CN102089422A - 新的益生长双歧杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的长双歧杆菌益生抗炎菌株，其用于预防、减轻或治疗疾病以及用于制备人类或宠物食品的用途，或药物组合物。所述菌株产生大量具有高含量的甘露糖和葡萄糖残基的胞外多糖。因此，本发明还涉及由所述菌株获得的细菌多糖组合物，其用于治疗疾病的用途，以及包含此类多糖的药物组合物。

Description

新的益生长双歧杆菌
技术领域
本发明涉及新的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)益生抗炎菌株，其用于预防、减轻或治疗疾病以及用于制备人类或宠物食品的用途，或药物组合物。此外，本发明涉及由所述菌株获得的细菌多糖、其用于治疗疾病的用途、以及包含该多糖的药物组合物。
背景技术
乳酸菌
已经长时间知晓发酵糖产生酸尤其是主要的新陈代谢组分乳酸的细菌。此类细菌可以在牛奶或乳品、活着的或腐败植物中发现，也可以在人类和动物肠道中发现。传统上，这类细菌被称为“乳酸菌”。乳酸菌指发酵糖产生酸(包括乳酸)的革兰氏阳性、无运动微需氧或厌氧细菌的相当异种的一类，乳酸菌包括，例如，双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属和片球菌属。
几个世纪以来，乳酸菌已用于制备食品和饲料产品，包括大部分乳制品，现在，乳酸菌在制备所有发酵乳品例如酸奶、发酵全脂牛奶、乳冻食品(junket)、乳酪和黄油中是必不可少的。
大量记载各种乳酸菌有益影响人类和/或动物健康的报道的发表吸引了对这类细菌进一步的兴趣。尤其是，发现乳杆菌属或双歧杆菌属的特定菌株能够在肠粘膜集群，并辅助维持宿主健康。这类细菌通常被称为益生菌或益生菌剂。
益生菌
益生微生物已经被定义为“在足量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FAO/WHO 2002)。
尽管已经鉴别很多益生菌(尤其是乳杆菌属或双歧杆菌属菌株)，然而大量的研究也表明参考其系统分类并不能准确地预测益生菌。而相反地，每一菌株应当分别评价。研究也表明即使是密切相关的益生菌也可能对健康产生相当不同的影响。
然而，清楚的是，大部分鉴别的益生菌除了其健康有益效果之外，具有一些额外的特征。
抗胆汁酸
通常认为，益生菌剂发挥其对肠道上皮的有益效果的先决条件是足量的活益生菌存在。进入肠上部后，益生菌接触高水平的胆汁盐。因此，最重要的是益生菌抗胆汁酸。
肠屏障功能
肠屏障功能在粘膜与外界的交界处调节运输和宿主防御机制。细胞间和旁细胞流受到膜泵、离子通道和紧密联结的严密调控，调节渗透性至生理需求。任何水平的干扰、特别是由于增加渗透性引起的细菌易位和由于受损上皮细胞和T细胞相互作用引起的口腔耐受性破坏，可以导致炎症和组织损伤。
上皮屏障抑制诸如LPS及其他炎性化合物的高分子量物质从肠腔侧进入循环系统。
紧密联结引起该上皮屏障的功能之一。紧密联结或闭合带是膜连接在一起形成对液体实质上的非渗透屏障的两个上皮细胞的紧密结合区域，其将血管系统与消化道腔相分离。因此，已经证明，降低所述紧密联结屏障功能导致不需要的物质诸如LPS由肠腔进入循环系统的侵入增加。相反地，预期诱导紧密联结屏障功能引起不需要的物质诸如LPS的侵入减少。
胞外多糖和生物膜形成
尽管存活对于粘附和集群能力(即生物膜形成)是重要的，但是它也被认为是益生菌发挥它的有益效果所需的一个重要的促成因素，无论它是通过免疫调节、病原体排除或与粘膜的接触增强(1)。
很多细菌在生物膜发生中的重要特征是粘液样物质，已知为胞外多糖(EPS)或胞外基质。胞外多糖是包括乳杆菌属和双歧杆菌的很多细菌表面上存在的胞外聚合物(2)。EPS形成粘液层，其松弛地附着于细胞表面或分泌到环境中(3)。
通过比较非EPS产生菌和EPS产生菌等基因变体研究了这些分子的生理功能。表明细胞结合EPS保护细菌抵御噬菌体和细胞壁降解酶(4)。最近，Mao等人发现，由大肠杆菌菌株产生的胞外多糖增强该菌在模拟胃肠流体中的存活(5)。这些发现表明，某些细菌产生的胞外多糖事实上可能对于它们在肠中生存是必不可少的。
可用于乳业制备诸如酸奶的发酵乳品的菌株很重要的技术特征是其在发酵乳品的流变学和质地改善中的用途(30)。在很大程度上菌株的结构特征与EPS的产生相关(30)。尽管这是重要的技术特征，EPS很可能由于其特定的化学结构对接受者产生有益的健康效果。
已经显示，乳酸菌所产生的一些种类的EPS对于人类健康具有有益效果，例如降低胆固醇的能力(6)、免疫调节活性(7；8)、对胃肠粘液的微生物粘附(9；10)、抗氧化剂和自由基清除活性(11)以及益生(双歧(bifidogenic))作用(12)。
近来，已经表明，产生高水平EPS的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)显著降低结肠炎的鼠模型中炎症的严重性(13)。因此，看起来清楚的是高产量特定EPS可能与益生菌的免疫调节作用有关。
涉及肠微生物群的胃肠并发症
炎症是先天免疫系统的复杂反应，涉及在侵染、毒素暴露或细胞伤害位点处的白细胞和血浆蛋白质的累积和活化。尽管炎症在控制感染和促进组织修复中起到防护功能，其也会引起组织损伤和疾病。胃肠机能紊乱诸如炎症性肠病(克罗恩病)、溃疡性结肠炎和过敏性肠综合征是自发性炎症。涉及胃肠炎症的其它疾病为隐窝炎、食物过敏、和食物过敏引起的异位性皮炎(14-16)。
克罗恩病和溃疡性结肠炎在北欧、英国和北美洲最为流行，其中每100,000达500人受影响。虽然这些疾病具有不同的病因学，但均涉及机能紊乱的粘膜免疫系统对土著菌群及其他腔抗原的不当响应(6)。这些紊乱的急性治疗依赖于抗生素和抗炎药，而在严重病例中，手术则是必要的。长期的治疗包括生活方式改变、饮食调整和停止吸烟(7)。已经表明益生菌通过对胃肠上皮和粘膜免疫系统发挥正效应而延长免于这些病症(8)。
过敏性肠综合征(IBS)影响7-31％的已经克服由于沙门氏菌属、弯曲杆菌属或志贺氏菌属感染导致的感染性胃肠炎患者。具有腹泻但不具有感染性起始的IBS可以在经历“不利”生活事件的个体中发生(17)。尽管临床试验表明在IBS中益生菌的效力变化大，但是双盲安慰剂对照研究已经表明，某些益生菌的混合物可对IBS具有有益效果(18-20)，因此突出了识别新的益生菌的重要性。
益生菌剂的免疫调节效应
已经表明，益生菌具有减轻具有胃肠炎性并发症如克罗恩病和溃疡性结肠炎的患者症状的能力(21；22)。具体地说，双歧杆菌已经被描述为在胃肠疾病的预防和治疗中具有潜力的益生菌，如EP 1 688481、EP 0 199535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903和WO 00/53200所述。
EP 0 768 375(Nestle SA)描述了双歧杆菌属的具体菌株，其能够埋入肠内菌丛并能够竞争性地排除病原菌粘着至肠细胞。据报道，这些双歧杆菌帮助免疫调节并因此帮助个体健康的维持。双歧杆菌的免疫调节效应甚至可赋予未出生的儿童。WO 01/97822例如描述了通过母亲摄入动物双歧杆菌属(Bifidobacterium animalis)菌株BB-12
Figure BPA00001293634700041
减少了儿童中特应性疾病的发生。此外，WO 03/099037(Nestec SA)描述了动物双歧杆菌属菌株BB-12
Figure BPA00001293634700042
能够有利地调节免疫反应。
尽管已经描述了相当多的具有抗炎性质的双歧杆菌属菌株，但只有少数菌株已经被报道在体内有效治疗实验诱导的肠炎。
WO04052462A1(B.Pot，Danisco A/S)描述了某些两歧双歧杆菌和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)菌株能够在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症的严重性。
WO2007/09369A1(Nestec SA)描述了长双歧杆菌菌株BL999(ATCCBAA-999)在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症的严重性。
EP 1688481和EP 1141235B(University College of Cork)描述了婴儿长双歧杆菌菌株UCC35624在结肠炎的鼠模型中减少炎症的严重性。
Foligne等(2007)描述了在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症严重性的三种双歧杆菌。
然而，这些文件对于EPS产生、菌株的EPS组成、紧密联结的强度都并未描述，并且，除了EP1688481之外，对于双歧杆菌属菌株的胆汁酸抗性也没有描述。
由于即使是密切相关的益生菌也对健康产生颇为不同而特定的效应，因此对新的益生菌存在持续的需求，包括能够调理炎性肠疾病、抗胆汁酸和由于高水平的EPS而能够集群于肠的新的抗炎双歧杆菌属菌株。
发明概述
本发明出乎意料地发现：特定长双歧杆菌菌株综合了胆汁抗性、改善肠屏障功能和体内大量产生具有优异抗炎性的胞外多糖这些重要的益生特征。
特别地，本发明人出乎意料地鉴别了长双歧杆菌的一个特定益生菌株，即长双歧杆菌DSM 21062，其综合了所有上述重要的益生特征。
预期直接来源于该益生菌的菌株很可能保持其益生特征。
因此，在第一方面，本发明涉及长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其可用于益生菌剂，耐受胆汁盐，产生高量的胞外多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗炎效应，其特征在于所述菌株为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变株，其中所述突变株通过使用保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。
如在实施例中表明，长双歧杆菌DSM 21062菌株在体内具有一些非凡的免疫调节性能，表明其可以有效防御多种疾病。因此，在第二方面，本发明涉及包含长双歧杆菌DSM 21062细菌细胞或其突变株的组合物用于制备药物的用途。
特别地，所述菌株可用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎性病症的药物。
许多益生菌剂用于制备食品或饲料产品；因此，本发明的另一重要方面是提供包含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的人类或宠物食物组合物。
当制备所述食品或饲料产品时，制造商通常使用用于加工食品和饲料产品的所谓的起子培养物。起子培养物广泛用于乳品业。一般地，起子培养物给予各种食品或饲料产品特定的特征。沿用已久的事实是稠度、质地、主体和口感与用于制备所述食品或饲料的起子培养物的EPS产生强烈地相关。因此，本发明的另一方面是包含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的起子培养物组合物，优选地其中所述起子培养物组合物具有以下浓度的活细胞，所述浓度的范围为每克所述组合物104至1012CFU。
本发明也设计一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括：向食品或饲料产品起始材料添加包含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的起子培养物组合物，并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下。
由实施例可见，长双歧杆菌DSM 21062不仅产生高量的胞外多糖，也产生相当不常见类型的EPS，该EPS通常富含甘露糖和葡萄糖残基。
众所周知，一些类型的EPS涉及对人类健康的特定效应(6)、(9；10)、(11)、(12)。因此，本申请考虑，长双歧杆菌DSM 21062EPS异常结构可能参与甚至负责由该菌株产生的独特免疫调节效果。因此，另一个方面，本发明涉及由长双歧杆菌DSM 21062或其突变株分离的多糖。包含所述长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的多糖的药物组合物也是本发明的一方面。
进一步考虑，长双歧杆菌DSM 21062的EPS的独特结构可能通常涉及炎性疾病。先前表明，当施用于哺乳动物时，含有甘露糖的复杂聚合物(甘露聚糖)具有显著的生物学活性。因此，在本发明的一方面，长双歧杆菌DSM 21062细胞或所述细胞的部分通常用于治疗炎性疾病。特别地，本发明涉及一种治疗炎性疾病的方法，其特征在于向需要治疗的人施用有效量的包含多糖的组合物，所述组合物包含获得自DSM 21062或DSM 21062的突变株的EPS。
定义
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供与本发明的主要方面相关的特定术语的定义。
本文中所用的术语“胞外多糖”指高分子量聚合物，其由通过微生物分泌到周围环境中的糖残基组成。
表达“益生菌剂(probiotics或probioticum)指的是包含益生微生物的组合物。益生菌定义为对宿主的卫生和健康具有有益效果的微生物细胞。益生微生物已经被定义为“在足量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FAO/WHO 2002)。
表达“益生元”指增加肠内益生菌的数量的组合物或组合物的组分。因此，益生元指任何由土著菌在结肠中特别发酵的任何非活的食品组分，认为其具有积极价值，例如，双歧杆菌属，乳杆菌属。联合施用益生菌与一种或多种益生化合物可以提高施用的益生菌剂在体内的生长，产生更加显著的健康益处，称为协同益生(symbiotic)。
表达“相对富含甘露糖残基的EPS”指其中甘露糖是存在的至少第二最丰富种类的单糖的EPS。
表达““Glu-N∶甘露糖比”指葡糖胺(Glu-N)和甘露糖的量之间的比。
表达“相对富含葡萄糖残基的EPS”指其中葡萄糖是存在的最丰富种类的单糖的EPS。
表达““Glu-N∶葡萄糖比”指葡糖胺(Glu-N)和葡萄糖的量之间的比。
仅通过例举的方式，如下描述本发明的实施方案
发明详述
本发明旨在鉴别一种新的益生菌株，其可用于预防、减轻或治疗与炎症、尤其是肠炎相关的紊乱、病症或疾病。
这里，我们第一次描述了益生长双歧杆菌菌株，其特征在于：耐受胆汁盐，产生大量胞外多糖(EPS)，加强体外上皮细胞的紧密联结，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗炎效应。
在本发明的优选实施方案中，所述长双歧杆菌菌株是长双歧杆菌菌株(DSM 21062)。
根据国际承认用于专利程序的布达佩斯条约，所述益生长双歧杆菌菌株DSM 21062于2008年1月23日保藏于德国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig。
实施例1表明长双歧杆菌菌株(DSM 21062)能够在实验结肠炎小鼠模型中预防炎症。从图1可见，长双歧杆菌菌株(DSM 21062)对TNBS诱导的结肠炎的防护效应明显好于其它测试菌株的效应。用DSM 21062处理的小鼠的宏观炎症分数(macroscopic inflammation score)(Wallace分数)为2.85+/-0.52，而该分数高于其它菌株(菌株9555 3.5+/-0.53；菌株9553：3.55+/-0.58，菌株：8773：4.75+/-0.77，菌株8818：4.0+/-0.58)。TNBS参照的平均Wallace分数为5.15+/-0.62，而防护的阳性对照(泼尼松龙)为高度防护性的，平均Wallace分数为2.35+/-0.31。在健康小鼠中没有检测到炎症迹象(Wallace分数0.5赋予所有乙醇-处理的小鼠)。
Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TEER)使得能够测量与紧密联结破坏相关的旁细胞离子流变化(Velarde et al.(1999)Toxicology in Vitro 13，723-727)，因此该测定可用于定量益生菌对紧密联结的保护效应。在实施例6中，表明长双歧杆菌菌株(DSM 21062)在其响应于紧密联结破坏性癸酸钠(C10)时减少Caco-2细胞层跨上皮电阻(TEER)降低的能力优于其它益生菌。不囿于理论，我们预期紧密联结强度与肠屏障功能和肠上皮的紧致度正相关，因此可能当采用小鼠(TNBS)诱导的结肠炎模型时与上皮的响应相关。
所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)在所述研究中进一步产生与其它菌株相比大量的EPS。DSM 21062在实施例2所描述获得的并通过HPLC在PA10柱(高pH阴离子交换色谱法)测量的EPS提取物中产生至少3mg/ml，诸如超过5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更多。
然而，EPS的量和实际组成对于其功能皆是重要的。先前表明，当施用于哺乳动物时，含有甘露糖的复杂聚合物(甘露聚糖)具有显著的生物学活性。这包括活化免疫系统，然后将甘露糖结合于识别分子例如在巨噬细胞和树突细胞上表达的甘露糖受体(CD206)(23-25)。近来已经表明甘露糖受体为新疫苗的靶标，不仅用于使免疫防御针对癌症和传染病，也用于在自身免疫性疾病的治疗中特异性诱导耐受性(26)。肠树突细胞(DC)被认为取样并呈递共生菌至肠相关免疫系统(27)并表明具有高含量甘露糖的EPS能够调节对肠微生物群落的免疫反应。已经表明来自真菌的EPS具有免疫刺激和抗肿瘤效应，并且来自这些真菌的EPS含有甘露糖(28；29)。就我们所知，尚未教导真菌EPS选择其免疫刺激效应的机制是通过与甘露糖结合受体的相互作用，我们考虑，情况正是如此。因此，认为本发明长双歧杆菌菌株(DSM 21062)的重要特征在于其产生相对富含甘露糖残基的EPS，例如测得Glu-N∶甘露糖比为40或更高，例如超过50甚至60或更高。如表II所表明的，甘露糖残基的绝对量也显著高于其它研究的细菌。而且，分析DSM 21062产生的EPS显示其还出乎意料地富含葡萄糖残基。所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS，例如，测得Glu-N∶葡萄糖比为50以上，例如超过100，或者甚至180以上。葡萄糖残基的绝对量也出乎意料地高。
这显示所述长双歧杆菌菌株(DSM21062)产生具有独特的化学组成的EPS。预期这些独特的EPS至少部分负责所述菌株的有益效果，因此从所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)或其突变分离的多糖可用于配制包含所述多糖的益生元或药物组合物，其可用于预防、减轻或治疗各种炎性疾病或病症。正如所述，所述菌株EPS的甘露糖残基的高量和葡萄糖残基的量被认为是显著的。我们相信，特别是分离自菌株DSM 21062(或其突变体)并相对富含甘露糖和葡萄糖残基的多糖制备物将证明特别地有效。然而，任何这里提及的包含任一所述多糖的益生元或药物组合物为本发明的一种实施方案。
如实施例4表明，所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)进一步能够抑制致病菌株的生长。该实施例表明该菌株能够抑制选自以下的菌株：单核细胞增多性利斯特菌、沙门氏菌ssp、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
值得注意的是，长双歧杆菌菌株(DSM21062)能够抑制致病菌株的生长，因为产生除了有机酸之外的抗微生物物质对于双歧杆菌属菌株而言是罕有的。只分离了少数能够产生过氧化氢和热稳定蛋白质抗菌化合物的菌株(30)。EP1688481(Univ.College of Cork)描述了一种具有抗微生物活性的婴儿长双歧杆菌。该菌株的抗微生物活性可能是由于产生了乙酸和乳酸，因为进行的测定不涉及pH调节。我们已经开发了评价来自益生菌株长双歧杆菌DSM 21062、CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773和CHCC8818的pH调节条件培养基的抗微生物活性的测定。在该测定中，长双歧杆菌DSM 21062在抑制病原体生长上明显优异，该效应与EP 168848中描述的婴儿长双歧杆菌菌株相反，不是由于产生乙酸或乳酸，该测定表明长双歧杆菌DSM 21062通过独特的机制发挥其抗微生物效应。
TNBS诱导的结肠炎导致小鼠重量显著损失，这可以通过DSM 21062抵消至一定程度，但不能通过其它细菌处理实现。
因此，在一实施方案中，本发明的菌株特征在于，接受所述菌株的动物经历的由于TNBS诱导的结肠炎引起的重量损失显著小于(在p＝0.1水平)接受对照菌株的动物的重量损失。
由上清楚的是DSM 21062可以用于制备药物。实施例1表明，DSM 21062可用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎性病症的药物。人体胃肠道炎症的实例包括过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾、斑疹伤寒症和与食物过敏相关的肠炎。在本发明的一实施方案中，DSM 21062用于制备预防、减轻或治疗任何这些病症的药物。
在另一方面，本发明涉及包含DSM 21062或其突变株的人类或宠物食物组合物。优选，所述细菌可以作为添加剂施用至正常的饮食或者作为营养完全人类或宠物食物的组分。剂型可以是液体或固体。在后一情况下，所述产品可以粉末化并形成片剂、颗粒或胶囊，或者简单与其它食物组分混合，形成功能性食品。
本发明的食品组合物可以是使用DSM 21062或其突变株产生的任何可摄取的材料，选自乳、凝乳、乳基发酵产品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、乳基粉末、乳浓缩物、乳酪、涂抹干酪、调味品、饮料、冰淇淋、发酵的基于谷物的产品、婴儿配方、片剂、液体细菌悬液、干口服添加剂、湿口服添加剂、干管道饲喂或湿管道饲喂。
在进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含药学可接受载体。本文中所用的术语“药学可接受载体”是指适于施用于人类或动物并且与所述益生活性有机体相容的一种或多种固体或液体填充稀释剂或囊化物质。术语“相容的”涉及能够与DSM 21062或其突变株混合的药物组合物组分，混合的方式使得在正常使用条件下没有会实质上降低选择用于本发明的有机体的益生效能的相互作用。药学可接受载体必须具有足够高的纯度，并且足够低的毒性，使得其适于施用于被处理的人类和动物。
本文中所述的固体组合物优选为片剂、胶囊或颗粒(包括许多颗粒)。优选所述固体组合物为口服剂型。常规配制技术的综述可以在例如“The Theory and Practice of Industrial Pharmacy”中找到(31)或(32)。因此，所述片剂可以通过本领域已知的方法制备，并且可以是压缩的、肠包衣的、糖包衣的、膜包衣的、或多次压缩的，含有适宜的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、粉末化剂、流动-产生剂和熔化剂。具有液体或固体内含物的胶囊(软胶囊和硬胶囊)可以根据制药工业公知的常规技术进行制备。作为一个实例，可以使用适宜的填充机将益生活性有机体填充至明胶胶囊中。本文中所述的固体组合物也可以是丸。
所述人类或宠物食物组合物或剂型应当如上所述至少包含DSM 21062或其突变株，从而每一个体可获得的两种菌株之一的量为约103-1014CFU/天，诸如106-1013CFU/天，包括108-1012CFU/天，或甚至109-1011CFU/天。该量取决于个体重量，优选对于人类为约109-1012CFU/天，对于宠物为107-1010CFU/天。然而，会理解，对于任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、健康概况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度、药物联合以及进行治疗的特定疾病的严重程度。
在进一步的实施方案中，所述人类或宠物食物组合物或营养增补剂剂型进一步包含一种或多种益生物质。适宜的益生物质的实例为低聚果糖(FOS)和菊糖。然而，也考虑从DSM 21062的细菌细胞获得的其它益生物质，诸如低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)、甚至多糖组合物。
微生物参与包括大部分乳品的食品和饲料产品的制备。细菌培养物，尤其是通常分类为乳酸菌的细菌培养物在制备所有发酵乳品、乳酪和黄油中必不可少。这些微生物的培养物经常被经常称为起子培养物，并通过行使多种功能赋予各种乳制品特定特征。为了使所述起子培养物发挥其功能，必不可少的是它包含足量的活细胞。因此，本发明的一个实施方案是包含活长双歧杆菌DSM21062或其突变株的起子培养物，并且优选其中所述起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物104至1012CFU的范围内。
起子培养物通常用于通过根据食品或饲料产品起始材料添加起子培养物组合物并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下来制备食品或饲料产品。在优选的实施方案中，所述食品为乳基产品，诸如乳酪、酸奶、黄油，或者液体发酵乳产品，诸如例如酪乳或饮用酸奶。特别优选本发明用于制备牛乳产品的用途。
尽管益生效应与活细胞相关，很多报道已经显示死的或失活的细菌也可以具有独特的有益健康性能。因此，在本发明的一个实施方案中，死的或灭活的长双歧杆菌DSM 21062或其突变株或所述细胞的部分用于治疗炎性疾病。尤其是，此类细胞或者此类细胞的部分被考虑用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物，诸如过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、与食物过敏相关的肠炎、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾或斑疹伤寒症。
以权利要求的形式呈现本发明
本发明的优选方面和实施方案可以所谓的权利要求的形式呈现。这些如下给出。
1、长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其可用作益生菌剂，耐受胆汁盐，产生大量胞外多糖(EPS)，加强体外紧密联结，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗炎效应。
2、权利要求1的菌株，其中计算为(100x(平均Wallace分数“TNBS-阳性对照组-平均Wallace分数“处理”组)/平均Wallace分数“TNBS-阳性对照组”)的“％相对防护”为35％或更高，诸如40％，或者甚至43％或更高。
3、前述权利要求任一项的菌株，其中当EPS根据实施例2的方法分离时，所述菌株产生至少3mg/ml，诸如超过5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更高。
4、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含甘露糖残基的EPS，测得Glu-N∶甘露糖比为40或更高，例如超过50，或者甚至60或更高。
5、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS，测得Glu-N∶葡萄糖比为50或更高，例如超过100，或者甚至180或更高。
6、根据前述权利要求任一项的菌株，其中共培养Caco-2细胞(ATCC HTB-37)的体外培养层与所述细菌菌株引起Caco-2细胞层的紧密联结统计上显著的加强，所述紧密联结测量为所述Caco-2细胞层在暴露于紧密联结破坏剂癸酸钠后所述Caco-2细胞层的跨上皮电阻。
7、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株还能够抑制致病菌株的生长。
8、根据权利要求7的菌株，其中所述致病菌株选自单核细胞增多性利斯特菌、沙门氏菌ssp、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
9、根据前述权利要求任一项的菌株，其中接受所述菌株的动物由于TNBS-诱导的结肠炎经历重量损失，该重量损失小于接受对照菌株的动物的重量损失。
10、根据前述权利要求任一项的菌株，其为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变株，其中所述突变株通过使用该保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。
11、包含根据前述权利要求任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于制备药物的用途。
12、包含根据权利要求1至10任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物的用途。
13、权利要求12的用途，其中所述炎症选自以下病症组成的组：过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾、斑疹伤寒症和与食物过敏相关的肠炎。
14、人类或宠物食物组合物，其包含至少一种权利要求1-10任一项的细菌细胞的菌株。
15、一种起子培养物组合物，其包含权利要求1至10任一项的细菌细胞，优选其中所述起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物104至1012CFU的范围内。
16、一种制备食品或饲料产品的方法，该方法包括将根据权利要求15的起子培养物添加到食品或饲料产品起始材料中并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下。
17、权利要求16的方法，其中所述食品是乳，优选牛乳。
18、从权利要求1至10任一项的长双歧杆菌菌株分离的多糖。
19、权利要求18的多糖，其相对富含甘露糖残基，测得Glu-N∶甘露糖比为40或更高，例如超过50，或者甚至60或更高。
20、权利要求18的多糖，其相对富含葡萄糖残基，测得Glu-N∶葡萄糖比为50或更高，例如超过100，或者甚至180或更高。
21、权利要求18的多糖，其根据权利要求17和18相对富含甘露糖和葡萄糖残基两者。
22、药物组合物，其包含权利要求18至21任一项的多糖。
23、权利要求1-10任一项的细菌细胞或所述细胞的部分用于治疗炎性疾病的用途。
24、前述权利要求23的用途，其中所述疾病为过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、与食物过敏相关的肠炎、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾或斑疹伤寒症。
25、治疗炎性疾病的方法，其特征在于向需要治疗的人施用有效量的前述权利要求任一项的包含多糖的组合物。
在以下非限制性实施例和附图中进一步阐明本发明，其中：
图1：(A)TNBS诱导的结肠炎的宏观炎症评价，表示为Wallace分数。以细菌处理的小鼠与单独接受TNBS或假治疗的小鼠相比较。(B)TNBS诱导的结肠炎的宏观炎症评价，表示为％防护，与单独接受TNBS或假治疗的小鼠相比较。*表明防护显著不同于假治疗，p≤0.05；**p≤0.01的统计显著性水平；***p≤0.002的统计显著性水平；(*)不显著(t检验)。误差棒指示1x平均标准误差。
图2：没有细菌处理可以减轻重量损失，除了菌株DSM 21062，其中注意到减少体重损失的正趋势(12.4％+/-1.6，p＝0.09)。防护的阳性对照(泼尼松龙)在减轻重量损失方面非常显著。(4.75％+/-1.25，p≤0.001)。***表明防护显著不同于假治疗，p≤0.001。
图3：MPO测定证实在发炎组织中，特别是对于TNBS对照组，嗜中性白细胞的大量渗入(12.56+/-3.75)，与“健康小鼠”不同，其中仅测到非常微弱的活性(1.75+/-0.07)。通过类皮质激素调节进行防护显著降低了该参数(4.21+/-0.96)。发现所有细菌处理组的平均值均远在阳性对照值之下，然而没有观察到显著降低。表现出最佳的降低的菌株为菌株DSM 21062(p＝0.07)。误差棒指示1x平均标准误差。
图4：通过当等量的细菌生物质沉淀时形成的球团粒度所表明的长双歧杆菌DSM 21062、瘤胃乳杆菌菌株CHCC8818和干酪乳杆菌菌株CHCC8773的蓬松性。
图5：测量穿过Caco-2细胞汇合层的跨上皮电阻。“无处理”为既未用C10亦未用益生菌剂处理的Caco-2细胞层，“C10”为仅用C10处理的细胞层。益生菌剂处理(Bb-12，CRL-431，La-5和DSM 21062)细胞层，然后以C10挑战，示于四个右侧的柱)。误差棒指示1x平均标准误差。**表示p≤0.01的统计显著性水平，***p≤0.001的统计显著性水平(t检验)。
实施例：
实施例1：体内分析长双歧杆菌DSM 21062的抗炎潜能
培养条件和所用菌株
在本研究中使用以下菌株：长双歧杆菌菌株DSM 21062(CHCC8879)。菌株瘤胃乳杆菌菌株CHCC8818、干酪乳杆菌菌株CHCC8773、两歧双歧杆菌菌株CHCC9555和两歧双歧杆菌菌株CHCC9553用作对照菌株。菌株CHCC8818、CHCC8773、CHCC9555和CHCC9553为在产生本发明的筛选过程中鉴定和研究的Chr.Hansen培养物收集的4个推定的益生菌株。
乳杆菌属于37℃培养于MRS肉汤(Difco，BD Diagnostics，Sparks，MD，USA)。使用Anaerocult A培养袋(Merck，Darmstadt，Germany)于37℃ MRS肉汤+0.05％半胱氨酸氢氯化物中培养双歧杆菌。
对于每一菌株，在生长曲线以及琼脂培养基上细菌计数的基础上建立了OD600nm/CFU(集落形成单位)对应关系。
关于动物实验，每日将500μl各菌株从不同的储瓶接种到50ml相应的生长培养基中，以确保最后的细菌计数＞1010CFU。
离心培养物，在PBS中洗涤，并在将所述细菌施用于动物前再悬浮于足够体积的缓冲液中。
TNBS诱导的结肠炎和炎症记分
描述用于炎性标记的模型和测定的方案对应于标准方法，先前描述于(33)。简言之，通过胃内途径每日给予10只小鼠的组别或者碳酸盐缓冲液(“TNBS阳性对照”)或者新鲜培养的1x109活细菌(“处理”)，连续进行5日。此外，以10mg/kg的泼尼松的商业制备物(Cortancyl，Sanofi Aventis，France)处理10只小鼠的组，在施用TNBS前口服5日，并在TNBS处理后口服连续2日(“阳性防护对照”)。
通过直肠内施用50％乙醇中50μl TNBS溶液(Sigma-Aldrich Chemical)诱发急性结肠炎。施用100mg/kg TNBS在所用的BALB/c小鼠中引起中度严重的肠炎。10只小鼠的组也被给予碳酸盐缓冲液，但是仅接受50μl的50％乙醇溶液(无TNBS；“阴性”(健康)对照″)。接下来每日监测动物的体重减轻。诱导结肠炎2日后，处死小鼠。研究设计示于表I。在小鼠解剖后，两位独立的观察者在不知情的情况下以Wallace尺度对结肠的宏观炎症进行计分(34)。如前所述，％相对防护计算为100x(平均Wallace分数“TNBS-阳性对照”组-平均Wallace分数“处理”组)/平均Wallace分数“TNBS阳性对照组”。
公布时缺失
表I：体内TNBS诱导的结肠炎的研究设计(i.r.＝直肠内施用，i.g.＝胃内施用)
Figure BPA00001293634700161
髓过氧化物酶测定
根据Bradley等，1982，在邻近的结肠组织中测量酶MPO(多形核白细胞嗜中性初级粒子的标记物)的活性(35)。处死后，立即从盲肠-结肠连接3cm处提取结肠样品(1cm长)。将样品悬浮于磷酸钾缓冲液(50mmol/L，pH 6.0)，并使用Polytron在冰上匀浆。进行三个冻融循环。然后于4℃以10,000g离心悬浮液15min。弃去上清液，在六癸基三甲基溴化铵缓冲液(HTAB 0.5％，w/v，在50mmol/L磷酸钾缓冲液中，pH 6.0)中重悬浮团块，HTAB为诱导MPO从多形核白细胞嗜中性初级粒子释放MPO的去垢剂。冰上超声处理这些悬浮液，然后于4℃再次离心15min。在含有0.167mg/ml的邻联茴香胺二盐酸化物和0.0005％过氧化氢(H2O2)的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中稀释所得的上清液。来自人类嗜中性白细胞的MPO(0.1U/100mL，Sigma)用作标准物。在450nm处吸光度变化经5min和10min以微板分光光度计进行记录。MPO活性表示为MPO的国际单位/cm肠。一个单位的MPO活性定义为在25℃每mL每min降解1mmol过氧化氢的MPO的量。
统计分析
通过非参数单向方差分析，MannWhitney U检验(XLSTAT软件：http://www.xlstat.com)分析结果。当p值＜0.05时差异被判断为是统计上显著的。
结果
TNBS-诱导的炎症产生具有中度严重性的结肠炎，对于TNBS参照导致5.15的平均Wallace分数，而在健康小鼠中未能够检测到炎症的迹象(对于所有乙醇处理小鼠，赋予0.5的Wallace分数)。防护的阳性对照(泼尼松龙)是高度防护性的，具有2.35的平均Wallace分数(相当于54.4％的防护，p＝0.002)(参见图1A和B)。
长双歧杆菌菌株DSM 21062(CHCC8879)防护TNBS诱导的伤害达44％(p＝0.007)，明显优于其它双歧杆菌菌株(CHCC9555；CHCC9553)，其防护分别为32％和31％。
菌株CHCC8773和CHCC8818没有引起显著的防护(分别7.76％和22.3％)。
诱导的结肠炎(100mg/kg TNBS)可以定义为中度严重，对于阳性对照组没有死亡且体重损失15.4％+/-1.77％。诱导结肠炎两日后体重损失示于图2。
没有细菌处理可以减轻重量损失，除了菌株DSM 21062，其中注意到减少体重损失的正趋势(12.4％+/-1.6，p＝0.09)。防护的阳性对照(泼尼松龙)在减轻重量损失方面非常显著(4.75％+/-1.25，p＜0.001)。
MPO活性测量示于图3。MPO测定证实在发炎组织中，特别是对于TNBS对照组，嗜中性白细胞的大量渗入(12.56+/-3.75)，与“健康小鼠”不同，其中仅测到非常微弱的活性(1.75+/-0.07)。通过类皮质激素对照的防护显著降低了该参数(4.21+/-0.96)。
发现所有细菌处理组的平均值均远在阳性对照值之下，然而没有观察到显著降低。表现出最佳的降低的菌株为菌株DSM 21062(p＝0.07)。
实施例2：菌株的EPS纯化、定量和组成
培养条件
乳杆菌属于37℃在200ml MRS中培养24-48小时。使用Anaerocult A培养袋(Merck)于37℃在200mlMRS肉汤+0.05％半胱氨酸氢氯化物中培养双歧杆菌24-48小时。
EPS纯化
EPS纯化基本上如(36)所示进行。简言之，在培养200ml细菌培养物后，向所述培养物加入三氯乙酸至终浓度4％。通过离心并将上清液通过0.2μm过滤器除去细胞和蛋白质。通过添加等体积的冰冷乙醇沉淀EPS。通过离心收集沉淀，并将EPS再溶于纯化水。
单糖组成和浓度
通过高pH阴离子交换色谱法(HPAEC)进行纯化的EPS的单糖组成分析，如(3)所述。简言之，将纯化的EPS溶液与4M TFA(50％体积/体积)混合，并于100℃水解2小时。通过在冰水中冷却30min终止该反应。使用吹氮来干燥样品，然后在ddH2O中再悬浮至初始体积。采用的HPAEC法使用果糖作为内标来提供葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖-胺、半乳糖-胺、甘露糖和葡糖醛酸的浓度(以ppm表示)。固定相为设计用于定量测定单糖和二糖的Carpopac(PA10)柱。在Carbopac柱前放置氨基阱柱(amino trap column)以从所述样品保留氨基酸，并将硼酸盐阱柱放置在注射阀前的洗脱液流中。全部仪器来自于Dionex公司。流动相由三种洗脱液组成：以NaOH(200mM)、NaAc(300mM)和ddH2O，梯度应用。
基于分析物的响应相对于在样品制备中被加到样品和标准物的内标的响应来计算单糖浓度。
结果
从各菌株纯化的EPS的单糖组成分析表明菌株DSM 21062特征在于与产生低于1.97mg/ml的其它菌株相比表达高浓度的EPS(7.7mg/ml)。而且，来自DSM 21062的EPS独特地具有葡萄糖和甘露糖水平比其它菌株分别高10倍和1.8倍的特征(参见表II)。
公布时缺失
表II：通过HPLC在PA10柱(高pH阴离子交换色谱法)测得的纯化的EPS的浓度和组成。(Fuc：岩藻糖，Rham：鼠李糖，Glu-n：葡萄糖胺，Gal-N：半乳糖胺，Gal：半乳糖，Man：甘露糖，H-Glu：葡糖醛酸)。
Figure BPA00001293634700201
实施例3：菌株膨松度和稠度
菌株膨松度
如上所述培养所述菌株。各菌株的光密度调节至4.04(600nm处OD)，即，调节到等量的细菌生物质。然后在15ml锥形管中以2400xg将10ml菌株DSM21062、CHCC8773和CHCC8818离心15min。
结果
菌株DSM 21062、CHCC8773和CHCC8818的团块高度分别为16、5和4mm(参见图4)。DSM 21062的膨松度证实该菌株产生大量的胞外多糖，并且也可能产生荚膜多糖。
菌株稠度
如上所述培养所述菌株。各菌株的光密度调节至4.04(600nm处OD)。使用标准C25浮子和杯几何学(直径2.5cm)在Stresstech Rheometer(Rheologica AB，Lund，Sweden)上进行流变性测量。在恒温室(thermo chamber)中将样品调节温度至13℃，并于该温度进行分析。以300s-1的剪切速率测量剪切应力。
结果
尽管全部菌株具有低粘度，菌株DSM 21062与CHCC8773和CHCC8818相比具有略微提高的粘度(参见表III和图4)。
表III：DSM 21062、CHCC8773和CHCC8818的剪切应力和粘度。
  菌株   剪切应力(Pa)  粘度(mPa s)
  DSM 21062   0.82  2.7
  DSM 21062   0.83  2.8
  CHCC8773   0.79  2.6
  CHCC8773   0.79  2.6
  CHCC8818   0.78  2.6
  CHCC8818   0.75  2.5
实施例4：抑制病原体生长
如实施例1所述，在MRS培养基中培养益生菌剂分离物(CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773、CHCC8818和DSM 21062)3天。病原体金黄色葡萄球菌和单核细胞增多性利斯特菌的生长培养基为BHI-肉汤(Difco，BD Diagnostics，Sparks，MD，USA或Oxoid Limited Hampshire，UK)而对于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，生长培养基为LB肉汤(Difco，BD Diagnostics，Sparks，MD，USA或Oxoid Limited Hampshire，UK)。病原体培养物获自Oxoid Limited Hampshire，UK。
通过离心回收来自益生菌剂培养物的条件培养基。所述条件培养基pH调节至pH 6.5-6.7，并存储于4℃直到使用。早晨从冷冻甘油储液或冻干接种环接种所述病原体培养物。当OD600达到0.2或更高时，一式三份将病原体培养物加入有或者没有益生菌剂条件培养基的微量滴定板。通过在微量滴定板阅读器中测量OD600，每30min监测所述病原体的生长。计算(最小二乘法)并比较生长曲线的斜率(1-3.5小时)，以表示上清液的抑制。阳性对照(益生菌株La-5和CRL-431均可获自Chr.Hansen A/S，Hoersholm，Denmark)、阴性对照(MRS pH 6.5)和酸对照(MRS pH 4.2)包括在每个微量滴定板上。
结果
结果表示为百分比，将阳性对照(没有任何抑制上清液的病原体)的斜率定义为100％。尽管一些菌株没有影响病原体生长乃至提高病原体生长，但菌株DSM 21062与菌株CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773和CHCC8818相比抑制病原体生长是优异的(参见表VI)。
表VI：在来自益生菌剂培养物的条件培养基存在下病原菌的生长没有抑制生长定义为100％。(E.coli：大肠杆菌，S.aureus：金黄色葡萄球菌，L.mono：单核细胞增多性利斯特菌，S.typh：鼠伤寒沙门氏菌)。
  菌株   E.coli(％)   S.aureus(％)   L-mono.(％)   S.typh.(％)
  CHCC9555   101   80   86   80
  CHCC9553   85   76   74   81
  CHCC8773   97   75   41   97
  CHCC8818   112   86   61   108
  DSM 21062   61   43   60   73
实施例5：胆汁测定
基本上如Noriega et al.2004(37)所述进行胆汁耐受性测定(37)。简言之，如实施例1所述制备细菌培养物。制备添加0、0.63、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0％胆汁(牛的或猪的，分别为Sigma B3883和B8631)的MRS琼脂板，并将20μl细菌培养物接种到所述板上。37℃厌氧培养2日后，检测板的生长/没有生长，以测定最小抑菌浓度(MIC)。
结果
全部菌株对于牛和猪胆汁具有极好的耐受性(MIC＞或＝2％)(参见表IV)，除了CHCC8773表现出对牛胆汁的耐受性差(MIC＝0.5％)，对猪胆汁耐受性更差(0.25％)。该发现可以解释在结肠炎模型中该菌株(CHCC8773)的不良表现(参见实施例1)。
表V：最小抑制胆汁浓度(MIC：最小抑制浓度)。
Figure BPA00001293634700221
实施例6：长双歧杆菌DSM 21062加强体外紧密联结。
菌株和培养条件
菌株：长双歧杆菌菌株(DSM 21062)、动物双歧杆菌乳酸亚种菌株BB-12(DSM15954)、嗜酸乳杆菌菌株La5(DSM13241)和副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株CRL431(ATCC 55544)。动物双歧杆菌乳酸亚种菌株BB-12
Figure BPA00001293634700223
(DSM15954)、嗜酸乳杆菌菌株La5(DSM13241)和副干酪乳杆菌副干酪亚种菌株CRL431(ATCC 55544)可从Chr.Hansen A/S，10-12 Boege Alle，DK-2970 Hoersholm，Denmark商购获得。
于37℃在MRS肉汤(Difco，BD Dianostics，Sparks，MD，USA)+0.05％半胱氨酸氢氯化物中，使用Anaerobic A培养袋(Merck，Darmstadt，Germany)培养动物双歧杆菌乳酸亚种。于37℃在MRS肉汤(Difco，BD Dianostics，Sparks，MD，USA)+0.05％半胱氨酸氢氯化物+1％蔗糖中，使用Anaerobic A培养袋(Merck，Darmstadt，Germany)培养长双歧杆菌。
于37℃在MRS肉汤中使用Anaerobic A培养袋(Merck，Darmstadt，Germany)培养乳杆菌。
Caco-2细胞的培养
Caco-2细胞(ATCC HTB-37，LGC Standards AB，Boras，Sweden)源自于人结肠直肠腺癌。该肠上皮细胞系是回盲肠上皮细胞的模型。在Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)中培养Caco-2细胞，所述Dulbecco改良Eagle培养基具有稳定的Glutamax-1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，补充有20％的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、1.25％的庆大霉素/两性霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1％的非必需氨基酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
Caco-2细胞在无菌聚酯膜Transwell-Clear插入皿(孔径大小：0.4μm；生长表面积：cm2；膜直径：6.5mm；来自Costar；Corning Incorporated Life Sciences，Lowell，MA)上培养。所述细胞以大约60.000个细胞/cm2的密度接种并培养19-21天，每隔一天更换培养基。在每个Transwell插入皿中，在底外侧上具有600μl生长培养基，而在顶面上具有120μl生长培养基。
细菌培养物和Caco-2细胞的共培养。
在log期的细菌培养物被稀释至6.6x106细菌/ml。为确保细菌培养物的存活，将Caco-2细胞层在HBSS中洗涤两次并与无庆大霉素的生长培养基温育2小时。在Transwell中在Caco-2细胞层的顶面上培养各菌株(120μl，即100个细菌/孔)6小时(一式三份)。在6小时之后取出培养物并用HBSS洗涤细胞层两次。
将癸酸钠(C10)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)添加(120μl的8mM在HBSS中的溶液)至细胞以诱导紧密联结的打开。在测量跨上皮电阻(TEER)之前将C10置于Transwell中的Caco-2细胞层的顶面上15min。TEER于37℃在来自Precision Instruments，Stevenage，UK的Endohm 6mm培养杯中进行测量。
两个对照被包括在实验中。两个对照都与培养物的培养同时进行生长培养6小时。之后，一个对照与生长培养基在一起，而另一个对照接受C10处理15分钟。
结果
对于未经处理的Caco-2细胞层，细胞培养物的TEER为1711(+/-83)Ohm xcm2，而用C10攻击的细胞层的TEER降低至687(+/-94)Ohm x cm2。在C10攻击之前用益生菌株处理细胞层，显著减少了CRL 431(855(+/-46)Ohm x cm2)和La-5(825(+/-46)Ohm x cm2)的TEER降低。与不能显著地改善细胞层的TEER的双歧杆菌属菌株BB-12相反，双歧杆菌属菌株DSM21062是具有最好的减少C10攻击诱导的TEER降低的能力。双歧杆菌属菌株DSM21062的TEER被测量为1071(+/-22)Ohm x cm2。
统计分析
结果通过学生t检验进行分析(Graphpad Prism软件：http://www.graphpad.com)。当p值＜0.05时差异被判断为是统计上显著的。
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关于保藏的微生物体[专家方案]
对于在本专利申请中提到的并且未纳入对公众开放的收集处中的全部保藏的微生物体，要求所谓的专家方案。
关于其中寻求欧洲专利的指定，保藏微生物的样品仅通过所述样品发放给请求该样品的人员所指定的专家并经i)申请人和/或ii)欧洲专利局(无论哪一个适用)批准才可以在欧洲专利授权公布之日或申请被驳回或视为撤回之日之前获得。(EPC-2000第32条)。

Claims (11)

1.一种长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其用作益生菌剂，耐受胆汁盐，产生高量的胞外多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗炎效应，其特征在于所述菌株为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变株，其中所述突变株通过使用该保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。
2.权利要求1的菌株，其中共培养Caco-2细胞(ATCC HTB-37)的体外培养层与所述菌株引起所述Caco-2细胞层的紧密联结统计上显著的加强，所述紧密联结测量为所述Caco-2细胞层在暴露于紧密联结破坏剂癸酸钠后所述Caco-2细胞层的跨上皮电阻。
3.根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株还能够抑制致病菌株的生长。
4.根据权利要求1至3任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含甘露糖残基的EPS，测得Glu-N∶甘露糖比为40或更高。
5.根据权利要求1至4任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS，测得Glu-N∶葡糖糖比为50或更高。
6.包含根据前述权利要求任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于制备药物的用途。
7.包含根据权利要求1至5任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物的用途。
8.人类或宠物食物组合物，其包含至少一种权利要求1至5任一项的细菌细胞的菌株。
9.一种起子培养物组合物，其包含权利要求1至5任一项的细菌细胞，优选其中所述起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物104至1012CFU的范围内。
10.一种制备食品或饲料产品的方法，该方法包括将根据权利要求9的起子培养物添加到食品或饲料产品起始材料中并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下。
11.从权利要求1至5任一项的长双歧杆菌菌株分离的多糖。
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