CN111254138A - 一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，其步骤具体如下：步骤一：收集切胶回收后的酶切产物100μL；步骤二：配制3M醋酸钠溶液备用；步骤三：加入3M10μL醋酸钠溶液到总反应体系中；步骤四：加入异丙醇100μL至反应体系中；步骤五：加入糖元1μL至反应体系中；步骤六：室温下反应20min；步骤七：将反应物离心12000rpm，10min；步骤八：弃上清，去离子水孵育后得到浓缩后酶切产物；步骤九：取3μL检测其A260：A280。本发明步骤解决现有酶切片段浓缩过程中去除污染效率不高、反应时间长等问题，来获得更纯的酶切产物，使分子克隆实验高效顺利完成。

Description

一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法
【技术领域】
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法。
【背景技术】
分子克隆过程中，酶切是重要步骤，在合适的Buffer中，加入内切酶在37℃进行酶切，时间根据目的片段的大小而定，结束后对酶进行80℃失活处理。为了获得较多的酶切产物，除了扩大酶切体积，对产物进行电泳验证以外，还要进行切胶回收检测回收效率如何。此时的酶切产物可能存在蛋白、其他DNA片段杂质污染，因此，对酶切产物纯化浓缩可大大提升浓度，提高克隆效率。
应用最广的酶切产物浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收，回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
但传统方法中由于乙醇浓缩过程中作用易造成片段不稳定。另外，若乙醇处理过程中若风干不彻底，本身对片段就有很大损伤。因此，若处理不当，易对于酶切产物段质量造成严重影响，并且乙醇处理片段时间较久，延长整个分子克隆的时间，影响实验进程。
加入的醋酸钠作用是其中Na+和RNA分子上的负电荷结合，降低RNA分子之间的排斥作用，易于互相聚合而形成RNA-钠盐沉淀，排除RNA污染。异丙醇的存在将消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团更好的暴露，它本身有亲水性，因此加入后能夺取酶切产物周围的水分，因此DNA片段能都发生聚集沉淀。加入糖元是因为糖元会和DNA形成大分子网状结构，三者共同促进DNA沉淀。因此，我们提出一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法。
【发明内容】
本发明的主要目的在于提供一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，其步骤具体如下：
步骤一：收集切胶回收后的酶切产物100μL；
步骤二：配制3M醋酸钠溶液备用；
步骤三：加入3M10μL醋酸钠溶液到总反应体系中；
步骤四：加入异丙醇100μL至反应体系中；
步骤五：加入糖元1μL至反应体系中；
步骤六：室温下反应20min；
步骤七：将反应物离心12000rpm，10min；
步骤八：弃上清，去离子水孵育后得到浓缩后酶切产物；
步骤九：取3μL浓缩后酶切产物检测其A260：A280。
进一步的，所述步骤二中醋酸钠溶液的制备方法是根据其分子量大小配制20mL溶液：计算醋酸钠加入量为M＝m：n。
进一步的，步骤八中去离子水孵育时间为3min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：步骤解决现有酶切片段浓缩过程中去除污染效率不高、反应时间长等问题，来获得更纯的酶切产物，使分子克隆实验高效顺利完成。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施1：
一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，其步骤具体如下：
步骤一：收集切胶回收后的酶切产物100μL；
步骤二：根据其分子量大小配制20mL溶液：计算醋酸钠加入量为M＝m：n，配制3M醋酸钠溶液备用；
步骤三：加入3M10μL醋酸钠溶液到总反应体系中；
步骤四：加入异丙醇100μL至反应体系中；
步骤五：加入糖元1μL至反应体系中；
步骤六：室温下反应20min；
步骤七：将反应物离心12000rpm，10min；
步骤八：弃上清，去离子水孵育3min后得到浓缩后酶切产物；
步骤九：取3μL浓缩后酶切产物检测其A260：A280。
实施例2：
分别取6管酶切产物各100μL，编号为A、B、C、D、E和F在反应时，在A、B两管加入醋酸钠10μL；C、D两管加入异丙醇100μL，醋酸钠10μL；E、F加入无水乙醇100μL、糖元1μL、醋酸钠10μL；在同样室温下反应20min；将反应物离心12000rpm，10min；弃上清，去离子水孵育3min后得到浓缩后酶切产物；取3μL浓缩后酶切产物检测其A260：A280。
实施例1和实施例2检测结果如下表所示：
Figure BDA0001889467240000041
从检测结果来看，在吸光度A260:A280之比，在同样反应条件下，C、D与实施例1比较可说明，糖元对于浓缩效率的提高起到一定作用。E、F与实施例1比较可说明，在较少反应体积下，异丙醇的去杂效果高于无水乙醇，根据所测结果，可得较高纯度酶切片段，分光光度计所测结果A260：280平均为1.937，没有DNA和蛋白污染。

Claims (3)

1.一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，其步骤具体如下：
步骤一：收集切胶回收后的酶切产物100μL；
步骤二：配制3M醋酸钠溶液备用；
步骤三：加入3M10μL醋酸钠溶液到总反应体系中；
步骤四：加入异丙醇100μL至反应体系中；
步骤五：加入糖元1μL至反应体系中；
步骤六：室温下反应20min；
步骤七：将反应物离心12000rpm，10min；
步骤八：弃上清，去离子水孵育后得到浓缩后酶切产物；
步骤九：取3μL浓缩后酶切产物检测其A260：A280。
2.如权利要求1所述的分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，其特征在于：所述步骤二中醋酸钠溶液的制备方法是根据其分子量大小配制20mL溶液：计算醋酸钠加入量为M＝m：n。
3.如权利要求1所述的分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法，其特征在于：步骤八中去离子水孵育时间为3min。
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