CN110387342A - 鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110387342A
CN110387342A CN201910769228.XA CN201910769228A CN110387342A CN 110387342 A CN110387342 A CN 110387342A CN 201910769228 A CN201910769228 A CN 201910769228A CN 110387342 A CN110387342 A CN 110387342A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ccfm1068
lactobacillus rhamnosus
food
drug
microbial inoculum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910769228.XA
Other languages
English (en)
Inventor
陈卫
王刚
杨树荣
赵建新
张灏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910769228.XA priority Critical patent/CN110387342A/zh
Publication of CN110387342A publication Critical patent/CN110387342A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
    • A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
    • A23C11/106—Addition of, or treatment with, microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/50—Fermented pulses or legumes; Fermentation of pulses or legumes based on the addition of microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/175—Rhamnosus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了鼠李糖乳杆菌CCFM1068及其应用，鼠李糖乳杆菌CCFM1068能够在肠道内快速定植，显著提高粪便含水量、提高小肠推进率、缩短排首粒黑便时间、下调血清中酪酪肽含量、上调结肠组织中5‑羟色胺水平、上调结肠组织中神经营养因子‑3水平、上调结肠组织脑源性神经营养因子、上调结肠组织中Aqp4基因转录水平。此外，对全氟辛酸有较强的吸附能力，具有缓解PFOA毒性的能力。鼠李糖乳杆菌CCFM1068能很好的耐受模拟胃肠液，可用于制备缓解便秘和PFOA毒性的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

鼠李糖乳杆菌CCFM1068及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及鼠李糖乳杆菌CCFM1068及其应用。
背景技术
近年来，随着我国社会经济水平的不断发展，大众的生活水平不断改善，饮食结构中碳水化合物、油脂的比重日益增加、粗纤维的比重逐渐下降。饮食结构的改变，使得人们的肠道菌群也慢慢发生改变。研究表明，便秘人群和正常人群的肠道菌群存在着显著差异。目前益生菌干预肠道菌群成为了研究热点，所以可以通过介导肠道菌群，从而缓解便秘。
便秘具有许多症状，其主要表现为：排便费力、硬便、想排便但没有的感觉,排便频率减少或排便不尽感；排便每周少于3次,每天粪便的重量<35g或≥25％的时间感到排便费力；结肠的转运时间延长。
目前用于治疗便秘的药物主要分为容积性泻药、渗透性泻药、刺激性泻药、润滑性泻药。但这些泻药都存在着其个别缺点，比如：容积性泻药一般需要几天才能发挥作用，且不适合于结肠无力、肠道运动功能差的患者；刺激性泻药因其大多含有蒽醌类物质，长期服用会引起药物依赖、结肠病变甚至诱发肠息肉。益生菌调节肠道菌群，调节免疫力，还可以调节胃肠道紊乱。益生菌安全有效，且可以长期服用，具有良好的商业和医学前景。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供鼠李糖乳杆菌CCFM1068，其保藏编号为GDMCC No：60718。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：鼠李糖乳杆菌 CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其中：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068能够用于制备提高粪便含水量的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备提高小肠推进率的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备下调血清中酪酪肽含量、提高胃肠道动力的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备提高结肠中5-HT的含量、提高结肠动力的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备吸附PFOA、缓解PFOA毒性的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备提升结肠中NT-3的表达、加速全肠道排空速度的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备肠道内快速定植的菌剂、食品和/或药物。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述食品，包括发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。
作为本发明所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/ 或药物中的应用的一种优选方案：所述乳制品包括牛奶、酸奶油或干酪；所述豆制品包括豆奶、豆豉或豆酱；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。
本发明的有益效果：鼠李糖乳杆菌CCFM1068能够在肠道内快速定植，显著提高粪便含水量、提高小肠推进率、缩短排首粒黑便时间、下调血清中酪酪肽(PYY)含量、上调结肠组织中5-羟色胺(5-HT)水平、上调结肠组织中神经营养因子-3(NT-3)水平、上调结肠组织脑源性神经营养因子(BDNF)、上调结肠组织中Aqp4基因转录水平。此外，对全氟辛酸(PFOA)有较强的吸附能力，具有缓解PFOA毒性的能力。所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068能很好的耐受模拟胃肠液，可用于制备缓解便秘和PFOA毒性的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是鼠李糖乳杆菌CCFM1068的菌落形态；
图2是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠排首粒黑便时间的影响；
图3是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠小肠推进率的影响；
图4是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠粪便含水量的影响；
图5是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠血清酪酪肽(PYY)水平的影响；
图6是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠结肠中5-羟色胺(5-HT)水平的影响；
图7是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠结肠中神经营养因子-3(NT-3)水平的影响；
图8是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠结肠中脑源神经营养因子神经营养因子(BDNF)水平的影响；
图9是鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠结肠中Aqp4基因转录水平的影响；
注：a,b,c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
鼠李糖乳杆菌CCFM1068(Lactobacillus rhamnosus)，于2019年07月10 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59 号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60718。
鼠李糖乳杆菌CCFM1068具有下述生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：有氧或厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm 之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，奶油白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。
(3)生长特性：在37℃恒温有氧或厌氧的条件下，在mMRS培养基中培养约16小时达到对数末期。
(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力；
(5)显著缩短便秘小鼠排首粒黑便时间；
(6)显著提高便秘小鼠小肠推进率；
(7)显著提高便秘小鼠粪便含水量；
(8)显著提高便秘小鼠结肠中脑源神经营养因子(BDNF)；
(9)显著提高便秘小鼠血清酪酪肽(PYY)水平；
(10)显著提高便秘小鼠结肠中5-羟色胺(5-HT)水平；
(11)显著提高便秘小鼠结肠中神经营养因子-3(NT-3)水平；
(12)显著提高便秘小鼠结肠中Aqp4基因转录水平；
(13))具有较强吸附全氟辛酸(PFOA)的能力。
本菌株的提取方法为：
(一)乳酸菌的分离筛选：
(l)取1g来自健康人群的新鲜粪便。将样品在含有山梨醇GM17培养基中35℃富集12h；
(2)将富集样品进行梯度稀释后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的GM17 固体平板上，培养24～48h；
(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌目基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
(4)将上述单菌落培养于液体GM17培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
(二)发酵用乳酸菌的初步鉴定：溶钙圈测定法
(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体山梨醇GM17培养液中培养24h，然后取lmL培养物8000rpm离心2min；
(2)用0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)将所得菌泥重悬，划线在山梨醇GM17-0.75％CaCO3的固体培养基上，培养24h；
(4)选取溶钙圈明显，且呈凸面圆形、细密色白、无菌丝体的菌落，革兰氏染色后显微镜观察菌体进行初步判定。
(三)发酵用乳酸菌的分子生物学鉴定：
(l)单菌基因组抽提：
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液l mL 于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
B.用lmL无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
C.加入200μLSDS裂解液，80℃水浴30min；
D.加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μL；
E.加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，﹣20℃静置1h， 12000rpm离心5-10min，弃上清；
F.加入500μL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；
G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
H.50μLddH2O重溶沉淀以备PCR；
(2)16S rDNA PCR
A.细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系：
10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶， 0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，38μL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃ 2min；
(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量5μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用 BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为属于鼠李糖乳杆菌的一种新发现的菌株，-80℃保藏备用。
实施例1：鼠李糖乳杆菌CCFM1068对模拟胃肠液具有良好的耐受性
将冷冻保存的鼠李糖乳杆菌CCFM1068接种于mMRS培养基(MRS培养基 +0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mMRS培养液传代培养2～3次后，取1mL鼠李糖乳杆菌CCFM1068的培养液，与9.0mL pH 2.5 人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、pH＝2.5的mMRS培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。取取1mL鼠李糖乳杆菌CCFM1068的培养液加入9mL人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的mMRS培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，用mMRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，鼠李糖乳杆菌CCFM1068对人工胃肠液具有较好的耐受性。
表1鼠李糖乳杆菌CCFM1068在人工模拟胃液中的耐受性
表2鼠李糖乳杆菌CCFM1068在人工模拟肠液中的耐受性
实施例2：鼠李糖乳杆菌CCFM1068对BALB/C小鼠无毒副作用
将鼠李糖乳杆菌CCFM1068菌体重悬于2％的蔗糖溶液中，制成浓度为3.0 ×109CFU/mL的菌悬液。取体重16-20g左右的健康雄性BALB/C小鼠8只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。
这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度3.0×109CFU/mL的鼠李糖乳杆菌CCFM1068未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表3小鼠体重的变化及死亡情况
注：-：小鼠无死亡
实施例3：鼠李糖乳杆菌CCFM1068对便秘小鼠排首粒黑便的影响
将鼠李糖乳杆菌CCFM1068菌种于-80℃冰箱取出后，划线于MRS平板中， 37℃培养48h，挑取单菌落于MRS液体管中，37℃培养18h，以2％的体积量接种于新的MRS液体培养基中，于37℃培养18h，按照同样的方式再次培养一代，然后将乳酸菌菌悬液在8000r/min、4℃条件下离心8min，然后用3％的蔗糖溶液进行重悬，制得菌悬液，放于-80℃冰箱冻存。
取6周龄的健康雄性Balb/C小鼠30只，适应环境1周，随机分为5组：空白对照组(NC)、模型对照组(M)、酚酞对照组(RH)、鼠李糖乳杆菌CCFM1068 干预组(CCFM1060)、鼠李糖乳杆菌4-1对照组(4-1)，每组含小鼠6只，灌胃发酵物的剂量为每天每只小鼠0.2mL。实验动物分组及处理方法见表4：
表4实验动物分组
在第29天，空白组给予0.2ml无菌水、模型组和灌菌组均给予0.2ml盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，1h后，所有组别灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠首粒排黑便的时间。
实验结果如图2所示，便秘模型小鼠排首粒黑便时间显著大于正常组小鼠，灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1068后，能显著缩短便秘小鼠的排首粒黑便时间，且其效果和泻剂酚酞相当，优于灌胃鼠李糖乳杆菌4-1组别。
实施例4：鼠李糖乳杆菌CCFM1068显著提高便秘小鼠小肠推进率
Balb/C小鼠分组、造模同实施例2。第30天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第31天上午8点空白组给予0.2ml 3％蔗糖溶液、模型组和灌菌组均给予0.2ml 盐酸洛哌丁胺溶液(10mg/kg b.w)，30min后，空白组和模型组灌胃墨汁，四组灌菌组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照以下公式计算小肠推进率。
小肠推进率(％)＝(墨汁推进长度(cm))/(小肠总长度(cm))×100
实验结果如图3所示。模型组小鼠小肠推进率显著低于正常组，灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1068后明显提高了便秘小鼠的小肠推进率水平并接近于空白对照组，且与泻剂酚酞组相当。
实施例5：鼠李糖乳杆菌CCFM1068提高便秘小鼠粪便含水量
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。在第28天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照如下公式计算粪便含水量。
粪便含水量＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重
实验结果如图4所示，模型组小鼠在接受洛哌丁胺处理后，粪便中的含水量与正常组相比显著降低。灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1068后，便秘小鼠粪便中的含水量与模型组小鼠相比得到了显著的提高，而酚酞处理组含水量没有显著变化。
实施例6：鼠李糖乳杆菌CCFM1068降低便秘小鼠血清酪酪肽(PYY)的水平
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。第30天处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中血清中PYY的浓度。有研究表明PYY能减缓胃排空，减缓胃肠道动力。
实验结果如图5所示，由图5可知，鼠李糖乳杆菌CCFM1068组相比于模型组，能显著下调便秘小鼠血清PYY的含量，且下调能力优于鼠李糖乳杆菌4-1 组和酚酞对照组。由实验结果可知，鼠李糖乳杆菌CCFM1068组能通过下调血清中PYY的含量加速胃肠道动力，缓解肠道蠕动减慢的便秘症状。
实施例7：鼠李糖乳杆菌CCFM1068提高便秘小鼠结肠中5-羟色胺(5-HT)的水平
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(按照1:9的重量体积比)，在高通量组织破碎仪上进行破碎，最后将匀浆与5000×g离心5-10分钟，取上清检测，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中组织中5-HT。
实验结果如图6所示，便秘模型小鼠与空白组相比，其结肠组织中5-HT出现了显著降低的现象，已知文献报道，5-HT能增加结肠收缩，加速肠道蠕动。由图7可知鼠李糖乳杆菌CCFM1068能显著提升便秘小鼠结肠组织中5-HT的含量至正常水平，且其效果明显优酚酞组。这说明鼠李糖乳杆菌CCFM1068可以通过提高结肠中5-HT的含量提高结肠动力。
实施例8：鼠李糖乳杆菌CCFM1068提高便秘小鼠结肠神经营养因子-3(NT-3)的水平
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(按照1:9的重量体积比)，在高通量组织破碎仪上进行破碎，最后将匀浆与5000×g离心5-10分钟，取上清检测，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中组织中NT-3。
实验结果如附图7所示。经过洛哌丁胺造成便秘后，模型组结肠中NT-3显著低于空白组。从图7我们发现鼠李糖乳杆菌CCFM1068能显著提升便秘小鼠结肠中的NT-3水平。经研究NT-3能加速全肠道排空速度。所以可知，鼠李糖乳杆菌CCFM1068能提升便秘小鼠结肠中NT-3的水平从而缓解便秘。
实施例9：鼠李糖乳杆菌CCFM1068提高便秘小鼠结肠脑源性神经营养因子(BDNF)的水平
BALB/C小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(按照1:9的重量体积比)，在高通量组织破碎仪上进行破碎，最后将匀浆与5000×g离心5-10分钟，取上清检测，参照相应试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中组织中BDNF。
实验结果如附图8所示。经过洛哌丁胺造成便秘后，模型组结肠中BDNF 显著低于空白组。从图8我们发现鼠李糖乳杆菌CCFM1068能显著提升便秘小鼠结肠中的BDNF水平。经研究BDNF能加速全肠道排空速度。所以可知，鼠李糖乳杆菌CCFM1068能提升便秘小鼠结肠中BDNF的水平从而缓解便秘。
实施例10：鼠李糖乳杆菌CCFM1068提高小鼠结肠中Aqp4基因的转录水平
Balb/c小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)来测定相关蛋白的表达量。取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，按说明书用Trizol法提取总RNA，具体方法如下：
将小鼠解剖后取出的新鲜结肠组织0.2g在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL Trizol试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入 200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15 min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1m L用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA 溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量。以提取的总RNA为模板，根据TaKaRa公司的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作步骤逆转录合成c DNA，-20℃下保存。
小鼠Aqp4基因和内参基因mGAPDH基因引物如表5所示。
表5小鼠c-kit蛋白基因和mGAPDH基因引物序列
qRT-PCR反应体系及条件：
用Bio-CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
c-kit基因qRT-PCR反应体系为：
c-kit基因qRT-PCR反应条件为：
95℃2min；95℃30S，59℃30S，72℃，20s,共38个循环。以mGAPDH基因为内参照，CFX96Manager软件分析结果。AQP4蛋白(水通道蛋白4)是细胞膜表面的一种蛋白质，控制着水在细胞内外的进出。若其表达量变高，则证明其数量增多，导致结肠从粪便中吸水增多，导致粪便含水量下降，粪便干结，不易排除。实验结果如图9所示，由图可知，灌胃洛哌丁胺后，便秘模型小鼠的Aqp4 基因转录水平显著上升。灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1068的小鼠，其Aqp4基因转录水平显著下降，且下降程度大于酚酞组。以上结果说明，灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1068通过降低便秘小鼠结肠中AQP4蛋白的数量，防止结肠从粪便中过度吸水，从而提高便秘小鼠粪便中含水量，促进粪便排出。
实施例11：体外具有良好的PFOA吸附能力
菌体吸附对鼠李糖乳杆菌CCFM1068进行纯化和活化培养，按1％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h。然后在8000r/min离心5min 收集菌体，取沉淀用生理盐水清理后继续在8000r/min离心5min，去沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬于50mg/LPFOA溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬于不含PFOA的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOA溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(少于0.5ml)其离子强度对PFOA吸附的影响可以忽略。随后将装有100ml样液的250ml锥形瓶置于37℃、150rpm摇床培养，6h后取样测定，2次平行试验取平均值。
PFOA吸附量的测定：吸附实验后，样液在8000r/min离心5min，并用 0.22μm的水膜过滤，PFOA浓度用具有SYNAPT MS系统的UPLC-MS 测定，采用Acquity UPLC BEHc18柱(2.1×100mm，1.7μm，Co.)，柱温35℃，进样量1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v)甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min。
表6梯度洗脱条件
t/min 0-0.5 0.5-5.0 5.0-7.0 7.0-7.5
溶剂A比例 70％ 70-100％ 100％ 100-70％
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)；3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；Source Temperature(放射源温度)：120℃；Desolvation (去溶剂化)温度：400℃；Conc Gas Flow：50L/h；Desolvation Gas Flow：700L/h. 气体流速为0.1ml/min；质子比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(公司)分析；根据吸附前后PFOA的浓度差异计算乳酸菌对PFOA的吸附量。测定结果表明，鼠李糖乳杆菌CCFM1068对50mg/L 的PFOA的吸附率为79.64％±5.47％。
表7 PFOA吸附率测试
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.鼠李糖乳杆菌CCFM1068，其保藏编号为GDMCC No：60718。
2.鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068能够用于制备提高粪便含水量的菌剂、食品和/或药物。
3.权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备提高小肠推进率的菌剂、食品和/或药物。
4.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备下调血清中酪酪肽含量、提高胃肠道动力的菌剂、食品和/或药物。
5.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备提高结肠中5-HT的含量、提高结肠动力的菌剂、食品和/或药物。
6.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备吸附PFOA、缓解PFOA毒性的菌剂、食品和/或药物。
7.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备提升结肠中NT-3的表达、加速全肠道排空速度的菌剂、食品和/或药物。
8.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌CCFM1068还能够用于制备肠道内快速定植的菌剂、食品和/或药物。
9.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述食品，包括发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。
10.如权利要求2或3所述的鼠李糖乳杆菌CCFM1068在制备功能性菌剂、食品和/或药物中的应用，其特征在于：所述乳制品包括牛奶、酸奶油或干酪；所述豆制品包括豆奶、豆豉或豆酱；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。
CN201910769228.XA 2019-08-20 2019-08-20 鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用 Pending CN110387342A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910769228.XA CN110387342A (zh) 2019-08-20 2019-08-20 鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910769228.XA CN110387342A (zh) 2019-08-20 2019-08-20 鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110387342A true CN110387342A (zh) 2019-10-29

Family

ID=68289288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910769228.XA Pending CN110387342A (zh) 2019-08-20 2019-08-20 鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110387342A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111000247A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 扬州江大食生一生食品有限公司 一种复合益生菌粉的制备方法
CN112322528A (zh) * 2020-11-03 2021-02-05 江南大学 一株可干预代谢综合征的鼠李糖乳杆菌及应用
CN113025530A (zh) * 2021-03-30 2021-06-25 江南大学 一株缓解泻剂结肠的两歧双歧杆菌及其应用
CN114774313A (zh) * 2022-04-13 2022-07-22 微康益生菌(苏州)股份有限公司 鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途
CN116420831A (zh) * 2023-06-01 2023-07-14 山东向日葵生物工程有限公司 一种鼠李糖乳杆菌sf-l30在制备改善机体血清素水平发酵饮品中的应用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111000247A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 扬州江大食生一生食品有限公司 一种复合益生菌粉的制备方法
CN112322528A (zh) * 2020-11-03 2021-02-05 江南大学 一株可干预代谢综合征的鼠李糖乳杆菌及应用
CN113025530A (zh) * 2021-03-30 2021-06-25 江南大学 一株缓解泻剂结肠的两歧双歧杆菌及其应用
CN113025530B (zh) * 2021-03-30 2022-11-01 江南大学 一株缓解泻剂结肠的两歧双歧杆菌及其应用
CN114774313A (zh) * 2022-04-13 2022-07-22 微康益生菌(苏州)股份有限公司 鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途
CN114774313B (zh) * 2022-04-13 2024-01-26 微康益生菌(苏州)股份有限公司 鼠李糖乳杆菌LRa05在制备缓解便秘制品或调解肠道菌群制品方面的用途
CN116420831A (zh) * 2023-06-01 2023-07-14 山东向日葵生物工程有限公司 一种鼠李糖乳杆菌sf-l30在制备改善机体血清素水平发酵饮品中的应用
CN116420831B (zh) * 2023-06-01 2023-08-22 山东向日葵生物工程有限公司 一种鼠李糖乳杆菌sf-l30在制备改善机体血清素水平发酵饮品中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110387342A (zh) 鼠李糖乳杆菌ccfm1068及其应用
CN111436203B (zh) 一株发酵植物乳杆菌及其用途
CN111117907B (zh) 副干酪乳杆菌ccfm1069及其应用
CN107893044B (zh) 一株长双歧杆菌及其应用
CN108728382B (zh) 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用
CN104694409B (zh) 植物乳杆菌及其用途
CN108048368B (zh) 一株植物乳杆菌ua-416株及其应用
CN110305820A (zh) 鼠李糖乳杆菌ccfm1064及其应用
CN108384735A (zh) 植物乳杆菌ccfm1019、其发酵食品及其在制备药物中的应用
CN110343642A (zh) 一种发酵乳杆菌及其冻干粉的制备方法
CN110144304A (zh) 干酪乳杆菌菌株及其应用
CN111925961B (zh) 一株植物乳杆菌Lp2及其应用
CN109481476A (zh) 发酵乳杆菌cqpc04在制备改善溃疡性结肠炎的食品或药品中的应用
CN107227278A (zh) 一种植物乳杆菌a11及其应用
CN110468070A (zh) 鼠李糖乳杆菌ccfm1060、其发酵食品及菌剂制备方法
CN113943681B (zh) 一株降低炎症反应且具有缓解便秘作用的长双歧杆菌
CN103911306B (zh) 加氏乳杆菌菌株及其用途
CN104430847A (zh) 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum Lee工作发酵剂制品及其预防便秘保健用途
CN111849836B (zh) 一种具有抗氧化的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN109628346A (zh) 发酵乳杆菌cqpc04及其在制备改善便秘的食品中的应用
CN109251877A (zh) 一种具有减脂等功能的纳豆芽孢杆菌Bn-SJLH001益生作用及其应用
CN108330086A (zh) 一种产胞外多糖空间植物乳杆菌ss18-33及其在提高生物抗氧化活性中的应用
CN104877940B (zh) 一株嗜热链球菌
CN110226630A (zh) 缓解pfoa毒害作用的多功能布氏乳杆菌ccfm1053、其发酵食品及应用
CN108373983A (zh) 戊糖片球菌ccfm1012、其发酵食品及其在制备拮抗空肠弯曲杆菌感染药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination