルキルホスホン酸）〔アミノトリス（メチレンホスホン酸）等〕、ニトリロポリ（アルキルホスホン酸）〔ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）等〕、モノ又はポリアルキレンポリアミンポリ（アルキルホスホン酸）〔エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、エチレンジアミン-N,N'-ビス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＤＰＯ）、イソプロピレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-ペンタ（メチレンホスホン酸）、エチレンジアミンビス（メチレンホスホン酸）、ヘキセンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）等〕、アルキルアミノポリ（アルキルホスホン酸）〔エチルアミノビス（メチレンホスホン酸）、ドデシルアミノビス（メチレンホスホン酸）等〕等の分子中に１〜３個の窒素原子と２〜５個のホスホン酸基を有する含窒素ポリホスホン酸類、例えばメチルジホスホン酸、エチリデンジホスホン酸、1-ヒドロキシエチリデン-1,1'-ジホスホン酸（ＨＥＤＰＯ）、1-ヒドロキシプロピリデン-1,1'-ジホスホン酸、1-ヒドロキシブチリデン-1,1'-ジホスホン酸等のヒドロキシ基を有していてもよいアルカンポリホスホン酸類、例えばジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）等が挙げられ、なかでもＥＤＴＡが好ましい。
また、上記した如きキレート剤の使用量としては、用いられるキレート剤の種類により異なるため一概には言えないが、一般的には、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、例えば下限は通常１mM以上、好ましくは３mM以上、より好ましくは５mM以上、更に好ましくは７mM以上、特に好ましくは９mM以上であり、上限は特に限定されないが、経済性等を考慮すると、試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の反応液中の濃度として、通常200mM以下、好ましくは100mM以下、より好ましくは50mM以下、更に好ましくは25mM以下、特に好ましくは10mM以下である。
【００２６】
上記に於いて、キレート剤を共存させる方法としては、硬組織由来の生体試料にプロテイナーゼＫを作用させる際に、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物（要すれば緩衝剤）と同時にキレート剤を共存させれば良く、前述した如き硬組織由来の生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物（要すれば緩衝剤）とを含有する水溶液を調製する方法に準じて行えばよい。即ち、最終的に、硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する溶液が得られる方法であればよく、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤の全てを含有する水溶液（反応液）に硬組織由来の生体試料を添加するか、硬組織由来の生体試料を当該反応液に添加する方法、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を別々に含有する水溶液を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法、或いはプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤のうち１種以上を含有する水溶液２種以上を硬組織由来の生体試料に夫々添加する方法等が挙げられる。
尚、このような方法のうち、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤のうちの１種以上を含有する水溶液２種以上を、硬組織由来の生体試料に夫々別々に添加する方法としては、先ず硬組織由来の生体試料に陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する水溶液（溶解液）を添加するか、或いは陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する水溶液（溶解液）に硬組織由来の生体試料を添加するかして、硬組織由来の生体試料と陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）及びキレート剤とを含有する溶液を調製し、次いで、当該溶液に更に塩化カリウム及びチオール化合物を含有する水溶液、並びにプロテイナーゼＫを含有する水溶液を順次添加混合する方法が好ましい。
上記方法に於いて、各溶液中のキレート剤の使用濃度は、最終的な反応液（硬組織由来の生体試料、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物（要すれば緩衝剤）及びキレート剤を含有する溶液）中の濃度が上記した如き範囲から選ばれるように、各溶液の使用量を考慮に入れて適宜決定すればよい。
【００２７】
本発明の遊離方法１を実施するには、例えば以下の通り行えばよい。
即ち、適当な大きさに切断した硬組織由来の生体試料をテストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）含有水溶液、適当量のチオール化合物及び塩化カリウム含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ含有水溶液を、これら溶液の全体量として当該試料が浸漬し得る程度の量夫々加え、当該溶液（反応液）を、例えば下限37℃以上、上限70℃以下、下限pH7.5以上、下限12以下の条件下で下限10分以上、上限36時間以下反応させればよい。
尚、上記に於いては、陰イオン界面活性剤（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）含有水溶液、チオール化合物及び塩化カリウム含有水溶液、プロテイナーゼＫ含有水溶液を別々の溶液として、当該試料に夫々添加しているが、当該試料に添加する前に、これら溶液を予め混合して１つの溶液とし、これを当該試料に添加しても良い。
また、試料として爪等の比較的固いものを用いる場合には、プロテイナーゼＫを数回に分けて反応液に追加添加して試料と反応させれば、核酸の回収率を上げることが可能となる。このような方法を実施する際の追加回数、追加する際のプロテイナーゼＫの濃度、反応時間等については特に制限はないが、例えば初めに試料とプロテイナーゼＫとを反応させた後、１乃至５時間毎に１乃至５回プロテイナーゼＫを追加添加すればよく、その際の使用濃度としては、使用するプロテイナーゼＫの総量（初めに試料と反応させたプロテイナーゼＫの量＋追加添加したプロテイナーゼＫの量）が、前述した如き濃度範囲となるように、夫々の場合（初めに試料と反応させる際及び追加添加する際）で使用されるプロテイナーゼＫの量を適宜選択すればよい。
更に、上記したようにプロテイナーゼＫを追加添加する場合には、チオール化合物（要すれば塩化カリウム）も併せて追加添加するのが好ましい。チオール化合物（要すれば塩化カリウム）を添加するには、プロテイナーゼＫ含有水溶液中にこれらを共存させておき、プロテイナーゼＫと同時に追加添加しても、また、追加添加するプロテイナーゼＫ含有水溶液とは別の溶液としてプロテイナーゼＫとは別に追加添加しても良い。尚、当該チオール化合物（要すれば塩化カリウム）の追加添加は、プロテイナーゼＫを追加添加する毎に併せて行う必要はなく、追加添加する際のチオール化合物や塩化カリウムの量は、前述した濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００２８】
以下に、体毛又は爪を試料として用いる場合の本発明の遊離方法１を具体的に説明する。
【００２９】
〔体毛を試料とする場合〕
例えば１cm以下に切断した体毛を適当量（４cm以下）テストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.01％以上、0.2％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（0.2mg／ml以上、2.5mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として体毛が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で10分以上、140分以下反応させればよい。
尚、上記方法に於いて、不溶物が存在する場合等には、必要に応じて常法に従って遠心分離処理（例えば通常5000rpm以上、好ましくは10000rpm以上、通常20000rpm以下、好ましくは15000rpm以下で、通常30秒以上、好ましくは１分以上、通常５分以下、好ましくは２分以下）を行い、上清を採取することにより当該不溶物を除去することができる。
【００３０】
〔爪を試料とする場合〕
例えば0.5mm×1mm以下に切断した爪を適当量（2mg以下）テストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.02％以上、0.5％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（0.3mg／ml以上、５mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として試料の爪が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で２時間以上、36時間以下反応させればよい。
尚、上記方法に於いて、プロテイナーゼＫを一度に添加して試料と反応させているが、0.5mg以上の爪を試料とする場合、及び１mgの爪を試料とする場合には、夫々以下のようにプロテイナーゼＫを数回に分けて添加して試料と反応させることにより、より効率よく核酸を遊離することができる。
即ち、0.5mg以上の爪を試料とする場合は、例えば0.5mm×1mm以下に切断した爪をテストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.02％以上、0.5％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／３量：0.１mg／ml以上、1.67mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として試料の爪が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で４時間反応させた後、これに適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／３量：0.１mg／ml以上、1.67mg／ml以下）含有水溶液を追加添加して更に４時間反応させる。次いで、再度適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／３量：0.１mg／ml以上、1.67mg／ml以下）含有水溶液を追加添加して終夜（１２〜１８時間）反応させればよい。（尚、プロテイナーゼＫ含有溶液の添加は計３回となる。）
また、１mg以上の爪を試料とする場合は、例えば0.5mm×1mm以下に切断した爪をテストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.02％以上、0.5％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／４量：0.075mg／ml以上、1.25mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として試料の爪が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で３時間反応させる。次いで、これに適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／４量：0.075mg／ml以上、1.25mg／ml以下）含有水溶液を追加添加して更に３時間反応させる。この操作を再度行った後、再度適当量のプロテイナーゼＫ（総プロテイナーゼ量の約１／４量：0.075mg／ml以上、1.25mg／ml以下）含有水溶液及び適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液を追加添加して終夜（１２〜１８時間）反応させればよい。（尚、プロテイナーゼＫ含有溶液の添加は計４回となる。）
尚、上記方法に於いては、必要に応じて常法に従って遠心分離処理（例えば通常5000rpm以上、好ましくは10000rpm以上、通常20000rpm以下、好ましくは15000rpm以下で、通常30秒以上、好ましくは１分以上、通常５分以下、好ましくは２分以下）を行い、上清を採取してもよい。
【００３１】
上記した如き本発明の遊離方法１で遊離された核酸鎖は、そのまま各種核酸鎖分析等の試料として使用することも可能であり、また、これを更に、この分野で通常使用されている方法によって核酸鎖を採取・精製する際の試料とすることも可能である。
【００３２】
次ぎに、本発明の遊離方法２について以下に述べる。
【００３３】
本発明の遊離方法２は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させることを特徴とするものである。
即ち、本発明の遊離方法２は、60℃に於けるpKaが7.20以上の緩衝剤を用いることにより、常温から酵素反応を行うために温度を上昇させた場合、上記した如きプロテイナーゼＫの安定pH領域或いは最適pH付近での緩衝能を十分に保持し得る。換言すれば、このような緩衝剤を用いることにより、酵素反応を行う温度（反応温度）に於いて、試料とプロテイナーゼＫとの反応の際のpHを上記した如きプロテイナーゼＫの安定pH領域或いは最適pH付近に保つことができる。その結果、プロテイナーゼＫの活性を十分に引き出すことができ、常法に比べ高収率に核酸を遊離させることができるのである。
【００３４】
本発明の遊離方法２に於いて、用いられる生体試料としては特に限定されないが、例えば各種臓器、皮膚、血液，唾液等の体液等（軟組織）、血痕、唾液斑或いはウイルス、細菌、培養細胞、植物・動物由来の試料等が挙げられる。尚、本発明の遊離方法２は、硬組織（例えば爪、体毛、骨、歯等）に由来する生体試料に於いても使用可能である。
また、上記した如き生体試料の使用量としては、本発明の方法を実施した後に得られた核酸を各種分析に共するのに十分な量の核酸を試料から遊離（抽出）し得る量であればよく、また、用いられる試料の種類によっても異なるため一概には言えないが、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、特に限定されない。
【００３５】
本発明の遊離方法２に於いて用いられる60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤としては、60℃に於けるpKaが7.20以上のものであれば良く、特に限定されない。また、なかでも60℃に於けるpKaが7.30以上のものを使用するのが好ましい。また、上限としては通常13.00以下、好ましくは11.00以下、より好ましくは10.00以下、更に好ましくは9.50以下である。
このような緩衝剤の具体例としては、前述した如き本発明の遊離方法１と同様である。
本発明の遊離方法２に於いては、常温から酵素反応を行うための温度上昇に伴うpH変動を減少させることにより、高収率に核酸を遊離させることができるため、上記した如き性質を有し、且つΔpKa／℃が通常−0.030以下、好ましくは−0.025以下の緩衝剤を使用するのが好ましい。
このような緩衝剤としては、例えばHEPPS〔ΔpKa／℃：−0.007〕、Tricine〔ΔpKa／℃：−0.021〕、Bicine〔ΔpKa／℃：−0.018〕、CHES〔ΔpKa／℃：−0.009〕、CAPS〔ΔpKa／℃：−0.009〕が挙げられ、なかでもTricineが最も好ましい。
また、上記した如き緩衝剤の使用量も、前述した如き本発明の遊離方法１と同様である。
【００３６】
また、本発明の遊離方法２に於いて用いられる塩化カリウムの使用量、好ましい態様、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の具体例、使用量、好ましい態様等は上記で述べた通りであり、また、プロテイナーゼＫの使用量、好ましい態様等は、上記した如き本発明の遊離方法１と同様である。
【００３７】
本発明の遊離方法２は、上記した如き生体試料と、プロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤とを含有する水溶液（反応液）を調製し、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下、該生体試料にプロテイナーゼＫを作用（反応）させることにより実施することができる。
尚、上記に於いて、水溶液（反応液）を調製する方法は上記した如き本発明の遊離方法１に準じてこれを行えばよい。
【００３８】
また、本発明の遊離方法２に於ける反応条件、即ち、反応温度、反応時間、反応pH等は、本発明の遊離方法１と同様である。
【００３９】
本発明の遊離方法２に於いても、更に、通常この分野で使用される試薬類、例えばキレート剤等を共存させても良く、キレート剤の具体例、好ましい態様及び使用量等は上記した如き本発明の遊離方法１と同様であり、キレート剤を共存させる方法も上記した如き本発明の遊離方法１に準じて行えばよい。
【００４０】
本発明の遊離方法２を実施するには、通常この分野で行われている方法に準じて実施すればよい。
尚、生体試料として体毛又は爪を試料として用いる場合は、上記した如き本発明の遊離方法１と同様に実施すればよく、また、これら以外の生体試料〔例えば各種臓器、皮膚、血液，唾液等の体液等（軟組織）、ウイルス、細菌、培養細胞、植物・動物由来の試料等〕を試料とする場合は、自体公知の方法に準じて実施すればよい。
【００４１】
以下に、血痕、唾液斑を試料として用いる場合の本発明の遊離方法２を具体的に説明する。
【００４２】
例えば先ず、血痕又は唾液斑が付着している部分に生理食塩水を滴下し、血痕又は唾液斑中の血液又は唾液成分を当該生理食塩水中に溶解又は懸濁させる。当該生理食塩水を回収し、ガーゼ、紙（和紙）等の吸収性担体に塗布した後、当該吸収性担体の生理食塩水塗布部位を切り取る。次いで当該切り取り片を適当量（４cm以下）テストチューブに入れ、適当量の陰イオン界面活性剤（0.01％以上、0.2％以下）〔要すればキレート剤（１mM以上、200mM以下）又は／及び緩衝剤（１mM以上、500mM以下）〕含有水溶液、適当量のチオール化合物（9.5mM以上、１M以下）及び塩化カリウム（19mM以上、２M以下）含有水溶液、適当量のプロテイナーゼＫ（0.2mg／ml以上、2.5mg／ml以下）含有水溶液を夫々加え（これら溶液の全体量として切り取り片が浸漬し得る程度）、これ（反応液）を、適当な温度（37℃以上、70℃以下）、適当なpH（pH7.5以上、pH12以下）の条件下で10分以上、140分以下反応させればよい。
尚、上記方法に於いて、使用した吸収性担体を、例えばピンセット等で除去するか、或いは必要に応じて常法に従って遠心分離処理（例えば通常5000rpm以上、好ましくは10000rpm以上、通常20000rpm以下、好ましくは15000rpm以下で、通常30秒以上、好ましくは１分以上、通常５分以下、好ましくは２分以下）を行い、上清を採取することにより除去することができる。
【００４３】
上記した如き本発明の遊離方法２で遊離された核酸鎖は、そのまま各種核酸鎖分析等の試料として使用することも可能であり、また、これを更に、この分野で通常使用されている方法によって核酸鎖を採取・精製する際の試料とすることも可能である。
【００４４】
上記した如き本発明の遊離方法１又は２を実施した後、即ち、試料とプロテイナーゼＫとを反応させた後（要すれば、反応後、更に遠心分離処理等を行って上清を採取した後）に、更に核酸を沈澱させる処理を行って、当該沈澱を採取することにより、遊離した核酸を精製・採取することができる。
【００４５】
本発明に於いて、核酸を沈澱させる処理としては、この分野で核酸を沈澱させるために行われている方法であればよく、特に限定されない。
このような方法としては、例えばアルコール沈澱法、塩化セシウム密度勾配遠心法（超遠心法）等が挙げられ、アルコール沈澱法が好ましい。
用いられるアルコール類としては、核酸を特異的に沈澱し得る性質を有するものであれば良く、特に限定されないが、具体的には例えばイソプロパノール、エタノール等の低級アルコール類が挙げられ、特にイソプロパノールが好ましい。また、後述するようにカオトロピック剤としてヨウ化ナトリウムを用いる場合には、特にイソプロパノールを用いて核酸の沈澱を行うことがより好ましい。
これらアルコール類の使用濃度としては、核酸を溶液から沈澱し得るような濃度であればよく、特に限定されないが、例えばイソプロパノールを用いる場合には、イソプロパノールの最終濃度（核酸とイソプロパノールとを接触させる際の溶液中の濃度）が通常40％以上、好ましくは50％以上となるように、本発明の遊離方法１又は２によって得られた溶液中に添加され、また、エタノールを用いる場合には、エタノールの最終濃度（核酸とエタノールとを接触させる際の溶液中の濃度）が通常60％以上、好ましくは70％以上の範囲で用いられる。
【００４６】
上記した如き方法を実施するには、例えば以下の如く行えばよい。
【００４７】
即ち、前述した如き本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液〔即ち、硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、塩化カリウム（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）の存在下に反応させて得られた溶液、又は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させて得られた溶液、或いはこれら溶液に遠心分離処理等を行って得られた上清〕に、適当量のアルコール類を添加し（例えばイソプロパノールの場合、最終濃度として通常40％以上、好ましくは50％以上となるような量、エタノールの場合、最終濃度として通常60％以上、好ましくは70％以上となるような量）、混合する。混合後、必要応じてこれを静置してもよい。
尚、ここで核酸を沈澱させ易くするため、例えばＮａＣｌ、酢酸ナトリウム等の塩類をアルコール類と共に適宜加えても良く、また、通常この分野で用いられている共沈剤の存在下に核酸を沈澱させても良い。更に、同様の目的で、遊離した核酸を含有する溶液とアルコール類とを混合した後−80℃〜４℃の低温で冷却しても良い。
混合後（要すれば静置後）、遠心分離処理し、核酸を沈澱させた後、上清を除き、得られた沈澱に、例えば通常20％以上、好ましくは30〜50％、より好ましくは40％のイソプロパノール溶液、又は通常50％以上、好ましくは60〜80％、より好ましくは70％のエタノール溶液等を適当量添加して洗浄する。
尚、当該洗浄は上記したイソプロパノール溶液及びエタノール溶液の何れかのみを用いて行っても良いが、好ましくはこれらの溶液を組み合わせて洗浄を行う（どちらかの溶液を用いて洗浄を行った後、続けて別の溶液を用いて洗浄を行う）のが好ましい。
洗浄後、遠心分離処理によって上清を除いた後、得られた核酸沈澱を加温や減圧等の常法により乾燥処理すれば、目的の核酸を得ることができる。
尚、上記方法で得られた核酸を、各種核酸鎖分析（例えばPCR法による遺伝子分析等）等の試料として使用する場合には、これを更にこの分野で通常使用されている方法、例えばＴＥ緩衝液（10mM Tris−塩酸緩衝液、１mM EDTA含有、pH8.0）等の通常この分野で用いられている緩衝液等に再溶解したものを使用するのが望ましい。尚、目的の核酸がDNAである場合には、再溶解された核酸溶液にRNase等を添加・反応させて共存するRNAを消化する方法等で核酸を更に精製しても、また、目的の核酸がRNAである場合には、再溶解された核酸溶液にDNase等を添加・反応させて共存するDNAを消化する方法等で核酸を更に精製してもよい。
【００４８】
上記方法に於いて用いられる共沈剤としては、通常この分野で用いられているものであれば良く、得に限定されないが、例えばグリコーゲン、デキストラン等の高分子多糖類、例えばトランスファーＲＮＡ等が挙げられる。なかでもグリコーゲン、デキストラン等の高分子多糖類が好ましく、グリコーゲンが特に好ましい。
また、上記した如き共沈剤の存在下に核酸を沈澱させる方法としては、核酸を沈澱させる際に、最終的に共沈剤を存在させ得る方法であれば良く、本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液に、アルコール類を添加する前、又はアルコール類を添加するのと同時或いは添加後に、共沈剤を含有する水溶液を遊離した核酸を含有する溶液に添加すればよい。なかでも、本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液に、アルコール類を添加する前に、共沈剤を含有する水溶液を添加しておいたほうが好ましい。
共沈剤の使用量としては、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すれば良く、特に限定されない。
【００４９】
上記した如き本発明の遊離方法１又は２を実施した後、即ち、試料とプロテイナーゼＫとを反応させた後（要すれば、反応後、更に遠心分離処理等を行って上清を採取した後）に、更に核酸を抽出する処理を行い、その後、更に核酸を沈澱させる処理を行って、当該沈澱を採取することにより、共存する不純物を除去することができる。
【００５０】
本発明に於いて、核酸を抽出する処理としては、この分野で通常行われている方法であればよく、特に限定されない。
このような方法としては、例えばフェノール、クロロホルム、フェノール−クロロホルム、クロロホルムとその他の有機溶媒の混合物を用いる方法やカオトロピック剤を用いる方法等の共存するタンパク質を変性溶解処理する方法、例えばガラス等のシリカ表面への固相吸着等の方法及び陰イオン交換体等のフィルターを用いる方法等が挙げられるが、なかでもカオトロピック剤を用いる方法は、フェノール・クロロホルム等の（水飽和フェノールやクロロホルム）有機溶媒を用いる代わりにカオトロピック剤を使用することにより、その後の有機溶媒を除去する過程を省略することができ、また、特別な装置等も必要としないので好ましい。
カオトロピック剤としては、一般にカオトロピック剤として知られているような、水溶液に添加した際にカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生成し、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばヨウ化アルカリ、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸のアルカリ金属塩、トリクロロ酢酸のアルカリ金属塩、及びチオシアン酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。これらアルカリ金属塩或いはヨウ化アルカリに於けるアルカリ金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。なかでも、ヨウ化アルカリが好ましく、ヨウ化ナトリウムが特に好ましい。
これらカオトロピック剤の使用濃度は、用いるカオトロピック剤の種類により異なるが、一般的にカオトロピック剤の最終濃度（核酸とカオトロピック剤とを接触させる際の溶液中の濃度）が下限として通常95Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、より好ましくは２Ｍ以上、上限として通常７Ｍ以下、好ましくは５Ｍ以下、より好ましくは３Ｍ以下の範囲で用いられる。特にヨウ化ナトリウムを使用する場合には、下限として通常95Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、より好ましくは２Ｍ以上、上限として通常７Ｍ以下、好ましくは５Ｍ以下、より好ましくは３Ｍ以下の範囲となるように使用するのが好ましい。
【００５１】
本発明の方法に於いて、カオトロピック剤を用いる方法としては、上記した如き本発明の遊離方法１又は２により得られた核酸〔即ち、硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、塩化カリウム（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）の存在下に反応させて得られた溶液、又は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させて得られた溶液、或いはこれら溶液に遠心分離処理等を行って得られた上清〕とカオトロピック剤とを接触させ得る方法であれば良く、通常は本発明の遊離方法１又は２で得られた核酸を含有する溶液に、上記した如き濃度範囲のカオトロピック剤を含有する水溶液を添加すればよい。
尚、当該カオトロピック剤を含有する水溶液中には、前述した如きグッドの緩衝剤、Tris緩衝剤、グリシン、リン酸塩、クエン酸塩等、通常この分野で用いられる緩衝剤を共存させても良い。また、その使用濃度も通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すれば良く、通常１〜500mM、好ましくは10〜200mM、より好ましくは10〜100mMの範囲で用いられる。
また、カオトロピック剤を含有する水溶液のpHとしては、核酸の遊離を妨げない範囲であれば特に限定されないが、通常２〜12、好ましくは７〜９の範囲から適宜選択される。
更に、核酸とカオトロピック剤とを接触させる際には、例えばEDTAに代表される上記した如きキレート剤等の核酸分解酵素（例えばDNase、RNase等）の阻害剤の共存下でこれを行うことが好ましい。尚、本発明に於いては、カオトロピック剤を含有する水溶液中にキレート剤を含有させておくことが好ましいが、本発明の遊離方法１又は２でキレート剤を用いた場合であって、核酸とカオトロピック剤とを接触させる際に十分な核酸分解酵素阻害作用を得られる量のキレート剤が存在している場合には、核酸とカオトロピック剤とを接触させる際に、特にキレート剤を添加しなくてもよい。また、キレート剤の使用量としては、核酸分解酵素を阻害し得る量であれば良く特に限定されないが、通常核酸とカオトロピック剤とを接触させる際の溶液中の濃度として、通常１〜200mMの範囲から適宜選択される。
【００５２】
上記した如き方法を実施するには、例えば以下の如く行えばよい。
【００５３】
即ち、前述した如き本発明の遊離方法１又は２で得られた遊離した核酸を含有する溶液〔即ち、硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、陰イオン界面活性剤、チオール化合物、塩化カリウム（要すればキレート剤又は／及び緩衝剤）の存在下に反応させて得られた溶液、又は、生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤、チオール化合物及び60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤の存在下で反応させて得られた溶液、或いはこれら溶液に遠心分離処理等を行って得られた上清〕に、適当量のカオトロピック剤（要すれば緩衝剤又は／及びキレート剤）を含有する水溶液を添加して（下限として通常0.5Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、より好ましくは２Ｍ以上、上限として通常７Ｍ以下、好ましくは５Ｍ以下、より好ましくは３Ｍ以下）当該溶液とカオトロピック剤とを接触させる。その後、更に適当量のアルコール類を添加し（例えばイソプロパノールの場合、最終濃度として通常40％以上、好ましくは50％以上となるような量、エタノールの場合、最終濃度として通常60％以上、好ましくは70％以上となるような量）、混合する。混合後、必要応じてこれを静置してもよい。尚、ここで核酸を沈澱させ易くするため、例えばＮａＣｌ、酢酸ナトリウム等の塩類をアルコール類と共に適宜加えても良く、また、通常この分野で用いられている共沈剤の存在下に核酸を沈澱させても良い。更に、同様の目的で、遊離した核酸を含有する溶液とアルコール類とを混合した後−80℃〜４℃の低温で冷却しても良い。
混合後（要すれば静置後）、遠心分離処理し、核酸を沈澱させた後、上清を除き、得られた沈澱に、例えば通常20％以上、好ましくは30〜50％、より好ましくは40％のイソプロパノール溶液、又は通常50％以上、好ましくは60〜80％、より好ましくは70％のエタノール溶液等を適当量添加して洗浄する。
尚、当該洗浄は上記したイソプロパノール溶液及びエタノール溶液の何れかのみを用いて行っても良いが、好ましくはこれらの溶液を組み合わせて洗浄を行う（どちらかの溶液を用いて洗浄を行った後、続けて別の溶液を用いて洗浄を行う）のが好ましい。
遠心分離処理によって上清を除いた後、得られた核酸沈澱を加温や減圧等の常法により乾燥処理すれば、目的の核酸を得ることができる。
尚、上記方法で得られた核酸を、各種核酸鎖分析（例えばPCR法による遺伝子分析等）等の試料として使用する場合には、これを更にこの分野で通常使用されている方法、例えばＴＥ緩衝液（10mM Tris−塩酸緩衝液、１mM EDTA含有、pH8.0）等の通常この分野で用いられている緩衝液等に再溶解したものを使用するのが望ましい。尚、目的の核酸がDNAである場合には、再溶解された核酸溶液にRNase等を添加・反応させて共存するRNAを消化する方法等で核酸を更に精製しても、また、目的の核酸がRNAである場合には、再溶解された核酸溶液にDNase等を添加・反応させて共存するDNAを消化する方法等で核酸を更に精製してもよい。
【００５４】
上記方法に於いて用いられる共沈剤の具体例、好ましい態様、使用濃度等は前述した通りであり、また、使用方法は、アルコール類を添加する前、又はアルコール類を添加するのと同時或いは添加後に、共沈剤を含有する水溶液を添加して、核酸と接触させれば良い。換言すれば、カオトロピック剤を含有する水溶液を添加して核酸をカオトロピック剤と接触させる前、又は接触させると同時或いは接触させた後に、共沈剤を含有する水溶液を添加して核酸を共沈剤と接触させれば良い。なかでも、上記方法に於いては、カオトロピック剤を核酸と接触させると同時或いは接触させた後に、共沈剤を核酸に接触させのが好ましく、特に、カオトロピック剤を含有する水溶液中に当該共沈剤を含有させておけば、操作をより簡便にし得る等の理由から、カオトロピック剤と共沈剤とを同時に核酸に接触させるのがより好ましい。
また、上記方法に於いては、核酸を含有する溶液にカオトロピック剤（要すれば緩衝剤、キレート剤、共沈剤）を含有する水溶液を添加した後、続けてアルコール類を添加するものであり、カオトロピック剤の反応に特別な反応時間や反応温度（通常は常温で行う）等を必要とするものではない。
【００５５】
本発明の核酸を遊離させるためのキットは、上記した如き本発明の方法を効果的に実施するために使用されるもので、（ｉ）▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬、並びに▲３▼プロテイナーゼＫを含む試薬、若しくは（ｉｉ）▲１▼陰イオン界面活性剤を含む試薬、▲２▼チオール化合物を含む試薬、▲３▼塩化カリウムを含む試薬、並びに▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬、とを組み合わせてなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例等については先に述べた通りである。
尚、上記した如き本発明のキットに於いて、各成分を含む試薬は、前述した如き濃度範囲から選ばれる量を含有する水溶液等の溶液状態のものでも、また、当該濃度範囲から選ばれる量を含有する凍結乾燥状態又は乾燥状態のものでも良く、試薬形態については特に限定されない。尚、試薬形態が凍結乾燥状態又は乾燥状態である場合には、必要に応じてそれを溶解するための溶液と組み合わせても良い。
特に、本発明のキットの各試薬のうち、チオール化合物を含む試薬及びプロテイナーゼＫを含む試薬は凍結乾燥状態とする方が、チオール化合物及びプロテイナーゼＫを安定に保つことができるので好ましい。
【００５６】
本発明のキットは、本発明の方法に適用されるものであり、各試薬を混合させた際のpHが、前述した如きpH範囲、即ち、具体的には、下限が通常pH7.5以上、好ましくはpH8.0以上、より好ましくはpH8.2以上、特に好ましくはpH8.3以上、下限が通常pH12以下、好ましくはpH10以下、より好ましくはpH９以下の範囲となるように適宜調整されたものである。
【００５７】
本発明のキットに於いては、各試薬を混合させた際のpHを上記した如き範囲とするために、緩衝剤を用いることができる。
このような緩衝剤の具体例、好ましい態様等は前述した通りであるが、HEPPS、Tricine、Bicine、CHES、CAPS、グリシルグリシン等の60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤が特に好ましく、HEPPS、Tricine、Bicine、CHES等の60℃に於けるpKaが7.30以上、9.50以下である緩衝剤が更に好ましく、なかでもTricineが最も好ましい。
尚、緩衝剤は、各試薬を混合させた際のpHを上記した如き範囲とすることができるのであれば、各試薬の夫々全てに含有させても、また、何れかの試薬にのみ含有させておいても、或いは上記した如き本発明の各試薬とは別の試薬としても良く、特に制限はない。
特に、本発明のキットに於いては、陰イオン界面活性剤を含有する試薬中に含有させておくのが好ましい。
【００５８】
本発明のキットに於いては、上記した如きプロテイナーゼＫ、塩化カリウム、陰イオン界面活性剤及びチオール化合物以外に、更に、通常この分野で使用される試薬類、例えばキレート剤等を組み合わせても良い。
このようなキレート剤の具体例、好ましい態様等は前述した通りであるが、EDTAが好ましい。
尚、キレート剤は、各試薬の夫々全てに含有させても、また、何れかの試薬にのみ含有させておいても、或いは上記した如き本発明の各試薬とは別の試薬としても良く、特に制限はない。
特に、本発明のキットに於いては、陰イオン界面活性剤（要すれば緩衝剤）を含有する試薬中に含有させておくのが好ましい。
【００５９】
以下に、本発明のキットの一例を具体的に示す。
▲１▼陰イオン界面活性剤、緩衝剤及びキレート剤を含む試薬
▲２▼チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬
▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬
【００６０】
以下に、本発明のキットの他の一例を具体的に示す。
▲１▼陰イオン界面活性剤、緩衝剤及びキレート剤を含む試薬（水溶液）
▲２▼チオール化合物を含む試薬（凍結乾燥状態）
▲３▼塩化カリウムを含む試薬（水溶液）
▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬（凍結乾燥状態）
【００６１】
本発明のキットには、更に、上記した如き核酸を抽出する処理する方法に於いて用いられる試薬、例えばフェノール、クロロホルム、フェノール−クロロホルム、クロロホルムとその他の有機溶媒の混合物やカオトロピック剤等のタンパク質変性溶解剤を含む試薬を組み合わせても良い。なかでも、カオトロピック剤を含む試薬を組み合わせることが好ましい。
また、当該カオトロピック剤を含む試薬中には、前述した如き緩衝剤、キレート剤等の核酸分解酵素の阻害剤等を共存させても良い。
このようなカオトロピック剤を含む試薬のpHは、前述した通り、通常２〜12、好ましくは７〜９である。
更に、当該カオトロピック剤を含む試薬中には、更に共沈剤を含有させることもできる。
尚、カオトロピック剤、緩衝剤、キレート剤、共沈剤等の好ましい態様、具体例等については先に述べた通りであるが、カオトロピック剤としてはヨウ化ナトリウムが好ましく、緩衝剤としてはTris緩衝剤が好ましい。また、キレート剤としてはEDTAが好ましく、共沈剤としてはグリコーゲンが好ましい。
また、当該カオトロピック剤を含む試薬の形態は、特に限定されず、水溶液等の溶液状態のものでも、また、凍結乾燥状態又は乾燥状態のものでも良く、試薬形態が凍結乾燥状態又は乾燥状態である場合には、必要に応じてそれを溶解するための溶液と組み合わせても良い。
【００６２】
本発明のキットには、更に、上記した如き核酸を沈澱させる処理に於いて用いられる試薬を組み合わせても良い。このような試薬としては、例えばイソプロパノール、エタノール等の低級アルコール類が挙げられ、特にイソプロパノールが好ましい。
尚、使用濃度等については先に述べた通りである。
【００６３】
また更に、本発明のキットには、核酸を沈澱させる処理により得られた核酸沈澱を洗浄するために用いられる、アルコール類を含む水溶液１種以上を組み合わせても良い。このようなアルコール類としては、イソプロパノール、エタノール等が好ましい。なかでも、イソプロパノールを含む水溶液及びエタノールを含む水溶液の２種の水溶液を組み合わせるのが好ましい。
尚、使用濃度等については先に述べた通りである。
【００６４】
本発明のキットは、例えば下記の如き構成からなるものが好ましい。
▲１▼陰イオン界面活性剤、緩衝剤及びキレート剤を含む試薬（水溶液）
▲２▼チオール化合物を含む試薬（凍結乾燥状態）
▲３▼塩化カリウムを含む試薬（水溶液）
▲４▼プロテイナーゼＫを含む試薬（凍結乾燥状態）
▲５▼カオトロピック剤及び共沈剤を含む試薬（水溶液）
▲６▼40％イソプロパノール溶液からなる試薬
▲７▼70％エタノール溶液からなる試薬
尚、▲５▼の試薬中には、更に緩衝剤及びキレート剤を含有させておくのが好ましい。また、上記▲１▼〜▲７▼の試薬の他に、核酸を沈澱させるためのアルコール類からなる試薬を組み合わせても良い。
【００６５】
本発明の方法及び試薬を用いて得られた遊離された核酸は、遺伝子工学、臨床診断、法医学等の分野に於ける、遺伝情報の解析，遺伝子疾患・ウイルス性疾患等の診断・原因究明，或いは個人識別・親子鑑定・犯罪鑑識等の各種分析（例えばサザンブロッティング法やPCR法を利用する方法等）に用いられる試料として用いることができる。
なかでも、DNAタイピング法やDNAフィンガープリント法（例えばPCR-RFLP法、PCR-SSOP法、PCR-LIPA法、PCR-SSCP法、PCR-SSP法、PCR-CFLP法、PCR-RAPD法、PCR-RDA法、RNaseプロテクション法、DGGE法、TGGE法）に於いて有用に用いられる。
【００６６】
以下に、実験例、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００６７】
【実施例】
実施例．１ 塩の違いによる試料の溶解性の変化
１cmに切断した毛髪１本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で75分間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 0.05％
・ＤＴＴ 45mM
・所定の塩 所定濃度
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表１に示す。
尚、表中の溶解性判定に於ける記号は夫々以下のことを示す。
−：反応前後で変化なし。
±：反応前後で変化有り。（試料が軟化する。）
＋：若干溶解が認められる。（試料が小さくなる。）
＋＋：溶解が認められる。（試料がかなり小さくなる。）
＋＋＋：強い溶解が認められる。〔試料が小片（バラバラ）になる。〕
＋＋＋＋：著しい溶解が認められる。（試料が粒状になる。）
○：完全に溶解する。
【００６８】
【表１】
表１の結果から明らかなように、ＫＣｌは、ＮａＣｌに比べ、毛髪に対してかなり強い溶解力を有していることが判る。
【００７０】
実施例．２ 塩化カリウム濃度と試料の溶解性との関係
１cmに切断した毛髪３本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で55分間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 0.05％
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 所定濃度
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表２に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００７１】
【表２】
表２から明らかなように、ＫＣｌは、20mM以上の濃度から強い溶解力を示すようになり、50mM以上の濃度ではその溶解力に殆ど差が認められないこと、即ち、これ以上の濃度では溶解力の濃度依存性が殆どないことが判る。
【００７３】
実施例．３ 界面活性剤の違いによる試料の溶解性の変化
１cmに切断した毛髪２本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・所定の界面活性剤 所定濃度
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 75mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表３に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００７４】
【表３】
表３から明らかなように、ラウリルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤は強い溶解力を示すのに対して、陽イオン界面活性剤である臭化セチルトリメチルアンモニウムは試料を殆ど溶解し得ないことが判る。即ち、本発明に用いられる界面活性剤としては陰イオン界面活性剤が極めて有用であることが示唆される。
【００７６】
実施例．４ 界面活性剤濃度と試料の溶解性及びＤＮＡ収量との関係
１cmに切断した毛髪１本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 所定濃度
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 75mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表４に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００７７】
【表４】
表４から明らかなように、ＳＤＳは何れの濃度に於いても溶解性を示すものの、至適濃度が存在することが判る。特に、0.1％以上の濃度を用いると、その溶解力が著しく低下してくることが判る。即ち、本発明に於いては、界面活性剤を0.02％〜0.1％未満の濃度範囲、好ましくは0.02％〜0.06％の濃度範囲で用いればより効果的に試料を溶解し得ること、特に0.03％〜0.05％の濃度範囲で界面活性剤を用いた場合試料の溶解性が著しく強いことが判る。
【００７９】
実施例．５ 界面活性剤濃度と試料の溶解性との関係
0.5cm×１cmに切断した爪 １個を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を240μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 所定濃度
・ＤＴＴ 45mM
・ＫＣｌ 100mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の爪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
結果を表５に示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００８０】
【表５】
表５から明らかなように、試料として爪を用いた場合でも、ＳＤＳは何れの濃度に於いても溶解性を示すものの、至適濃度が存在することが判る。即ち、本発明に於いて爪を試料として用いた場合には、界面活性剤を0.02％〜0.15％の濃度範囲、好ましくは0.03％〜0.1％未満の濃度範囲で用いればより効果的に試料を溶解し得ること、特に0.05％〜0.08％の濃度範囲で界面活性剤を用いた場合試料の溶解性が著しく強いことが判る。
【００８２】
実施例．６ チオール化合物の種類及び濃度と試料の溶解性との関係
１cmに切断した毛髪１本を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を220μl加えた後、60℃で所定時間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した。
〔溶解液〕
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10mM
・ＳＤＳ 0.05％
・所定のチオール化合物 所定濃度
・ＫＣｌ 75mM
・プロテイナーゼＫ 770μg／ml
〔結果〕
反応後の毛髪の状態を観察し、その結果に基づいて溶解性を判定した。
チオール化合物としてＤＴＴを用いた場合の結果を表６に、また、チオール化合物としてβＭＥを用いた場合の結果を表７に夫々示す。
尚、表中の溶解性の欄に於ける記号の意味は、実施例．１と同様である。
【００８３】
【表６】
【表７】
表６から明らかなように、ＤＴＴは9.5mM〜100mMの濃度範囲に於いて強い溶解力を有することが判る。特に38mM〜50mMの濃度範囲に於いては著しい溶解力を有していることが判る。
また、表７から明らかなように、βＭＥは100mM〜1000mMの濃度範囲に於いて強い溶解力を有することが判る。特に200mM〜750mMの濃度範囲に於いては著しい溶解力を有していることが判る。
以上のことから、チオール化合物の種類によって至適濃度は多少異なるものの、本発明に於いてチオール化合物が有用であることが示唆される。
【００８６】
実施例．７ 毛髪からのＤＮＡの採取
下記毛髪試料を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を190μl、下記組成からなるＤＴＴ溶液を10μl及び10mg/mlプロテイナーゼＫ含有溶液（ＰＫ溶液）を10μl加えた後、55℃で40分間加熱した。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した後、15,000rpmで１分間遠心分離処理し、上清200μlを別のマイクロ遠沈管に移した。その上清にヨウ化ナトリウム溶液〔7.62Ｍ ヨウ化ナトリウム、20mM ＥＤＴＡ及び90μg/mlグリコーゲン含有40mM Tris-HCl（pH8.0）〕を250μl及びイソプロパノールを450μl加え、攪拌した後15,000rpmで10分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に、40％イソプロパノール溶液を１ml加えて攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に70％エタノール溶液を１ml加えて更に攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除き、乾燥処理して目的の核酸を得た。最後に、得られた核酸を25μlのＴＥ緩衝液〔１mM ＥＤＴＡ含有10mM Tris-HCl（pH8.0）〕に再溶解してＤＮＡサンプルとした。
（試料）
・抜去毛（毛根部）：５mm×１本
・脱落毛（毛根部）：５mm×１本
（溶解液）
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10.5mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10.5mM
・ＳＤＳ 0.053％
（ＤＴＴ溶液）
・ＤＴＴ 0.9Ｍ
・ＫＣｌ 1.5Ｍ
【００８７】
得られたＤＮＡサンプルは、自体公知の吸光度法（A260法）及び電気泳動法（「増補版 ラボマニュアル遺伝子工学」，３４〜３５頁，平成２年６月３０日発行，丸善株式会社に記載の「光学的方法」及び「電気泳動で調べる方法」）に従ってＤＮＡ収量を確認した。
その結果を表８に示す。
また、従来法として、上記試料を用いて平野等の方法（「毛髪，および爪からの迅速なＤＮＡ抽出法」，ＤＮＡ多型Ｖｏｌ.６ ＤＮＡ多型のさらなる展開，７６〜８０頁，１９９８年７月３１日発行，株式会社東洋書店）に従って、これを行った。
その結果を、表８に併せて示す。
〔結果〕
【００８８】
【表８】
表８の結果から明らかなように、本発明方法は従来法に比べてＤＮＡ収量が多いことが判る。即ち、本発明の方法により、容易に且つ効率よく毛髪から核酸を遊離し得ることが判る。
【００９０】
実施例．８ 毛髪からのＤＮＡの採取
下記毛髪試料を用いた以外は、実施例．７と同じ試薬を用い、同じ操作を行って、ＤＮＡサンプルを得た。
（試料）
女性２名（Ａ、Ｂ）及び男性３名（Ａ、Ｂ、Ｃ）から得た以下の長さの毛髪（毛幹部）を試料とした。
・５mm（５mm×１本）
・1.0cm（５mm×２本）
・1.5cm（５mm×３本）
得られたＤＮＡサンプルのうち２μlについて、ＰＣＲ法によりミトコンドリアＤＮＡ高変位領域Ｉの増幅反応を行い、ＰＣＲ法用サンプルとしての良否を検討した。尚、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄを用いて常法に従い、以下の条件により行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エチジウムブロマイド0.5μg/mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液〔１mm ＥＤＴＡ含有0.04Ｍ Tris-酢酸緩衝液（pH7.8）〕を用いて作製した1.5％アガロースゲルを使用して100Ｖ定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶを使用してＤＮＡを蛍光検出した。
その結果を図１に示す。
（ＰＣＲ条件）
・Forwardプライマー（合成）：5'-TACTTGACCACCTGTAGTAC-3'（配列番号：１）
・Reverseプライマー（合成）：5'-TAGTTTCACGGAGGATGGTG-3'（配列番号：２）
・95℃11分間；95℃30秒間，52℃30秒間，72℃45秒間、45回；72℃７分間
【００９１】
尚、図１中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：分子量マーカー〔φＸ１７４ HaeIII消化産物、TAKARA社製〕
・レーン２：女性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン７：女性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１０：男性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１１：男性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１２：男性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１３：男性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１４：男性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１５：男性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１６：男性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１７：陽性コントロール〔常法により血液から採取したゲノムＤＮＡ〕
・レーン１８：陰性コントロール〔ＤＮＡサンプルの代わりに蒸留水を用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行ったもの〕
また、図１中、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
【００９２】
〔結果〕
図１から明らかなように、性別を問わずいずれの場合でもミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅断片が認められ、本発明の方法により得られた核酸は、支障無くＰＣＲ法のサンプルとして使用し得ることが判る。
即ち、本発明の方法により得られた核酸は、メラニン等のＰＣＲ反応阻害物質の混入が殆どなく、ＰＣＲ法のサンプルとして良好に用いることができることが判る。
また、得られたＰＣＲ増幅産物は、その後のシークエンス解析に於いて、質・量共に良好なサンプルとなり得ることが示唆される。
【００９３】
実施例．９ 毛髪からのＤＮＡの採取
下記毛髪試料を用いた以外は、実施例．８と同じ試薬を用い、同じ操作を行って、ＤＮＡサンプルを得た。
（試料）
女性２名（Ｃ、Ｄ）及び男性１名（Ｄ）から得た以下の長さの毛髪（毛幹部）を試料とした。
・５mm（５mm×１本）
・1.0cm（これは５mm×２本）
・1.5cm（これは５mm×３本）
得られたＤＮＡサンプルのうち２μlについて、ＰＣＲ法によりアメロゲニン遺伝子の増幅反応を行い、ＰＣＲ法用サンプルとしての良否を検討した。尚、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄを用いて常法に従い、以下の条件により行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エチジウムブロマイド0.5μg/mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液〔１mm ＥＤＴＡ含有0.04Ｍ Tris-酢酸緩衝液（pH7.8）〕を用いて作製した4.0％アガロースゲルを使用して100Ｖ定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶを使用してＤＮＡを蛍光検出した。
その結果を図２に示す。
（ＰＣＲ条件）
・Forwardプライマー（合成）：5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3'（配列番号：３）
・Reverseプライマー（合成）：5'-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3'（配列番号：４）
・95℃11分間；95℃30秒間，67℃30秒間，72℃30秒間、45回；72℃７分間
【００９４】
尚、図２中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：女性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン２：女性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン７：男性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
また、図２中、「→」はＸ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（106bp）を、「⇒」はＹ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（112bp）を夫々示す。
【００９５】
〔結果〕
図２から明らかなように、本発明の方法により、Ｘ染色体由来のアメロゲニン遺伝子及びＹ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅断片が認められ、本発明の方法により得られた核酸は、支障無くＰＣＲ法のサンプルとして使用し得ることが判る。
即ち、本発明の方法により得られた核酸は、これをＰＣＲ法のサンプルとして用いた場合、１細胞中に数百コピー存在するミトコンドリアＤＮＡだけでなく、１細胞中に１コピーしか存在しないアメロゲニン遺伝子をも良好に増幅し得ることが判る。
以上のことから、本発明の方法により得られた核酸は、ゲノムＤＮＡのローカスを増幅するためのＰＣＲ法用サンプルとしても使用可能であることが示唆される。
【００９６】
実施例．１０ 爪からのＤＮＡの採取
下記爪試料を、マイクロ遠沈管（1.5ml容）に入れ、下記組成からなる溶解液を190μl、下記組成からなるＤＴＴ溶液を10μl及び10mg/mlプロテイナーゼＫ含有溶液（ＰＫ溶液）を10μl加えた後、55℃で加熱した。加熱開始から４時間毎に、更にＰＫ溶液10μlを２回追加添加し（計３回）、終夜（加熱開始から16時間）に渡り加熱を続けた。その後、マイクロチューブミキサー（ＭＴ−３６０、トミー精工製）にて攪拌した後、ヨウ化ナトリウム溶液〔7.62Ｍ ヨウ化ナトリウム、20mM ＥＤＴＡ及び90μg/mlグリコーゲン含有40mM Tris-HCl（pH8.0）〕を250μl及びイソプロパノールを480μl加え、攪拌した後15,000rpmで10分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に、40％イソプロパノール溶液を１ml加えて攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除いた。得られた沈澱に70％エタノール溶液を１ml加えて更に攪拌（洗浄）した後、15,000rpmで５分間遠心分離処理し、上清を取り除き、乾燥処理して目的の核酸を得た。最後に、得られた核酸を30μlのＴＥ緩衝液〔１mM ＥＤＴＡ含有10mM Tris-HCl（pH8.0）〕に再溶解してＤＮＡサンプルとした。
（試料）
・爪：１×２mm １片（約１mg）
・爪：１×１mm ５片（約2.5mg）
（溶解液）
・Ｔｒｉｃｉｎｅ 10.5mM（pH8.5）
・ＥＤＴＡ 10.5mM
・ＳＤＳ 0.053％
（ＤＴＴ溶液）
・ＤＴＴ 0.9Ｍ
・ＫＣｌ 1.5Ｍ
得られたＤＮＡサンプルは、実施例．７の方法に従ってそのＤＮＡ収量を確認した。
その結果を表９に示す。
また、従来法として、上記と同じ試料を１×１mm 10片（約５mg）又は１×１mm 20片（約10mg）用いてTahir等の方法〔J. Forensic Sci., 40, 634-636, (1995)〕に従って、これを行った。
その結果を、表９に併せて示す。
〔結果〕
【００９７】
【表９】
表９の結果から明らかなように、本発明方法は従来法に比べて試料の量が少ないにも拘わらず、得られるＤＮＡ収量が多いことが判る。即ち、本発明の方法により、従来法では困難であった爪から容易に且つ効率よく核酸を遊離し得ることが判る。
【００９９】
実施例．１１ 爪からのＤＮＡの採取
下記爪試料を用いた以外は、実施例．１０と同じ試薬を用い、同じ操作を行って、ＤＮＡサンプルを得た。
（試料）
男性３名（Ｅ、Ｆ、Ｇ）から得た以下の大きさの爪を試料とした。
・爪：１×２mm １片
得られたＤＮＡサンプルのうち２μlについて、ＰＣＲ法によりミトコンドリアＤＮＡ高変位領域Ｉの増幅反応を行い、ＰＣＲ法用サンプルとしての良否を検討した。尚、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡＢＩ社製のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄを用いて常法に従い、以下の条件により行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エチジウムブロマイド0.5μg/mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液〔１mm ＥＤＴＡ含有0.04Ｍ Tris-酢酸緩衝液（pH7.8）〕を用いて作製した1.5％アガロースゲルを使用して100Ｖ定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶを使用してＤＮＡを蛍光検出した。
その結果を図３に示す。
（ＰＣＲ条件）
・Forwardプライマー（合成）：5'-TACTTGACCACCTGTAGTAC-3'（配列番号：１）
・Reverseプライマー（合成）：5'-TAGTTTCACGGAGGATGGTG-3'（配列番号：２）
・95℃11分間；95℃30秒間，52℃30秒間，72℃45秒間、45回；72℃７分間
尚、図３中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：男性Ｅの爪を試料とした場合の結果
・レーン２：男性Ｆの爪を試料とした場合の結果
・レーン３：男性Ｇの爪を試料とした場合の結果
また、図３中、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
【０１００】
〔結果〕
図３から明らかなように、いずれの場合でもミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅断片が認められ、本発明の方法により得られた核酸は、支障無くＰＣＲ法のサンプルとして使用し得ることが判る。
また、得られたＰＣＲ増幅産物は、その後のシークエンス解析に於いて、質・量共に良好なサンプルとなり得ることが示唆される。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明は、核酸を高収率且つ簡便に遊離させる方法及びそれに用いられるキットを提供するものであり、本発明によれば、生体試料、特に硬組織（体毛、爪、骨等）由来の生体試料から、核酸を高収率且つ簡便に遊離させることが可能となる。
【０１０２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例．８で得られたＤＮＡサンプルをポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）で増幅した後に、アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【図２】実施例．９で得られたＤＮＡサンプルをポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）で増幅した後に、アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【図３】実施例．１１で得られたＤＮＡサンプルをポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）で増幅した後に、アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す。
【符号の説明】
図１に於いて、図中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：分子量マーカー〔φＸ１７４ HaeIII消化産物、TAKARA社製〕
・レーン２：女性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン７：女性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ａの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ａの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１０：男性Ａの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１１：男性Ｂの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１２：男性Ｂの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１３：男性Ｂの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１４：男性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン１５：男性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン１６：男性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン１７：陽性コントロール〔常法により血液から採取したゲノムＤＮＡ〕
・レーン１８：陰性コントロール〔ＤＮＡサンプルの代わりに蒸留水を用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行ったもの〕
また、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
図２に於いて、図中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：女性Ｃの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン２：女性Ｃの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン３：女性Ｃの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン４：女性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン５：女性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン６：女性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
・レーン７：男性Ｄの毛髪５mmを試料とした場合の結果
・レーン８：男性Ｄの毛髪１cmを試料とした場合の結果
・レーン９：男性Ｄの毛髪1.5cmを試料とした場合の結果
また、「→」はＸ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（106bp）を、「⇒」はＹ染色体由来のアメロゲニン遺伝子の増幅産物（112bp）を夫々示す。
図３に於いて、図中の各レーンは夫々以下の結果を示す。
・レーン１：男性Ｅの爪を試料とした場合の結果
・レーン２：男性Ｆの爪を試料とした場合の結果
・レーン３：男性Ｇの爪を試料とした場合の結果
また、「→」はミトコンドリアＤＮＡ高変異領域Ｉの増幅産物（240bp）を示す。
【０１０３】
【配列表】
Claims (13)
- 硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを、塩化カリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）の陰イオン界面活性剤及びチオール化合物の存在下で反応させることを特徴とする、当該試料から核酸を遊離させる方法。
- 更にキレート剤の存在下で当該反応を行う、請求項１に記載の方法。
- 更に核酸鎖を沈澱させる処理を行う、請求項１又は２に記載の方法。
- 反応させて得られた反応液を、カオトロピック剤と接触させた後、又は反応させて得られた反応液を遠心分離処理して得た上清を、カオトロピック剤と接触させた後、核酸鎖を沈澱させる処理を行う、請求項１又は２に記載の方法。
- カオトロピック剤を接触させた後又は同時に、更に共沈剤を接触させることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、チオール化合物がジチオスレイトールであり、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸であり、カオトロピック剤がヨウ化ナトリウムであり、共沈剤がグリコーゲンであり、核酸鎖を沈澱させる処理をアルコール類により行わせる請求項５に記載の方法。
- (1)硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の溶液中の濃度として０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）となるような量の陰イオン界面活性剤を含む試薬、(2)チオール化合物及び塩化カリウムを含む試薬、並びに(3)プロテイナーゼＫを含む試薬、若しくは(1)硬組織由来の生体試料とプロテイナーゼＫとを反応させる際の溶液中の濃度として０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．０９％（ｗ／ｖ）となるような量の陰イオン界面活性剤を含む試薬、(2)チオール化合物を含む試薬、(3)塩化カリウムを含む試薬、並びに(4)プロテイナーゼＫを含む試薬、とを組み合わせてなる生体試料から核酸を遊離させるためのキット。
- (1)陰イオン界面活性剤を含む試薬に、更にキレート剤が含まれる請求項７に記載のキット。
- (1)陰イオン界面活性剤を含む試薬に、更に60℃に於けるpKaが7.20以上である緩衝剤が含まれる請求項７又は８に記載のキット。
- 更にカオトロピック剤を含む試薬を組み合わせてなる請求項７〜９の何れかに記載のキット。
- カオトロピック剤を含む試薬に、更に共沈剤が含まれる請求項１０に記載のキット。
- 更にアルコール類を含む水溶液１種以上を組み合わせてなる請求項７〜１１の何れかに記載のキット。
- 陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、チオール化合物がジチオスレイトールであり、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸であり、緩衝剤がＮ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Tricine）であり、カオトロピック剤がヨウ化ナトリウムであり、共沈剤がグリコーゲンであり、アルコール類がイソプロパノール又は／及びエタノールである請求項１２に記載のキット。
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