CN111154753A - 一种磁珠法细菌核酸提取液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁珠法细菌核酸提取液，包括以下组分：稀土化合物、酸性缓冲液、表面活性剂和螯合剂。利用稀土化合物和表面活性剂的配合使用，使细菌核酸提取效率更高，提取时间更短。

Description

一种磁珠法细菌核酸提取液
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种磁珠法细菌核酸提取液
背景技术
核酸提取中最经典的方法是酚－氯仿法，利用核酸、蛋白质等物质在不同溶剂中溶解度不同而进行核酸分离。酚－氯仿法经典、便宜，但其具有毒性且耗费时间较长，不能满足快速、高效提取核酸的需求。此外，市面上的细菌提取试剂多采用煮沸法，虽然操作便利，但核酸的产量及纯度较低，会直接影响下游检测结果。磁珠法核酸提取是目前运用广泛的一种快速提取核酸的方法，具有磁性的微粒可以结合特定抗体，在液相中能特异性地与相应的抗原结合，依靠磁场完成分离，从而达到富集纯化样品的目的。
现在市场运用最多的磁珠法提取试剂，都是利用表面活性剂实现对细胞膜的脂双层结构的破坏和通过使DNA酶和RNA酶变性失活，对核酸起到保护作用。但单纯的表面活性剂对细胞的裂解效果并不是十分理想，存在裂解不彻底，耗时较长等问题。
稀土元素是元素周期表IIIB族中原子序数为21、39和57-71的17种化学元素的统称。稀土化合物因为具有抑菌甚至杀菌的作用，在医药学、病理学领域具有广泛的应用前景。国内外研究者对于稀土化合物的抑菌，杀菌和促进细菌生长机理已有大量研究。稀土化合物主要分为稀土配合物和稀土盐。稀土多元配合物的抑菌作用优于单独的稀土盐和配体，但需要合成。相对于稀土多元配合物，稀土盐的优点在于，可以直接应用而不用再次合成，操作简单。但到目前为止，稀土盐在生物医药上的应用还是局限于抑菌剂、杀菌剂与消毒剂等。
基于上述问题，本发明将稀土化合物和表面化形剂相配合组成细菌核酸提取液，扩大稀土化合物的应用范围，并能使细菌核酸提取过程的裂解更彻底，耗时更短。
发明内容
本发明的一个方面是针对现有技术使用表面活性剂裂解细胞存在的问题，提供了一种磁珠法细菌核酸提取液。
为了解决上述问题，本发明的技术方案为：
一种磁珠法细菌核酸提取液，所述提取液包括稀土化合物、酸性缓冲液、表面活性剂和螯合剂。
优选地，所述提取液包括1-10mM稀土化合物；酸性缓冲液、表面活性剂和螯合剂
更优选地，所述提取液包括1-10mM稀土化合物；50-200mM、pH3-7的酸性缓冲液；10-50mMKCl；0.1％-0.4％表面活性剂；1-50mM螯合剂。
优选地，酸性缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、HEPES缓冲液或碳酸缓冲液中一种。
优选地，所述稀土化合物选自稀土盐。
进一步优选，所述稀土盐选自稀土氯化盐、稀土硫酸盐或稀土硝酸盐。
稀土盐中的稀土元素为元素周期表中17种稀土元素中的一种，优选地，所述稀土盐中的稀土元素选自轻稀土元素。
更优选地，所述轻稀土元素选自La、Ce、Nd或Eu。
优选地，所述提取液中含有的表面活性剂选自SDS、NP-40、N-月桂酰肌氨酸钠、Tween80或Triton X-100中的一种或多种。
优选地，所述提取液中含有的螯合剂选自EDTA、NTA或柠檬酸。
另一方面，本发明涉及一种磁珠法细菌核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括上述的提取液。
本发明的另一个方面是一种磁珠法全血核酸的提取方法，包括以下步骤：
(1)混合上述提取液、样本、蛋白酶K和磁珠溶液，进行裂解提取；
(2)用洗涤液洗涤，吸磁，去上清液；
(3)加洗脱液进行洗脱。
另一方面本发明公开了稀土化合物在核酸提取和/或制备核酸提取相关试剂中的应用。
所述磁珠法提取核酸中的磁珠可以为市售磁珠法核酸提取中所用的任意常规磁珠，提取液、蛋白酶K、磁珠可以按任意比例混合，作为优选体积比为：200-250:5-15:1-10，更优选体积比为250:10:3。
作为优选，磁珠选用超顺磁性氧化硅纳米微球。
所述洗涤液和洗脱液可以为市售磁珠法核酸提取中所用的洗涤液和洗脱液，优选为：
洗涤液：Tris-HCl130mM、KCl30mM、60％异丙醇；
洗脱液：Tris-HCl130mM、KCl5mM。
文中所有的％，均为体积百分含量，表示溶液浓度。
本发明的有益效果为：
本发明磁珠法细菌核酸提取液可以充分、有效的裂解细菌细胞。此外本发明可以减少表面活性剂的用量，同时本提取液性质温和稳定，不受温度影响。
在本发明技术方案中，创造性地使用稀土化合物和表面活性剂配合进行细菌核酸提取。可以充分裂解细菌细胞，减少表面活性剂用量并减少裂解时间。
本发明提取液不使用乙醇、异丙醇、胍盐等，可以避免胍盐的不稳定和醇类对盐类物质的稀释作用而导致核酸提取效果下降的问题。
具体实施方式
本发明公开了一种磁珠法细菌核酸提取液，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
制备例1-17细菌核酸提取液的制备
所述细菌优选为金黄色葡萄球菌(拉丁名Staphyloccocusaureus、菌株号ATCC25923)
制备例1-17为细菌核酸提取液的实施方案的筛选，通过不同组分及条件的配合，考察稀土元素和表面活性剂配合对金黄色葡萄球菌核酸提取的影响，核酸提取液组分如表1所示。
制备例1-17通用的制备方法为：1)将一定量稀土化合物(NdCl3)，酸性缓冲液(pH6的Tris-HCl)，表面活性剂,螯合剂(EDTA)混合。
表1核酸提取液组分
Figure BDA0002405024870000031
Figure BDA0002405024870000041
提取复苏培养过夜的菌液离心沉淀重悬液
磁珠法核酸提取过程如下：
A、取500uL核酸提取液与蛋白酶K和磁珠悬液混合，其中磁珠为超顺纳米磁微粒
B、裂解10min
C、离心，吸取上清液
D、加入洗涤液，清洗2次，去除上清
E、加入洗涤液，取上清检测
其中，所述洗涤液和洗脱液可以为市售磁珠法核酸提取中所用的洗涤液和洗脱液，优选为：
洗涤液：Tris-HCl130mM、KCl30mM,60％异丙醇
洗脱液：Tris-HCl130mM、KCl5mM。
实施例1
探究稀土盐和表面活性剂配合使用的提取效果，结果如表2所示。
为了验证本发明提取液与多种表面活性剂配合提取液的差异，利用不同浓度的稀土盐替换一种甚至几种表面活性剂
为了与多种表面活性剂配合提取液相比，稀土盐NdCl3与N-月桂酰肌氨酸钠浓度保持一致
表2提取效果
制备例 核酸提取浓度(ng/uL) OD260/280 OD260/230
1 32.055 1.55 1.74
2 88.352 1.87 2.03
3 32.428 1.75 1.86
4 38.759 1.78 1.92
从制备例1-4对核酸的提取，可以得出结论：只有稀土化合物没有表面活性剂，提取浓度与只用表面活性剂相当，但是纯度更低，不利于核酸提取。
从制备例2-4对核酸的提取，可以得出：用同样浓度的1％曲通X-100，本发明用2.5mMNdCl3代替0.25％N-月桂酰肌氨酸钠，提取量约为两种表面活性剂叠加使用的3倍。用2.5mMNdCl3代替0.25％N-月桂酰肌氨酸钠和0.1％SDS，提取量约为三种表面活性剂叠加使用的2.3倍.
综上所述：稀土盐和表面活性剂的配合使用，比表面活性剂彼此配合使用或者单纯的稀土化合物使用提取效率更高，具有更高的提取浓度和纯度，更适合用在细菌核酸提取中。
实施例2
在制备例5-7的基础上，探究核酸提取浓度均在35-40ng/uL之间，三种提取液各自需要添加的曲通X-100含量，结果如表3所示。
表3表面活性剂用量
制备例 曲通X-100％
5 0.35
6 1.2
7 1
试验结果表明，
三种表面活性剂的叠加达到相同提取效果曲通X-100用量少于两种表面活性剂的叠加曲通X-100的用量，而曲通X-100与稀土化合物配合使用时用量最少；
稀土盐的加入，可以用更少的表面活性剂达到相同的提取效果，即，稀土盐和表面活性剂的配合使用，比表面活性剂彼此配合使用效率更高
实施例3
在制备例2-4的基础上，利用三种提取液，通过上述提取方法，探究提取时间与提取浓度的关系，结果如表4所示。
表4不同时间提取浓度
Figure BDA0002405024870000051
结果表明：制备例2的最佳裂解时间在3-7min，7min以后随着时间的增加，裂解浓度变化并不明显，说明已经裂解完成。制备例3、制备例4的裂解时间在13min裂解量还在持续增加，说明没有裂解完全。
利用稀土和表面活性剂的配合作用，比单纯的叠加，裂解时间更短，完全裂解只需要一半的时间，且裂解量更大。
实施例4
探究稀土盐与表面活性剂配合的最佳浓度范围
根据制备例8-12，探究最适的稀土化合物浓度，结果如表5所示。
表5稀土化合物浓度探究
制备例 8 9 10 11 12
提取浓(ng/uL) 12.566 68.752 87.214 94.493 94.981
OD260/280 1.64 1.81 1.82 1.82 1.81
OD260/230 1.87 1.91 2.02 2.11 1.97
随之浓度升高提取效果提高，但是超过10mM之后，没有明显上升，继续增加浓度会浪费原料，所以取1-10mM的稀土盐
根据制备例13-17，探究最适的表面活性剂浓度，结果如表6所示。
表6表面活性剂浓度探究
制备例 13 14 15 16 17
提取浓度(ng/uL) 35.795 82.752 87.214 90.493 90.812
OD260/280 1.57 1.80 1.82 1.83 1.82
OD260/230 1.72 1.93 2.02 2.08 2.01
随之浓度升高提取效果提高，但是超过1％之后，没有明显上升，继续增加浓度会浪费原料，所以取0.1-1％的表面活性剂
实施例4
对多种不同细菌的提取效果
利用制备例14的提取液，提取浓度107cfu/mL的革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(sa)，枯草芽孢杆菌(BS)和
革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Ec)的核酸，结果如表7所示。
表7不同菌提取结果
sa Ec BS
提取浓度 82.752 93.465 77.663
OD260/280 1.80 1.82 1.77
OD260/230 1.93 2.04 1.87
革兰氏阴性菌细胞壁较薄，所以更容易被破碎提取
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的提取量高于枯草芽孢杆菌，相对而言，本提取液对金黄色葡萄球菌的提取效率更高
实施例5
在制备例18的基础上，分别加入三种不同的稀土氯化物(5mM)，比较不同稀土化合物对实施例4中细菌的提取量，结果如表8所示。
分别为两种轻稀土：PrCl3、LaCl3，一种重稀土ErCl3。
表8不同稀土化合物对细菌的提取浓度
Figure BDA0002405024870000071
从表中可以看出，不同稀土盐提取会有差别，轻稀土盐的提取效果优于重稀土盐，革兰氏阴性菌优于革兰氏阳性菌；且在革兰氏阳性菌中，对于金黄色葡萄球菌的提取效果佳，基本与革兰氏阴性菌提取量相当，但即使效果不佳，依旧大于单纯表面活性剂叠加的提取浓度，所以稀土和表面活性剂配合的提取液适合用于细菌提取，更适合用于革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌的提取。
实施例6
替换提取液组分，探究不同组分，提取液对金黄色葡萄球菌的裂解效果
提取液成分如表9所示，提取结果如表10所示。
表9核酸提取液组分
制备例 稀土化合物5mM 表面活性剂0.1％ 螯合剂5mM 缓冲液130mM
19 NdCl<sub>3</sub> 曲通X-100 EDTA 磷酸缓冲液
20 NdCl<sub>3</sub> 曲通X-100 柠檬酸 Tris-HCl缓冲液
21 PrCl<sub>3</sub> 曲通X-100 EDTA Tris-HCl缓冲液
22 NdCl<sub>3</sub> SDS EDTA Tris-HCl缓冲液
23 NdCl<sub>3</sub> 曲通X-100 柠檬酸 磷酸缓冲液
24 NdCl<sub>3</sub> SDS NTA Tris-HCl缓冲液
25 PrCl<sub>3</sub> SDS EDTA Tris-HCl缓冲液
26 PrCl<sub>3</sub> Tween80 柠檬酸 醋酸缓冲液
表10核酸成分更换的提取结果
Figure BDA0002405024870000072
Figure BDA0002405024870000081
结果表明，只要保持稀土化合物和表面活性剂相互配合作用，提取液的组分被替换裂解效果还是能稳定维持。

Claims (10)

1.一种磁珠法细菌核酸提取液，其特征在于，所述提取液包括稀土化合物、酸性缓冲液、表面活性剂和螯合剂。
2.根据权利要求1所述的提取液，其特征在于，所述提取液包括1-10mM稀土化合物；50-200mM Tris-HCl缓冲液；0.1％-1％表面活性剂和1-50mM螯合剂。
3.根据权利要求1或2所述的提取液，其特征在于，所述稀土化合物选自稀土盐。
4.根据权利要求3所述的提取液，其特征在于，所述稀土盐选自稀土氯化盐、稀土硫酸盐或稀土硝酸盐。
5.根据权利要求3所述的提取液，其特征在于，所述稀土盐中的稀土元素选自轻稀土元素。
6.根据权利要求5所述的提取液，其特征在于，所述轻稀土元素选自La、Ce、Nd或Eu。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的提取液，其特征在于，所述表面活性剂选自SDS、NP-40、N-月桂酰肌氨酸钠、Tween 80或Triton X-100中的一种或多种。
8.一种磁珠法细菌核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7任意一项所述的提取液。
9.一种磁珠法全血核酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)混合如权利1-7任意一项所述的提取液、样本、蛋白酶K和磁珠溶液，进行裂解提取；
(2)用洗涤液洗涤，吸磁，去上清液；
(3)加洗脱液进行洗脱。
10.稀土化合物在核酸提取和/或制备核酸提取相关试剂中的应用。
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