CN113943682B - 缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌制剂 - Google Patents

缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌制剂，属于微生物领域。本发明提供的长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CCFM1114能够有效缓解便秘小鼠的首粒黑便时间、肠道推进率以及粪便含水量，具有明显改善便秘表观病理指标的作用；在生理指标的检测中，长双歧杆菌还能够影响一些神经肽的含量，从根本上影响便秘的症状；长双歧杆菌不仅在生理和病理两方面具有一定的可观效果，较泻药而言缺少一些副作用，还能使槲皮素在体内的生物利用度有所提高，从而使槲皮素能够更好地发挥抗炎、抗氧化的作用，因此在制备功能性食品方面具有非常可观的应用前景。

Description

缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌 制剂
技术领域
本发明涉及缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌制剂，属于微生物领域。
背景技术
便秘是一种在世界各地都非常常见，并且影响了各个年龄层的疾病。据不完全统计，亚太地区的患病率8.75％，西方国家的患病率高达27％；儿童和青少年患病率为0.7-29.6％，老年人患病率为15-50％。根据罗马Ⅳ标准，便秘患者的判断标准：至少25％的排便感到费力；至少25％的排便为干球状便或硬便；至少25％的排便有肛门直肠阻塞感或梗阻感；至少25％的排便需要手法帮助(如用手指助便、盆底支持)；便次<3次/周；在不使用泻药时很少出现稀便等现象。
便秘的病因机制可能是多因素的，药物治疗的副作用，由炎症、分泌功能障碍、胃肠道运动障碍和胃肠道神经支配改变等多种原因共同作用，从而延迟肠道运输，影响液体进入结肠，从而增加粪便排泄时间和减少大便频率。也有研究发现便秘与动脉粥样硬化和肠道微生物的改变有重要联系。便秘疾病会严重影响患者的身心健康，甚至引发结肠癌。其次，便秘患者由于排便困难，可造成心、脑血管疾病发作，从而诱发心绞痛、心肌梗死等。长期便秘还会使代谢产物久滞于消化道中，部分细菌会分解产生大量有害物质，扩散进入中枢神经系统，严重干扰大脑功能，使患者记忆力下降。近年来，有研究调查了慢性便秘与后期临床病症(如死亡率和心血管疾病)之间的关系，并提供了相应证据，从而有人认为慢性便秘与心血管死亡风险的增加有所联系。
正是由于便秘的发病率高、病因广泛且危害众多，这种疾病越来越得到大家的广泛关注。对于便秘的治疗，症状轻者可以多食用膳食纤维丰富的食物，纠正自己的不良饮食或作息习惯，增加运动量；症状严重者可以使用渗透性或刺激性泻药，如聚乙二醇、乳果糖或蒽醌衍生物等，但是这类泻药常会引起依赖性，甚至恶心、腹痛、腹泻等副作用。现阶段，一种副作用小，效果良好的治疗手段是服用益生菌相关制剂，因此，通过使用益生菌来缓解便秘的方法需要得到更加深入的研究与思考。
目前，针对双歧杆菌相关的生理特性与功能特性等研究已有国内外的学者正在进行，但仍旧存在一些无法解释的问题，需要继续探究下去。无论是将其制成菌粉还是加入到发酵乳中进行食用，都有非常大的应用前景，不仅能够预防便秘疾病的发生还能缓解便秘的症状，调节肠道菌群的组成。通过对双歧杆菌缓解便秘进行研究，将会对食品科学、微生物学以及预防医学等各方面产生巨大的影响，因此，需要进行双歧杆菌对便秘缓解作用的研究。
发明内容
针对现有技术所面临的具有缓解便秘作用的双歧杆菌生长缓慢，不易活化及功能单一等缺陷，本发明的目的在于提供一株主要针对胃肠活性肽及相关受体表达从而能够有效缓解便秘的长双歧杆菌，且对提高槲皮素的口服生物利用度有一定作用，能够克服现有技术中存在的不足，提供相应益生菌制剂、功能性食品，从而预防便秘，或使便秘患者能逐步摆脱药物治疗的副作用与局限性。
本发明涉及的技术方案为：
本发明的第一个目的是提供一株从甘肃张掖8个月的男婴粪便中分离筛选出的长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CCFM1114，于2019年12月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:60941。
所述长双歧杆菌具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：为革兰氏染色阳性的无芽孢杆菌，菌体约0.5-1.3μm×1.5-8μm，多形性明显。
(2)菌落特征：在含0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上划线培养48h后形成明显的菌落，直径在0.2-2.5mm之间，圆形，凸面或透镜状，微白，不透明，有平滑至粘液状的柔软表面，不形成菌丝体。
(3)生长特性：该菌株最适生长温度为36-38℃，32-38℃生长良好，但是能够在45℃下进行生长，成活率高。最适初始pH为6-7，pH 5.5或以下生长较少。在含有葡萄糖的培养液中厌氧培养生长良好，培养20h即进入对数期后期或稳定期前期，液体管混浊，最终pH为4.0-4.8。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力。
(5)具有粘附性，能够较好的粘附在结肠癌细胞HT-29上。
(6)能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、首粒黑便时间以及小肠推进率，调节血清中胃肠活性肽的含量，能够作用于结肠组织相关蛋白或受体来缓解便秘，且效果良好。
(7)能够增加槲皮素的口服生物利用度。
本发明的第二个目的是提供含有所述长双歧杆菌长亚种的微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂含有所述长双歧杆菌长亚种的湿菌体或冻干后的细胞。
在一种实施方式中，所述微生物制剂是将含有长双歧杆菌长亚种GDMCC NO:60941的菌液干燥得到菌体细胞含量≥1×108CFU/g的粉剂。
所述干燥是指真空冷冻干燥或其它菌液干燥工艺。
本发明的第三个目的是提供一种发酵食品，所述发酵食品是使用长双歧杆菌长亚种CCFM1114发酵生产制得；所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品；所述乳制品包括发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料、奶油、乳酪、调制乳饮料、乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳粉；所述果蔬制品包括白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃、杨梅制品。
本发明的第四个目的是药物提供一种有效缓解便秘的组合物，所述组合物包含长双歧杆菌，还包括能够在药学上允许的载体。
在一种实施方式中，所述在药学上允许的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述药物组合物的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明还提供所述长双歧杆菌在制备缓解便秘的功能性食品方面的应用。
本发明还提供所述长双歧杆菌，或所述长双歧杆菌的微生物制剂，或含有所述长双歧杆菌的功能性食品或药物在提高槲皮素的利用度方面的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述长双歧杆菌与槲皮素用于制备可摄入人体的食品或药品。
本发明有益效果：
本发明的长双歧杆菌GDMCC NO:60941生长特性较好，具有一定的耐酸碱性，能显著提高便秘小鼠的粪便含水量、首粒黑便时间以及小肠推进率，下调血清中生长抑素(SS)、下调血清中血管活性肠肽(VIP)、下调结肠组织中血管活性肠肽受体(VIPR1)、下调结肠组织中水通道蛋白(AQP3)的基因表达、上调结肠组织中5-HT4R的基因表达、增加粪便中乙酸、丙酸与戊酸这几种短链脂肪酸的含量以及提高槲皮素的口服生物利用度。不仅能够有效缓解便秘，并且可以避免一些泻药存在的副作用，因此，本发明的长双歧杆菌长亚种CCFM1114可以视为一种缓解或治疗便秘的药物或作为药物的有效成分，还可以应用于功能性食品或者是一些发酵食品中，从而广泛发挥其作用，具有非常有价值的应用前景。
生物材料保藏
一株长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)CCFM1114，其分类学命名为Bifidobacterium longum subsp.longum，已于2019年12月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60941，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
附图说明
图1为不同组小鼠缓解便秘相关指标(排首粒黑便时间、粪便含水量、小肠推进率)的示意图；
图2为不同组小鼠血清中生长抑素(SS)含量变化示意图；
图3为不同组小鼠血清中血管活性肠肽(VIP)含量变化示意图；
图4为不同组小鼠结肠中血管活性肠肽受体1(VIPR1)表达量变化示意图；
图5为不同组小鼠结肠中血清素受体4(5-HT4R)表达量变化示意图；
图6为为不同小鼠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸)含量变化示意图。
图7为不同组小鼠结肠组织中水通道蛋白3(AQP3)表达量变化示意图。
具体实施方式
实施例1：长双歧杆菌长亚种CCFM1114的筛选和鉴定
(一)菌株的分离筛选：
(L)使用一次性无菌取便器采集甘肃张掖8个月男婴的粪便，将粪便样品在含有低聚果糖MRS+0.05％-0.1％(质量百分数)半胱氨酸培养基中，于厌氧培养箱(N2:CO2:H2＝80:10:10)中富集12h；
(2)将粪便样品用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于添加了无菌的100μg/mL莫匹罗星、50U/mL制霉菌素的MRS+0.05％-0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的固体平板上，培养24-48h；
(3)选取符合双歧杆菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出所选菌株；
(4)将上述单菌落培养于液体MRS+0.05％-0.1％半胱氨酸培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
(1)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体MRS+0.05％-0.1％半胱氨酸培养液中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；
(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH6.5的0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；
(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸轻胺，并于室温放置10min；
(6)分别添加200μL 15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCL；
(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCL，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
(1)取步骤(二)筛选出并且活化3代的菌体(培养12-48h)1mL用于菌种鉴定，6000r/min离心3min，弃上清得菌体。
(2)加入1mL无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μL无菌水重悬，作为菌液模板。
(3)16S rDNA PCR体系:
A.细菌16S rDNA，20μLPCR反应体系：
27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，1μL；模板，1μL；ddH20，8μL。
B.PCR条件：
94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃2min；72℃10min；step2-4 30×；12℃2min。
(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×Loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，其序列结果为TTCTGCAGAGCGGAGCGGGTCACCTTGACCGGGTCGGTCACACCGGCGGCCAGCAGGTCTTCGTAGGTGTCGGTGGCGGCGTTGAAGCCTTCGCCATCAGGCAGGGAGCGGACGGTGTTGATGACCACGTCACCGGACACGCCGGCGTTCTCGGCGATCTGCTTGATCGGGGCCTCGATGGCGCGGAACACGATGGCGGCACCGGTAGCCTCTTCGCCGGTCAGGGAGGTGACGGCCTCGGTCTTCTCGGCCTTGGCAGCAGCCTGAACGAGGGCCACGCCACCGCCAGGCAGCAGGCCTTCCTCGATGGCGGCCTTGGCGTTACGCACGGCATCTTCGATGCGGTGCTTGCGCTCCTTGGCCTCGACCTCGGTGGCAGCGCCGACCTTGATGACAGCCACGCCGCCAGCCAGCTTGGCCAGACGCTCCTGCAGCTTCTCACGtCGATAATCGGAA(SEQ ID NO.1)，并将得到的序列结果使用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为长双歧杆菌的菌株，-80℃保藏备用；
(四)长双歧杆菌菌悬液的制备
将活化3代后的菌液以2％的接种量接种至1L液体MRS培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用无菌生理盐水(含0.05％-0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐)进行清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行保存，-80℃冰箱冻存一周。在进行动物实验前，将菌液以6000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的活菌数量。MRS培养基的配方为：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5g；MgSO4·7H2O 0.1g；MnSO4·H2O 0.05g；柠檬酸氢二铵2g；K2HPO4·3H2O 2.6g；吐温80 1mL；L-半胱氨酸盐酸盐0.8g；调节pH为6.8±0.2；定容至1L。高压灭菌115℃20min。
实验结果：初始活菌数为6.8×109cfu/mL，1周后活菌数为3.7×109cfu/mL，数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。
实施例2：长双歧杆菌长亚种CCFM1114对洛哌丁胺诱导产生便秘相关症状的缓解
将长双歧杆菌长亚种CCFM1114、两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632(该菌株公开于公开号为CN106834187B的专利文件中)与长双歧杆菌CCFM642(该菌株公开于DOI：10.3389/fmicb.2019.01721的论文中)菌种于-80℃冰箱取出后，划线于MRS平板中，37℃培养48h，挑取单菌落于MRS液体管中，37℃培养24h，以2％的体积量接种于新的MRS液体培养基中，于37℃培养24h，按照同样的方式再次培养一代，然后将双歧杆菌菌悬液在6000r/min、4℃条件下离心5min，然后用10％的脱脂乳进行重悬，制得菌悬液，用于动物实验。
取6周龄的健康雄性Balb/c小鼠30只，适应环境1周，随机分为5组：对照组、模型组、两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632组、长双歧杆菌组CCFM642组、长双歧杆菌CCFM1114组，每组含小鼠6只，灌胃菌悬液的浓度为5×109CFU/mL，每天早上9点开始灌胃，每次0.2mL。实验动物分组及处理方法见表1：
表1实验动物分组
Figure BDA0003351771530000061
Figure BDA0003351771530000071
在第37天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100％
在第38天，对照组给予0.2mL生理盐水、模型组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，1h后，分别向每组灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间。
第38天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第39天上午9点对照组给予0.2mL生理盐水，模型组和灌菌组均给予0.2mL盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，30min后，各组分别灌胃墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率。
小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100％
粪便含水量、排首粒黑便时间、小肠推进率实验结果如图1所示，由图可知，长双歧杆菌长亚种CCFM1114组相对于便秘模型组，灌胃长双歧杆菌长亚种CCFM1114能显著提高小肠推进率、提高粪便含水量，缩短排首粒黑便时间，且提高粪便含水量、小肠推进率的能力要优于两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632，而长双歧杆菌CCFM642则无明显的改善作用。此外，长双歧杆菌CCFM1113对首粒黑便时间的影响较小肠推进率更为显著，明显强于两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632和长双歧杆菌CCFM642。综上，长双歧杆菌长亚种CCFM1114具有良好的缓解便秘效果。
实施例3：长双歧杆菌长亚种CCFM1114降低便秘小鼠血清中生长抑素(SS)的含量
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。第39天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000g离心15min后获得血清，采用生长抑素(SS)检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中SS的浓度。
有研究表明生长抑素对胃肠运动与消化道激素的分泌均有一定的抑制作用。实验结果如图2所示，由图2可知，长双歧杆菌长亚种CCFM1114组相比于模型组，长双歧杆菌长亚种CCFM1114与两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632能显著下调便秘小鼠血清SS的含量，而长双歧杆菌CCFM642处理的小鼠血清中SS的含量与模型组相比无显著差异。由实验结果可知，长双歧杆菌长亚种CCFM1114能通过下调血清中SS的含量加速胃肠道动力，刺激消化道激素的分泌，从而缓解肠道蠕动减慢的症状。
实施例4：长双歧杆菌长亚种CCFM1114提高便秘小鼠血清中血管活性肠肽(VIP)的含量
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。第39天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，采用VIP检测试剂盒，根据说明书进行实验，由标准曲线计算出血清中VIP的浓度。实验结果如图3所示，便秘模型小鼠与空白对照组相比，其血清中VIP出现了显著升高的现象，从文献中可知，血管活性肠肽(VIP)，是神经递质的一种，存在于中枢神经和肠神经系统中。VIP功能多样，能够舒张肠道平滑肌，并使食管下段括约肌、肠道平滑肌、肛门内括约肌松弛。由图3可知长双歧杆菌长亚种CCFM1114能显著降低便秘小鼠血清中VIP的含量，可使VIP含量较空白对照组降低3.4pg/ml，而长双歧杆菌CCFM642处理组便秘小鼠血清VIP含量相对于模型组无显著改变。这说明长双歧杆菌长亚种CCFM1114可以通过降低血清中VIP的含量从而促进肠道的收缩蠕动。
实施例5：长双歧杆菌长亚种CCFM1114降低便秘小鼠结肠组织中VIPR1受体表达量
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。受体VIPR1位于肠肌组织上，血管活性肽(VIP)通过作用于肠肌上VIPR1，从而使平滑肌舒张，因此，VIPR1的作用不可小觑。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定这种受体VIPR1的表达量，首先去要从新鲜组织中提取RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维世纪公司的HiFiScript gDNARemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。
小鼠VIPR1基因和内参基因mGAPDH基因引物如表2所示，
表2小鼠VIPR1基因和mGAPDH基因引物序列
Figure BDA0003351771530000091
qRT-PCR反应体系及条件：
用Bio-
Figure BDA0003351771530000092
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure BDA0003351771530000093
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃30s；95℃10s，60℃30s，共40个循环。以mGAPDH基因作为内参基因，通过CFX96Manager软件分析结果。实验结果如图4所示，由图4可知，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的VIPR1表达量显著增加63.9％，说明模型小鼠结肠中VIP能够更多地作用于VIPR1从而使肠道括约肌松弛，蠕动减少。灌胃长双歧杆菌长亚种CCFM1114的小鼠，其肠道中VIPR1基因表达量与模型组相比显著降低了71.2％，与空白对照组的表达量相接近，使抑制型神经递质发挥作用的可能性减少，而长双歧杆菌CCFM642与两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632处理的小鼠肠道中VIPR1基因表达量与模型组相比无显著差异。从结果可知，长双歧杆菌长亚种CCFM1114可以通过减少便秘小鼠肠道VIPR1的表达量来促进肠道收缩与蠕动，从而缓解便秘。
实施例6：长双歧杆菌长亚种CCFM1114提高便秘小鼠结肠组织中5-HT4R表达量
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。5-HT4R是介导肠道分泌的一种重要受体，同时可以增加近端平滑肌的收缩，主要受5-HT的激活，在肠道中分布广泛。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定介导肠道分泌的5-HT4R的表达量，首先去要从新鲜组织中提取RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维世纪公司的HiFiScript gDNARemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。
小鼠5-HT4R基因和内参基因mGAPDH基因引物如表3所示，
表3小鼠5-HT4R基因和mGAPDH基因引物序列
Figure BDA0003351771530000101
qRT-PCR反应体系及条件：
用Bio-
Figure BDA0003351771530000102
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure BDA0003351771530000103
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃30s；95℃10S，60℃30S，共40个循环。以mGAPDH基因作为内参基因，通过CFX96Manager软件分析结果。实验结果如图5所示，由图5可知，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的5-HT4R表达量显著下降，说明模型小鼠结肠中5-HT能作用的受体减少，但灌胃长双歧杆菌长亚种CCFM1114的小鼠，其肠道中5-HT4R基因表达量较模型组增加了53.2％，5-HT能够通过刺激相应受体来促进肠道蠕动，而长双歧杆菌CCFM642与两歧双歧杆菌CGMCCNO.13632处理的小鼠肠道中5-HT4R基因表达量无显著恢复。因此，长双歧杆菌长亚种CCFM1114可以通过增加便秘小鼠肠道5-HT4R的表达量来促进肠道收缩，从而缓解便秘。
实施例7：长双歧杆菌长亚种CCFM1114提高便秘小鼠粪便中短链脂肪酸含量
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。将实验结束前所收集的测定粪便含水量的小鼠粪便冻存于-80℃。具体方法如下，称取20mg粪便，用500μL饱和NaCL溶液重悬，加入20μL 10％H2SO4溶液；加入1000μL无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后12000rpm 4℃离心15min；取上层乙醚相，加入0.25g无水Na2SO4进行干燥；静置30min后12000rpm 4℃离心5min取上层乙醚相，利用GC-MS测定小鼠冻干粪便中的短链脂肪酸含量。使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL,按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min,离子化温度为20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标法测得标准曲线，从而计算出各种短链脂肪酸的浓度。实验结果如图6所示，用洛哌丁胺造模后，空白对照组小鼠乙酸、丙酸含量比便秘模型组高77.3％、101.2％，而灌胃长双歧杆菌长亚种CCFM1114后，粪便中乙酸与丙酸的含量显著上升，比长双歧杆菌CCFM642组高41.5％与25.8％，丙酸水平比两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632组高27.7％，并向空白对照组的含量靠拢。两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632也能提高乙酸的含量，但对丙酸的提高效果不如长双歧杆菌CCFM1114。乙酸、丙酸这些短链脂肪酸能够降低肠道pH值，促进肠道中钙镁离子的吸收，抑制有害菌的侵染，刺激肠道蠕动。因此，长双歧杆菌长亚种CCFM1114能够通过增加乙酸、丙酸这几种短链脂肪酸的含量来缓解便秘。
实施例8：长双歧杆菌长亚种CCFM1114降低便秘小鼠结肠组织中AQP3基因表达量
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定与肠道液体分泌与转运相关的水通道蛋白3(AQP3)的表达量。取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，按说明书用TrizoL法提取总RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL TrizoL试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据康维世纪公司的HiFiScript gDNARemovaL RT MasterMix反转录试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。
小鼠AQP3蛋白基因和内参基因mGAPDH基因引物如表4所示，
表4小鼠AQP3蛋白基因和mGAPDH基因引物序列
Figure BDA0003351771530000121
qRT-PCR反应体系及条件：
用Bio-
Figure BDA0003351771530000122
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure BDA0003351771530000123
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃30s；95℃10S，60℃30S，共40个循环。以mGAPDH基因为内参基因，CFX96Manager软件分析结果。AQP3蛋白(水通道蛋白3)是一种可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，位于结肠黏膜表面上皮细胞，主要促使结肠细胞对水的吸收，也可增强其对尿素和甘油的转运。若其表达量增加，则结肠粘膜更容易从粪便中转运水分子，从而导致粪便含水量下降，粪便干硬，易导致便秘。实验结果如图7所示，由图7可知，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的AQP3蛋白表达量显著上升，导致肠道对粪便中水分子的转运增加，从而使粪便含水量下降。灌胃长双歧杆菌长亚种CCFM1114的小鼠，其AQP3蛋白表达量显著下降，且下降程度大于长双歧杆菌CCFM642组。因此，长双歧杆菌长亚种CCFM1114能够通过降低便秘小鼠结肠中AQP3的表达，从而避免肠道过度吸收粪便中的水分，提高便秘小鼠粪便中含水量，从而缓解便秘症状。
实施例9：长双歧杆菌长亚种CCFM1114提高槲皮素在小鼠体内的口服生物利用度
槲皮素(Quercetin)是一种具有多重生物活性的黄酮醇类化合物。已有研究表明，槲皮素预处理能减轻氧化应激损伤和细胞内钙超载，降低炎症反应，有效保护心肌缺血-再灌注损伤，在抗菌、抗过敏、防止糖尿病并发症方面也有较强的生物活性。但由于这类抗氧化抗炎物质容易失活，生物利用度较低，因此，需要研制开发能够增加槲皮素生物利用度的方法。取6周龄的健康雄性Balb/c小鼠24只，适应环境1周，随机分为3组：槲皮素组(Quercetin)、长双歧杆菌HAN4-25对照组(所选取的长双歧杆菌HAN4-25公开于论文《长双歧杆菌遗传与表型多样性及其与免疫调节功能的相关性研究》中)、长双歧杆菌CCFM1114干预组，每组含小鼠8只，灌胃菌悬液的剂量为5×109CFU/mL，每天早上9点开始灌胃，每次0.2mL。
实验动物分组及处理方法见表5：
表5实验动物分组
Figure BDA0003351771530000131
在第35天，对每一组小鼠分别在5min，10min，20min，30min，45min，1h，2h，3h，4h眼眶取血，测定槲皮素在小鼠体内的血浆血药浓度。测定方法主要采用高效液相色谱仪，色谱柱：YMC-Pack-ODS-A(250mm×4.6mm,5μm)；保护柱：Zorbax SB-C18柱(4.6mm×12.5mm,5μm)；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％磷酸溶液；流速：1.0mL·min-1；梯度洗脱：0-30min，19％-21％A相，30-60min，21％-23％A相；DAD检测器；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：20μL。精密称取经真空干燥至恒重的槲皮素对照品10mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为40μg·mL-1的槲皮素标准液；再用甲醇稀释成标准曲线相应浓度的标准工作液。取血浆200μL，加乙腈400μL，涡旋1min，3000r/min离心20min，取上清液并于37℃水浴中氮气吹扫挥干，加水2mL，以乙酸乙酯提取3次，每次加乙酸乙酯1.6mL，合并乙酸乙酯提取液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，于37℃水浴中氮气吹扫挥干乙酸乙酯，所得物用40μL甲醇溶解。
实验结果如表6所示：
表6不同时间点槲皮素在小鼠体内的血药浓度比较
Figure BDA0003351771530000141
经过长双歧杆菌长亚种CCFM1114定植后，在第20min时达到峰值，小鼠血浆中槲皮素的含量有明显增加，相比于不施用CCFM1114提高了41.4％，这说明长双歧杆菌长亚种CCFM1114能够促进槲皮素在体内的吸收分布，使槲皮素的口服生物利用度有所增加。
实施例10：利用本发明长双歧杆菌长亚种CCFM1114制造含该菌的发酵果蔬制品
选用新鲜蔬菜或水果洗净后榨汁，包括白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃、杨梅制品中的一种或上述多种的混合物为原料。
对榨汁后的原料进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明的长双歧杆菌长亚种CCFM1114或含有该菌株的菌剂发酵剂，使CCFM1114的细胞浓度达到108CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，得到含有本发明长双歧杆菌长亚种CCFM1114活菌的果蔬饮料。
实施例11：利用本发明长双歧杆菌长亚种CCFM1114制造含该菌的发酵食品
利用长双歧杆菌长亚种CCFM1114作为发酵微生物生产发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括发酵乳制品(发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、奶油、乳酪、含乳饮料以及乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳粉。
实施例9、实施例10制备的发酵食品能够提高粪便含水量与小肠推进率，同时减少首粒黑便出现时间、下调血清中生长抑素(SS)、下调血清中血管活性肠肽(VIP)、下调结肠组织中血管活性肠肽受体(VIPR1)、下调结肠组织中水通道蛋白(AQP3)的基因表达、上调结肠组织中5-HT4R的基因表达、增加粪便中乙酸、丙酸与戊酸这几种短链脂肪酸的含量以及提高槲皮素的口服生物利用度。
本发明所述的长双歧杆菌长亚种CCFM1114可用于含有槲皮素的食品中，不仅能够对缓解便秘产生作用，同时对槲皮素的口服生物利用度产生有益影响，具有非常广泛的应用前景。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌制剂
<130> BAA211527A
<150> 202011263699.2
<151> 2020-11-12
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 456
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum subsp. longum
<400> 1
ttctgcagag cggagcgggt caccttgacc gggtcggtca caccggcggc cagcaggtct 60
tcgtaggtgt cggtggcggc gttgaagcct tcgccatcag gcagggagcg gacggtgttg 120
atgaccacgt caccggacac gccggcgttc tcggcgatct gcttgatcgg ggcctcgatg 180
gcgcggaaca cgatggcggc accggtagcc tcttcgccgg tcagggaggt gacggcctcg 240
gtcttctcgg ccttggcagc agcctgaacg agggccacgc caccgccagg cagcaggcct 300
tcctcgatgg cggccttggc gttacgcacg gcatcttcga tgcggtgctt gcgctccttg 360
gcctcgacct cggtggcagc gccgaccttg atgacagcca cgccgccagc cagcttggcc 420
agacgctcct gcagcttctc acgtcgataa tcggaa 456
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<400> 13
tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims (9)

1.一种长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp. longum)CCFM1114，于2019年12月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60941。
2.一种发酵食品，其特征在于，所述发酵食品是使用权利要求1所述的长双歧杆菌长亚种CCFM1114发酵制得。
3.如权利要求2所述的发酵食品，其特征在于，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品。
4.权利要求1所述的长双歧杆菌长亚种CCFM1114在制备提高槲皮素的口服生物利用度的药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的长双歧杆菌长亚种CCFM1114及槲皮素。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，还含有能够在药学上允许的载体；所述在药学上允许的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
7.根据权利要求4或5所述的应用， 其特征在于，所述药物含有≥108CFU/g的活性长双歧杆菌长亚种CCFM1114。
8.权利要求1所述的长双歧杆菌长亚种CCFM1114在制备提高槲皮素的口服生物利用度和缓解便秘症状的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物具有如下至少一种功能：
提高粪便含水量；
提高小肠推进率；
缩短排便的间隔时间；
下调血清中生长抑素和/或血管活性肠肽；
下调结肠组织中血管活性肠肽受体、下调结肠组织中水通道蛋白的基因表达和/或上调结肠组织中5-HT4R的基因表达；
增加粪便中乙酸、丙酸与戊酸这几种短链脂肪酸的含量。
CN202111340462.4A 2020-11-12 2021-11-12 缓解便秘的长双歧杆菌长亚种及其制备的发酵食品与益生菌制剂 Active CN113943682B (zh)

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