KR20180080647A

KR20180080647A - 필터 추출용 조성물 및 이를 이용한 식품 내 미생물 분리 방법

Info

Publication number: KR20180080647A
Application number: KR1020170001591A
Authority: KR
Inventors: 오세욱; 김진희; 성지영
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-04
Filing date: 2017-01-04
Publication date: 2018-07-12
Also published as: KR101927720B1

Abstract

본 발명은 필터에 결합된 미생물 추출용 조성물에 관한 것으로, 계면활성제; 피루빈산(pyruvate); 및 글리신(glycine)을 포함하는 필터 추출용 조성물을 제공한다.

Description

필터 추출용 조성물 및 이를 이용한 식품 내 미생물 분리 방법{A COMPOSITION FOR EXTRATING MICROORGANISM IN FILTER, AND METHOD FOR SEPARATION OF MICROORGANISM IN FOOD USING THE SAME}

본 발명은 식품 내 미생물을 신속하게 검출하는 방법에 관한 것으로, 필터 내 미생물을 추출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 미생물 분리 방법을 제공한다.

식중독은 발열, 구역질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는 질환으로서 세균성 식중독이 대부분이다. 세균성 식중독은 발병 형태에 따라 감염형, 독소형으로 분류된다.

감염형 식중독은 병원성 미생물에 오염된 식품의 섭취에 의해 미생물이 장 내에서 증식하여 발병하는 것으로, 살모넬라(Salmonella spp), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio paraheamolyticus), 대장균 O157(Escherichia coli O157:H7) 등이 주된 원인균이다.

독소형 식중독은 식품에 증식하는 병원성 미생물이 생산한 독소를 섭취함으로써 발병할 수 있다. 이 경우 원인균이 식품 내에서 이미 사멸되었더라도 독소의 존재에 의해 발병할 수 있으며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridiumbotulinum)이 주요 원인균이다.

식중독은 단체 급식의 확대 또는 외식의 증가 등 생활 패턴의 변화와 지구의 온난화 현상에 의해 발생 비율이 증가하고 있으며, 규모 역시 집단화, 대형화되고 있으므로, 원인균을 조기에 발견하는 것이 중요하다.

그럼에도 불구하고 식중독 유발균을 포함하는 병원성 미생물은 통상적으로 고전적인 배지법에 의해 검출되고 있으며, 상기 방법은 장시간의 증균 과정 및 분석 기간이 소요되므로 신속한 검출 결과를 담보할 수 없다.

상기 문제점을 극복하기 위하여 효소중합연쇄반응(PCR)이 적용되고 있으나, 양성인지 판단하기 위하여 전기영동법을 수행하여야 하며, 이를 위해서는 추가 장비와 시간이 소요되므로 신속한 진단에 적합하지 않다.

또한 식중독균을 검출하기 위하여 리포좀을 이용한 화학 발광 면역센서, 실시간 폴리머라제 연쇄반응(PCR), 수정발진자 마이크로밸런스(QCM), 표면플라즈몬 공명(SPR) 등을 이용한 면역 센서법이 개발되고 있으나, 이러한 방법들은 10³cfu/ml 이상의 낮은 검출감도로 인해 실용성이 낮다(Yacoub-George, E. et al., Analytica Chimica Acta 457, 3-12, 2002, Ho, J. A., et al., Analytical Biochemistry, 339, 342-349, 2004, Wu, V. C.H. et al., Biosensors and Bioelectronics 22, 2967-2975, 2007, Fu, Z. et al., International Journal of Food Microbiology 99, 47-57, 2005, Yang, L. et al., Analytical Chemistry, 76, 1107-1113, 2004, Waswa, J., et al., LWT, 40, 187-192, 2007).

따라서, 식품에 존재하는 미생물은 농도가 매우 낮아 검출기술이 요하는 최소한의 미생물 농도에 도달하기까지 배양해야 하기 때문에 많은 시간이 소요되는 한계가 있으므로 이를 단축시키기 위한 다양한 기술이 개발되고 있다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 고가의 장비 없이 미생물을 신속하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 계면활성제; 피루빈산(pyruvate); 및 글리신(glycine)을 포함하는 필터 추출용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 계면활성제는 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 이온성 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 소듐 비스(2-에틸헥실)설포석시네이트(Sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosucci-nate, AOT), 소듐 도데카노에이트(Sodium dodecanoate), 소듐 헥실 설페이트(Sodium hexyl sulfate), 소듐 옥틸 설페이트(Sodium octyl sulfate) 및 소듐 데실 설페이트(Sodium decyl sulfate)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 0.03 내지 0.5 중량%일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Octylphenoxypolyethoxyethanol, IGEPAL) 및 트윈 80(Tween 80, polyoxyethylene sorbitan monooleate)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 1.0 내지 5.0 중량%일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 미생물 추출용 조성물은 생리식염수(normal saline) 또는 완충용액을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 식품 시료 내의 미생물을 필터로 여과하는 단계; 및 상기 조성물로 상기 필터에 여과된 미생물을 추출하는 단계;를 포함하는 미생물의 분리 방법이 제공된다.

본 발명의 일 측면에 따른 미생물 추출용 조성물은 필터에 의해 여과된 식품 시료 내의 미생물을 효과적으로 분리 및 농축시킴으로써 단시간 내에 검출 한계에 도달시킬 수 있다.

또한, 종래 미생물의 증식에 사용하는 전배양배지가 PCR 등 신속 검출법에 대한 다양한 저해 요소를 포함한 것과 달리 별도의 저해물질이 불필요하므로 신속 검출법에 있어서 유용하게 활용할 수 있다.

특히, 상기 미생물 추출용 조성물을 이용할 때 고가의 장비 없이 신속하게 미생물의 농도를 증가시켜 단시간에 검출 한계에 도달시킬 수 있으므로 현장 활용도가 우수하다.

특히, 상기 미생물 분리용 조성물을 이용할 때 고가의 장비 없이 신속하게 미생물을 농축시켜 검출 한계에 도달할 수 있으므로 현장 활용도가 우수하다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물의 분리 방법을 이용한 미생물의 신속 검출 방법을 도식화 한 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 계면활성제; 피루빈산(pyruvate); 및 글리신(glycine)을 포함하는 필터 추출용 조성물을 제공한다.

상기 “미생물 추출용 조성물”은 특정 대상체, 구체적으로 필터에 의해 여과되어 필터 조직과 결합한 미생물을 분리 및 추출하는 액상의 조성물을 의미한다. 상기 미생물 추출용 조성물에 여과된 필터를 투입하고 스토마칭(stomaching)하거나 초음파를 조사하여 상기 필터에 결합된 미생물을 분리할 수 있다.

상기 미생물은 식품에서 증식하여 섭취 시 식중독을 유발할 수 있는 미생물일 수 있고, 예컨대 대장균 O157(E. coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridiumbotulinum), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .), 또는 쉬겔라 속 균주(Shigella spp.)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 식품은 고형물, 액체(예컨대, 용액, 분산물, 에멀젼, 현탁액) 또는 반고형 식용 조성물일 수 있다. 상기 식품은 육류, 가금류, 난류, 생선, 해산물, 야채류, 과일류, 조리 식품(예컨대, 수프, 소스, 페이스트), 곡물 제품(예컨대, 곡분, 시리얼, 빵), 통조림, 밀크, 기타 유제품(예컨대, 치즈, 요구르트, 사워 크림), 지방, 오일, 디저트, 양념류, 향신료, 파스타, 음료, 물, 동물 사료일 수 있으나, 식용으로서 섭취될 수 있으면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 미생물 추출용 조성물은 필터에서 상기 미생물을 손상시키지 않고 효과적으로 분리시킬 뿐만 아니라, 미생물의 생장이나 신속 검출에 대한 저해 요소를 포함하지 않으므로 미생물의 검출에 유용하게 활용될 수 있다. 특히 상기 미생물 추출용 조성물은 양양 성분을 포함하므로 상기 분리된 미생물의 회복을 용이하게 할 수 있다.

상기 미생물 추출용 조성물은 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 계면의 경계를 완화시키므로 상기 필터 조직에 흡착되어 있는 미생물을 용이하게 이탈시킬 수 있다.

상기 이온성 계면활성제는 우수한 세정력으로 인해 필터에 흡착 또는 결합되어 있는 미생물을 필터에서 효과적으로 분리시킬 수 있다.

상기 이온성 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 소듐 비스(2-에틸헥실)설포석시네이트(Sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosucci-nate, AOT), 소듐 도데카노에이트(Sodium dodecanoate), 소듐 헥실 설페이트(Sodium hexyl sulfate), 소듐 옥틸 설페이트(Sodium octyl sulfate) 및 소듐 데실 설페이트(Sodium decyl sulfate)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 바람직하게는 소듐 도데실 설페이트(SDS)일 수 있다.

상기 이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 0.03 내지 0.5 중량%일 수 있다. 상기 이온성 계면활성제의 함량이 0.03 중량% 미만이면 상기 미생물의 분리 효율이 저하될 수 있고, 0.5 중량% 초과이면 상기 미생물의 막단백질에 대한 손상을 야기시켜 미생물의 회복 또는 증식을 저해할 수 있다.

한편, 상기 비이온성 계면활성제는 유화력이 우수하여 상기 미생물을 포함한 고형 성분을 조성물 내에 균일하게 분산시킬 뿐만 아니라 저자극성으로 인해 미생물을 손상시키지 않고 미생물의 분리 효율을 극대화할 수 있다. 따라서, 상기 비이온성 계면활성제는 상기 이온성 계면활성제가 소량 첨가된 경우에도 상기 미생물에 대한 손상을 최소화함과 동시에 미생물의 용출 효율을 개선할 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Octylphenoxypolyethoxyethanol, IGEPAL) 및 트윈 80(Tween 80, polyoxyethylene sorbitan monooleate)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 바람직하게는 트윈 80일 수 있다.

상기 비이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 1.0 내지 5.0 중량%일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 1.0 내지 5.0 중량%일 수 있다. 상기 이온성 계면활성제의 함량이 1.0 중량% 미만이면 상기 미생물의 분리 효율이 저하될 수 있고, 5.0 중량% 초과이면 미생물의 회복 및 증식 속도가 저하될 수 있다.

또한, 상기 미생물 추출용 조성물은 피루빈산(pyruvate) 및 글리신(glycine)을 포함할 수 있다. 상기 피루빈산은 외력 또는 계면활성제의 자극에 의해 손상된 미생물의 대사를 촉진하여 세포의 회복을 돕고 미생물의 증식능을 현저히 개선할 수 있다. 또한 상기 글리신은 미생물의 각종 대사 반응에 작용하여 세포의 단백질 형성을 촉진함과 동시에 완충작용을 통해 손상된 세포의 회복을 촉진할 수 있다.

한편, 상기 미생물 추출용 조성물은 상기 피루빈산과 함께 펩톤(Peptone), 성장 인자 등 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있는 다양한 첨가제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 생리식염수(normal saline) 또는 완충용액을 더 포함할 수 있다.

상기 생리식염수(normal saline) 또는 완충용액은 염류를 소정의 농도로 포함하므로 세포에 대한 삼투압의 변화를 유발하지 않고 세포를 안정화시키며 상기 조성물을 적정 농도로 유지시킬 수 있다.

상기 완충용액은 당업계에서 동물세포 처리시 통상적으로 사용되는 완충용액일 수 있고, 예컨대, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS), HBSS(Hank's balanced salt solution) 또는 TBS(Tris buffered saline)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1을 참조하면, 발명의 다른 측면은 식품 시료 내의 미생물을 필터로 여과하는 단계; 및 상기 필터 추출용 조성물로 상기 필터에 여과된 미생물을 추출하는 단계;를 포함하는 미생물의 분리 방법을 제공한다.

구체적으로, 식품의 미생물 분리용 조성물 및 식품 시료를 혼합한 후 필터를 통해 여과시킴으로써 상기 식품 시료 내의 미생물을 분리 및 농축할 수 있다. 상기 식품 시료는 미생물에 의한 오염 여부를 평가하기 위하여 식품에서 일부 분리된 대상체 일 수 있다. 상기 식품 시료의 종류는 특별히 제한되지 아니하나 식중독 등 질병을 유발할 수 있는 미생물에 의한 오염이 의심되는 식품을 지칭할 수 있다.

상기 식품 시료는 상기 식품의 미생물 분리용 조성물에서 균질화되고 배양됨으로써 미생물의 증식이 촉진될 수 있으며, 액상의 조성물에 현탁되므로 상기 필터에 의해 회수될 수 있다.

상기 식품 시료는 상기 미생물 분리용 조성물 내에서 균질화되어 미세한 입자상으로 균일하게 분산될 수 있다. 상기 식품 시료는 미세한 크기로 분쇄되어 상기 미생물 분리용 조성물에 투입될 수 있으며, 호모게나이져(homogenizer), 스토마쳐(stomacher), 초음파 분산기 등 다양한 균질화 장치에 의해 상기 조성물 내에 균일하게 분포될 수 있다.

상기 미생물 분리용 조성물 및 상기 식품 시료는 10 내지 15 : 1 내지 2의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기 미생물 분리용 조성물의 비율이 과소한 경우 식품 시료가 상기 미생물 분리용 조성물 내에서 균일하게 분산되지 않아 여과 효율 저하되고 미생물의 성장이 둔화될 수 있으며, 상기 미생물 분리용 조성물의 비율이 과다한 경우 비용 및 공정 효율이 저하될 수 있다.

상기 필터는 액상의 조성물 내에 균일하게 분산된 고형의 미세입자를 여과시켜 식품 시료에 함유된 미생물을 효과적으로 회수할 수 있다.

상기 필터는 미세한 기공크기를 가지고 소정의 성분을 여과할 수 있으면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 셀룰로오스계 필터일 수 있다. 상기 셀룰로오스계 필터는 질산셀룰로오스(Cellulose Nitrate), 초산셀룰로오스(Cellulose Acetate), 또는 셀룰로오스 혼합 에스테르(Mixed Cellulose Ester) 필터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 셀룰로오스계 필터는 섬유질의 극성 성분이 미생물과 정전기적으로 상호 작용하고 섬유층이 복수층으로 형성되어 있으므로 여과 효율이 우수하다. 특히, 상기 셀룰로오스계 필터는 섬유질의 3차원적 망상 구조로 인해 결정화도가 높고 기계적 강도, 흡착성, 보수성, 현탁 안정성, 결착성이 우수하므로 상기 미생물의 여과에 적합하다.

상기 여과된 필터를 본 발명의 일 실시예에 따른 필터 추출용 조성물에 투입한 후 스토마칭(stomaching)하거나 초음파를 조사함으로써 상기 필터에 결합된 미생물을 분리할 수 있다.

상기 스토마칭은 통상적으로 스토마쳐(stomacher) 장치에 의해 수행되는 것으로 상기 필터 추출용 조성물에 상기 여과필터를 투입한 후 일정 주파수 및 진폭으로 진동시킴으로써 상기 여과필터에 흡착된 미생물을 이탈시킬 수 있다.

상기 초음파는 초음파 발생기에 의해 조사될 수 있으며, 상기 초음파의 진동수는 15KHz 내지 25KHz, 진폭은 5 내지 50㎛일 수 있다. 상기 초음파는 상기 범위 내에서 상기 여과필터를 효과적으로 진동시켜 흡착된 고형성분을 효율적으로 분리시킬 수 있다.

상기 식품의 미생물 분리용 조성물 및 상기 필터 추출용 조성물은 20 내지 30 : 1 내지 3의 중량비로 사용될 수 있다.

상기 다량의 미생물 분리용 조성물에 식품 시료를 투입하고 여과한 후, 상대적으로 소량의 필터 추출용 조성물에 미생물을 분리시킴으로써 미생물의 밀도 및 증식 속도를 단시간 내에 현저히 증가시킬 수 있다. 예컨대, 상기 미생물 분리용 조성물 250mL와 혼합된 식품 시료를 필터로 여과시킨 후 필터 추출용 조성물 2.5mL에 재부유(resuspension)시킴으로써 미생물 농도를 약 100배 이상 증가시킬 수 있다.

이 때, 상기 농축된 미생물을 추가 배양시켜 고농도로 증식시킬 수 있다. 상기 증식 방법은 특별히 제한되지 않으며 상기 분리된 미생물을 별개의 액체 배지에 투입하고 종래 알려진 방법으로 배양함으로써 수행될 수 있다

한편, 상기 농축 및 증식된 미생물은 종래에 널리 알려진 다양한 방법에 의해 탐지될 수 있다. 상기 미생물은 상기 농축 방법에 의해 단시간 내에 검출 한계에 도달할 수 있으므로 장시간 소요되는 배양시간이 현저히 단축될 수 있으며 미생물에 대한 신속한 검출이 가능하다.

본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 : 균주 배양 및 분리

살모넬라 (Salmonella spp .) 균주를 BHI 배지(brain heart infusion broth; Oxoid, Hampshire, England)를 이용하여 챔버(Whitley A35 anaerobic chamber; Don Whitley Scientific Ltd., Shipley, UK)에서 혐기적으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 선택배지(selective agar; BD BBL, Sparks, USA)에 도말하여 장파 자외선(long-wave ultraviolet light)에서 녹색/노랑(green/yellow) 형광을 나타내는 단일 콜로니를 분리하여 실험에 사용하였다.

필터 추출용 조성물의 분리 효율을 평가하기 위해 하기 표 1과 같이 상이한 조성의 필터 추출용 조성물을 준비하였다.

구분	조성비
실시예 1	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(1.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 2	생리식염수(Saline)+SDS(0.01%)+Tween 80(1.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 3	생리식염수(Saline)+SDS(0.03%)+Tween 80(1.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 4	생리식염수(Saline)+SDS(0.1%)+Tween 80(1.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 5	생리식염수(Saline)+SDS(0.5%)+Tween 80(1.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 6	생리식염수(Saline)+SDS(0.7%)+Tween 80(1.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 7	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(0.1%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 8	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(0.5%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 9	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(1.0%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 10	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(3.0%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 11	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(5.0%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
실시예 12	생리식염수(Saline)+SDS(0.05%)+Tween 80(7.0%)+피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
비교예 1	생리식염수(Saline)
비교예 2	SDS(0.05%)
비교예 3	Tween 80(1.5%)
비교예 4	피루브산(0.1%)+글리신(0.1%)
비교예 5	BPW(Buffered peptone water)

실험예 1 : 미생물 분리 효율 시험

상기 살모넬라(Salmonella spp .) 균주 100g을 양상추에 접종하고 크린벤치에서 30분간 건조하여 양상추 표면에 고정시켰다.

미생물 분리용 조성물 225mL에 상기 건조된 양상추를 투입하고 균질화하였다. 균질화된 혼합 조성물을 45 μm의 여과지(filter paper)로 여과하였다.

손상된 세포(injured cell)가 회복(resuscitation)될 수 있도록 여과지를 회수하여 TSA plate 상에서 6시간 동안 배양하였다. 상기 여과지를 살모넬라 균주의 선택배지인 XLD로 이동시켜 배양하였다.

상기 여과지에 형성되는 콜로니의 전형적인 모양을 관찰하여 살모넬라 균수를 측정하였으며, 표 1과 같이 조성을 달리한 필터 추출용 조성물에 의해 회수된 살모넬라 균수와 여과지에 형성된 살모넬라 균수를 비교하여 분리율을 평가하였다.

구분	분리율(%)
실시예 1	99.6
비교예 1	64.5
비교예 2	83.5
비교예 3	80.1
비교예 4	31.4
비교예 5	51.4

평가 결과, 실시예 1의 필터 추출용 조성물은 양상추 표면에 접종된 살모넬라 균주를 온전히 분리한 것으로 측정되었다.

반면, 계면활성제가 포함되지 않은 비교예 4의 조성물은 분리율이 현저히 감소하였으며, 이는 계면활성제의 부재로 인해 식품의 표면에 결합한 균주에 대한 분리 효율이 낮은 것으로 평가할 수 있다.

또한, 완충액만을 포함하는 조성물(비교예 1), 계면활성제만을 포함(비교예 2, 3)하는 조성물, 식중독균의 분리에 있어서, 전배양배지로 사용되는 BPW(비교예 5)의 분리율도 현저히 낮은 수준으로 측정되었으며, 이는 여과된 균주의 손상으로 인해 회복률이 감소하였거나 살모넬라 균주에 대한 분리 효율이 낮은 것으로 평가할 수 있다.

실험예 2 : 이온성 계면활성제 농도에 따른 분리 효율 비교

상기 필터 추출용 조성물에 포함된 이온성 계면활성제의 농도를 달리하여 분리율의 변화를 비교하고, 결과를 표 3에 나타냈다.

표 3을 참조하면, 이온성 계면활성제로서 첨가된 SDS의 농도가 0.03%(w/w) 이상일 때 분리율이 현저히 증가였으며, 0.05%(w/w)의 농도에서 분리율이 최대로 측정되었다.

반면, SDS의 농도가 0.5%(w/w)를 초과하였을 때 분리율은 점차 감소하였다. 이는 세포에 대한 SDS의 자극성으로 인해 농도가 점차 증가함에 따라 세포가 손상되고 이로 인한 회복률이 감소한 것으로 평가할 수 있다.

조성	분리율(%)
실시예 1	99.6
실시예 2	82.1
실시예 3	94.3
실시예 4	96.4
실시예 5	95.6
실시예 6	84.3

실험예 3 : 비이온성 계면활성제 농도에 따른 분리 효율 비교

상기 필터 추출용 조성물의 비이온성 계면활성제의 농도를 달리하여 분리율의 변화를 비교하고, 결과를 표 4에 나타냈다.

표 4를 참조하면, 비이온성 계면활성제로서 첨가된 Tween 80의 농도가 1.0%(w/w) 이상일 때 분리율이 현저히 증가였으며, 1.5%(w/w)의 농도에서 분리율이 최대로 측정되었다.

반면, Tween 80의 농도가 5.0%(w/w)를 초과하였을 때 분리율은 점차 감소하였다. 즉, Tween 80의 농도가 점차 증가함에 따라 손상된 세포의 회복에 부정적인 영향을 미치거나 또는 이온성 계면활성제에 의한 미생물의 분리를 저해하는 것으로 평가할 수 있다.

조성	분리율(%)
실시예 1	99.6
실시예 7	75.1
실시예 8	84.4
실시예 9	93.5
실시예 10	96.8
실시예 11	94.9
실시예 12	89.1

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

계면활성제; 피루빈산(pyruvate); 및 글리신(glycine)을 포함하는 필터 추출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 계면활성제는 이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 이온성 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 소듐 비스(2-에틸헥실)설포석시네이트(Sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosucci-nate, AOT), 소듐 도데카노에이트(Sodium dodecanoate), 소듐 헥실 설페이트(Sodium hexyl sulfate), 소듐 옥틸 설페이트(Sodium octyl sulfate) 및 소듐 데실 설페이트(Sodium decyl sulfate)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 조성물.
제2항에 있어서,
상기 이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 0.03 내지 0.5 중량%인 조성물.
제2항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Octylphenoxypolyethoxyethanol, IGEPAL) 및 트윈 80(Tween 80, polyoxyethylene sorbitan monooleate)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 조성물.
제2항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제의 함량이 조성물 총 중량 대비 1.0 내지 5.0 중량%인 조성물.
제1항에 있어서,
생리식염수(normal saline) 또는 완충용액을 더 포함하는 조성물.
식품 시료 내의 미생물을 필터로 여과하는 단계; 및
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물로 상기 필터에 여과된 미생물을 추출하는 단계;를 포함하는 미생물의 분리 방법.