CN111117907B - 副干酪乳杆菌ccfm1069及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了副干酪乳杆菌CCFM1069及其应用，副干酪乳杆菌CCFM1069能耐受人体胃肠环境，显著显著提高粪便含水量、提高小肠推进率、缩短排首粒黑便时间、下调血清中酪酪肽含量、上调结肠组织中5‑羟色胺水平、上调结肠组织中神经营养因子3水平、下调结肠组织中Aqp4基因转录水平、增加结肠组织中Cajal间质细胞的数量以及增加肠道内短链脂肪酸的含量；所述副干酪乳杆菌CCFM1069对全氟辛酸有较强的吸附能力，具有缓解PFOA毒性的能力，具有非常广泛的应用前景。

Description

副干酪乳杆菌CCFM1069及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及副干酪乳杆菌CCFM1069及其应用。
背景技术
目前，便秘已经成为了困扰现代人的主要问题之一，影响到了患者的情绪，是其生活质量和生活的满意度下降，并且许多患者对传统的治疗方案并不是很满意，主要因其治疗效果欠佳。所以现在的患者及普通正常人群需要一种有效的方法来治疗和预防便秘。从临床观察，女性患者较男性患者而言，数量较多。在北美洲便秘患者中，女性比男性的数量在2.2：1左右，且便秘的出现概率随着年龄的增长而增加，在65岁以后尤其明显。国内的调查还显示慢性便秘的发生有明显的地域性。全国6个城市老年人便秘调查结果显示：我国北方地区便秘患病率高于南方地区，如北方城市北京患病率为20.3％，西安患病率为12.9％，沈阳为18.5％：南方城市上海患病率为7.0％，广州为9.0％，成都为10.4％。便秘的患病率在同一地区还显示出城乡差别。北京的调查结果显示，农村为 23.0％，城市为18.2％。成都的调查结果显示，农村的患病率为12.6％，城市为 4.7％。广东省的调查显示，农村患病率为5.4％，城市为3.3％，农村明显高于城市(P＝0.0001)。并且癌症患者便秘的患病率高达78％，原因来自原发性或转移性肠肿瘤和慢性阿片类药物使用。
目前便秘治疗主要有：1、一般治疗。便秘患者需要对饮食及生活习惯进行调节，多饮水，多食富含纤维素的蔬菜、水果及粗粮，使粪便的含水量提高，增加粪便容积，刺激结肠蠕动，可加快结肠转运.养成每天定时排便的习惯，同时积极运动，特别是锻炼腹肌，有利于改善肠道功能2、药物治疗。目前用于治疗便秘的药物主要分为容积性泻药、渗透性泻药、刺激性泻药、润滑性泻药，但药物治疗都有一定的副作用，不可长期使用。从自然界中筛选出一株可食用并对便秘有缓解作用的菌株，有助于丰富缓解便秘的对策，提高便秘相关症状的效率。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供副干酪乳杆菌CCFM1069，其保藏编号为GDMCC No：60719。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：副干酪乳杆菌 CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用，其中：所述副干酪乳杆菌CCFM1069能够用于制备提高便秘小鼠粪便中短链脂肪酸、增加肠道内渗透压的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述副干酪乳杆菌CCFM1069还能够用于制备提高小肠推进率、上调血清中MTL的含量、加速小肠蠕动的菌剂、食品和/ 或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述副干酪乳杆菌CCFM1069还能够用于制备下调血清中酪酪肽含量、提高胃肠道动力的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述副干酪乳杆菌CCFM1069还能够用于制备提高结肠中5-HT的含量、提高结肠动力的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述副干酪乳杆菌CCFM1069还能够用于制备吸附PFOA、缓解PFOA毒性的菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述副干酪乳杆菌CCFM1069还能够用于制备提升结肠中NT-3的表达、加速全肠道排空速度的菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述副干酪乳杆菌CCFM1069还能够用于制备肠道内快速定植的菌剂、食品和或药物。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述食品，包括发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。
作为本发明所述的副干酪乳杆菌CCFM1069在制备功能性菌剂、食品和或药物中的应用的一种优选方案：所述乳制品包括牛奶、酸奶油或干酪；所述豆制品包括豆奶、豆豉或豆酱；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。
本发明的有益效果：副干酪乳杆菌CCFM1069能耐受人体胃肠环境，显著显著提高粪便含水量、提高小肠推进率、缩短排首粒黑便时间、下调血清中酪酪肽(PYY)含量、上调结肠组织中5-羟色胺(5-HT)水平、上调结肠组织中神经营养因子3(NT-3)水平、下调结肠组织中Aqp4基因转录水平、增加结肠组织中Cajal间质细胞的数量以及增加肠道内短链脂肪酸的含量；所述副干酪乳杆菌CCFM1069对全氟辛酸(PFOA)有较强的吸附能力，具有缓解PFOA毒性的能力，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是副干酪乳杆菌CCFM1069的菌落形态；
图2是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠排首粒黑便时间的影响；
图3是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠小肠推进率的影响；
图4是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠粪便含水量的影响；
图5是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠血清中胃动素(MTL)水平的影响；
图6是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠血清酪酪肽(PYY)水平的影响；
图7是副干酪乳杆菌CCFM1069对对便秘小鼠结肠中5-羟色胺(5-HT)水平的影响；
图8是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠结肠中神经营养因子-3(NT-3) 水平的影响；
图9是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠结肠中c-kit基因转录水平的影响；
图10是副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠结肠中Aqp4基因转录水平的影响；
图11是副干酪乳杆菌CCFM1069对全氟辛酸(PFOA)的吸附效果；
注：a，b，c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
副干酪乳杆菌CCFM1069(Lactobacillus paracasei)，于2019年07月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60719。
副干酪乳杆菌CCFM1069具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：有氧或厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm 之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，奶油白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。
(3)生长特性：在37℃恒温有氧或厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约16小时达到对数末期。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力；
(5)显著缩短便秘小鼠排首粒黑便时间；
(6)显著提高便秘小鼠小肠推进率；
(7)显著提高便秘小鼠粪便含水量；
(8)显著提高便秘小鼠血清中胃动素(MTL)水平；
(9)显著提高便秘小鼠血清酪酪肽(PYY)水平；
(10)显著提高便秘小鼠结肠中5-羟色胺(5-HT)水平；
(11)显著提高便秘小鼠结肠中神经营养因子-3(NT-3)水平；
(12)显著提高便秘小鼠结肠中c-kit基因转录水平；
(13)显著提高便秘小鼠粪便中短链脂肪酸；
(14)显著提高便秘小鼠结肠中Aqp4基因转录水平；
(15)具有较强吸附全氟辛酸(PFOA)的能力；
本菌株的提取方法为：
(一)乳酸菌的分离筛选：
(l)取1g来自健康人群的新鲜粪便。将样品在含有山梨醇GM17培养基中35℃富集12h；
(2)将富集样品进行梯度稀释后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的GM17 固体平板上，培养24～48h；
(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌目基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
(4)将上述单菌落培养于液体GM17培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
(二)发酵用乳酸菌的初步鉴定：溶钙圈测定法
(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体山梨醇GM17培养液中培养24h，然后取lmL培养物8000rpm离心2min；
(2)用0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)将所得菌泥重悬，划线在山梨醇GM17-0.75％CaCO3的固体培养基上，培养24h；
(4)选取溶钙圈明显，且呈凸面圆形、细密色白、无菌丝体的菌落，革兰氏染色后显微镜观察菌体进行初步判定。
(三)发酵用乳酸菌的分子生物学鉴定：
(l)单菌基因组抽提：
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液lmL 于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
B.用lmL无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
C.加入200μLSDS裂解液，80℃水浴30min；
D.加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μL；
E.加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，﹣20℃静置1h， 12000rpm离心5-10min，弃上清；
F.加入500μL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；
G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
H.50μLddH2O重溶沉淀以备PCR；
(2)16S rDNA PCR
A.细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系：
10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶， 0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，38μL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃ 2min；
(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量5μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用 BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为属于副干酪乳杆菌的一种新发现的菌株，-80℃保藏备用。
实施例1：副干酪乳杆菌CCFM1069对BALB/C小鼠无毒副作用
将副干酪乳杆菌CCFM1069菌体重悬于2％的蔗糖溶液中，制成浓度为3.0 ×109CFU/mL的菌悬液。取体重16-20g左右的健康雄性BALB/C小鼠8只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。
结果表明，喂食浓度3.0×109CFU/mL的副干酪乳杆菌CCFM1069未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
实施例2：副干酪乳杆菌CCFM1069对便秘小鼠排首粒黑便的影响
将副干酪乳杆菌CCFM1069菌种于-80℃冰箱取出后，划线于MRS平板中， 37℃培养48h，挑取单菌落于MRS液体管中，37℃培养18h，以2％的体积量接种于新的MRS液体培养基中，于37℃培养18h，按照同样的方式再次培养一代，然后将乳酸菌菌悬液在8000r/min、4℃条件下离心8min，然后用3％的蔗糖溶液进行重悬，制得菌悬液，放于-80℃冰箱冻存。
取6周龄的健康雄性Balb/C小鼠30只，适应环境1周，随机分为5组：空白对照组(NC)、模型对照组(M)、酚酞对照组(RH)、副干酪乳杆菌CCFM1069 干预组(CCFM1060)、副干酪乳杆菌4-1(4-1)，每组含小鼠6只，灌胃的剂量为每天每只小鼠0.2mL，浓度为109CFU/mL。实验动物分组及处理方法见表1：
表1实验动物分组
Figure GDA0003535374690000071
Figure GDA0003535374690000081
在第29天，空白组给予0.2ml无菌水、模型组和灌菌组均给予0.2ml盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kgb.w)，1h后，所有组别灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠首粒排黑便的时间。
实验结果如图2所示，便秘模型小鼠排首粒黑便时间显著大于正常组小鼠，灌胃副干酪乳杆菌CCFM1069后，能显著缩短便秘小鼠的排首粒黑便时间，且其效果和泻剂酚酞相当，优于灌胃副干酪乳杆菌4-1组别。
实施例3：副干酪乳杆菌CCFM1069显著提高便秘小鼠小肠推进率
Balb/C小鼠分组、造模同实施例1。第30天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第31天上午8点空白组给予0.2ml3％蔗糖溶液、模型组和灌菌组均给予0.2ml 盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，30min后，空白组和模型组灌胃墨汁，四组灌菌组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率。
小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100
实验结果如图3所示。模型组小鼠小肠推进率显著低于正常组，灌胃副干酪乳杆菌CCFM1069后明显提高了便秘小鼠的小肠推进率水平并接近于空白对照组，且与泻剂酚酞组相当。
实施例4：副干酪乳杆菌CCFM1069提高便秘小鼠粪便含水量
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。在第28天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
实验结果如图4所示，模型组小鼠在接受洛哌丁胺处理后，粪便中的含水量与正常组相比显著降低。灌胃副干酪乳杆菌CCFM1069后，便秘小鼠粪便中的含水量与模型组小鼠相比得到了显著的提高，而酚酞处理组含水量没有显著变化。
实施例5：副干酪乳杆菌CCFM1069降低便秘小鼠血清胃动素(MTL)的水平
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。第30天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中血清中MTL的浓度。
验结果如图5所示，由图5可知，副干酪乳杆菌CCFM1069组相比于模型组，能显著上调便秘小鼠血清MTL的含量，且上调能力优于副干酪乳杆菌4-1 组和酚酞对照组。由实验结果可知，副干酪乳杆菌CCFM1069组能通过上调血清中MTL的含量加速小肠蠕动，缓解肠道蠕动减慢的便秘症状。
实施例6：副干酪乳杆菌CCFM1069降低便秘小鼠血清酪酪肽(PYY)的水平
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。第30天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中血清中PYY的浓度。有研究表明PYY能减缓胃排空，减缓胃肠道动力。
实验结果如图6所示，由图6可知，副干酪乳杆菌CCFM1069组相比于模型组，能显著下调便秘小鼠血清PYY的含量，且下调能力优于副干酪乳杆菌4-1 组和酚酞对照组。由实验结果可知，副干酪乳杆菌CCFM1069组能通过下调血清中PYY的含量加速胃肠道动力，缓解肠道蠕动减慢的便秘症状。
实施例7：副干酪乳杆菌CCFM1069提高便秘小鼠结肠中5-羟色胺(5-HT) 的水平
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(按照1：9的重量体积比)，在高通量组织破碎仪上进行破碎，最后将匀浆与5000×g离心5-10分钟，取上清检测，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中组织中5-HT。
实验结果如图7所示，便秘模型小鼠与空白组相比，其结肠组织中5-HT出现了显著降低的现象，已知文献报道，5-HT能增加结肠收缩，加速肠道蠕动。由图7可知副干酪乳杆菌CCFM1069能显著提升便秘小鼠结肠组织中5-HT的含量至正常水平，且其效果明显优酚酞组。这说明副干酪乳杆菌CCFM1069可以通过提高结肠中5-HT的含量提高结肠动力。
实施例8：副干酪乳杆菌CCFM1069提高便秘小鼠结肠神经营养因子-3(NT-3) 的水平
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(按照1：9的重量体积比)，在高通量组织破碎仪上进行破碎，最后将匀浆与5000×g离心5-10分钟，取上清检测，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中组织中NT-3。
实验结果如附图8所示。经过洛哌丁胺造成便秘后，模型组结肠中NT-3显著低于空白组。从图8我们发现副干酪乳杆菌CCFM1069能显著提升便秘小鼠结肠中的NT-3水平。经研究NT-3能加速全肠道排空速度。所以可知，副干酪乳杆菌CCFM1069能提升便秘小鼠结肠中NT-3的水平从而缓解便秘。
实施例9：副干酪乳杆菌CCFM1069改善便秘小鼠结肠中c-kit基因转录水平
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。Cajal间质细胞(ICC)数量可以用其表面蛋白c-kit蛋白转录量来表示。采用实时荧光定量聚合酶链反应 (qRT-PCR)来测定相关蛋白的表达量。取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，按说明书用Trizol法提取总RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL Trizol试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入 200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15 min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA 溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量。以提取的总RNA为模板，根据TaKaRa公司的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。
小鼠c-kit蛋白基因和内参基因mGAPDH基因引物如表2所示：
表2小鼠c-kit蛋白基因和mGAPDH基因引物序列
Figure GDA0003535374690000111
qRT-PCR反应体系及条件：
用
Figure GDA0003535374690000112
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。 c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure GDA0003535374690000113
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃2min；95℃30S，59℃30S，72℃，20s，共38个循环。以mGAPDH基因为内参照，CFX96Manager软件分析结果。实验结果如图9所示，由图可知，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的c-kit基因转录水平显著下降，说明模型小鼠结肠中肠道“起搏”细胞Cajal间质细胞数量变低，但灌胃了副干酪乳杆菌CCFM1069 的小鼠，其肠道c-kit基因转录水平提高，这意味着Cajal间质细胞数量得到了显著的提升。这提示，副干酪乳杆菌CCFM1069可以通过增加便秘小鼠肠道Cajal细胞的数量来促进肠道蠕动缓解便秘。
实施例10：副干酪乳杆菌CCFM1069提高便秘小鼠短链脂肪酸(SCFAs) 的含量
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。试验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃。首先对粪便进行前处理，称取20mg粪便，用500μl饱和NaCl溶液重悬，加入20μl10％的H2SO4酸化；加入800μl无水乙醚，震荡均匀，提取脂肪酸，然后18000g离心15min；取上层乙醚相，加入0.25g无水Na2SO4进行干燥；静置 30min后18000g离心5min取上层乙醚相，利用GC-MS测定小鼠冻干粪便中的短链脂肪酸含量。使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径。25μm)；载气为He，流速为2ml/min；进样体积1μl，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min，离子化温杜伟20℃；分析采用全扫描模式，为通过外标法值得标准曲线，从而计算出各短链脂肪酸浓度。实验结果如表3所示，用洛哌丁胺造模后，便秘模型组小鼠乙酸含量显著低于正常组，这提示，便秘可能与结肠中乙酸含量有关。而灌胃酚酞泻剂组的小鼠，乙酸并没有明显升高，而副干酪乳杆菌CCFM1069的小鼠粪便中乙酸含量显著升高且优于于副干酪乳杆菌4-1组。除了乙酸，灌胃副干酪乳杆菌CCFM1069后其他几种短链脂肪酸也有相应的升高，文献报道，短链脂肪酸含量升高可增加肠道内渗透压，降低PH，增加粪便含水量，有利于粪便排出。
表3便秘小鼠短链脂肪酸(SCFAs)的含量
Figure GDA0003535374690000121
实施例11：副干酪乳杆菌CCFM1069提高小鼠结肠中Aqp4基因的转录水平
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定相关蛋白的表达量。取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，按说明书用Trizol法提取总RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL Trizol试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15 min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1mL用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA 溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量。以提取的总RNA为模板，根据TaKaRa公司的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作步骤逆转录合成cDNA，-20℃下保存。
小鼠Aqp4基因和内参基因mGAPDH基因引物如表4所示：
表4小鼠c-kit蛋白基因和mGAPDH基因引物序列
Figure GDA0003535374690000131
qRT-PCR反应体系及条件：
用
Figure GDA0003535374690000132
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。 c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
Figure GDA0003535374690000133
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃2min；95℃30S，59℃30S，72℃，20s，共38个循环。以mGAPDH基因为内参照，CFX96Manager软件分析结果。AQP4蛋白(水通道蛋白4)是细胞膜表面的一种蛋白质，控制着水在细胞内外的进出。若其表达量变高，则证明其数量增多，导致结肠从粪便中吸水增多，导致粪便含水量下降，粪便干结，不易排除。实验结果如图10所示，由图可知，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的Aqp4基因转录水平显著上升。灌胃副干酪乳杆菌CCFM1069的小鼠，其Aqp4 基因转录水平显著下降，且下降程度大于酚酞组。以上结果说明，灌胃副干酪乳杆菌CCFM1069通过降低便秘小鼠结肠中AQP4蛋白的数量，防止结肠从粪便中过度吸水，从而提高便秘小鼠粪便中含水量，促进粪便排出。
实施例12：体外具有良好的PFOA吸附能力
菌体吸附对副干酪乳杆菌CCFM1069进行纯化和活化培养，按1％(v/v) 接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h。然后在8000r/min离心5min 收集菌体，取沉淀用生理盐水清理后继续在8000r/min离心5min，去沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬于50mg/LPFOA溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬于不含PFOA的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOA溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(少于0.5ml)其离子强度对PFOA吸附的影响可以忽略。随后将装有100ml样液的250ml锥形瓶置于37℃、150rpm摇床培养，6h后取样测定，2次平行试验取平均值。
PFOA吸附量的测定：吸附实验后，样液在8000r/min离心5min，并用 0.22μm的水膜过滤，PFOA浓度用具有Waters SYNAPT MS系统的UPLC-MS 测定，采用Acquity UPLC BEHc18柱(2.1×100mm，1.7μm，WatersCo.)，柱温35℃，进样量1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v) 甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min。
表5梯度洗脱条件
t/min 0-0.5 0.5-5.0 5.0-7.0 7.0-7.5
溶剂A比例 70％ 70-100％ 100％ 100-70％
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)；3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；Source Temperature(放射源温度)：120℃；Desolvation (去溶剂化)温度：400℃；Conc Gas Flow：50L/h；Desolvation Gas Flow：700L/h. 气体流速为0.1ml/min；质子比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(Waters公司)分析；根据吸附前后PFOA的浓度差异计算乳酸菌对PFOA的吸附量。测定结果列于图11，副干酪乳杆菌CCFM1069 对50mg/L的PFOA的吸附率为62.98％±4.19％，明显优于其他两株菌对于 PFOA的吸附效果。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）CCFM1069，于2019年07月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60719。
2.权利要求1所述副干酪乳杆菌CCFM1069在制备菌剂中的应用。
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