CN113564069B - 一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用 - Google Patents

一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用。本申请提供了一种长双歧杆菌，其为长双歧杆菌亚种Bifidobacteriumlongumsubsp.longum，保藏号为GDMCCNo：61618。本申请提供了长双歧杆菌胞外多糖，包括从长双歧杆菌提取的胞外多糖。本申请提供的长双歧杆菌胞外多糖的提取方法，包括：将长双歧杆菌在培养基中培养，收集发酵液；将发酵液去除菌体，使发酵液的酶失活，沉淀多糖和除去蛋白后，纯化得长双歧杆菌胞外多糖。本申请提供了一种新的长双歧杆菌，以及具有提高免疫活性以及改善胰岛素抵抗效果的长双歧杆菌胞外多糖。

Description

一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用。
背景技术
多糖又称为多聚糖，是由超过20个单糖分子聚合而成的糖类化合物，按来源可以分为三类，分别为动物多糖、植物多糖和微生物多糖，按糖类组成分为均多糖和杂多糖，因多糖具有多种生物学活性且来源广泛，所以对于新药的开发提供了无限的可能。目前研究主要集中于真菌多糖以及植物多糖，如灵芝多糖、香菇多糖和枸杞多糖等，它们在抗肿瘤、抗氧化以及抗炎等方面具有重要作用。随着肠道菌群逐渐成为研究者关注的焦点，人们发现肠道微生物在维持人体内营养代谢、生态位竞争、免疫发育以及病理生理过程中起着至关重要的作用，且某些特定菌群发挥这些生理作用的机制则是通过细菌自身产生的活性多糖而实现的。
细菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是在细菌生长过程中分泌到细胞外的长链多糖，是细菌与免疫系统的第一个接触点。近年来，继基因组学、蛋白质组学、糖生物学和糖组学的发展，人们对细菌胞外多糖的研究也逐渐深入，并发现了细菌胞外多糖的众多生物学活性。因此，将某些具有特定功能的肠道菌群及其衍生的活性物质开发成保健食品甚至是药品具有非常广阔的前景。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用，提供了一种新的长双歧杆菌，以及具有提高免疫活性以及改善胰岛素抵抗效果的长双歧杆菌胞外多糖。
本申请第一方面提供了一种长双歧杆菌，其为长双歧杆菌亚种Bifidobacteriumlongum subsp.longum，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61618。
本申请第二方面提供了一种长双歧杆菌胞外多糖，包括从所述长双歧杆菌提取的胞外多糖。
另一实施例中，所述长双歧杆菌胞外多糖的糖含量为99.20±1.21％。
另一实施例中，所述长双歧杆菌胞外多糖的相对分子质量为6.38×105Da。
另一实施例中，所述长双歧杆菌胞外多糖包括甘露糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖；所述甘露糖、所述葡萄糖、所述鼠李糖和所述半乳糖的摩尔比为11.85：5.60：0.46：0.68。
本申请第三方面提供了一种长双歧杆菌胞外多糖的提取方法，包括：
步骤1、将权利要求1所述的长双歧杆菌在培养基中培养，收集发酵液；
步骤2、将所述发酵液去除菌体，使所述发酵液的酶失活，沉淀多糖和除去蛋白后，纯化得到长双歧杆菌胞外多糖。
具体的，所述培养基为MRS液体培养基，培养温度为37℃，厌氧环境中培养48h。
具体的，去除菌体包括：离心发酵液以除去菌体，离心条件是8000rpm,30min,4℃。
具体的，酶失活包括：收集无菌上清液并将其置于100℃中水浴15min以使发酵液中的酶失活。
具体的，沉淀多糖包括：对酶失活后的上清液减压浓缩至原体积的1/10，并向浓缩液中加入3倍体积的冰乙醇，于4℃静置过夜。次日对醇沉部分进行离心(8000rpm,30min,4℃)并收集沉淀，用适量超纯水复溶即得到XZ01胞外多糖粗提液。
具体的，除去蛋白包括：采用Sevage试剂对XZ01胞外多糖粗提液进行脱蛋白处理，具体操作为：于粗提液中加入1/5体积的Sevage试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1，v/v)，剧烈振摇15min后离心(4500rpm,30min,4℃)，收集上层多糖溶液。重复上述步骤以至蛋白层完全消失。将除尽蛋白的溶液转移至透析袋(截留分子量：8000Da)中用纯净水透析48h以除去小分子杂质，期间每隔4h换水一次。完成透析后，进行冷冻干燥以获得胞外多糖粗提物样品，将其密封后置于干燥器内保存。
另一实施例中，所述纯化包括DEAE cellulose-52离子交换柱纯化和SephacrylS-300HR葡聚糖凝胶纯化。
本申请第四方面提供了所述长双歧杆菌胞外多糖或所述提取方法得到的长双歧杆菌胞外多糖在提高免疫调节活性中的应用。
另一实施例中，所述提高免疫调节活性具体为激活鼠源巨噬细胞产生NO，增强鼠源巨噬细胞吞噬活性，以及上调鼠源巨噬细胞的细胞因子表达。
本申请第五方面提供了所述长双歧杆菌胞外多糖或所述提取方法得到的长双歧杆菌胞外多糖在改善胰岛素抵抗活性中的应用。
需要说明的是，尽管来源同一个菌属，但不同双歧杆菌所表达胞外多糖的结构却截然不同，因而各表现出不同功能特性。
本申请提供了一种新的长双歧杆菌，从该长双歧杆菌提取的胞外多糖具有提高免疫调节活性，激活鼠源巨噬细胞细胞产生NO，增强鼠源巨噬细胞吞噬活性，上调鼠源巨噬细胞的细胞因子表达，以及改善胰岛素抵抗活性。具体的，本申请试验数据可知，本申请公开的长双歧杆菌提取的胞外多糖C-EPS和S-EPS-1能激活巨噬细胞RAW264.7，且在激活巨噬细胞的同时，还能够增强其吞噬活性并提高免疫功能，不同浓度的C-EPS和S-EPS-1均能上调RAW264.7细胞IL-1β、IL-6以及TNF-α在基因水平的表达，同时也证实了C-EPS和S-EPS-1具有良好的免疫调节活性；此外，本申请公开的长双歧杆菌提取的胞外多糖具有改善胰岛素抵抗活性的作用。说明了本申请公开的长双歧杆菌及其提取的胞外多糖C-EPS、S-EPS-1在功能食品、保健品以及免疫佐剂的开发方面具有一定的应用潜力与商业价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供的菌株XZ01的革兰氏染色结果图；
图2为本申请实施例提供的菌株XZ01 16S rRNAPCR产物电泳图；
图3为本申请实施例提供的菌株XZ01的系统发育树；
图4为本申请实施例提供的菌株XZ01的C-EPS、S-EPS-1多糖的紫外光谱图；
图5为本申请实施例提供的菌株XZ01的S-EPS-1多糖的渗透凝胶色谱图；
图6为本申请实施例提供的菌株XZ01的S-EPS-1单糖组成分析；其中，A图为混合单糖标准品经PMP衍生化的液相色谱图；B图为S-EPS-1PMP经衍生化的液相色谱图；1：甘露糖；2：鼠李糖；3：葡萄糖醛酸；4：半乳糖醛酸；5：葡萄糖；6：半乳糖；7：木糖；8：阿拉伯糖；9：岩藻糖；
图7为本申请实施例提供的菌株XZ01的C-EPS、S-EPS-1多糖对RAW264.7形态的影响(标尺长度200μm)；
图8为本申请实施例提供的菌株XZ01的C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7 NO释放的影响(与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01)；
图9为本申请实施例提供的不同处理组的RAW264.7细胞对中性红的吞噬情况，图中红色箭头代表RAW264.7细胞吞噬中性红的现象；
图10为本申请实施例提供的菌株XZ01的C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7细胞吞噬活性的影响，与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；
图11为本申请实施例提供的菌株XZ01的C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7细胞因子表达的影响(与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01)；
图12为本申请实施例提供的不同浓度的菌株XZ01的C-EPS多糖对HepG2细胞活性的影响(与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01)；
图13为本申请实施例提供的不同浓度的菌株XZ01的C-EPS多糖对TNFα诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的改善情况(与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01)；
图14为本申请实施例提供的不同浓度的菌株XZ01的C-EPS多糖对TNFα诱导后的HepG2细胞PI3K基因的表达(与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01)；
图15为本申请实施例提供的不同浓度的菌株XZ01的C-EPS多糖对TNFα诱导后的HepG2细胞IRS1基因的表达(与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01)。
具体实施方式
本申请提供了一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用，提供了一种新的长双歧杆菌，以及具有提高免疫活性以及改善胰岛素抵抗效果的长双歧杆菌胞外多糖。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例的试剂或原料均为市售或自制。
本申请保藏号为GDMCC No：61618的长双歧杆菌命名为：Bifidobacterium longumsp.longum XZ01，以下简称为XZ01。
以下实施例的RAW264.7为小鼠单核巨噬细胞。
菌株XZ01的复苏和培养包括：从-80℃冰箱取出菌株XZ01冻存管，于37℃水浴融化后，将冻存管转移至无菌超净工作台。随后，将蘸满75％乙醇的棉球围绕冻存管擦拭一周，揭开封口膜后在酒精灯上稍微加热，旋开冻存管盖，将无菌接种环伸入冻存管中蘸取适量菌液，采用三区划线法将适量菌液接种于MRS平板，并于37℃，厌氧环境中培养48h。待菌株活化后，在划线平板中筛选单菌落，并将单菌落转至液体培养基中按相同培养条件扩大培养。
实施例1
本申请实施例提供了菌株XZ01的鉴定试验，包括：
1、于超净工作台中，对活化了的菌株XZ01进行革兰氏染色。染色的操作现有常规方法步骤进行操作。染色结束后，于显微镜下镜检并拍照，若染色结果为红色，则为革兰氏阴性菌；反之，蓝色则为革兰氏阳性菌。
菌株XZ01经活化后，在MRS平板上呈边缘规整、光滑白色不透明圆点状生长。革兰氏染色结果如图1所示，菌株XZ01为革兰氏阳性菌，显微形态多为杆状或分叉状(Y字形)，是双歧杆菌的典型形态特征。
2、按照现有常规方法鉴定菌株XZ01的生理生化指标，包括棉籽糖、山梨醇、松三糖、D-纤维二糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖、D-半乳糖、半乳糖、D-蔗糖、D-果糖、淀粉、硫化氢、过氧化氢酶、氧化酶、动力实验、硝酸盐还原、吲哚产生、尿素酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶和生长pH。结果如表1。
表1
鉴定指标 GDMCC1.248 XZ01 鉴定指标 GDMCC1.248 XZ01
棉籽糖 + + 硫化氢 — —
山梨醇 — — 过氧化氢酶 — —
松三糖 + + 氧化酶 — —
D-纤维二糖 — — 动力实验 — —
D-阿拉伯糖 — — 硝酸盐还原 — —
葡萄糖 + + 吲哚产生 — —
D-半乳糖 + + 尿素酶 — —
半乳糖 + + 鸟氨酸脱羧酶 + +
D-蔗糖 — — 精氨酸双水解酶 — —
D-果糖 — — 苯丙氨酸脱氨酶 — —
淀粉 + + 生长pH 4-7 3-9
由表可知，菌株XZ01的碳源利用特性为：能够利用培养基中的棉籽糖、松三糖、葡萄糖、半乳糖、D-半乳糖与淀粉，无法利用山梨醇、D-纤维二糖、D-阿拉伯糖、D-蔗糖与D-果糖。此外，其酶学实验结果表明，除鸟氨酸脱羧酶显阳性外，其余均为阴性。对于生长pH条件而言，菌株XZ01可生长的pH范围较对照菌株GDMCC1.248稍宽泛，即对pH的耐受程度较对照菌株更强。综上，菌株XZ01的生理生化特性与长双歧杆菌基本完全一致。
3、菌株XZ01的16S rRNA鉴定试验，包括：
(1)细菌基因组DNA提取：
菌株XZ01的基因组DNA使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体流程依照说明书严格进行操作。在获得菌株XZ01的DNA后，对其DNA浓度以及纯度进行检测，OD260/OD280比值在1.7-1.9范围视为合格。
(2)PCR扩增体系及条件：
将上下游引物、Taq PCRMaster Mix以及无菌水置于冰上融化，使用前用移液枪将每种试剂吹打混匀，依次按照表2将PCR反应体系配制于无菌灭酶的PCR管中，配制完毕后将PCR管短暂离心以甩下沾壁的反应液，随后进行PCR扩增程序。引物序列以及扩增条件如表2～表4所示。
表2 PCR扩增体系
表3 16S rRNA扩增引物序列
表4 PCR扩增条件
程序 温度/℃ 时间 循环数
预变性 94 4min 1
变性 94 1min 30
退火 55 1min 30
延伸 72 1.5min 30
延长 72 10min 1
保温 4 - -
(3)PCR扩增产物检测：
采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增的结果进行检定，具体条件为：琼脂糖(0.8％，1×TAE缓冲液配制，w/v)，PCR扩增产物(上样量5μL)，Marker D(上样量2.5μL)，电压(110V)，电泳时间(30min)。按以上条件进行电泳，结束后于凝胶成像仪下成像观察是否于1500bp处出现目的条带。
(4)PCR扩增产物回收：
根据Marker指示的位置，筛选琼脂糖凝胶中的目的条带，并使用胶回收试剂盒对目的扩增产物进行回收，操作严格按说明书中的步骤进行。
(5)PCR扩增产物与T载体的连接：
将回收得到的目标扩增产物与T载体pUCm-TVector进行连接，连接条件如表5所示。
表5 T载体连接体系
反应体系配制完成后，于22℃连接10min。同时，冰上解冻感受态细胞，随后加入水浴好的反应液，混匀后再于冰上静置30min。接着，42℃热激90s后，于冰上静置5min并往反应液中加入900μL无菌LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1h。再将菌液于4000rpm离心3min后弃750μL上层培养基，并用离心管中余下的液体将细菌悬浮，再将细菌混悬液均匀涂布于含IPTG和X-gal的LB平板上，平板于37℃培养1h再将其倒置并过夜培养。
次日，于无菌超净台用吸头挑取蓝色菌落周围的白色单菌落，即为阳性单克隆。随后，将该单菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃过夜培养，将培养后的菌液委托上海生工生物完成16S rRNA测序。
(6)16S rRNA测序结果分析：
利用Chromas软件查看测序峰图并对测序结果进行判定，再使用DNAStar软件对位于两端的载体序列去除后再拼接序列。
登录NCBI数据库，并选择Blast功能将菌株XZ01的序列与其他细菌的16S rRNA序列进行相似度比对，使用MEGAX软件中的邻位相连法(Neighbor-Joining method)进行系统发育分析以及系统发育树的构建，结合菌株XZ01的形态特征、生理生化结果对其种属进行确证。
在对菌株XZ01的基因组DNA进行提取与PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，凝胶成像结果如图2所示，图2从左往右看，第一列为Marker、第二列为对照菌株GDMCC1.248的DNA、第三列为菌株XZ01的DNA。图2表明，在1500bp的位置出现了特异条带，这两条单一条带即为成功扩增的目的片段条带。随后，对目的条带位置进行胶回收等后续操作，并筛选其阳性克隆进行16S rRNA测序鉴定。
测序完成后，先对得到的XZ01的测序峰图进行分析，XZ0116S rRNA测序峰图波形对称且清晰，峰和峰的间距均匀，底部无杂峰干扰，即表明该测序成功、结果可靠。
通过BLAST功能，将XZ0116S rRNA序列与NCBI数据库中其他细菌的16S rRNA序列同源性进行相似度比对，比对结果如表2-5所示(表中所示菌株为与菌株XZ01相似度大于97％的菌株)。从表中可得知，与XZ01菌株序列相似度大于97％的菌株均同属于双歧杆菌属，并且其中四株菌与菌株XZ01的相似度均超过99％，以长双歧杆菌亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)最高，为99.86％，这表明XZ01极有可能属于长双歧杆菌亚种。
表6
菌株名称 相似度
Bifidobacterium longum subsp.longum 99.86％
Bifidobacterium longum subsp.suis 99.52％
Bifidobacterium longum subsp.infantis 99.17％
Bifidobacterium longum subsp.suillum 99.17％
Bifidobacterium felsineum 97.51％
Bifidobacterium scaligerum 97.17％
选择相似度较高的比对序列，利用MEGAX软件绘制系统发育树，其中Escherichiacoli为引入的外源基因以作为对照。根据系统发育树所示(图3)，菌株XZ01与Bifidobacterium longum subsp.longum JCM1217位于同一分支，具有非常接近的亲缘关系，且与JCM 1217位于同一簇的其他菌株均为长双歧杆菌亚种。综上，结合形态学特征、生化特性、16S rRNA的测序结果，本申请将菌株XZ01认定为Bifidobacterium longumsubsp.longum，即长双歧杆菌亚种。
实施例2
本申请实施例提供了XZ01菌株的胞外多糖的提取试验，包括：
将保藏于-80℃的XZ01菌株取出，接种于MRS液体培养基，37℃培养24h，按此步骤活化两代后，以2％(v/v)的接种量将其转入MRS液体培养基中进行扩大培养，置于37℃培养48h。
培养48h后，离心发酵液(8000rpm,30min,4℃)以除去菌体，收集无菌上清液并将其置于100℃中水浴15min以使发酵液中的酶失活。随后对该上清液减压浓缩至原体积的1/10，并向浓缩液中加入3倍体积的冰乙醇，于4℃静置过夜。次日对醇沉部分进行离心(8000rpm,30min,4℃)并收集沉淀，用适量超纯水复溶即得到XZ01胞外多糖粗提液。
采用Sevage试剂对多糖粗提液进行脱蛋白处理，具体操作为：于粗提液中加入1/5体积的Sevage试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1，v/v)，剧烈振摇15min后离心(4500rpm,30min,4℃)，收集上层多糖溶液。重复上述步骤以至蛋白层完全消失。将除尽蛋白的溶液转移至透析袋(截留分子量：8000Da)中用纯净水透析48h以除去小分子杂质，期间每隔4h换水一次。完成透析后，进行冷冻干燥以获得胞外多糖粗提物样品，将其密封后置于干燥器内保存。
上述经37℃培养48h的长双歧杆菌亚种XZ01的发酵液，经离心去除菌体、沸水浴使酶失活、冰乙醇过夜沉淀多糖、Sevage试剂反复除蛋白、透析以及冷冻干燥等一系列步骤后，得到棕褐色、蓬松状长双歧杆菌亚种XZ01粗多糖，其产量为747.86mg/L，将长双歧杆菌亚种XZ01菌株的胞外粗多糖脱色处理，得到脱色处理后得到的长双歧杆菌亚种XZ01粗多糖，简称C-EPS。
实施例3
本申请实施例提供了XZ01菌株的胞外多糖分离纯化试验，包括：
本实施例采用DEAE cellulose DE-52阴离子交换柱以及Sephacryl S-300HR葡聚糖凝胶对实施例2的经脱色处理后得到的长双歧杆菌亚种XZ01粗多糖(C-EPS)进行分级分离与纯化，收集糖含量较高的S-EPS-1中性多糖组分，随后结合紫外光谱(UV)、高效液相色谱(HPLC)对S-EPS-1的纯度及相对分子质量、单糖组成及比例进行了分析。
1、DEAE cellulose-52离子交换柱纯化试验，包括：
1.1、纤维素前处理：称取适量的DEAE Cellulose 52离子交换纤维素于玻璃烧杯中，加入足量超纯水溶胀，除去悬浮物以及不溶大颗粒后，先用0.5mol/L的NaOH溶液处理1h，随后用超纯水反复清洗至中性，再用0.5mol/L的HCl溶液处理1h，以超纯水洗至中性。
1.2、装柱：层析柱规格为2.6×50cm，缓缓将纤维素倒入层析柱后让其自然沉降，并用洗耳球轻敲外壁以去除气泡，再反复添加填料至合适高度，连接恒流泵，用超纯水以1.0mL/min的流速平衡。
1.3、上样：称取400mg的C-EPS溶于10mL超纯水中，4500rpm离心15min后，取上清并用0.45μm滤膜过滤；上样后，启动恒流泵并开始洗脱。
1.4、洗脱：洗脱液依次为0、0.05、0.1、0.3、0.5mol/LNaCl溶液，流速为1.0mL/min，每管收集10mL。
1.5、检测：利用硫酸苯酚法隔管检测洗脱液的糖含量，并绘制相应的洗脱曲线。
1.6、收集：依据洗脱曲线，把相同组分合并，减压浓缩后，进行透析和冻干并获得不同组分的多糖样品。
DEAE-Cellulose 52是一种阴离子交换纤维素，主要用于大分子多糖分离与纯化。其分离原理是基于离子交换反应，当多糖溶液通过该填料时，带负电荷的酸性多糖被填料吸附，而不带电荷的中性多糖则直接流出，随后再采用不同离子强度的洗脱液进行梯度洗脱，即可将多糖混合物中不同的酸性多糖组分洗脱出来以实现分离纯化的目的。
本实施例采用阴离子交换纤维素对脱色后的长双歧杆菌亚种XZ01粗多糖进行进一步的分离与纯化。粗多糖经过不同浓度梯度的NaCl洗脱后，共得到3个明显的洗脱峰，按出峰先后依次命名为EPS-1、EPS-2和EPS-3。根据洗脱曲线可知，EPS-1为超纯水洗脱下来的组分，表明EPS-1为不带电荷的中性多糖。而EPS-2和EPS-3分别是经0.05mol/L和0.3mol/LNaCl溶液洗脱而来，表明这两个组分的多糖聚合物是带有一定量的负电荷，即酸性多糖。不过经过DEAE-Cellulose 52得到的洗脱峰并不一定是单一组分，其可能是由含有带相同电荷量但分子量不同的组分混合而成，故还需要再利用凝胶色谱对其进一步纯化。
2、Sephacryl S-300HR葡聚糖凝胶纯化试验，包括：
2.1、纤维素前处理：用超纯水洗净Sephacryl S-300HR中的乙醇，然后采用与步骤1.1和1.2中相同的方式将填料填装于层析柱(1.6×90cm)中，待填料沉降后，连接恒流泵，用0.1mol/LNaCl溶液以0.5mL/min的流速平衡。
2.2、上样：分别称取50mg经离子交换柱纯化得到的各个组分，充分溶于10mL超纯水中，采取与步骤1.3方法相同的方式上样。
2.3、洗脱：洗脱液为0.1mol/LNaCl溶液，流速为0.5mL/min，每管收集4mL。
2.4、检测与收集方法同步骤1的1.5和1.6方法。
此外，经过这一步纯化后一共得到4个组分，分别为S-EPS-1～S-EPS-4。S-EPS-1组分产量以及含糖量较高，对S-EPS-1组分进行化学组成测定、紫外光谱分析、分子量测定和单糖组成分析。
Sephacryl S-300HR是一种烯丙基葡聚糖交联共聚物，该凝胶基质具备良好的刚性、化学稳定性以及广泛的分离范围，常用于带有不同分子量的多糖样品之间的分离。
由此，本申请实施例对上述得到的三个组分使用烯丙基葡聚糖凝胶进行下一步纯化。EPS-1和EPS-2经Sephacryl S-300HR葡聚糖凝胶柱洗脱后均得到单一的对称洗脱峰S-EPS-1和S-EPS-2，即表明组分EPS-1和EPS-2是分子量较为均一的组分组成。而EPS-3组分经纯化后得到2个互相分离的洗脱峰，表示EPS-3组分可能是由两个带电荷量近似但是分子量不同的多糖组分构成的。考虑到S-EPS-1组分的含糖量以及得率较其他组分而言更高，因此将该组分进行收集、透析并冻干以进行后续分析。
3、对步骤2纯化后的S-EPS-1多糖进行分析，包括：
3.1、采用现有常规方法测定S-EPS-1多糖中的总糖含量与蛋白质含量。
3.2、用超纯水将C-EPS、S-EPS-1组分配制成1mg/mL的溶液，在190-400nm区域范围内扫描，并检查在260nm、280nm是否出现特征吸收。
3.3、分子量测定：利用凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography,GPC)检测S-EPS-1的分子量，同时检验其纯度。相继进样不同分子量的葡聚糖标准品，同时记录其保留时间(TR)，并将各标品的TR作为横坐标，其相应分子量(Mw)的lg对数作为纵坐标以绘制标准曲线，得出lg(Mw)与TR的回归方程为lg(Mw)＝-0.7789TR+10.417，相关系数R2＝0.9937。
色谱条件：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，PolySep-GFC-P 4000色谱柱(Phenomenex，300×7.8mm)，蒸发光散射检测器，检测器温度为60℃，增益值为10，柱温为35℃，以超纯水为流动相，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。
按上述步骤将S-EPS-1组分进样检测，根据对应的保留时间，代入回归方程计算得出相应S-EPS-1的相对分子量，此外，按照S-EPS-1在色谱图上的峰形判断多糖的纯度。
本实施例采用HPGPC法测定长双歧杆菌亚种XZ01胞外多糖中S-EPS-1组分的相对分子质量，如图5所示，S-EPS-1的渗透凝胶色谱图呈现出单一且对称的色谱峰，即表明该组分的相对分子质量分布较为均匀，为纯度较高的均一多糖。根据线性回归方程，将其保留时间TR＝5.921min带入计算得到S-EPS-1的相对分子质量为6.38×105Da。同时，本实施例前期对XZ01 EPS的分离纯化采用的是Sephacryl S-300HR烯丙基葡聚糖凝胶，其分离范围为104～1.5×106，且S-EPS-1组分的分子量位于该范围之内，即表明GPC对S-EPS-1分子量的测定结果与前期采用凝胶色谱的分离纯化结果相互吻合。
3.4、单糖组成分析：采用PMP柱前衍生化-高效液相色谱法测定S-EPS-1组分的单糖组成。
多糖样品的水解：称取5.0mg S-EPS-1样品于密闭反应管中，加入2mL三氟乙酸(TFA，3M)，确认反应管密封后放置于120℃水解6h，水解完毕后于室温下冷却，随即加入甲醇并将其旋干(反复3遍)，再加入800μL超纯水溶解并将完全水解的多糖溶液转移至离心管中备用。
多糖样品的衍生化反应：取100μL完全水解的多糖样品溶液于密闭反应管中，加入0.5M PMP甲醇溶液与0.3MNaOH溶液各100μL，混合均匀后置于70℃水浴反应30min，随后取出并于室温下冷却，再依次加入105μL0.3M HCl、200μL超纯水以及600μL氯仿，涡旋混匀后离心(10000rpm,15min)，弃下层氯仿，重复3次以除去过量PMP，最后取上层水溶液过0.45μm滤膜后于HPLC检测。各单糖标准品以及混合标准品也按照上述步骤进行衍生化反应。
色谱条件：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，Symmetry C18(Waters，4.6×250mm)色谱柱，紫外检测器检测，检测波长为250nm，流动相为0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.7)-乙腈(体积比83:17)，流速为1.0mL/min，进样20μL。
将样品S-EPS-1衍生化后的出峰时间与峰面积与单糖标准品进行对比与计算，得出S-EPS-1的单糖组成及摩尔比。
在本实施例中，采用高效液相色谱测定S-EPS-1样品中单糖的种类与对应比例。将S-EPS-1组分的液相色谱图(图6-B)与混合单糖标准品衍生化产物峰图(图6-A)进行对比，根据保留时间可知S-EPS-1主要是由甘露糖、葡萄糖以及少量的鼠李糖和半乳糖组成，根据峰面积可得出各单糖间的摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖＝11.85：0.46：5.60：0.68。由以上结果可知，组分S-EPS-1主要是由4种单糖按不同比例构成的杂多糖(Heps)。
实施例4
本申请实施例提供了实施例3中的C-EPS和S-EPS-1多糖的免疫调节活性试验，具体包括：
以RAW264.7细胞为试验对象，先后对实施例3的C-EPS以及纯化后的S-EPS-1多糖组分的活性进行试验，主要包括对C-EPS和S-EPS-1干预后细胞NO释放量、细胞吞噬活性、细胞因子的mRNA表达水平进行测定并考察C-EPS和S-EPS-1的免疫调节活性。
1、对RAW264.7细胞进行复苏和培养，对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，过夜贴壁后，弃培养液，加入100μL用培养基稀释的不同浓度的C-EPS或S-EPS-1，浓度分别为25、50、100、150、200和300μg/mL，空白对照组只加等体积培养基，阳性对照组则相应加入等体积LPS溶液(LPS，1μg/mL)。按上述操作对细胞进行处理并转移至培养箱中培养24h后，将细胞置于显微镜下观察其形态并拍照记录，结果如图7所示。随后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)并置于37℃培养箱中避光孵育4h后，弃去上清液，再往每孔中加入200μL DMSO，随后震荡10min以使结晶完全溶解，于490nm波长测定吸光值，对照组作为100％细胞活性。
显微镜下观察经C-EPS和S-EPS-1处理的RAW264.7的形态特征(图7)，空白对照组细胞呈饱满圆形，单层贴壁且紧密抱团分布，细胞边缘清晰，未见形态改变。而经100μg/mLC-EPS和S-EPS-1处理24h后的RAW264.7细胞透亮，伸出大量伪足，细胞体积明显增大且呈梭形或者不规则多边形分布，与LPS处理的阳性对照组细胞形态基本一致。通常情况下，RAW264.7细胞形态的改变往往提示巨噬细胞的活化。
2、Griess法检测C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7分泌NO的影响试验，包括：
2.1、标准曲线的建立：用细胞完全培养基将NaNO2(1M)标准品分别稀释成浓度为0、1、2、5、10、40、60、100μM的标准溶液，分别取50μL上述浓度标准溶液于96孔板中，再分别加入试剂盒中的Griess试剂1和Griess试剂2各50μL，充分显色后于540nm波长下测定吸光值，以NaNO2的摩尔浓度为横坐标，以各浓度下对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为y＝0.0064x+0.0493，相关系数R2＝0.9994。其中，Griess试剂1：对氨基苯磺酸0.5g和稀醋酸(10％)150mL；Griess试剂2：α萘胺0.1g,蒸馏水20mL和稀醋酸(10％)150mL。
2.2、RAW264.7分泌NO的测定：细胞的接种、分组与给药方式均同步骤1和步骤2的方法。按上述方法处理细胞后于37℃培养箱培养24h，并从每孔取50μL上清液于新的96孔板中，依次加入等体积的Griess试剂1和Griess试剂2，摇匀后于540nm波长测定吸光度值，代入标准曲线计算各组细胞上清中的NO浓度。结果如图8所示。其中，Griess试剂1：对氨基苯磺酸0.5g和稀醋酸(10％)150mL；Griess试剂2：α萘胺0.1g,蒸馏水20mL和稀醋酸(10％)150mL。
如图8所示，与对照组相比，通过C-EPS、S-EPS-1的刺激后，RAW264.7释放的NO量显著增加，而与LPS阳性对照组相比，即便是在最高浓度下，C-EPS、S-EPS-1刺激RAW264.7释放的NO量也没有超过LPS，这说明C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7细胞的作用较为温和，因此能避免由于NO产生过多而导致的细胞凋亡。基于以上结果，可知C-EPS、S-EPS-1均能激活RAW264.7细胞，并促进其分泌并产生NO。
2.3、C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7吞噬活性试验：细胞的接种、分组与给药方式均同步骤1的方法。按上述方法处理细胞后于37℃培养箱培养24h，再加入预热的PBS缓冲液轻轻清洗细胞3遍，加入100μL 0.75mg/mL的中性红-PBS溶液，继续置于37℃培养箱中避光培养45min后，将细胞取出置于显微镜下镜检并拍照记录，再弃去上清液，用PBS缓冲液清洗3遍以洗去细胞表面未被吞噬的中性红结晶，往每孔加入100μL裂解液(乙醇：冰醋酸＝1:1,v/v)，于室温避光静置2h，待细胞溶解后，在540nm波长测定吸光值，以空白对照组作为100％细胞吞噬率。结果如图9～图10所示。
图9为经C-EPS、S-EPS-1处理24h后，RAW264.7对中性红吞噬情况的镜检图片，从图中可以看出，对照组RAW264.7细胞主要呈圆形聚集，对中性红几乎不摄取，而经过C-EPS、S-EPS-1或LPS处理过的RAW264.7细胞体积膨大，伸出大量伪足，对中性红的摄取量明显增加，即表明C-EPS和S-EPS-1能在不同程度上增强RAW264.7细胞的吞噬活性。如量化图(图10)所示，C-EPS和S-EPS-1均能在25-300μg/mL的浓度区间增强RAW264.7细胞对中性红的吞噬，并且随着浓度的增高，细胞的吞噬活性越强，呈现出一定的剂量依赖性。此外，相比于C-EPS，S-EPS-1对RAW264.7吞噬活性的增强效果更为明显。综合以上结果表明，C-EPS和S-EPS-1能增强RAW264.7细胞的吞噬活性。
3、C-EPS、S-EPS-1对RAW264.7细胞因子表达试验，包括：
3.1、细胞总RNA提取：将对数生长期的RAW264.7细胞按照1.5×106个/孔的密度接种于6孔板，每孔加入2mL细胞悬液，过夜贴壁后，弃培养液，加入浓度分别为50、100和200μg/mL的C-EPS或S-EPS-1溶液，空白及阳性对照组处理方式同步骤1的方法。将细胞置于37℃培养箱中培养24h后，取出6孔板对细胞总RNA进行提取。
吸出6孔板中的培养液，加入预冷PBS将细胞彻底清洗2遍后，每孔加入500μLTRIzol试剂，轻晃6孔板使TRIzol完全覆盖细胞表面。用移液枪反复吹打使细胞从孔板上脱落后，再把细胞裂解液转移到标记好的无酶离心管，室温静置5min，加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，涡旋10s，再次室温静置10min并于12000rpm4℃离心15min。随后，将上层无色液体转移到新离心管，加入等体积预冷异丙醇，上下颠倒混匀并室温下静置10min后，于4℃12000rpm离心10min。弃去上清液，向离心管中加入预冷的75％乙醇以重悬离心管底部的RNA沉淀，12000rpm4℃离心3min，弃掉上清液。室温干燥RNA至半透明状，加入40μLDEPC水将RNA溶解稀释，并对RNA的纯度和浓度进行测定和记录。
3.2、逆转录反应：将3.1步骤提取得到的RNA模板、FSQ-301试剂盒中反应液以及DEPC水取出，待其融化后用移液枪将每种反应液吹打混匀，按表7对反应体系进行配制，配制完成后依次进行反应I和反应II，逆转录反应的条件设置如表8所示。
表7逆转录反应液的配制
反应液 加入体积
反应I：4×DN Master Mix 2.0μL
RNA 0.5μg
DEPC水 5.5μL
总体积 8.0μL
反应II：上一步得到的反应液 8.0μL
5×RT Master Mix II 2.0μL
总体积 10.0μL
表8
反应温度 反应时间
反应I：37℃ 5min
反应II：37℃ 15min
50℃ 5min
98℃ 5min
3.3、实时定量PCR反应：将经逆转录反应得到cDNA及其对应的引物(引物序列见表9)，QPK-201剂盒中的反应液，DEPC水分别取出并置于冰上，待其融化后，将反应液按表10在无菌灭酶的8联管中避光配制，配制完成后短暂离心以防部分反应液沾壁，随后将8联管转移至荧光定量PCR仪中，按表11中的程序设定并开始反应。反应完成后，将GAPDH作为内参基因，使用2-△△Ct法计算IL-1β、IL-6以及TNF-α的相对表达量。
表9 PCR引物序列
表10实时荧光定量PCR反应体系
组成成分 添加量
cDNA 2.0μL
SYBR Green Realtime PCR Mater Mix 10.0μL
Forward引物 0.8μL
Reverse引物 0.8μL
DEPC水 6.4μL
总体积 20.0μL
表11实时荧光定量PCR反应程序
实验中各组数据以均值±标准差(mean±SD)的形式表示，并用IBM SPSS 23.0对数据进行统计学处理，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，当数据满足方差齐性时，使用Tukey HSD法进行组内两两比较，否则采用Dunnett’s T3法进行处理。当p＜0.05时，则认为差异具有统计学意义。结果如图11所示。
IL-1β、IL-6以及TNF-α是巨噬细胞被激活后表达的重要细胞因子，负责参与调控宿主机体内的免疫反应。本实施例测定了经不同浓度C-EPS、S-EPS-1刺激24h后RAW264.7细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的基因转录水平，结果如图11所示。据图可知，相较于空白对照组，在浓度范围在50-200μg/mL之间时，C-EPS和S-EPS-1均能呈浓度依赖式地在不同程度上促进RAW264.7细胞在mRNA水平上表达细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α，而且高浓度(200μg/mL)的S-EPS-1对RAW264.7细胞表达细胞因子的促进效果与阳性对照组LPS几乎无异。综合以上结果，提示C-EPS和S-EPS-1不但能对巨噬细胞RAW264.7进行激活，还能在mRNA水平上调RAW264.7细胞中细胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达，表明长双歧杆菌亚种XZ01所表达的C-EPS和S-EPS-1具有非常可观的免疫调节活性。
实施例5
本申请实施例提供了实施例2中脱色后的C-EPS粗多糖的改善胰岛素抵抗活性试验，具体包括：
1、设置空白对照组、C-EPS处理组，对照组仅加入细胞培养基，C-EPS处理组为HepG2细胞加入不同浓度实施例2中C-EPS粗多糖，共培养24小时后利用MTT法检测细胞活性，考察C-EPS多糖对HepG2细胞活性的影响，结果如图12所示。据图12表明，表明菌株XZ01产生的C-EPS多糖在50-600μg/mL的浓度下处理HepG2细胞24小时不会对细胞活性产生影响。
2、设置空白对照组、C-EPS处理组、模型组(TNFα)，C-EPS处理组为HepG2细胞用TNFα和不同浓度实施例2中C-EPS粗多糖处理，模型组用TNFα处理以诱导胰岛素抵抗模型，24小时后使用葡萄糖氧化酶试剂盒测定细胞上清中的葡萄糖浓度，结果如图13。如图13所示，25-100μg/mL的C-EPS均可增加TNF a诱导后的HepG2细胞对葡萄糖的利用和消耗，即表明菌株XZ01产生的C-EPS可以改善TNFα诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗情况。
设置空白对照组、C-EPS处理组、模型组(TNFα)，C-EPS处理组为HepG2细胞用TNFα和不同浓度实施例2中C-EPS粗多糖处理，模型组用TNFα处理以诱导胰岛素抵抗模型，24小时后利用qPCR测定HepG2细胞中PI3K和IRS1基因的转录水平，PI3K和IRS1引物序列见表9。结果如图14和图15。如图14和图15所示，C-EPS在25-200μg/mL的浓度范围均可上调TNF a诱导后的HepG2细胞PI3K和IRS1基因的表达，即表明菌株XZ01产生的C-EPS可以改善TNFα诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗情况。
综上所述，本申请实施例首先通过形态学检查、生理生化指标测定、16S rRNA测序以及系统发育树对菌株XZ01进行种属鉴定，染色结果提示菌株XZ01为革兰氏阳性菌，其显微形态呈典型杆状或Y字形，同时生理生化特征与对照菌株长双歧杆菌亚种GDMCC1.248基本无异，16S rRNA测序序列与长双歧杆菌亚种高度相似(99.86％)，且系统发育树提示其与长双歧杆菌亚种JCM1217位于同一分支，并且拥有非常相近的亲缘关系，因此菌株XZ01被鉴定为长双歧杆菌亚种。
第二、本申请实施例采用DEAE-Cellulose 52离子交换柱以及Sephacryl S-300HR烯丙基葡聚糖凝胶柱对C-EPS进行进一步分级分离与纯化并得到了一个得率以及含糖量较高的中性多糖组分S-EPS-1，随后结合紫外光谱、凝胶渗透色谱、高效液相色谱等分析方法对S-EPS-1的化学组成与纯度、相对分子质量、单糖组成以及比例进行表征，结果如下：
1)C-EPS经DEAE-Cellulose 52离子交换柱纯化后，共得到3个组分，分别为中性多糖EPS-1、酸性多糖EPS-2和EPS-3。再利用Sephacryl S-300HR烯丙基葡聚糖凝胶柱对以上得到的3个组分进一步纯化后，共得到4个组分，包括S-EPS-1、S-EPS-2、S-EPS-和S-EPS-4。
2)紫外扫描结果表明，S-EPS-1中不含核酸和蛋白质等杂质，同时，硫酸苯酚法和BCA蛋白定量法的测定结果也表明S-EPS-1组分中没有蛋白质的存在，糖含量为99.20±1.21％。
3)采用高效液相色谱法对S-EPS-1的分子量以及单糖组成进行分析，发现S-EPS-1是相对分子质量为6.38×10^5Da的均一多糖；单糖组成的分析结果说明，S-EPS-1主要由甘露糖、葡萄糖以及少量的鼠李糖和半乳糖组成，其摩尔比依次为11.85:5.60:0.46:0.68。
第三、本申请实施例发现C-EPS和S-EPS-1具有免疫调节活性，主要的结果总结如下：
1)C-EPS和S-EPS-1能影响RAW264.7细胞的形态。
2)C-EPS和S-EPS-1能激活RAW264.7细胞，并能在25-300μg/mL的浓度范围内呈浓度依赖式地促进其产生NO。
3)C-EPS和S-EPS-1能增强RAW264.7细胞的吞噬活性，具体表现为增强RAW264.7对中性红的吞噬能力。
4)C-EPS和S-EPS-1能显著上调RAW264.7细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α在mRNA水平的表达，具有较为理想的免疫调节活性。
第四、本申请提供的菌株XZ01产生的胞外多糖可改善TNFα诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗情况。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (5)

1.一种长双歧杆菌，其为长双歧杆菌亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）XZ01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61618。
2.一种长双歧杆菌胞外多糖，其特征在于，包括从权利要求1所述的长双歧杆菌提取的胞外多糖；
所述胞外多糖是由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖组成的杂多糖，所述甘露糖、所述葡萄糖、所述鼠李糖和所述半乳糖的摩尔比为11.85：5.60：0.46：0.68；
所述长双歧杆菌胞外多糖的相对分子质量为6.38×105 Da。
3.根据权利要求2所述的长双歧杆菌胞外多糖，其特征在于，所述长双歧杆菌胞外多糖的糖含量为99.20±1.21%。
4.如权利要求2所述的一种长双歧杆菌胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括：
步骤1、将权利要求1所述的长双歧杆菌在培养基中培养，收集发酵液；
步骤2、将所述发酵液去除菌体，使所述发酵液的酶失活，沉淀多糖和除去蛋白后，纯化得到长双歧杆菌胞外多糖。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述纯化包括 DEAE cellulose-52离子交换柱纯化和Sephacryl S-300 HR葡聚糖凝胶纯化。
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