CN102016066A - 使用核酸探针检测样品中的相关核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于测定和检测样品中的核酸序列的方法。核酸可为RNA或DNA或两者。本发明也涉及用于测定样品中各种微生物的存在和物种的方法。也已鉴别革兰氏阴性(Gram-negative)生物体的rRNA内的一组寡核苷酸核酸序列，其在以池的形式或组合使用于例如杂交检验中时有助于广泛鉴别作为一类的革兰氏阴性生物体。这组寡核苷酸可检测出指示这一大类革兰氏阴性生物体中的生物体存在的序列，同时显示几乎不会错误鉴别革兰氏阳性生物体和真菌或其它微生物。此检验包括至少一种相关核苷酸序列、至少一种核酸探针、氟表面活性剂和核酸酶同时培育。此检验可进一步用以通过使用其它的特异性探针来检测细菌、真菌或其它微生物的存在，或检测和/或鉴别样品中的标靶核酸序列。另外，本发明也涉及在结合检验中减少非特异性结合并促进复合物形成的方法。结合检验可为(但不限于)核酸杂交检验或免疫检验。本发明也涉及采用至少一种可为核苷酸序列的相关标靶、至少一种可为核酸探针的探针、和核酸酶的检测方法。

Description

使用核酸探针检测样品中的相关核苷酸序列

相关申请案的交叉引用

本申请案主张2009年1月23日申请的美国专利申请案第12/359,263号的优先权益，所述专利申请案主张2008年1月24日申请的美国临时专利申请案第61/023,348号的优先权益，所述申请案都以全文引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及用于测定和检测样品中相关的核酸序列的方法。核酸可为RNA或DNA或两者。本发明也涉及用于测定样品中各种微生物的存在和物种的方法。也已鉴别革兰氏阴性(Gram-negative)生物体的rRNA内的一组寡核苷酸核酸序列，其在以池的形式或组合使用于例如杂交检验中时有助于广泛鉴别作为一类的革兰氏阴性生物体。这组寡核苷酸可检测出指示这一大类革兰氏阴性生物体中的生物体存在的序列，同时显示几乎不会错误鉴别革兰氏阳性生物体和真菌或其它微生物。此检验可进一步用以通过使用其它的特异性探针来检测细菌、真菌或其它微生物的存在，以及检测和/或鉴别样品中的标靶核酸序列。

本发明也涉及一种检验，其包括至少一种相关核苷酸序列、至少一种以可检测标记作标记的核酸探针、任选氟表面活性剂和核酸酶同时培育。此检验可进一步用以通过使用其它的特异性探针来检测细菌、真菌或其它微生物以及裸核苷酸序列的存在，或检测和/或鉴别样品中的标靶核酸序列。另外，本发明涉及在结合检验中减少非特异性结合并促进复合物形成的方法。结合检验可为(但不限于)免疫检验、微流体检验、容器钝化(passivation of vessels)、细胞培养或核酸杂交检验。本发明也涉及采用至少一种可为核苷酸序列的相关标靶、至少一种探针(例如核酸探针)、和(限于)蛋白质、肽、小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质的检测方法。另外，本发明涉及用于进行这些检验的试剂盒。

背景技术

除病毒外，所有生命形式的每个细胞都含有核糖体，且因此都含有核糖体RNA。核糖体含有三种独立的单股RNA分子，即大分子、中等大小的分子和小分子。两种较大的rRNA分子在不同生物体中因大小而异。核糖体RNA为直接基因产物，且由rRNA基因编码。此基因的DNA序列用作合成rRNA分子的模板。每个核糖体RNA亚基都存在独立的基因。大部分生物体中存在多个rRNA基因，其中许多高等生物体含有核和线粒体rRNA基因。植物和某些其它形式含有核、线粒体和叶绿体rRNA基因。为简单起见，将此三种独立的rRNA基因都称为rRNA基因。

所有生命形式的所有细胞中都存在大量核糖体。典型细胞中大约85％-90％的总RNA为rRNA。例如大肠杆菌等细菌每个细胞约含有10⁴个核糖体，而哺乳动物肝细胞每个细胞约含有5×10⁶个核糖体。因为每个核糖体都含有一个各rRNA亚基，所以细菌细胞和哺乳动物细胞分别含有10⁴和5×10⁶个各rRNA亚基。

除核糖体RNA外，核糖核酸，特别是信使RNA，非常适用于测定来自RNA或DNA病毒两者的活性病毒感染的身份、代谢或疾病状况、或存在。对转录鉴别、表达程度或两者的测定可极大地有益于诊断学和生命科学研究以及各种质量控制检验。同样，例如微RNA等其它形式RNA的测量可非常有益于诊断测定，特别是癌症。

核酸杂交是所属领域中熟知的程序，其已用来特定地检测极少量或大量的特定核酸序列，甚至在极大过量的非相关序列存在下。在涉及以下的公开案中发现许多现有技术使用核酸杂交：细胞和病毒的分子遗传学；细胞和病毒的基因表达；生命形式的遗传分析；进化和分类或生物体和核酸序列；疾病过程的分子机制；和用于达到特定目的的诊断方法，包括检测细胞和生物体中的病毒和细菌。

可能得到最佳表征和最多研究的基因和基因产物为rRNA基因和rRNA。现有技术包括遗传分析中使用rRNA和核糖体基因的杂交，以及生物体和核糖体基因序列的进化和系统分类(taxonomic classification)。遗传分析包括例如测定各种生物体中核糖体RNA基因的数目、细胞中存在的多种核糖体RNA基因之间的相似性、和细胞中rRNA合成的速率和程度和其控制因子。进化和分类研究常常包含比较来自相关生物体和迥然不同的生物体的rRNA基因碱基序列。

已知核糖体RNA基因核苷酸序列在迥然不同的生物体中至少部分相似。举例来说，大肠杆菌细菌核糖体RNA基因的DNA与来自植物、哺乳动物和多种细菌物种的rRNA杂交。与这些其它物种杂交的大肠杆菌基因的分数随这些生物体的相关度而变。实际上，所有rRNA基因序列都与来自密切相关的物种的rRNA杂交，但不太与来自关系遥远的物种的rRNA杂交。

通过利用对特定生物体组的rRNA具有特异性的探针检测这一组的灵敏度和简易性会因大量以单股核酸分子形式存在于每个细胞中的两种rRNA分子而大大增强。然而，虽然rRNA是单股分子，但其具有特别的高度旋绕的二级和三级结构，此可使探针进入某些区段极其困难。甚至在溶解状态下变性也仅从rRNA重新形成这些二级和三级结构的快速恢复趋势中得到部分缓解。此趋势快速发生，因为快速恢复是分子内的再折叠且不受扩散限制。通过使RNA变性，且使用例如吸附至硝酸纤维素或其它载体上等技术或使用熔融温度(Tm)比标靶区段的内部补体(internal complement)高的探针(此可阻止分子自行退火)将RNA固定在变性状态，可解决此问题。

此外，可使用对除rRNA以外的其它类别的细胞核酸具有特异性的rRNA探针，通过核酸杂交特定地检测、鉴别和定量特定生物体或细胞组。举例来说，rRNA在细菌大肠杆菌中以约6000个碱基长的前体分子形式合成。接着处理此前体分子，产生两种将并入核糖体中的rRNA亚基(总计约4500个碱基)和一些将丢弃的额外RNA序列(总计1500个碱基)。

众所周知的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)。在PCR中，用特定的引物扩增一条特有的相关特定核苷酸序列。如果引物发现其标靶位点，那么此遗传物质的序列将迅速扩大百万倍。

在PCR过程期间，所产生的DNA用作复制模板。此开始链式反应，其中DNA模板以指数方式扩增。PCR可使一条DNA的单个或少数拷贝扩增若干数量级，产生所述DNA条的百万个或更多拷贝。PCR可广泛修改以进行多种基因操作。

几乎所有的PCR应用都采用一种耐热DNA聚合酶。一个实例为Taq聚合酶，其是最初从细菌栖热水生菌(Thermus aqualicus)分离的酶。通过使用单股DNA作为模板、和起始DNA合成所需的DNA寡核苷酸(也称为DNA引物)，此DNA聚合酶以酶的方式从DNA构成组件(即核苷酸)组装新的DNA股。绝大多数PCR方法都使用热循环，即交替加热和冷却PCR样品至一系列确定温阶。这些热循环步骤为在高温下通过DNA聚合酶实体分离在较低温度下DNA合成期间用作模板的DNA双螺旋中的各股(DNA熔融)以选择性地扩增标靶DNA所必需。PCR的选择性由与旨在在特定热循环条件下扩增的DNA区互补的引物的使用产生。

PCR反应通常由一系列20至40次重复温度改变(称为循环)组成。每个循环通常由2-3个不连续温阶组成。最通常地，用具有三个温阶的循环进行PCR扩增。循环之前常常为高温(＞90℃)下的单一温阶(称为保持)，且循环之后最终还有一个保持供最终产物延伸或短暂存储用。每个循环中所用的温度和施加这些温度的持续时间视多个参数而定。这些参数包括用于DNA合成的酶、反应中二价离子和dNTP的浓度、和引物的熔融温度(Tm)。

起始步骤由加热反应至约94-96℃的温度(或如果使用极其耐热的聚合酶，那么加热至98℃)且保持1-9分钟组成。此步骤仅为需要通过热启动PCR热活化的DNA聚合酶所需要。

变性步骤为第一个规则的循环事件，且由加热反应至94-98℃且保持20-30秒组成。此步骤通过破坏DNA股的互补碱基之间的氢键，引起DNA模板和引物熔融，从而产生DNA单股。

接着，在退火步骤反应期间，温度降至约50-65℃且保持20-40秒，使引物与单股DNA模板退火。通常，退火温度比所用引物的Tm低约3-5℃。稳定的DNA-DNA氢键仅在引物序列与模板序列非常紧密地匹配时才会形成。聚合酶结合于引物-模板杂交物且开始DNA合成。

延伸/伸长步骤的温度视所用的DNA聚合酶而定。举例来说，Taq聚合酶的最佳活性温度为约75-80℃，且在此酶下通常使用72℃的温度。在此步骤中，DNA聚合酶通过加入在5′至3′方向上与模板互补的dNTP，使dNTP的5′-磷酸酯基与新生(延伸)DNA股的末端的3′-羟基缩合，来合成与DNA模板股互补的新的DNA股。延伸时间视所用的DNA聚合酶与待扩增的DNA片段的长度而定。DNA聚合酶在其最佳温度下通常每分钟将聚合一千个碱基。在最佳条件下，即如果没有归因于限制底物或试剂的限制，那么在每个延伸步骤中，DNA标靶的量将加倍，导致特定DNA片段以指数方式(几何)扩增。

有时在最后一个PCR循环后在70-74℃的温度下进行最终伸长历时5-15分钟，以确保任何剩余的单股DNA都充分延伸。可使用4-15℃下的最终保持，供反应短期存储用。

在以上分析中，可使用例如分离DNA片段的琼脂糖凝胶作定性评估。在最简单情况下，此评估提供关于引物的标靶位点存在于分析样品中的信息。

PCR技术的另一发展为定量PCR，其设法在存在的微生物的量与扩增DNA的量之间建立相关关系。另外，逆转录酶PCR允许检测样品内的RNA物质，且允许使用检测到的RNA用作代理来区别活的生物体与死亡生物体或自由DNA。然而，在扩增之前必须严格消除样品中存在的DNA以防止假阳性，使得仅存在于样品中的RNA产生扩增产物。

PCR的优势包括其具有高特异性且进行时间相对较短。主要缺点在于，其对污染具有高敏感性且会产生假阳性结果；如果不进行逆转录酶PCR，就如以上所提及，无法区别活的细胞与死的细胞或裸DNA；以及最后，由于存在抑制物质而有产生假阴性结果的危险。可通过修改可能会非凡地增加实施PCR的成本、设备、设施要求、时间和专家的适合的实验室规范或方案设计来克服许多这些缺点。

使用荧光标记的寡核苷酸的原位杂交为另一种适用的方法，且在20世纪90年代初发展起来。此方法已经成功地用于许多环境样品(亚曼(Amann)等人，以荧光-寡核苷酸探测全细胞用于微生物学中的测定、系统发生和环境研究(Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative，phylogenetic，and environmental studies in microbiology)，172(2)细菌学杂志(J.B_ACTERIOL.)762-770(1990))，且此方法通常称为“FISH”(荧光原位杂交)。FISH技术是一种特定地检测样品中的微生物且具有特异性的工具，且取决于以下前体，即每个细胞中所存在的核糖体核糖核酸(rRNAs)都具有高度保守与可变序列，即种属或甚至物种特异性。可针对这些序列结构域产生互补寡核苷酸，且可另外具备可检测的标记物，使得能够鉴别微生物物种、种属或组。FISH方法是唯一在不失真下表现生物群落的实际原位情况的通常已知的方法，可鉴别出生物群落中的非培养和非描述微生物。

在FISH中，探针刺入存在于分析样品中的细胞中并结合于细胞内的标靶序列，使得能够通过用探针标记来检测细胞。FISH也可用以鉴别通过传统培养难以检测的微生物，其使得能够在许多样品中检测出细菌种群。使用FISH检测微生物可能比通过培养检测要快得多。

还可使用FISH，通过目测细胞和/或组织来确定某些形态。可排除掉由于存在抑制物质而产生的假阴性结果，同样可排除掉可归因于污染的假阳性结果。

这些年来已经公开许多与分子生物学有关的参考文献。这些参考文献揭示：微生物培养方案；例如rRNA等核酸的结构和功能；与微生物鉴别有关的方法；核酸杂交技术；和核酸探针测定。

以下参考文献涉及培养细菌和其它微生物以及提取核酸的方案和方法：布赖恩·W·本布里奇(Brian W.Bainbridge)，基本分子生物学中分子生物学的微生物技术：细菌和噬菌体：实践方法xv-xvii(Microbial techniques for molecular biology：bacteria and phages in ESSENTIAL Molecular Biology：A Practical Approach xv-xvii)，21-54(T.A.布朗(T.A.Brown)编，2000)；劳拉·G·莱夫(Laura G.Leff)等人.比较从河流沉积物提取DNA的方法(Comparison of Methods of DNA Extraction from Stream Sediments)，61(3)应用与环境微生物(A_PPL.E_NVIRON.M_ICROBIOL.)1141-1143(1995)；蔡玉理(Yu-Li Tsai)和贝蒂·H·奥尔森(Betty H.Olson)，从土壤和沉积物直接提取DNA的快速方法(Rapid Method for Direct Extraction of DNA from Soil and Sediments)，57(4)应用与环境微生物，1070-1074(1991)；T_ECHN_OTE 302分子生物学(T_ECHN_OTE 302 M_OLECULAR B_IOLOGY)(邦斯实验室公司(Bangs Laboratories，Inc.)2002)。

以下参考文献涉及有关核糖体RNA结构和功能的研究：塞巴斯蒂安·贝伦斯(Sebastian Behrens)等人，细菌域、古细菌域和真核生物域成员的小亚基rRNA原位接近经Cy3标记的寡核苷酸探针(In Situ Accessiblity of Small-Subunit rRNA of Members ofthe Domains Bacteria，Archaea，and Eucarya to Cy3-Labeled Oligonucleotide Probes)，69(3)应用与环境微生物1748-1758(2003)；萨米特西·查克拉沃蒂(Soumitesh Chakravorty)等人，详细分析16S核糖体RNA基因区段以诊断病原菌(Adetailed analysis of 16Sribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria)，69(2)微生物学方法杂志(J.M_ICROBIOL.M_ETHODS)330-339(2007)；达雷尔·P·钱德勒(Darrell P.Chandler)等人，针对在平面寡核苷酸微阵列上直接检测16S rRNA的序列对结构(Sequence versus Structure for the Direct Detection of 16S rRNA on Planar Oligonucleotide Microarrays)，69(5)应用与环境微生物2950-2958(2003)；贝恩哈德·M·富克斯(Bernhard M.Fuchs)等人，未标记的辅助寡核苷酸促进萤光标记的寡核苷酸探针原位接近16S RNA(Unlabeled Helper Oligonucleotides Increase the In Situ Accessibility to 16S RNA ofFluorescently Labeled Oligonucleotide Probes)，66(8)应用与环境微生物3603-3607(2000)；丹尼拉·A·M·孔尼斯(Danielle A.M.Konings)和罗宾·R·戈特尔(Robin R.Gutell)，比较16S和类16S rRNA的相对衍生结构的热力学折叠(A comparison ofthermodynamic foldings with comparatively derived structures of 16S and 16S-like rRNAs)，1 RNA 559-574(1995)；哈里·F·诺勒(Harry F.Noller)等人，使用结构特定的化学探针研究16S核糖体RNA的结构和功能(Studies on the structure and function of 16S ribosomalRNA using structure-specific chemical probes)，8(3及4)有关生物分子结构相互作用的国际研讨会论文集(P_ROC.I_NT.S_YMP.B_IOMOL.S_TRUCT.I_NTERACTIONS)，生物科学杂志增刊(S_UPPL.J.B_IOSCI.)747-755(1985)；亚历克斯·珀科夫(Alex Pozhitkov)等人，rRNA与微阵列杂交测试表明无法预测用于物种辨别的寡核苷酸探针的杂交特征(Tests of rRNAhybridization to microarrays suggest that hybridization characteristics of oligonucleotide probes for species discrimination cannot be predicted)，34(9)核酸研究(N_{UCLEIC ACIDS RES.})e66(2006)；米盖尔·安琪尔·雷耶斯-洛佩兹(MiguelReyes-)等人，使用寡脱氧核糖核苷酸微阵列和有效杂交对原核16S rRNA基因进行指纹识别(Fingerprinting of prokaryotic 16S rRNA genes using oligodeoxyribonucleotide microarrays and virtual hybridization)，31(2)核酸研究779-789(2003)；阿克姆·施玛博格(Achim Schmalenberger)等人，在基于PCR的微生物群落分析和遗传识别中引物与小亚基rRNA基因的不同进化保守区杂交的影响(Effect of Primers Hybridizing to DifferentEvolutionarily Conserved Regions of the Small-Subunit rRNA Gene in PCR-Based MicrobialCommunity Analyses and Genetic Profiling)，67(8)应用与环境微生物3557-3563(2001)；S.-C.陶(S.-C.Tao)等人，硫氰酸胍浓溶液中标靶DNA与微阵列的室温杂交(Room-Temperature Hybridization of Target DNA with Microarrays in Concentrated Solutions of Guanidine Thiocyanate)，34(6)生物技术(B_IOT_ECHNIQUES)1261，1262(2003)；C.R.伍斯(C.R.Woese)等人，细菌16S核糖体RNA的二级结构模型：系统发生、酶和化学证据(Secondary structure model for bacterial 16S ribosomal RNA：phylogenetic，enzymatic and chemical evidence)，8(10)核酸研究2275-2293(1980)；L·萨法科·耶尔马兹(L.Safak Yilmaz)和丹尼尔·R·诺格拉(Daniel R.Noguera)，解决荧光原位杂交中的杂交效率问题的机械方法(Mechanistic Approach to the Problem of Hybridization Efficiency in Fluorescent In Situ Hybridization)，70(12)应用与环境微生物7126-7139(2004)；L·萨法科·耶尔马兹(L.Safak Yilmaz)等人，制备可原位接近单DNA寡核苷酸的大肠杆菌16S rRNA的所有部分(Making All Parts of the 16S rRNA of Escherichia coli Accessible In Situ to Single DNA Oligonucleotides)，72(1)应用与环境微生物733-744(2006)。

以下参考文献涉及细菌和其它微生物的鉴别和区分：希文·克拉西兹(Sven Klaschik)待人，检测和区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的实时PCR(Real-Time PCR for Detection and Differentiation of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria)，40(11)临床微生物学杂志(J.C_LIN.M_ICROBIOL.)4304-4307(2002)；伊丽莎白·M·马洛(Elizabeth M.Marlowe)等人，应用rRNA探针矩阵从常规血液培养物中快速鉴别细菌和真菌(Application of an rRNA Probe Matrix for Rapid Identification of Bacteria and Fungi from Routine Blood Cultures)，41(11)临床微生物学杂志5127-5133(2003)。

以下参考文献涉及在分子生物学中使用杂交技术：弗朗索瓦·库特勒(Francois Coutlee)等人，通过溶液杂交和酶免疫检验来定量检测信使RNA(Quantitative Detection of Messenger RNA by Solution Hybridization and Enzyme Immunoassay)，265(20)生物化学杂志(J.B_IOL.C_HEM.)11601-11604(1990)；加里·K·麦克马斯特(Gary K.McMaster)和戈登·G.·卡迈克尔(Gordon G.Carmichael)，在聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶上使用乙二醛和吖啶橙分析单股和双段核酸(Analysis of single-and double-stranded nucleic acids onpolyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange)，74(11)美国国家科学院院刊(P_ROC.N_ATL.A_CAD.S_CI.USA)4835-4838(1977)；南方杂交-基因组ES细胞DNA(Southern Hybridization-Genomic ES Cell DNA)。

以下参考文献涉及使用ARB软件获得的核糖体RNA探针可接近性(ARB来源于拉丁词arbor，或树)：亚胡·库玛(Yadhu Kumar)等人，使用ARB软件包图示核糖体RNA探针可接近性的资料(Graphical representation of ribosomal RNA probe accessibility data using ARB software package)，BMC生物信息学(BMC B_{IOINFORMATICS})第6卷6l(2005)；亚胡·库玛(Yadhu Kumar)等人，使用ARB软件包关于核糖体RNA的三维结构评估序列比对和寡核苷酸探针(Evaluation of sequence alignments and oligonucleotide probes with respect to three-dimensional structure of ribosomal RNA using ARB software package)，BMC生物信息学(BMC B_{IOINFORMATICS})第7卷240(2006)；亚胡·库玛(Yadhu Kumar)等人，陈述标题为使用ARB软件目测核糖体RNA的探针可接近性(presentation entitled Visualization of Probe Accessibility of Ribosomal RNA using ARB Software)。

以下参考文献涉及16S rRNA的探针和引物：K·格瑞森(K.Greisen)等人，大部分病原菌物种(包括脑脊髓液中发现的细菌)的16S rRNA基因的PCR引物和探针(PCRPrimers and Probes for the 16S rRNA Gene of Most Species of Pathogenic Bacteria，Including Bacteria Found in Cerebrospinal Fluid)，32(2)临床微生物学研究335-351(1994)；菲利普·胡根霍尔特兹(Philip Hugenholtz)等人，设计和评估靶向16S rRNA的寡核苷酸探针用于荧光原位杂交(Design and Evaluation of 16S rRNA-TargetedOligonucleotide Probes for Fluorescence In Situ Hybridization)，分子生物学方法(M_ETHODS.M_OL.B_IOL.)第179卷29-42(2002)；克里斯多佛·雷(Christopher Lay)等人，设计和验证16S rRNA探针以计数人类粪便微生物群中柔嫩梭菌亚群的成员(Design and validation of 16S rRNA probes to enumerate members of the Clostridium leptum subgroup in human faecal microbiota)，7(7)环境微生物学(E_NVIRON.M_ICROBIOL.)933-946(2005)。

核酸酶保护检验代表另一种用于检测核酸，特别是RNA的方法。核酸酶保护检验最常采用消化单股核苷酸序列的核酸酶，其通常对DNA或RNA底物具有特异性。这些核酸酶通常针对其各别底物核酸或嵌合双股核酸的双股形式，即包含RNA:RNA、DNA:DNA或RNA:DNA的双股，展示实质上减弱的活性或无活性。特别是核糖核酸酶保护检验使得能够鉴别和表征包括转录本、外显子/内含子边界等RNA物质。核糖核酸酶保护检验通常依赖于RNA探针与标靶RNA之间的杂交，以及在RNase，通常是RNaseA、RNaseT1、RNase I或这些RNase的组合的作用下对非杂交RNA的消化。通过将探针RNA与其标靶RNA组合，接着变性，且随后退火，产生双股RNA复合物，来进行反应。用RNase处理此探针/标靶复合物，以消化样品中的任何非杂交区段、未杂交探针或其它RNA分子。通常仅未经消化的双股探针/标靶RNA区段将经受得住核酸酶消化，随后通过检测加以分析。

无论这些领域中研究活动的数目如何，从大量不同的试样(例如植物、动物和微生物生物体的各种组织)或在这些试样中分离和检测DNA或RNA的方法常常需要先进的实验室、昂贵的设备和训练有素的高学历人员可靠地进行操作。这些方法也需要先进和主观的分析技术，如桑格定序(Sanger sequencing)、PCR、qRT-PCR和RT-PCR或FISH和阵列杂交。

另外，核酸分离、核酸检测或两者常常需要全部核酸、DNA或RNA高度纯化以及温度和时间条件小心且精确地受到控制。当整体考虑这些时，核酸分离和分析时间可为漫长的，且从开始到结束通常需要3-6小时。实际上，对于基于阵列的方法来说，过夜杂交为常见的。另外，在需要洗涤的情况下，通常严格地控制温度以提供严格性，特别是在杂交检验中。

在任何检验中，背景和非特定信号都可构成伪信号且内在地限制检验灵敏度。因此，已经发展大量试剂和技术来解决和减少检验中的背景信号。然而，还需要进一步改良以减少从非特定来源产生的信号，因为每个检验系统都具有促使背景或非特定信号产生的特征，且现有方法无法解决这个问题。例如免疫检验或核酸杂交检验等现有方法可受益于因背景和/或非特定信号减少而获改良的灵敏度。

因此，需要更灵敏且更易于使用的检验，其采用改良的分离方法、用于这些方法的杂交试剂和条件、和可用作核酸探针的寡核苷酸，以及灵敏且易于使用的检验。也需要避免使用先进仪器、广泛纯化的核酸或高学历人员和机构(facility)进行检验的检验。更明确地说，需要用于研究诊断学中且用于检测通常与人类和/或动物接触的常常在食物、废水、医药和个人护理产品和环境中发现的微生物的探针和检验。

发明内容

本发明涉及如下发现：当在核酸探针和标靶核酸存在下使用至少一种核酸酶时，探针与标靶核酸将轻易地形成可检测的探针-标靶复合物。而在缺乏核酸酶的情况下，将不形成可检测的探针:标靶复合物。形成这些复合物将比在核酸酶存在下形成这些复合物要慢得多，或形成所述复合物可能需要使用精确规定的与温度和溶剂有关的条件。另外，发现某些氟表面活性剂可减少因检验组份的非特异性结合而产生的信号(背景)。此减少可以改良检验灵敏度，特别是在例如采用化学发光作为检测模式的检验等高灵敏度检验中。使用这些发现中的一或两者可改良核酸杂交检验。下文将更详细地描述若干这些实施例。

本发明涉及一种检测样品中至少一种核苷酸序列的存在的方法，其包含：提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；通过组合样品或相关序列、至少一种以可检测标记作标记的核酸探针、和能够降解相关序列的核酸酶，产生混合物；其中核酸酶在探针加入之前或与之同时加入样品或相关序列中；且其中相关序列与探针之间形成复合物；和测量复合物中可检测标记的含量，其中复合物中存在可检测标记表明存在相关序列。

本发明也涉及一种检测样品中至少一种核苷酸序列的存在的方法，其包含：提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；通过组合样品或相关序列、和至少一种以可检测标记作标记的核酸探针与能够降解相关序列的核酸酶的组合，产生混合物；且其中相关序列与探针之间形成复合物；和测量复合物中可检测标记的含量，其中复合物中存在可检测标记表明存在相关序列。

本发明另外涉及一种检测样品中至少一种核苷酸序列的存在的方法，其包含：提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；通过组合样品或相关序列、至少一种以可检测标记作标记的核酸探针、和能够降解相关序列的核酸酶，产生混合物；其中探针在选定时期内加入样品或相关序列中；其中相关序列与探针之间形成复合物；和测量复合物中可检测标记的含量，其中复合物中存在可检测标记表明存在相关序列。

本发明也涉及一种检测样品中至少一种核苷酸序列的存在的方法，其包含：提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；通过组合样品或相关序列、至少一种以可检测标记作标记的核酸探针、和能够降解相关序列的核酸酶，产生混合物；其中核酸酶在相关序列与探针杂交之前加入样品或相关序列和探针中，产生选定杂交百分比；其中相关序列与探针之间形成复合物；和测量复合物中可检测标记的含量，其中复合物中存在可检测标记表明存在相关序列。

本发明涉及一种检测样品中至少一种核苷酸序列的存在的方法，其包含：提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；通过组合样品或相关序列、至少一种以可检测标记作标记的核酸探针、和能够降解相关序列的核酸酶以及至少一种氟表面活性剂，产生混合物；其中相关序列与探针之间形成复合物；和测量复合物中可检测标记的含量，其中复合物中存在可检测标记表明存在相关序列。

本发明也涉及一种用于检测样品中至少一种核苷酸序列的存在的试剂盒，其包含至少一种以可检测标记作标记的核苷酸探针、氟表面活性剂和能够降解相关核苷酸序列的核酸酶。

本发明试剂盒也可包含此试剂盒的使用说明书。试剂盒可另外包含试剂底物。试剂盒也可包括溶解/提取缓冲液和/或洗涤缓冲液。另外，本发明试剂盒可用于任何用于检测样品中的至少一种相关核苷酸序列的方法中。

本发明也涉及一种检测样品中相关标靶的存在的方法，其包含：提供可能含有相关标靶的样品；通过组合样品或相关标靶、至少一种以可检测标记作标记的探针、和至少一种氟表面活性剂，产生混合物；其中相关标靶与探针之间形成复合物；和测量复合物中可检测标记的含量，其中复合物中存在可检测标记表明存在相关标靶。相关标靶可选自由以下组成的群组：蛋白质、肽、小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质。

本发明另外涉及一种减少应用中的非特异性结合的方法，其包含：将至少一种氟表面活性剂加入缓冲液中；和进行此应用；其中至少一种氟表面活性剂的存在使表面上的非特异性结合减少。应用可为(但不限于)免疫检验、微流体检验、容器表面钝化、或细胞或组织培养。

本发明的优点在于，无需经纯化、分离的核酸，以及在样品RNA(当RNA为标靶时)存在下和在至少一种核酸探针存在下同时使用酶RNase A或另一核酸酶。另外，当使用样品全部核酸且DNA为标靶时，RNase A可用以帮助减少非特异性结合。另外，使用RNaseA或其它核酸酶使探针更好地接近其各别标靶不仅为新颖的，而且可应用到例如FISH或微阵列检验等其它方案中。此外，本发明检验不需要例如加热或离液序列高的盐(chaotropic salt)(通常为分离核酸所需)等任何使核酸变性的组份，或不需要在检验RNA之前或期间使样品中的RNA变性。可使用的其它核酸酶为RNase T1、RNaseI和S1核酸酶。

本发明也涉及一种检测样品中相关核苷酸序列的存在的方法，其包含以下步骤：提供可能含有待分析的相关核苷酸序列的样品；从样品中提取核苷酸序列；将所提取的相关核苷酸序列与至少一种核酸探针一起在杂交条件下培育，使得至少一种核酸探针与所提取的相关核苷酸序列杂交，形成相关核苷酸序列-探针复合物，其中所述至少一种核酸探针以可检测标记作标记；洗涤相关核苷酸序列-探针复合物；将试剂底物加入相关核苷酸序列-探针复合物中；和经由可检测标记测量杂交程度，其中检测到可检测标记表明存在相关核苷酸序列。

本发明的另一个实施例涉及一种区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌的方法，其包含以下步骤：提供可能含有包含待分析的相关核苷酸序列(nucleic sequence)的微生物的样品；使微生物溶解；从微生物中提取相关核苷酸序列；将所提取的相关核苷酸序列与至少一种核酸探针一起在杂交条件下培育，使得至少一种核酸探针与所提取的相关核苷酸序列杂交，形成相关核苷酸序列-探针复合物，其中所述至少一种核酸探针以可检测标记作标记；用洗涤溶液洗涤相关核苷酸序列-探针复合物；将试剂底物加入经洗涤的相关核苷酸序列-探针复合物中；和经由可检测标记测量杂交程度，其中检测到可检测标记表明存在革兰氏阴性微生物。

本发明也涉及一种检测样品中核酸的存在的方法，其包含以下步骤：提供可能含有待分析的RNA的细胞样品；使细胞溶解；从细胞中提取RNA；将所提取的RNA与至少一种核酸探针一起在杂交条件下培育，使得至少一种核酸探针与所提取的RNA杂交，形成RNA-探针复合物，其中所述至少一种核酸探针以可检测标记作标记；用洗涤溶液洗涤RNA-探针复合物；将试剂底物加入经洗涤的RNA-探针复合物中；和经由可检测标记测量杂交程度，其中检测到可检测标记表明存在RNA，和鉴别RNA的细胞身份。另外，可用本发明检验检测微生物，包括细菌、真菌或其它微生物。

本发明的另一个实施例涉及一种区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌的方法，其包含以下步骤：提供可能含有包含待分析的RNA的微生物的样品；使微生物溶解；从微生物中提取RNA；将所提取的RNA与至少一种核酸探针一起在杂交条件下培育，使得至少一种核酸探针与所提取的RNA杂交，形成RNA-探针复合物，其中所述至少一种核酸探针以可检测标记作标记；用洗涤溶液洗涤RNA-探针复合物；将试剂底物加入经洗涤的RNA-探针复合物中；和经由可检测标记测量杂交程度，其中检测到可检测标记表明存在革兰氏阴性微生物。

本发明也涉及一种检测样品中微生物的存在的方法，其包含以下步骤：提供可能含有包含待分析的DNA的微生物的样品；使微生物溶解；从微生物中提取DNA；将所提取的DNA与至少一种核酸探针一起在杂交条件下培育，使得至少一种核酸探针与所提取的DNA杂交，形成DNA-探针复合物，其中所述至少一种核酸探针以可检测标记作标记；用洗涤溶液洗涤DNA-探针复合物；将试剂底物加入经洗涤的DNA-探针复合物中；和经由可检测标记测量杂交程度，其中检测到可检测标记表明存在微生物。

本发明的另一个实施例涉及一种区分革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌的方法，其包含以下步骤：提供可能含有包含待分析的DNA的微生物的样品；使微生物溶解；从微生物中提取DNA；将所提取的DNA与至少一种核酸探针一起在杂交条件下培育，使得至少一种核酸探针与所提取的DNA杂交，形成DNA-探针复合物，其中所述至少一种核酸探针以可检测标记作标记；用洗涤溶液洗涤DNA-探针复合物；将试剂底物加入经洗涤的DNA-探针复合物中；和经由可检测标记测量杂交程度，其中检测到可检测标记表明存在革兰氏阴性微生物。

本发明检验可采用至少一种氟表面活性剂。例如

FSA等氟表面活性剂的新颖使用将减少样品的非特异性结合和发泡。另外，本发明的新颖且有益的特性包括：用于此检验的探针和其组合(可使用单个探针、双探针和三探针)；杂交时间相对较短；杂交与捕捉步骤之间无洗涤；使用各种杂交和捕捉温度，这些温度展示类似结果(即约20℃-约42℃，或甚至高达约55℃)；和使用不严格洗涤。

本发明所采用的至少一种氟表面活性剂可选自由阴离子型氟表面活性剂、阳离子型氟表面活性剂、两性氟表面活性剂、非离子型氟表面活性剂、两性离子型氟表面活性剂和其混合物组成的群组。所述至少一种氟表面活性剂可为3-[2(全氟烷基)乙硫基]丙酸的羧酸锂盐、双[2-(全氟烷基)乙基]磷酸铵、链长小于4的全氟醇、氟脂族磷酸酯铵(ammonium fluoroaliphatic phosphate ester)和其混合物。

在本发明方法中，必要时，可在培育之前从样品中提取至少一种相关核苷酸序列。可通过将样品与溶解/提取缓冲液一起培育来进行提取。

本发明方法可采用一个、两个、三个或更多核酸探针。探针可为用作捕捉探针与信号探针的单个探针；可为两个探针，其中一者为捕捉探针，且另一者为信号探针。也涵盖三探针系统，其将包括捕捉探针、信号探针和桥式探针。捕捉探针和信号探针可以可检测标记作标记，且加入试剂底物。

捕捉探针标记的一个实例为生物素，且信号探针标记的一个实例为碱性磷酸酶。碱性磷酸酶将与选自由以下组成的群组的试剂底物反应：金刚烷基-1，2-二氧环丁烷磷酸酯、磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯/硝基蓝四氮唑和磷酸对硝基苯酯。

本发明方法可包含溶液相杂交，接着捕捉所需核酸，接着为洗涤步骤。杂交步骤可以溶液杂交、固体载体上杂交、或利用溶液杂交与固体载体上杂交两者的杂交系统进行。

本发明方法可包含：固定复合物，用洗涤缓冲液洗涤复合物，以便去除未结合的物质，和在经由可检测标记测量杂交程度之前保留复合物。或者，复合物可固定，但不洗涤。本发明方法也可包含在采用洗涤步骤的洗涤后加入试剂底物。

本发明方法适用于检测所有类型的样品的DNA与RNA，包括(但不限于)微生物、细菌、和例如酵母和霉菌等真菌。另外，本发明方法可用于检测除核酸以外的相关标靶。举例来说，这些方法可用于检测蛋白质、肽、小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质。这些方法还可用以减少例如免疫检验、微流体检验、细胞培养和容器表面钝化等应用中的非特异性结合。

本发明的其它系统、方法、特性和优势将在所属领域的技术人员检查以下各图和具体实施方式后变得显而易见。所有这些其它的系统、方法、特性和优势都意欲包括在具体实施方式中，在本发明的范围内并受权利要求书保护。

附图说明

附图并入本说明书中且构成本说明书的一部分，说明本发明的实施，且连同具体实施方式一起用以说明本发明的优势和原理。

图1描绘大肠杆菌的小亚基核糖体RNA(rRNA)的二级结构的图。

具体实施方式

定义：

除非明确地相反陈述，否则如本文所使用，以下术语具有既定含义。

“核苷酸”为一种由磷酸酯基、5-碳糖和含氮碱基组成的核酸亚基。在RNA中发现的5-碳糖为核糖。在DNA中，5-碳糖为2-脱氧核糖。对于5′-核苷酸来说，糖在5′-碳-5处含有羟基(-OH)。此术语也包括这些亚基的类似物，且尤其包括在核糖的2′位具有甲氧基(-OMe)的类似物。如本文所使用，含有“T”残基的甲氧基寡核苷酸在核糖部分的2′位具有甲氧基，且在核苷酸的碱基位置具有尿嘧啶。

“寡核苷酸”为一种具有两个或两个以上核苷酸亚基共价接合在一起的核苷酸聚合物。寡核苷酸一般为约10至约100个核苷酸长。核苷酸亚基的糖基可为核糖、脱氧核糖或例如OMe等其经修饰的衍生物。核苷酸亚基可通过例如磷酸二酯键、经修饰的键等键，或通过不阻止寡核苷酸与其互补标靶核苷酸序列杂交的非核苷酸部分接合。经修饰的键包括标准磷酸二酯键由例如硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或中性肽键等不同的键置换的键。含氮碱基类似物也可为本发明寡核苷酸的组份。

“标靶核酸序列”、“标靶核苷酸序列”或“标靶序列”为可与寡核苷酸杂交的特定脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。

“核苷酸探针”为核苷酸序列充分与标靶核酸序列互补，从而能够在高严格性杂交条件下形成可检测的杂交探针:标靶双链体的核苷酸。核苷酸探针为分离的化学物质，且可包括标靶区以外的其它核苷酸，只要这些核苷酸不阻止高严格性杂交条件下的杂交即可。例如启动子序列、限制性内切酶识别位点、或赋予例如催化活性位点等所需二级或三级结构的序列等非互补序列可用以促进使用本发明探针进行检测。核苷酸探针可任选地经例如放射性同位素、荧光部分、化学发光部分、发色部分、酶或配体等可用以检测或证实探针与其标靶序列杂交或使得能够鉴别出序列的可检测部分标记。另外，核苷酸探针可含有核苷酸类似物。核苷酸类似物探针包括肽核酸(PNA)探针、含有硫代磷酸酯的探针、锁核酸(LNA)探针和含有2′-O-甲基残基的核酸探针。优选核苷酸探针的尺寸范围为10至100个核苷酸长。

“信号探针”含有可检测标记。信号探针能够优先与来自相关试样的标靶核酸内的标靶区段杂交，且通常包含15-100个核苷酸，通常为30-70个核苷酸，且优选为15-29个核苷酸，这些核苷酸能够与标靶核酸的标靶区段杂交。

“捕捉探针”能够结合于固体表面，例如纳米金、顺磁性微粒、微量滴定板孔的表面、塑料管壁、或固相例如用化合物涂布的膜。举例来说，涂布化合物可为抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素；接着，捕捉探针将会经生物素标记。另外，捕捉探针能够优先与来自相关试样的标靶核酸内的标靶区段杂交，且通常包含15-100个核苷酸，但经常为30-70个核苷酸，且优选为15-29个核苷酸。

“桥式探针”通常未经标记，且能够优先与来自相关试样的标靶核酸内的标靶区段杂交。桥式探针通常包含15-100个核苷酸，但经常为30-70个核苷酸，并且优选为10-29个核苷酸。桥式探针通常保护标靶rRNA的区段免于由用于检验中的RNase A降解。

术语探针也可涵盖：单个探针，其可标记为捕捉探针与信号探针两者；双探针系统，其中一者为捕捉探针且另一者为信号探针；或三探针系统，其中一者为捕捉探针，第二个探针为信号探针，且第三个探针为桥式探针。

这些探针中仅要求一者具有绝对辨别力或有差异地结合于标靶核酸。也就是说，信号或捕捉探针中至少一者应辨别出与标靶核酸的选定标靶区段杂交。信号探针可用于单个探针检验。捕捉和信号探针可用于双探针检验。信号、捕捉和桥式探针可用于三探针检验。实际上，信号和捕捉探针的杂交区段可相互替代，实质上同等成功地辨别革兰氏阴性生物体与革兰氏阳性生物体。当探针组中两者或两者以上用于检验中时，其通常将与标靶核酸的相邻区段杂交，但当其与标靶核酸内的各别标靶区段杂交时，可能在其末端之间存在小的间隙，即通常为10-20个核苷酸大小的间隙，更通常为5-10个，且优选为0-3个核苷酸。用于探针设计的序列和软件为所属领域中所熟知，且常用资源包括核酸库

和欧洲分子生物学实验室(the European Molecular Biology Laboratory，EMBL)、和例如在核糖体数据库工程(the Ribosomal Database Project，RDP)或ARB工程(ARB Project，ARB)下的软件等软件。

“可检测部分”为连接于核酸探针或合成作为核酸探针的一部分的分子。此分子应为可独特检测的，且因此使探针得到检测。这些可检测部分通常为放射性同位素、荧光分子、化学发光分子、发色酶、半抗原或独特的寡核苷酸序列。

“杂交物”或“双链体”为通过互补碱基之间的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)或非规范碱基配对，在两个单股核酸序列之间形成的复合物。

“杂交”为核酸的两个互补股组合形成双股结构(“杂交物”或“双链体”)的过程。

“互补性”为DNA或RNA单股的碱基序列所赋予的性质，通过在各别股上的沃森-克里克碱基对之间进行氢键结，所述单股可形成杂交或双股DNA:DNA、RNA:RNA或DNA:RNA。腺嘌呤(A)通常与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)互补，而鸟嘌呤(G)通常与胞嘧啶(C)互补。

“错配”是指杂交物中未形成规范沃森-克里克氢键的两个核苷酸的任何配对。另外，为进行以下讨论，错配可包括杂交物的一个股中的插入或缺失，其产生未配对核苷酸。

术语“严格性”用以描述杂交和后续处理步骤期间所存在的温度和溶剂组成。在高严格性条件下，只会形成高度互补的核酸杂交物；不会形成没有足够互补度的杂交物。因此，检验条件的严格性决定形成杂交物的两个核酸股之间需要的互补量。选择使由标靶和非标靶核酸形成的杂交物之间的稳定性差异最大的严格性条件。下文实施例中提供例示性的严格性条件。

术语“探针特异性”是指探针能够区别标靶与非标靶序列的特征。

“细菌”为被视为三大领域之一的系统发生群真细菌的成员。

“Tm”是指50％探针从杂交形式转变成未杂交形式所在的温度。

术语“所提取的RNA”是指A260/A280比率小于1.8的RNA。

术语“所提取的DNA”是指A260/A280比率小于1.8的DNA。

术语“全部核酸”是指A260/A280比率小于1.8的全部核酸。在纯化形式中，以上三种情况各自的A260/A280比率都为至少1.8，通常在1.8与2.2之间。

所属领域的技术人员应了解，本发明的实质上对应的探针可不同于所提及的序列，且仍与相同标靶核酸序列杂交。此核酸变化可根据序列内相同碱基的百分比或探针与其标靶序列之间完全互补碱基的百分比来说明。如果这些百分比为100％至80％，或为10个核苷酸的标靶序列中0个碱基错配至10个核苷酸的标靶序列中2个碱基错配，那么本发明探针实质上对应于核酸序列。在一个实施例中，百分比为100％至85％。在其它实施例中，此百分比为90％至100％；在其它实施例中，此百分比为95％至100％。

术语“充分互补”或“实质上互补”意指核酸具有足量的相邻互补核苷酸在高严格性杂交条件下形成供检测的稳定杂交物。

术语“核酸杂交物”或“探针:标靶双链体”意指一种结构，其为双股、氢键结的结构，优选为10至100个核苷酸长，更优选为14至50个核苷酸长。此结构足够稳定，使其由例如化学发光、生物发光或荧光检测、放射自显影(autoradiography)、电化学分析或凝胶电泳等方式检测到。这些杂交物包括RNA:RNA、RNA:DNA或DNA:DNA双链体分子或其类似物，例如PNA。

术语“优先杂交”意指在适合严格性杂交条件下，寡核苷酸探针可杂交其标靶核酸，形成稳定的探针:标靶杂交物(从而表明存在标靶核酸)，而不形成稳定的探针:非标靶杂交物(此将表明存在来自其它生物体的非标靶核酸)。因此，探针与标靶核酸杂交的程度比与非标靶核酸杂交的程度大得多，使所属领域的技术人员能够准确地检测例如革兰氏阴性类型细菌(例如肠杆菌科(family Enterobacteriaceae))的存在，并区别其存在与其它生物体的存在。可使用所属领域中已知和本文所述的技术测量优先杂交。举例来说，本发明的寡核苷酸探针优先杂交肠杆菌科细菌的核酸，相较于与白色念珠菌(C.albicans)(酵母)核酸杂交强约50-7,000倍。所属领域的一般技术人员将能确定特定的严格性条件或其范围，视其特定情况而定。也就是说，严格性可基于(但不限于)所进行的检验、核酸来源、所用探针等来确定。

肠杆菌科“标靶核酸序列区”是指存在于在肠杆菌科细菌中发现的核酸中的核酸序列或其互补序列，其不存在于其它物种的核酸中。核苷酸序列与标靶序列互补的核酸可通过标靶扩增来产生。

短语“至少一种核酸探针”是指一种或一种以上核酸探针。核酸可为RNA、DNA或例如PNA等核苷酸类似物。

术语“同时”定义为所有检验组份同时培育。更具体地说，所有组份同时加入反应容器中，以便所有所需组份在整个反应过程中都存在。

与RNA、特别是rRNA杂交优选于与DNA杂交，因为RNA为单股，通常以高拷贝数目存在且除某些病毒外，其代理活细胞。尽管rRNA是单股分子，但其具有特别的二级和三级结构，可使探针极难接近某些区段。为在微生物检测检验中成功地使用rRNA，必须破坏二级和三级结构，但仅仅是在可进行杂交的程度上。如果使rRNA在溶解状态下变性，那么其仍可显示快速恢复的趋势，将重新形成二级和三级结构。快速恢复由于分子内再折叠而快速发生，不受扩散限制。另外，必须确保rRNA分子未广泛降解。也就是说，rRNA之所以为优良的标靶，是因为其由于序列信息的深度和宽度以及存在于活细胞中且较为丰富而具有区分生物体的潜力。

申请者已惊奇并意外地发现使本发明实践人员能够简单且迅速地进行微生物的检测和/或测定检验的检验条件和方案。这些条件包括使用例如氟表面活性剂等试剂。氟表面活性剂或氟化表面活性剂为基于氟碳化合物的表面活性剂，其比类似的烃表面活性剂更有效地降低水的表面张力。为了达成本发明的目的，总体上氟表面活性剂在分子的一个氟碳化合物单元、实体、基团或区段部分中可具有6个或6个以上氟。

氟表面活性剂包括(但不限于)杜邦(DuPont)的

表面活性剂。这些化合物是一类氟表面活性剂和单体的成员。

FSA为3-[2-(全氟烷基)乙硫基]丙酸的羧酸锂盐且表示为R_fCH₂CH₂SCH₂CH₂COOLi。

FSE为另一种适合的氟表面活性剂，其性质类似于以上

FSA，且称为双[2-(全氟烷基)乙基]磷酸铵，且由式(R_fCH₂CH₂O)_xPO(ONH₄)_y(OCH₂CH₂OH)_3-x-y表示。另外，氟表面活性剂FSP为(R_fCH₂CH₂O)P(O)(ONH₄)₂与(R_fCH₂CH₂O)₂P(O)(ONH₄)的混合物，也适用于本发明检验中。清洁剂的使用显著地减少背景信号，使实践人员能够获得更透明且更明确的结果。另外，使用

表面活性剂也减少检验期间样品发泡。其它适用的氟表面活性剂系列为来自清美化学公司(Seimi Chemical Co.)的

系列、来自帝国化学工业公司(Imperial Chemical Industries)的

系列、来自欧诺法公司(Omnova Solutions)的链长小于4的全氟醇PolyFox^TM系列、和来自梅森化学公司(Mason Chemical Company)的

系列。

一般说来，氟表面活性剂可选自具有含烷基、芳基和烷芳基的全氟区段的表面活性剂，其还可以含有其它官能团。这些基团包括(但不限于)磷酸酯、羧酸或胺，胺中存在伯胺、仲胺、叔胺或季胺基团或官能团。另外，氟表面活性剂可选自己知的主要氟表面活性剂类别，例如阴离子类、阳离子类、两性、非离子类、和两性离子类。可用于本发明检验中的特定氟表面活性剂可为(但不限于)3-[2(全氟烷基)乙硫基]丙酸的羧酸锂盐、双[2-(全氟烷基)乙基]磷酸铵、链长小于4的全氟醇、氟脂族磷酸酯铵和其混合物。

具体地说，当反应物质含有在反应pH值下携带净负电荷(例如由杂交反应中核酸探针与样品核酸的磷酸骨架所显示的净负电荷)的分析物和活性试剂时，阴离子型氟表面活性剂为适用的。通常，杂交检验可涉及使用蛋白质相互作用。举例来说，当使用抗生蛋白链菌素/生物素或抗生物素蛋白/生物素相互作用时，所用蛋白质可具有正电荷，引起蛋白质与核酸之间的电荷相互作用，从而导致非特异性结合。如以下实例中所证实，使用阴离子型氟表面活性剂可减少这些相互作用。

重要的是，利用氟表面活性剂的有益影响也可施加于在反应pH值下主要反应物质具有净正电荷的基于蛋白质的检验。举例来说，溶液相或固定免疫检验可利用例如抗体等反应组份代替核酸。在这些情况下，使用阳离子型氟表面活性剂可减少这些非特异性相互作用且减少背景信号。在核酸杂交检验与基于蛋白质的检验中，也可采用阳离子型与阴离子型以及非离子型氟表面活性剂来减少背景和非特异性结合，特别是例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、玻璃、二氧化硅、铁氧化物、金属(例如金)或膜(例如由硝酸纤维素、PVDF、乙酸纤维素等构成的膜)等表面。所属领域的技术人员应了解用作检验组份的适用氟表面活性剂的所需物理性质，例如在所欲浓度下的水溶性以及与活性生物组份(例如抗体或酶)的相容性，使得氟表面活性剂不使其它检验组份失活。

然而，在一些情况下，可能需要氟表面活性剂使检验中例如蛋白酶或核酸酶等一些组份失活，如所属领域的技术人员可轻易地测定。氟表面活性剂的类型和浓度视检验中存在的pH值、盐和缓冲剂、以及检验的其它清洁剂和其它组份而定。氟表面活性剂浓度的适用范围一般介于1％与0.0001％之间。在一些情况下，例如为钝化膜或其它固体表面，氟表面活性剂可溶于有机溶剂或水/有机溶液(例如DMSO或乙醇)中，且所属领域的技术人员应了解所需的适当溶剂条件。氟表面活性剂可在检验中的若干点加入。在一个实施例中，氟表面活性剂可在组合其它成份(例如作为阻断剂或与阻断剂一起)之前加入。在另一个实施例中，氟表面活性剂可在培育或杂交步骤期间加入。在另一个实施例中，氟表面活性剂可在洗涤步骤期间加入。

另外，令人惊讶地，使用少量RNase会使RNA与核酸探针之间的杂交更佳且更完全。使用RNase会破环RNA的二级和三级结构，但不会广泛降解此结构，以致可发生杂交。虽然大部分rRNA最终可降解，但此降解实质上不应影响测试结果。可采用其它核酸酶，包括(但不限于)非特异性核酸酶和DNase的。此外，申请者意外地发现本发明检验可使用单个检验容器轻易地进行。

核酸酶为实质上不会降解复合物中的相关序列或探针的酶。包括样品或至少一种相关序列、至少一种以可检测标记作标记的探针和核酸酶的检验组份加入反应容器中。相较于其它反应组份，加入核酸酶的时间可在加入相关序列和探针之前或与之同时。在一个实施例中，核酸酶与相关序列和探针同时加入。

核酸酶加入杂交反应混合物中的时间的选择是重要的，因为在加入探针之前过早加入核酸酶会导致所分析的样品中的标靶序列降解。当核酸酶在加入一种或一种以上检验的核酸探针之前加入含有相关标靶序列的待检样品中时，探针优选可在几分钟后即加入。举例来说，选定用于加入核酸酶的时期可为约0分钟至约60分钟，或约1分钟至约30分钟，或约1分钟至约15分钟，或约0分钟至约5分钟，或约0分钟至约2分钟。这些时间范围反映了核酸酶是在加入探针后加入，且当核酸酶是在使核酸酶具有活性的温度下或其附近温度下加入时，这可为重要的。对于来源于嗜中温的生物体的核酸酶来说，此温度可为约20℃至约50℃。一些仅在远超过室温的温度下具有活性的抗热核酸酶可在室温或较低温度下显示几乎没有活性，但在杂交温度下具有适当活性，且因此探针加入的时间选择不再那么重要。

加入核酸酶的另一方面为，反应组份可在核酸酶没有活性的条件下以任何顺序加入。在这种情况下，这些条件可随后进行修改，以使核酸酶具有活性，而不折损其它检验组份的必要功能。举例来说，当加入组份时反应的温度为约4℃，核酸酶一般没有活性时，所有组份实际上可同时加入。随后增加检验温度至适于杂交的温度，将引起核酸酶基本上重新获得充足的活性且使杂交反应得以进行。

促进核酸酶的条件性失活或活化的另一个实施例为加入金属离子。金属离子会抑制检验中使用的任何核酸酶(例如钙离子或锌离子)。考虑到金属离子和核酸酶，使这些离子以适当浓度加入核酸酶缓冲液中，且从而可逆地使核酸酶失活。用于检验的杂交部分的组份包括含有一种或一种以上待检核酸、一种或一种以上核酸探针和可逆失活的核酸酶的样品。在杂交组份组装之后，通过加入所用金属离子的螯合剂活化核酸酶。举例来说，如果使用呈氯化物盐形式的钙离子来抑制核酸酶，那么可使用EDTA或EGTA来螯合钙且实质上消除其对核酸酶的抑制作用。钙的螯合将使核酸酶实质上重新获得其充足的活性，因此促进探针与潜在标靶之间的杂交反应。这些选择性且可逆地使核酸酶失活的方法有助于组装反应组份。如高通量情形下所常见，这在有大量样品需要检验(即96个样品、384个样品或1536个样品等)时特别适用。使用温度或螯合的两个实施例可个别或联合采用，或可使用选择性且可逆地抑制检验核酸酶的其它组合。

选择性且可逆地抑制核酸酶的优点在于，分析样品可同时开始起始杂交反应。所有样品中核酸酶的活化几乎同时发生，因此当与一系列从第一个样品至最后一个样品的加入可具有实质上不同的培育时间(incubation time)的个别组装的反应相比较时，本发明检验的定量或定性结果将获得改良。

本发明检验可包含溶液相杂交，接着捕捉所需核酸，接着为洗涤步骤。包括这些步骤与大部分生物体检测检验形成对比，这些检验中在初始杂交和捕捉两者之后都需要洗涤步骤。然而，杂交步骤可以溶液杂交、固体载体上杂交或利用溶液杂交与固体载体上杂交两者的杂交系统进行。

可通过在采用洗涤步骤的洗涤后将试剂底物加入样品中来进行检验检测。在一个实例中，如果使用一个核酸探针，那么其在一端用生物素标记且在另一端用碱性磷酸酶标记。如果使用两个探针，那么第一或捕捉探针可用生物素标记，且第二或信号探针可用碱性磷酸酶标记。在三探针系统中，信号和捕捉探针可经标记，而桥式探针一般不经标记。如果使用碱性磷酸酶作为信号探针标记，那么试剂底物可选自由以下组成的群组：金刚烷基-1，2-二氧环丁烷磷酸酯、磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯/硝基蓝四氮唑和磷酸对硝基苯酯。一般说来，当使用至少两个核酸探针时，探针的浓度实质上相同。

标靶核酸可从大量来源分离或制备。在一个实施例中，核酸可从例如细菌或病毒等微生物中分离。另外，来自多细胞生物体的核酸也可用作标靶核酸。或者，裸核酸可用于本发明中。

如果标靶核酸需要从细胞或病毒中分离，那么可使用多种核酸分离方案。这些方案可包含使用溶解/提取缓冲液，溶解细胞或破环病毒包膜和外壳。核酸可进一步通过包括酚提取和乙醇沉淀在内的多种技术来纯化。这些方案仅仅是核酸分离的简略实例，且其它方案为所属领域中的技术人员所熟知(参看例如“分子克隆-实验手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual.)”)。

一旦核酸已经分离或以其它方式获得，样品将可能需要脱盐。一种熟知的方法包含使用NAP柱。为使核酸样品脱盐，将样品施加于NAP柱中，且在一系列管中洗脱。一旦样品穿过所述柱，就使用乙醇沉淀进一步纯化。所属领域的技术人员将另外了解用于核酸样品的脱盐的其它方案。

如果聚集体或沉淀存在于核酸样品中，那么可使用各种熟知的方案去除这些聚集体或沉淀。举例来说，核酸样品可经受膜过滤、离心等。所属领域的技术人员将能够视样品和其来源而定，确定去除微粒/聚集体的最有效方法。

标靶核酸可固定于例如硝酸纤维素或玻璃或塑料显微镜载片等表面。在一个实施例中，当RNA为标靶，适当考虑保护RNA的完整性时，将标靶核酸包含在例如福尔马林固定的石蜡包埋组织或细胞或者乙醇固定且浸透的细胞等固定细胞中。在实现探针-标靶双链体形成的适合条件下在核酸酶存在下进行杂交，且通过适合的方式，考虑可检测标记的性质和其对检测的要求，检测信号。另外，探针、标靶、耐热信号和捕捉探针以及耐热核酸酶可组合且短暂暴露于足以使反应混合物中的核苷酸序列变性的温度。接着，混合物可冷却至使探针与标靶核苷酸可形成稳定的能鉴别的杂交双链体且核酸酶具有活性的温度。核酸酶优选抗热或耐热，或在RNaseA的情况下，核酸酶可在杂交温度下再折叠且变得具有充足活性。对于RNA标靶来说，暴露应少于5分钟，以便RNA在很大程度上或以最低程度降解。适合温度约介于约85℃至约95℃之间。

虽然申请者知道本发明可广泛地用于检测来自大量不同的样品类型的DNA与RNA，但使用核糖体RNA(rRNA)的小亚基(SSU)来评估本发明，以最优化本发明的特性。特别是在发展检验的过程中利用来自细菌和真菌的SSU rRNA。

在一些情况下，当检验从装备良好并拥有经验丰富的工作人员的分子生物学实验室的工作台扩大到真实世界的制造条件时，PCR抑制剂、高含量核酸酶和其它潜在的检验干扰可造成巨大的挑战。另外，rRNA的二级结构可激起挑战，因为序列同源性使得设计的探针难以充分地区别物种。此外，由于rRNA形成坚固的二级和三级结构，所以难以与核酸探针杂交。因此，申请者使用SSU rRNA来证实本发明相较于目前技术的优越性和新颖性。

必要时，使用氧化锆/二氧化硅珠粒溶解微生物，使RNA可接近且进行杂交。溶解可需要缓冲系统，所述系统可包含3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸(MOPS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS、二硫苏糖醇(DTT)、基于硅酮聚合物的消泡剂和水可稀释的活性硅酮(即设计用于控制水性系统中的泡沫)。溶解/提取缓冲液的组成和浓度可最优化。举例来说，溶解/提取缓冲液可包含约100mM至约300mM MOPS、约10mM EDTA至约30mMEDTA、约1％SDS至约3％SDS、约5mM DTT至约15mM DTT、约0.5％至约1.5％基于硅酮聚合物的消泡剂和约0.5％至约1.5％的水可稀释的30％活性硅酮乳液(即设计用于控制水性系统中的泡沫)。或者，溶解/提取缓冲液可包含约150mM至约250mMMOPS、约15mM EDTA至约25mM EDTA、约1.5％SDS至约2.5％SDS、约7.5mM DTT至约12.5mM DTT、约0.75％至约1.25％基于硅酮聚合物的消泡剂和约0.75％至约1.25％的水可稀释的30％活性硅酮乳液(即设计用于控制水性系统中的泡沫)。一种特定的溶解/提取缓冲液可包含约200mM MOPS、约20mM EDTA、约2％SDS、约10mM DTT、约1％基于硅酮聚合物的消泡剂和约1％水可稀释的30％活性硅酮乳液(即设计用于控制水性系统中的泡沫)。溶解后，可通过个别针筒过滤装置过滤样品，以从所提取的RNA去除细胞碎片。可使用例如凝胶排阻色谱法、离心柱和所属领域中已知的其它程序等技术过滤样品并脱盐。

所提取的RNA接着与核酸探针和核酸酶一起在杂交条件下同时培育。具体地说，本发明采用至少一种探针。在一个实施例中，本发明采用单个探针，其可为信号探针。在另一个实施例中，本发明采用两个探针：信号探针和捕捉探针。在另一个实施例中，本发明采用三个探针：捕捉探针、桥式探针和信号探针。这些探针各具有16个或更少的序列与标靶核酸序列互补的核苷酸，且可包含探针组合。举例来说，可使用一个或一个以上信号探针的组合或汇集。在另一个实例中，可使用一个或一个以上捕捉探针的组合或汇集。在使用这些组合探针或探针组的情况下，可检测一种以上相关序列。

当使用捕捉探针与信号探针且各探针与同一种SSU rRNA物质上的各别标靶杂交时，它们之间可有足够的单股RNA空间，因此如果桥式探针不在适当位置，那么预期RNase使此间插序列裂解且将捕捉探针和信号探针分成独立的RNA-探针复合物，导致随后检测步骤中出现检测损失。然而，意外地，未发生此检测损失，甚至是在未采用桥式探针的情况下。在本发明中，RNA并未如所预期，在RNase的作用下在两个区段之间裂解。因此，RNA区段未彼此分离，且捕捉探针和信号探针的串联情况得以保存。

RNase在所提取的RNA与至少一种核酸探针一起培育期间加入。接着RNA遭到破坏，但仅仅达到将发生杂交的程度。如果加入过多RNase，那么RNA将完全降解。可加入培育中的RNase的量介于约10ng至约40ng之间，或者介于约15ng至约25ng之间。约25ng的量的RNase可加入反应混合物中。

用于杂交检验中的核酸酶的适用浓度可为约1.0^-12至约2.0个单元，或约0.002至约0.16个单元。举例来说，对于150μl杂交反应体积，RNase A的浓度或量介于约0.01ng至约1μg范围内，或优选介于约1ng至约80ng范围内，特别是介于约4ng至约40ng范围内。基于关于RNase A活性的典型检验，高质量或更纯的此酶具有在每微克纯酶2个单元的范围内的比活性。所属领域的技术人员将认识到，核酸酶的这些浓度视反应体积、标靶和探针核苷酸的浓度、检验时间和温度以及用于此检验的核酸酶或核酸酶组合而定。

在一些情况下，在辨别例如仅相差单个碱基的序列等高度同源的标靶序列时，需要实质上较高浓度的核酸酶。提供这样的单碱基辨别力的核酸酶浓度的范围通常为以上所述的浓度的2至1000倍。然而，在大部分情况下，针对高度同源的标靶所需的浓度为2-100倍。另外，可能需要核酸酶对其股裂解基序具有更广泛的特异性，以通过用于检验中的核酸探针实现标靶序列与同源非标靶序列之间的单碱基辨别。举例来说，当使用经碱性磷酸酶标记的信号探针和经生物素标记的捕捉探针时，一个最佳的RNase A浓度为约1ng至约120ng，其中反应温度为约20℃至约50℃。所属领域的技术人员将认识到，不同的反应体积、探针浓度等将需要其自己进行条件最优化，这些条件根据本揭示案轻易地确定。

适合的RNase为来自牛胰腺的RNase A，或作用于单股RNA，但不作用于双股RNA或RNA-DNA杂交物的其它等效RNase。RNase A特异性裂解嘧啶残基的3′磷酸酯键上的单股RNA，留下嘧啶3′磷酸酯和具有末端嘧啶3′磷酸酯的寡核苷酸(1)。此酶的活性不需要辅因子和二价阳离子。一般说来，RNase A可用于以下应用：a)在RNA或DNA定位中使来自RNA:DNA杂交物的未杂交的RNA区域裂解；b)从DNA微型制剂(mini-preps)去除污染的RNA；c)制备重组蛋白质；d)核糖核酸酶保护检验；e)质粒和基因组DNA分离；和f)定位DNA或RNA中的单碱基突变。

另一个优选核酸酶为RNase T1，其可从例如黑曲霉菌(Aspergillus niger)分离，且为特异性降解G残基处的单股RNA的核糖核酸内切酶。其使相邻核苷酸的3′-鸟苷酸残基与5′-OH残基之间的磷酸二酯键裂解，形成相应的中间物2′，3′-环状磷酸酯。反应产物为3′-GMP和具有末端3′-GMP的寡核苷酸。RNase T1的活性不需要金属离子。

RNase T1也可用于多种应用。RNase T1可用于：a)从DNA制剂中去除RNA；RNA定序；b)核糖核酸酶保护检验；c)与RNase A联合；d)从重组蛋白质制剂中去除RNA；和e)测定活体外从含有“G较少的卡匣”的DNA模板合成的RNA转录本的含量。RNaseT1的抑制剂包括金属离子和单核苷酸。鸟苷酸-2′，5′-鸟苷为RNase T1的特定抑制剂。

可用于本发明中的第三种RNase为RNase I。RNase I可从大肠杆菌中分离。不同于仅在胞嘧啶和尿苷后进行裂解的RNase A，RNase I在所有二核苷酸对之间进行裂解，经由2′，3′环状单磷酸中间物，使单股RNA降解为核苷3′-单磷酸酯。另外，通过在70℃下加热15分钟，使所述酶完全失活，以致无需在多个后续程序之前去除所述酶。

RNase I可用于以下应用：a)从DNA制剂中去除RNA；和b)检测RNA:RNA和RNA:DNA杂交物中的单碱基对错配的RNase保护检验。

此外，所属领域的一般技术人员应了解，用于检验中的RNase的量可视各种标准而最优化。举例来说，所属领域的一般技术人员将能够确定用于检验中的RNase的最优量，且在考虑例如检验体积、存在的标靶物质的量、检验反应时间和检验反应温度等某些变数时改变此量。

S1核酸酶为另一种可用于本发明中的酶。具体地说，S1核酸酶通过内切核苷酸使单股DNA和RNA降解，产生5′-磷酰基封端的产物。双股核酸(DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA)抵抗降解，除非酶的浓度非常高。S1核酸酶可用以从双股DNA中去除单股末端或选择性裂解单股DNA和定位RNA转录本或定位RNA转录本。

核酸酶保护检验(NPA)为一种用于生物化学和遗传学中的实验室技术，其用于鉴别从细胞中提取的不均一RNA样品中的个别RNA分子。此项技术甚至在低的总浓度下也可鉴别一种或一种以上已知序列的RNA分子。在NPA中，所提取的RNA首先与反义RNA或DNA探针混合，这些探针与所述序列或相关序列互补，且这些互补股杂交形成双股RNA(或DNA-RNA杂交物)。接着，混合物暴露于仅特异性裂解单股RNA，而对双股RNA无活性的核糖核酸酶。当反应完成时，易受影响的RNA区降解为非常短的寡聚物或个别核苷酸。留存的RNA片段为与加入的反义股互补且因此含有相关序列的片段。当探针为DNA分子时，使用S1核酸酶；当探针为RNA时，可使用任何单股特异性核糖核酸酶。检测留存的探针-RNA补体。核酸酶保护检验用以定位转录基因区的内含子和5′和3′末端。可获得关于初始细胞提取物中存在的标靶RNA的量的定量结果；如果标靶为信使RNA，那么此可指示细胞中此基因的转录程度。

用于本发明中的核酸酶能够降解样品中的相关核苷酸序列。然而，此核酸酶能够在其未结合于或存在于反应期间所形成的复合物中时降解相关核苷酸序列。当形成含有相关核苷酸序列和核酸探针的复合物时，核酸酶不太可能降解相关序列或探针。

杂交条件可为用于溶液杂交、固体载体上杂交的条件。或者，杂交条件可采用溶液杂交组份与固体载体杂交组份两者。

杂交反应可采用缓冲液(MOPS、氯化钠、氯化镁、

20、叠氮化钠和阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)、探针1(SEQ ID NO.：1；表2)和探针2(SEQ ID NO.：2；表2)。探针可以每个探针约1皮摩尔至约100皮摩尔的量，约2皮摩尔至约50皮摩尔的量，或每个探针5皮摩尔的量存在。探针组份的体积视最终检验体积而定。使用的探针一般比待分析的标靶核酸过量得多。通常，探针以相对于彼此等摩尔的量使用。在一些情况下，探针相对于彼此的摩尔比宜不同。举例来说，在双探针杂交中，存在的捕捉探针的浓度宜高于信号探针，而在其它情况下，对等比率的这些探针可为优选的。

混合杂交缓冲液、探针和RNase A并培育。杂交反应以及整个检验可在环境温度或高温下进行。可进行杂交的温度范围为约20℃至约55℃。杂交反应可在约31℃下或者在约42℃下进行。

杂交缓冲液可包含特定浓度的各种组份。举例来说，杂交缓冲液可包含约100mM至约300mM MOPS、约1M至约3M氯化钠、约0.01％至约0.1％

20(v/v)、约0.005％至约0.015％叠氮化钠和约0.1％至约0.3％

FSA(阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)(v/v)。杂交缓冲液的pH值可介于约6至约8之间，或为约6.5至约7.5，或为约6.9。杂交缓冲液可包含约150mM至约250mM MOPS、约1.5M至约3.5M氯化钠、约0.02％至约0.07％

20(v/v)、约0.007％至约0.012％叠氮化钠和约0.15％至约0.25％

FSA(阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)(v/v)。杂交缓冲液可包含约200mM MOPS、约3M氯化钠、约0.05％

20(v/v)、约0.01％叠氮化钠和约0.2％

FSA(阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)(v/v)，其中pH值为约6.9。可使用具有同等作用的含有以上补充物的其它缓冲液，例如Tris-缓冲生理盐水，这些缓冲液为所属领域中所熟知。缓冲液不应含有干扰检测或使其它检验组份失活的组份，例如排除SDS用于使用经碱性磷酸酶标记的探针的杂交，因为SDS会使此酶失活。

评定用于本发明中的适合的杂交缓冲液包括以下：

TMAC[3M TMAC、50mM MOPS、0.1％Tween 20、0.0067％叠氮化钠]；

TBS[0.1M Tris、0.15M NaCl、0.05％Tween 20、0.01％叠氮化钠]；

MOPS/甘露糖[50mM MOPS、200mM甘露糖、150mM NaCl、0.01％Tween 20]；

3M TMAC、TE(3.3mM Tris、0.33mM EDTA)、0.1％SDS；

0.2M TEAC、TE(3.3mM Tris、0.33mM EDTA)、0.1％SDS；

SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、0.05％Tween 20；

SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、0.05％Tween 20、1％高PEG；

SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、0.05％Tween 20、1％低PEG；

SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、0.05％Tween 20、10mM D-甘露糖；

0.2M TEAC；

1M TEAC；

3M TMAC；

SSC(0.9M NaCl、0.09M柠檬酸钠)、0.1％SDS；和

1X PCR缓冲液(普洛麦格(Promega)，目录号M8901)、5mM氯化镁。

在设计用于辨别不同标靶生物体的SSU rRNA的探针下，所有缓冲液的使用都会产生适合的检测和对不同标靶生物体的辨别。优选实施例为实例1中所用的杂交缓冲液。杂交缓冲液可制备为2X浓缩物，且接着稀释，或稀释至如实例9中所用的杂交缓冲液的1x工作浓度。

关于核酸酶与杂交组份组合的另一个实施例涉及至少一种经标记的核酸探针与可能存在于样品中的其各别标靶核苷酸序列之间的杂交程度。举例来说，核酸酶在探针：标靶杂交复合物或杂交百分比已发展至约0％至约95％、或约5％至约95％、或约5％至约75％、或约15％至65％、或约15％至约50％后加入。或者，杂交百分比可为约40％至约95％。所属领域的技术人员将认识到，当确定核酸酶与杂交反应的其它组份组合的适当时刻时，可利用所述杂交程度。

氟表面活性剂可为

FSA，其减少杂交期间样品的非特异性结合和发泡。在杂交之前，用可包含Tris、氯化钠、氯化镁和叠氮化钠的稀释缓冲液稀释核酸探针。

杂交可在溶液相中进行。然而，捕捉探针可固定于固相上，而非受到捕捉。固定探针的方法为所属领域中所熟知。适合的固相：捕捉探针实施例可为尺寸在10纳米至1微米范围内的纳米粒子，其中此尺寸范围内的粒子提供的反应和杂交动力学非常类似于用溶液相所获得的反应和杂交动力学。适于与捕捉探针结合的粒子为量子点、顺磁性粒子、荧光编码珠粒或金。在一个实施例中，捕捉探针连接于微量滴定板或个别管或管带的壁或孔。在另一个实施例中，固相为例如硝酸纤维素等膜。在另一个实施例中，捕捉探针固定在流动带等上。

特别是对于双探针或三探针实施例，杂交可在单管中进行，其中捕捉探针固定，且杂交和核酸酶消化发生在管中，接着洗涤以去除未结合的物质，且随后检测标靶探针组复合物中的信号探针。杂交也可发生在一个管中，随后又转移至另一个管中，进行捕捉和检测，如实例中所显示。另外，另一个使用单个探针的实施例如下进行：组合单个经标记的荧光探针、含有或可能含有探针的标靶核酸的样品、和核酸酶，接着变性，且通过荧光偏振来检测杂交的探针:标靶双链体。

用于检验的探针可为信号探针、捕捉探针和桥式探针，其可稀释至约0.75皮摩尔/微升至约1.75皮摩尔/微升、或约1皮摩尔/微升至约1.5皮摩尔/微升。探针也可用AP(碱性磷酸酶)稀释缓冲液稀释至约1.25皮摩尔/微升。AP稀释缓冲液可包含约50mM至约150mM Tris、约50mM至约150mM氯化钠、约1mM至约10mM氯化镁和约0.001％至约0.02％叠氮化钠。AP稀释缓冲液的pH值可为约8至约10，或为约8.5至约9.5，或为约9.0。AP稀释缓冲液可包含约75mM至约125mM Tris、约75mM至约125mM氯化钠、约2.5mM至约7.5mM氯化镁和约0.0075％至约0.015％叠氮化钠。AP稀释缓冲液也可包含约100mM Tris、约100mM氯化钠、约5mM氯化镁和约0.01％叠氮化钠且pH值为约9.0。

用于本发明检验中的探针应对用于检验中的核酸酶或核酸酶组合具有抗性或惰性。当RNase用于检验中时，探针可具有DNA组成，或当S1核酸酶用于检验中时，探针可为RNA。所属领域的技术人员应知道，核苷酸序列探针的骨架可经修饰以对核酸酶具有抗性，在这样的情况下，这些探针即使在RNase用于检验中时也可包含RNA，或其可包含例如2′O-甲基核糖核苷酸等经修饰的核苷酸。同样，对于针对DNA或RNA标靶的任一种探针，骨架的核苷酸键可包含硫代磷酸酯、肽键(例如PNA)或N-吗啉基官能团。核苷酸序列的长度可为10-100个核苷酸、12-30个核苷酸或12-25个核苷酸。

所属领域的技术人员可了解且清楚，长度和核苷酸组成会影响杂交的温度。组成和长度也会影响与所选标靶核苷酸序列杂交的特异性和与非标靶核苷酸序列进行交叉反应的潜力。对来自类似生物体的同源标靶序列、同源基因来说，当检验是设计用于检测小的变化区段(例如癌症中p53基因中的SNP)或辨别不同生物体的小或大单元核糖体RNA时，尤为如此。在这些情况下，探针应为短的，通常为12至18个核苷酸长，以使探针与其标靶序列最大程度地杂交，且最低程度地与非标靶序列进行任何交叉杂交。

在另一个实施例中，能够与标靶序列杂交的单个探针是以例如放射性P³²或P³³等可检测标记或例如四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)或CY3等荧光标记作标记。在一个实施例中，探针为具有可检测标记的单个探针。在另一个实施例中，采用多个各连接有个别可检测且个别可区别的标记的个别探针，以使得能够检测可能存在于样品中的多个标靶序列。举例来说，可采用两个探针来检测基因中SNP的存在，其中一个探针经CY3标记以检测标靶基因的野生型等位基因，且另一个探针靶向变异等位基因。另外，可制备大量具有个别可检测且可区别的标记的探针，仅受用以辨别使用这些探针的多重检验中所使用的标记的方法的能力限制。重要的是，当采用片段分析方法检测探针与其各别标靶的杂交时，所形成的双链体的尺寸可用作另一种辨别探针:标靶双链体的方式。

如所述，用以检测标靶核酸的探针可由捕捉探针和伴侣信号探针组构成。在一个实施例中，制备单对捕捉和信号探针，以从样品中的其它核苷酸序列中检测出标靶核苷酸序列。在另一个实施例中，可采用多个捕捉和信号探针对，以检测样品内的多个标靶核苷酸序列，其中每个信号探针可个别检测且彼此相区别，具有如上文针对单个信号探针所述的考虑事项。

类似地，一个关于探针组的实施例可包含捕捉探针、桥式探针和信号探针组，其设计用于检测样品中的标靶核苷酸序列。如上文针对双探针所述，另一个关于三探针使用的实施例为采用多个设计用于检测样品中的多个标靶核苷酸序列的三探针组，以检测样品内的多个标靶核苷酸序列，其中每个信号探针可个别检测且彼此相区别，具有如上文针对单个信号探针所述的考虑事项。

使用的探针优选比进行分析的样品中标靶核苷酸序列的预期浓度过量得多，探针与标靶的比率通常为10∶1至1000∶1。如所属领域的技术人员所了解，当可归因于背景或非特异性结合的信号减至最少时，允许较高的探针与标靶的比率。另外，也可采用较低的探针与标靶的比率；然而，杂交所需的时间实质上可增加。

当检验中使用多个探针时，这些探针的浓度优选彼此类似或几乎相同，即1∶1。在另一个实施例中，检验中使用多个以上双探针或三探针组，其中每个信号探针可具有共同的捕捉探针以及个别可检测且可区别的信号探针，从而辨别样品中不同的标靶核苷酸序列。在另一个实施例中，捕捉探针和桥式探针可与其伴侣信号探针具有相同序列，从而辨别样品中不同的标靶核苷酸序列。

探针可以溶液相或以冻干形式提供。另外，当探针冻干时，核酸酶可与其共同冻干，以便其一经复原，即以适当浓度用于检验。

探针尾或间隔基为所属领域中已知的且先前已有所描述。在另一个实施例中，探针尾或间隔基由拉链码或条形码序列构成，使得探针:标靶复合物由各别拉链或条形码尾捕捉至固定于表面(例如阵列)或荧光编码珠粒(例如可得自路明克斯(Luminex)(奥斯汀(Austin)，德克萨斯州(TX))或波丽安公司(PolyAn Gmbh)(柏林(Berlin)，德国(DE)的珠粒)的对应拉链或条形码互补序列。

本发明检验可采用多种核酸探针。这些探针可具有连接于探针的5′或3′末端的间隔基，且这些间隔基可用以减少杂交反应期间的位阻。这样的间隔基可为聚乙二醇间隔基、烷基链、或例如聚T链等7-10个同源核苷酸的系列。聚乙二醇和烷基链间隔基也可与生物素一起使用。探针经选自由以下组成的群组的可检测部分标记：化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、荧光标记、酶标记和发色标记。这些探针可包括特异性寡核苷酸，包括SEQ ID NO.：1-4。

化学发光标记可选自由碱性磷酸酶(ALP)、三磷酸腺苷(ATP)、腺苷酸激酶(AK)、鲁米诺(luminol)和荧光素酶/荧光素组合组成的群组。化学发光和生物发光标记可为最终可通过化学发光和生物发光反应加以检测的前体。加入试剂底物后，可检测标记将显示特征显示，使得能够检测出特异性微生物。可利用例如Celsis Advance^TM光度计等光度计来检测此特征显示。

当采用化学发光或生物发光标记的探针时，试剂底物选自由荧光素酶/荧光素/二磷酸腺苷(ADP)组合、荧光素酶/荧光素组合、和ATP组成的群组。另外，可使用碱性磷酸酶和磷酸化潜在化学发光底物(包括1，2-二氧环丁烷调配物，例如鲁米津公司(Lumigen，Inc.)提供的Lumi-Phos 530、Lumi-Phos 480和Lumi-Phos Plus或罗氏(Roche)(印第安纳波利斯(Indianapolis)，印第安纳州)(IN))提供的类似底物)和辣根过氧化酶或鲁米诺。金刚烷基-1，2-二氧环丁烷磷酸酯或其等效物是碱性磷酸酶的直接底物，且以例如Attoglow^TM AP底物450LB(密歇根诊断产品公司(Michigan Diagnostics)，美国密歇根州(MI USA)皇家橡树园(Royal Oaks))等商品名出售。使用碱性磷酸酶作为信号产生酶的一个优势在于，肉眼可看见的例如BCIP/NBT(磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯/硝基蓝四氮唑)或磷酸对硝基苯酯等底物的变化，对化学发光底物具有适度的灵敏度，使得能够选择各种需要的检验灵敏度。

在另一个实施例中，检验的缓冲液和个别组份可含有染料或其它着色剂，这些染料或着色剂可用作试剂加入和组合的目测指示以确保其适当组装、混合和pH值。适合着色剂的实例包括七种美国联邦药物管理局(United States Federal Drug Administration)批准的FD&C着色剂(即FD&C蓝色1号-亮蓝FCF，E133(渐变蓝色)；FD&C蓝色2号-靛蓝，E132(渐变深蓝色)；FD&C绿色3号-坚牢绿FCF，E143(渐变蓝绿色)；FD&C红色40号-阿洛拉红AC(Allura Red AC)，E129(渐变红色)；FD&C红色3号-赤藓红，E127(渐变粉红色)；FD&C黄色5号-酒石黄，E102(渐变黄色)；和FD&C黄色6号-日落黄FCF，E110(渐变橙色))。用作目测指示物的适合浓度常常视所需着色力和目测适合性而定，通常为以染料重量计0.001％-0.1％。染料的各种组合产生跨越大部分可见光谱的多种颜色，且提供在加入到个别试剂和因试剂组合而引起的后续组合中时可轻易地彼此区别开来的颜色，从而在组合试剂后提供不同的可区别的颜色。这些颜色变化通过目测可指示组份的适当加入与进行一系列试剂组合的这些组合顺序的适当性。

可制备用于检测和测定相关核酸序列和/或微生物的试剂盒，且所述试剂盒包含至少一种以可检测标记作标记的核苷酸探针、氟表面活性剂和降解相关序列的核酸酶。替代性实施例可包括试剂底物、溶解/提取缓冲液、杂交缓冲液和/或洗涤缓冲液。试剂盒可另外含有适用于微生物溶解的氧化锆/二氧化硅珠粒。如果顺磁性珠粒欲用于所述的检验，那么这些珠粒可包括在试剂盒中。这些顺磁性珠粒可经可结合于RNA的探针标记，其中使用另一种也结合于RNA的探针进行检测。也可采用脂质体密封的发光试剂，使得能够甚至更大程度地扩大可检测信号。

试剂盒可另外包含用于净化所提取的相关核苷酸序列的柱，以及检验管。检验管可涂有适用于检测检验的化合物，例如抗生蛋白链菌素。

本发明的检测检验可用以检测许多不同类型的样品中的微生物，例如细菌、真菌或其它微生物。另外，本发明的检测检验可用以检测样品中的相关核酸序列。这些样品可包括食物、环境样品、临床样品、水、饮料、液体皂、遮光剂、润肤剂、牙膏、织物柔软剂、清洁剂、调色剂和个人护理产品(PCP)。检验也可区别革兰氏阴性与革兰氏阳性细菌。应采用对革兰氏阴性细菌具有特异性的探针，仅此类型细菌将展示阳性结果；因此，大部分革兰氏阳性细菌不会检测到。

检测检验的产物也可用于例如PCR或RT-PCR等其它检验。可使用这些检验来扩增核酸序列。这又可使检测更容易且更可重复。使用PCR或RT-PCR将使得能够定量产物以及增加检验的灵敏度。

本发明另外涉及相关标靶包括蛋白质、肽、小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质的检测检验。适当探针可以可检测标记作标记。举例来说，抗原可以放射性标记、化学发光标记、生物发光标记、荧光标记或电化学标记作标记，且允许对应抗体的检测。

另外，氟表面活性剂可用于许多应用中以减少非特异性或不必要的结合。如果至少一种如上所述的氟表面活性剂加入缓冲液或其它流体中且进行此应用，那么将减少非特异性结合。另外，氟表面活性剂将防止许多物质粘住或结合于表面或彼此粘住或结合。举例来说，本发明可涉及一种减少细胞、亚细胞器、生物分子或化学分子的非特异性结合的方法，其包含：将至少一种氟表面活性剂加入缓冲液中；和使细胞、亚细胞器、生物分子或化学分子与缓冲液接触；其中至少一种氟表面活性剂的存在会减少细胞、亚细胞器、生物分子或化学分子与表面或彼此的非特异性结合。此包括(但不限于)细胞、蛋白质、肽、核酸、小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质。此可为非常有益的作用且产生更容易且更可复现的结果。

当确定何种试剂或物质可减少或实质上减少非特异性结合时，某些需要性质包括(但不限于)：

·抑制检验组份与表面的非特异性结合(NSB)，包括非特异性疏水性结合、离子结合和共价结合；

·抑制检验组份、样品组份和反应容器或容器的表面或例如膜等其它表面之间的非特异性相互作用；

·不与检验组份，特别是抗体和蛋白质A或G或抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、核酸、糖基、脂肪酸、脂质、碳水化合物进行交叉反应；

·可伴随与固定和/或干燥有关的相变而发生的蛋白质变性作用减至最少。

·当用于稀释一般冷藏或冷冻存储的试剂时，蛋白质或其它分子稳定；

·很少或不污染酶活性(即过氧化酶、碱性磷酸酶)；

·抑制检验中可能存在的酶活性；和

·不破环任何固定的检验组份、或相关特定蛋白质或生物分子的检测。

·不含传染剂；

·可复现的性能。

本文所述的氟表面活性剂具有如通过描述所例示的性质且在本发明的实施例和实例中显示使用。

以下非限制性实例中更详细地描述本发明。所属领域的技术人员在考虑如上文所述和下文所例示的一般方法和试剂盒后，可轻易地确定本发明范围内的选择变化。

实例

实例１

微生物原液培养物的繁殖和制备

使用从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(

马纳萨斯(Manassas)，美国弗吉尼亚州(VAUSA))获得的已知生物体，测试用以获得适于后续检验的核酸的溶解方案。

表1.微生物

编号和革兰氏染液情况

按照伴随生物体原液来自供应商的建议，除黑曲霉菌

16404外的所有生物体都从来源培养物中繁殖。繁殖后，通过将1.875ml 80％甘油加入5ml含汇合微生物生长液的适当培养基中，制备每个生物体的30％甘油原液。接着将每个生物体的甘油原液分配成无菌聚丙烯填密的螺丝帽2ml管中的500μl等分试样，以提供一组菌株特异性存档甘油原液。菌株特异性存档甘油原液存储于-80℃下，直到需要使用为止。为制备供每种生物体进行核酸分离用的工作甘油原液，对于除黑曲霉菌

16404外的每种生物体，将一管菌株特异性存档甘油原液加入无菌150ml无菌通用容器(例如部件号1280200，塞尔斯公司(Celsis)，芝加哥(Chicago)，伊利诺斯州(IL)或葛莱娜第一生化股份有限公司(Greiner Bio-One)，门罗(Monroe)，北卡罗来纳州(NCA))中的100ml Difco^TM莱森肉汤(Letheen Broth)[含有卵磷脂和聚山梨醇酯80(80)(贝克顿迪金森公司(Becton，Dickinson and Company)，史百克(Sparks)，美国马里兰州(MD USA))]中。以上容器用生物体接种，且帽紧闭，在31℃下在例如C25Incubator

(美国新布伦兹威克科学公司(New Brunswick Scientific)，爱迪生(Edison)，美国新泽西州(NJ USA))等恒温箱振荡器上以200rpm培育24小时。使用37.5ml 80％甘油和100ml汇合微生物生长液制备工作甘油原液，且接着分配成无菌聚丙烯填密的螺丝帽2ml管中的1400μl等分试样。工作甘油原液存储于-20℃下，直到需要使用为止。

黑曲霉菌

16404因其生长特征如下繁殖，以提供菌株特异性存档和工作甘油原液。通过将6ml无菌去离子(DI)水加入

孢子原液中，且接着转移至15ml锥形组织培养管(飞世尔科学公司(Fisher Scientific)，匹兹堡(Pittsburgh)，宾夕法尼亚州(PA))中，紧闭帽，且不振荡在室温下培育过夜，来制备黑曲霉菌

16404的30％甘油原液。培育过夜后，加入2.25ml 80％甘油，提供所培育孢子的30％甘油溶液。所培育孢子的30％甘油溶液分配成经紫外(UV)光处理的0.5ml平帽管中的50μl等分试样，且提供工作甘油原液管的一部分等分试样存储于-20℃下，直到使用为止，而剩余的等分试样管用作菌株特异性存档甘油原液且存储于-80℃下，直到使用为止。

供核酸分离用的物种特异性培养物

将表1中每种生物体的一管工作甘油原液解冻且转移至个别无菌150ml容器中，其中每个容器含有100ml莱森肉汤。使生物体在31℃下在例如C25 Incubator

等恒温箱振荡器上以200rpm生长24小时。对于每种生物体，按照制造商所推荐的方案，通过使用如Celsis Rapiscreen^TM试剂(尔斯公司，芝加哥，伊利诺斯州)等ATP发光检验，在例如Celsis Advance^TM光度计等光度计上进行分析，来测定生长量。表1中列出的每种生物体培养物都产生阳性Rapiscreen^TM结果，表明充分生长供核酸分离用。

溶解过夜培养物

对于每种生物体，将500μl过夜生长液加入个别溶解管中。每个溶解管(1.5ml锥形螺丝帽)都含有500μl溶解/提取缓冲液和1g 0.5mm氧化锆/二氧化硅珠粒。溶解/提取缓冲液由200mM 3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸(MOPS)、20mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2％SDS、10mM二硫苏糖醇(DTT)、1％基于硅酮聚合物的消泡剂(例如消泡剂A(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)))、1％水可稀释的30％活性硅酮乳液(设计用于控制水性系统中的泡沫)(例如消泡剂Y-30(西格玛奥德里奇))和100μM以Alumion^TM(西格玛奥德里奇)出售的金精三羧酸(或其盐，例如铵盐)构成。

将含有500μl过夜生长液的溶解管放在例如Deluxe PulseVortex^TM混合器(飞世尔科学公司)等脉冲涡旋混合器中，且以3000x rpm的脉冲设定涡旋30秒，且静置10秒，按规划在10分钟的时间内重复此过程。

过滤和柱脱盐

涡旋后，将每一个个别溶解的样品倾倒至其自身的针筒过滤装置中，此过滤装置由例如

针筒过滤器(颇尔公司(Pall Corporation)，美国密歇根州安娜堡(AnnArbor))等0.8/0.2μm针筒过滤器连接于3ml具有例如Luer-Lok^TM尖端(贝克顿迪金森公司，美国马里兰州史百克)等锁闭尖端的针筒且过滤至CelsisAdvance^TM试管(12×75mm聚苯乙烯)中组成。试管中每个样品收集总体积为约700-800μl的滤液。将500μl每个样品的滤液负载至例如illustra Nap^TM-5柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，美国新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway))等交联葡聚糖凝胶珠粒DNA级柱上，此柱经1mM柠檬酸钠(pH 6.4)预平衡。在滤液负载至柱上后，500μl从柱洗脱的缓冲液作为废液排放。使用1ml 1mM柠檬酸钠(pH 6.4)从柱洗脱滤液。将1ml体积的含有核酸的洗脱物收集在Celsis Advance^TM试管中。

凝胶电泳

使用凝胶电泳证实以上所收集的1ml各样品的柱洗脱物中rRNA的存在。对于每个样品，通过使用例如30(密理博公司(Millipore Corporation)，美国马萨诸塞州(MA)贝德福德(Bedford))等离心过滤装置在14,000x g下离心25分钟，且在1,000x g下回旋1分钟，来浓缩500μl洗脱物，以收集浓样品洗脱物。使用2.5μl浓洗脱物等分试样和2.5μl含有甲醛、甲酰胺和示踪染料于MOPS缓冲液(龙沙公司(Lonza))中的甲醛样品缓冲液，制备供在例如

RNA盒(龙沙公司，美国缅因州(ME)罗克兰(Rockland))等1.2％琼脂糖凝胶上执行电泳用的样品。1微升

RNA标记物用作尺寸标记物，其含有0.5至9kb大小的RNA片段(龙沙公司)和4μl甲醛样品缓冲液。使这些制备的样品在65℃下变性5分钟，且接着负载至

RNA盒上的个别孔中，且在225伏特下电泳8分钟。按照凝胶制造商所建议的方案，将

RNA盒染色约20分钟。将

RNA盒放在高性能紫外线透照仪上，且用例如Kodak Gel Logic

照相机(柯达公司(Kodak)，美国纽约州(NY)罗切斯特(Rochester))等设计用于拍摄凝胶照片的成像系统捕捉影像。剩余500μl样品存储于-20℃下，直到用于检测检验为止。

结果

在凝胶照片中，通过适当尺寸和相对强度的rRNA条带的观测和外观以及基因组DNA的存在，指示阳性结果。这些结果表明，用于培养、溶解和核酸分离的方法产生足量rRNA和基因组DNA用于分析。

检测在个人护理产品存在下的微生物污染

为评估上述方法的效用，用5种常见的微生物生物体人为地污染一组代表性个人护理产品(PCP)并进行测试。使用以下生物体进行人为污染：大肠杆菌8739、枯草杆菌

6633、洋葱伯克霍尔德菌

25416、铜绿假单胞菌

9027和表皮葡萄球菌

12228。代表未污染和模拟污染的个人护理产品的培养物如下制备。针对5种生物体中的每一者，使用一管新鲜解冻的如上所述的工作甘油原液组装各培养物。如下，在150ml葛莱娜容器中通过混合以下各物来制备5种生物体中每一者的三种培养物：单独100ml莱森肉汤、莱森肉汤加1％洗发精(

2合1滋润洗发精和护发素(联合利华(Unilever)，美国康奈提格州(CT)特朗布尔(Trumbull))(w/v)(1g洗发精和99ml莱森肉汤))、和例如Difco^TM TAT肉汤(贝克顿迪金森公司)等胰蛋白胨-偶氮植物凝血素-

肉汤加1％遮光剂(Banana

SPF 8遮光剂(太阳医药公司(Sun Pharmaceuticals Corporation)，美国佛罗里达州(FL)德尔雷海滩(Delray Beach))(w/v)(1g遮光剂和1g

80+98ml TAT肉汤))。在31℃下在C25恒温箱振荡器上以200rpm培育培养物24小时。为测量生长，根据制造商的方案，使用RapiScreen^TM检验，在Celsis Advance^TM仪器上一式两份测试50μl的24小时生长液。

使用先前描述的方法，从培养物中分离出核酸。对于各培养物，将收集在Celsis Advance^TM试管中的1ml柱洗脱物分成2×500μl等分试样。浓缩1等分试样的洗脱物，以通过电泳确认rRNA的存在；所有培养物都指示存在核酸，特别是rRNA。其它等分试样用于下文所述的检测检验中。

检测检验

通过以下方法检验从上述模拟微生物污染的培养物中分离出的核酸。简单说来，此方法由以下组成：使一组设计用于检测革兰氏阴性生物体的探针与从培养物中分离出的核酸杂交，接着将通过探针与标靶rRNA杂交而形成的复合物捕捉至固相。在捕捉复合物后，通过洗涤去除未结合的反应组份。通过适合的检测方法检测结合于固相的复合物。

杂交和捕捉

对于各杂交反应，将89.5μl下文所述的杂交混合物连同60.5μl从模拟微生物污染培养物中分离的各核酸一起放在薄壁200μl聚合酶链式反应(PCR)12管带(飞世尔科学公司)中。对于各杂交反应，杂交混合物由以下组份构成：75μl杂交缓冲液[200mMMOPS、3M氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.2％FSA(阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)(v/v)，pH 6.9]；5μl探针1(SEQ IDNO.：1；表2)；5μl探针2(SEQ IDNO.：2；表2)；2μl探针3(SEQ IDNO.：3；表2)；和2.5μl RNase A-RPA级(用无菌DI水新鲜稀释至10ng/μl)。探针已用AP稀释缓冲液(100mM Tris、100mM氯化钠、5mM氯化镁、0.01％叠氮化钠，pH 9.0)稀释至1.25皮摩尔/微升。剩余439.5μl分离出的核酸放在-80℃下。也检验两个对照组：阴性对照组，其由60.5μL水组成；和阳性对照组，其由1μl探针4(SEQ ID NO.：4；表2)连同59.5μl水组成。将含有杂交混合物和核酸或对照组的管放在例如PTC-200热循环仪(伯乐公司(Bio-Rad)，美国加利福尼亚州(CA)赫拉克勒斯(Hercules))等热循环仪上，在42℃下放置30分钟。接着从热循环仪上移出这些管，且将每个管的内含物与例如

阻断缓冲液(皮尔斯公司(Pierce))等阻断缓冲液一起转移至经抗生蛋白链菌素涂布的具有8孔带的聚苯乙烯盘(例如Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的高结合力透明8孔带(皮尔斯公司，美国伊利诺斯州罗克福德(Rockford)))的个别孔中，且在室温下培育30分钟，以进行杂交且捕捉至盘上。接着用250μl洗涤缓冲液[100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％

FSA(v/v)，pH 7.2]洗涤每个孔，且声波处理1分钟。接着通过轻弹的动作，排出孔内含物，以去除基本上所有液体；用250μl洗涤缓冲液重复洗涤过程5次且每次洗涤进行1分钟声波处理。通过将管放在例如840型珠宝清洁器(标准产品公司(Standard Products Corp.)；美国马萨诸塞州惠特曼(Whitman))等珠宝清洁器中所放置的临时准备的浮动轨中，使用水进行漂浮，来进行声波处理。

表2.用于检测检验的探针

底物培育

如下用底物处理经洗涤的孔：在最终洗涤后，将200μl 3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧环丁烷-3，2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13，7]癸}-4-基)苯基磷酸二钠(底物)(罗氏诊断产品公司(Roche Diagnostics)，美国印第安纳州印第安纳波利斯)加入各孔中。在室温下底物在各孔中培育20分钟，同时用铝箔避光。底物培育完成时，将200μl经培育的底物转移至Celsis Advance^TM试管中。试管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：不使用注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对相对光单位(RLU)的校正因子为0.6。RLU对应于任意相对光单位且是仪器所检测的发射光的量度单位。

检测检验结果

表3-检测检验的结果

设定阴性结果的截止值为平均阴性对照RLU(RLU 902截止值)的两倍。所有用革兰氏阴性生物体接种的模拟微生物污染培养物的平均RLU都超过阴性对照组平均RLU的两倍，得出阳性结果。所有用革兰氏阳性生物体接种的模拟微生物污染培养物的平均RLU都不及阴性对照组平均RLU的两倍，得出阴性结果。此检测检验可辨别在单独肉汤中以及肉汤加代表性个人护理产品中生长的革兰氏阴性生物体与革兰氏阳性生物体。

意外地，RNase的存在足以使探针与所检查的未变性核糖体RNA之间发生杂交，而无需使所检查的核糖体RNA变性。也就是说，既不需要使用离液序列高的试剂，也不需要加热至足以使核糖体RNA变性，来使探针与核糖体RNA杂交。在不加入RNaseA的情况下，在基本上与上文所述相同的条件下，关于所检查的核糖体RNA所获得的信号基本上与阴性对照组一致。另外且出人意料地，在缺乏桥式探针(上表2中的序列2(SEQ ID NO.：2))的情况下检查的核糖体RNA产生仅小约20％的革兰氏阴性生物体信号，而针对革兰氏阳性生物体所获得的值不受影响，接近阴性对照组的值。这些针对核糖体RNA的相同组的捕捉和信号探针在缺乏桥式探针的情况下适当地区别革兰氏阴性与革兰氏阳性生物体。另外，可观测到相较于在缺乏声波处理的情况下所处理的样品，轻度的声波处理会改良针对对照组与样品核糖体RNA所获得的信号的重现性。

基本上使用实例1的方法，用以下5种常见的微生物生物体人为地污染更大的组的代表性个人护理产品(PCP)：大肠杆菌

8739、枯草杆菌

6633、洋葱伯克霍尔德菌

25416、铜绿假单胞菌

9027和金黄色葡萄球菌

6538。在150ml葛莱娜容器中，通过混合单独100ml莱森肉汤、100ml莱森肉汤加1g以下产品，来制备代表未污染和模拟污染个人护理产品的培养物：

·沐浴露(

美丽沐浴露(联合利华，美国康奈提格州特朗布尔))

·遮光剂(Banana

遮光剂SPF 8(太阳医药公司，美国佛罗里达州德尔雷海滩))

·咳嗽药(维克司44常规护理(Vicks 44 Custom Care)(宝洁公司(Proctor and Gamble)，美国俄亥俄州(OH)辛辛那提(Cincinnati)))

·睫毛膏(欧莱雅大体积睫毛膏(L′Oreal Voluminous)(欧莱雅美国公司(L′OrealUSAInc.)，美国纽约州纽约(New York))

·牙膏(高露洁口腔保护牙膏(Colgate Cavity Protection)(高露洁棕榄公司(Colgate-Palmolive Company)，美国纽约州纽约))

·织物柔软剂(萨维特野花织物柔软剂(Suavitel Field Flowers)(高露洁棕榄公司，美国纽约州纽约))

·万用表面清洁剂(清洁先生夏日柑橘清洁剂(Mr Clean Summer Citrus)(宝洁公司，美国俄亥俄州辛辛那提))

·镁乳(菲利普(Philips)(拜耳保健公司(Bayer Healthcare)，美国新泽西莫里森(Morristown)))

·燕麦粉浴液护理(Oatmeal Bath Treatment)(阿维诺(Aveeno)(强生公司(Johnson & Johnson)，美国新泽西斯奇曼(Skillman)))。

使用定量微生物制剂(

(瑞莫公司(Remel Inc.)，美国堪萨斯州(KN)莱内克萨(Lenexa)))，用5种上列物种中的每一者接种肉汤对照组和附加产品的肉汤，使得各接种样品接受不足100个活的微生物细胞。在30-32℃下在恒温箱振荡器中以200rpm培育样品24小时。

按照制造商所推荐的方案，对于每种生物体，通过使用如Celsis Rapiscreen^TM试剂盒(塞尔斯公司，美国伊利诺斯州芝加哥)等ATP发光检验和如Celsis AKuScreen^TM试剂盒(塞尔斯公司，美国伊利诺斯州芝加哥)等用于标记酶腺苷酸激酶(AK)的发光检验，在例如Celsis Advance^TM光度计等光度计上进行分析，来测定生长量。每种接种样品都产生阳性Rapiscreen^TM和AKuScreen^TM结果，表明充分生长供核酸分离用。除一个例外，每一个未接种样品都产生阴性结果，表明没有任何无意识的污染。除外为燕麦粉浴液，发现其含有活的孢子。

通过拧开下端拉手，翻转顶部螺丝帽四分之一个圈，且接着将各柱放在由Celsis Advance^TM试管(55mm×12mm聚苯乙烯管)组成的收集管中，且在1,000×g下离心每一柱-管组件1分钟，来制备脱盐离心柱(生物风险公司)用于去除存储缓冲液。收集管作为废物弃去，且接着将每一个经离心的离心柱转移至新的Celsis Advance^TM试管中，形成离心柱-管组件。接着使用100μL通过脉冲涡旋获得的各细胞溶解产物，通过转移至个别和相应制备的离心柱-管组件中，使溶解产物脱盐，其中每一种溶解产物一式两份进行处理。接着在1000×g下使施加有溶解产物的每一组件离心2分钟，且柱滤液收集在组件的管部分中。每一种施加的溶解产物都在其各别收集管中产生约100μL滤液。

对于各杂交反应，将75μl下文所述的杂交混合物连同75μl从上述接种和未接种样品中分离出的每一种核酸一起放在薄壁3.5ml聚丙烯管(斯坡特(Simport))中。对于各杂交反应，杂交混合物由以下组份构成：75μl杂交缓冲液[200mM MOPS、3M氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.2％FSA(阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)(v/v)，pH 6.9]；5μl探针1(SEQ ID NO.：1；表2)；5μl探针2(SEQ ID NO.：2；表2)；和2μl探针3(SEQ ID NO.：3；表2)；和2.5μL RNase A-RPA级(用无菌DI水新鲜稀释至10ng/μl)。探针已用AP稀释缓冲液(100mM Tris、100mM氯化钠、5mM氯化镁、0.01％叠氮化钠，pH 9.0)稀释至1.25皮摩尔/微升。

也检验两个对照组：阴性对照组，其由75μL杂交混合物和75μL 1mM柠檬酸钠(pH 6.4)组成；和阳性对照组，其由75μL杂交混合物、75μL 1mM柠檬酸钠(pH 6.4)和1μl探针4(SEQ ID NO.：4；表2)组成。含有杂交混合物和核酸或对照组的管放在电热板(曲莫公司(Troemner)，美国新泽西塞罗费尔(Thorofare))上，在42℃下放置30分钟。

接着将每一管的内含物转移至个别经抗生蛋白链菌素涂布的聚苯乙烯管(麦克特公司(Microcoat)，德国(Germany)柏瑞德(Bernried))中，且再在42℃下培育30分钟以进行捕捉。接着用1ml洗涤缓冲液[100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％

FSA(v/v)，pH 7.2]洗涤每一个孔，使所有管涡旋。通过轻弹动作，排出管的内含物，以去除基本上所有液体，且再重复洗涤过程3次。

接着，如下用底物处理经洗涤的管：在最终洗涤后，将200μl化学发光底物(SAP1113(密歇根诊断产品公司，美国密歇根州皇家橡树园))加入所有管中，立即将所述管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：不使用注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对相对光单位(RLU)的校正因子(RLU)为0.6。RLU对应于任意相对光单位且是仪器所检测的发射光的量度单位。

如先前实例所发现，用革兰氏阴性生物体接种的模拟微生物污染培养物的平均RLU一般超过阴性对照组平均RLU的两倍，得出阳性结果。用革兰氏阳性生物体接种的模拟微生物污染培养物的平均RLU一般不及阴性对照组平均RLU的两倍，得出阴性结果。

实例2

实例1中结果的PCR验证

为确认实例1的检测检验中获得的结果(表3)，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增作为验证方法。使用两种革兰氏阴性特异性引物，对从实例1的模拟微生物污染培养物中分离出的各核酸进行PCR扩增。所用正向引物和反向引物的序列分别由来自IDT的5′-CCG CAG AAG AAG CAC CGG C-3′(SEQ ID NO.：5)和5′-TGT RTG AAG AAG GYCT-3′(SEQ ID NO.：6)组成。R定义为嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)。Y定义为嘧啶(胸腺嘧啶或胞嘧啶)。

将各冷冻的从实例1的模拟微生物污染培养物中分离出的核酸从-80℃下移出，解冻，且接着通过用无菌去离子水制备1∶100稀释液，而用作模板。对15种冷冻核酸中的每一者进行PCR扩增，一式两份。通过以下方式，组装PCR反应组份，进行20μl反应：将2μl(10％)10X PCR缓冲液(ABI，美国加利福尼亚州福斯特城(Foster City))(2mM氯化镁、2％二甲亚砜(DMSO)；5mM二硫苏糖醇(DTT)；200μM dNTP)、0.125μl TaqDNA聚合酶(5U/μl AmpliTaq(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，美国加利福尼亚州福斯特城))、0.2μl(10皮摩尔)于0.1X Tris-EDTA(TE)、2％乙腈中的100皮摩尔/微升的反向引物(SEQ ID NO.：6)、0.2μl(10皮摩尔)于0.1X TE、2％乙腈中的100皮摩尔/微升的正向引物(SEQ ID NO.：5)和以无菌DI水补足至20μl的PCR组份组合在2.0ml管中且轻轻混合。使用20μl PCR混合物，将PCR混合物分配于96孔PCR盘(

伯乐公司，赫拉克勒斯，美国加利福尼亚州)的30个孔中的每一孔中。使用1μl各1∶100模板稀释液，将模板核酸加入适当孔中。使用例如

膜(伯乐公司)等膜密封剂来密封PCR盘。如下在PTC-200热循环仪(伯乐公司)上进行PCR：在95℃下变性12分钟，接着进行95℃下30秒、60℃下20秒、72℃下40秒的循环30次，接着在72℃下最终延长6分钟，且接着保持在4℃下。在程序完成后，通过在例如3∶1附加琼脂糖凝胶(康伯司公司(Cambrex)，罗克兰(Rockland)，美国缅因州)等高分辨率标准熔点琼脂糖的20孔4％凝胶上在200伏特下进行凝胶电泳25分钟，来分析2μl每一反应物。将琼脂糖凝胶放在高性能紫外线透照仪中，且用KodakGel Logic 100照相机捕捉影像。使用例如BioMarker M1A(生物风险公司)等DNA尺寸标记物评估PCR产物的尺寸。

结果

革兰氏阴性生物体大肠杆菌和铜绿假单胞菌对各PCR反应呈阳性。对于莱森肉汤/1％洗发精和TAT肉汤/1％遮光剂，革兰氏阴性生物体洋葱伯克霍尔德菌的PCR扩增呈极弱阳性，但在单独莱森肉汤中未观测到条带。对于各PCR反应，革兰氏阳性生物体枯草杆菌和表皮葡萄球菌的PCR扩增呈阴性。为验证每一革兰氏阳性生物体都确为阴性，进行另外7次PCR循环。含有剩余18μl各反应物的PCR盘放在PTC-200热循环仪上，且用

膜密封所述盘。进行另外7次PCR扩增循环，产生总计37次PCR循环。程序完成后，通过如上所述的凝胶电泳分析2μl各PCR反应物。

37次循环后，革兰氏阴性生物体大肠杆菌、铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌对PCR呈阳性，如4％3∶1附加琼脂糖凝胶上的亮带的存在所显示。革兰氏阳性生物体枯草杆菌和表皮葡萄球菌中的每一者都未在4％

3∶1附加琼脂糖凝胶上显示条带。

这些结果显示实例1的方法可用以分离核酸且提供适用于PCR的基因组DNA。结果也显示革兰氏阴性特异性引物区别革兰氏阴性与革兰氏阳性生物体。另外，从如上所述的溶解方案中分离的DNA已显示适用于PCR。

实例3

参考实例1，申请者意外地观测到，用于杂交和洗涤缓冲液中的

FSA表面活性剂惊人地显示，非特异性背景信号相较于申请者通过实验评估的传统非特异性阻断剂(包括牛血清白蛋白和例如

20、阻断缓冲液、丹哈德溶液(Denhardt′ssolution)和各种聚乙二醇等清洁剂)减小许多。所有这些传统的阻断剂都以与公认文献方法一致的浓度使用，且都产生相较于用如实例1中所用的FSA获得的背景，高得难以接受的背景。申请者观测到，当在杂交方案中使用传统的清洁剂或表面活性剂时，由于涡旋和/或振荡而产生显著发泡和干扰。此发泡可干扰用于杂交和/或洗涤的缓冲溶液的完全去除。并且，申请者惊人地发现，

FSA表面活性剂在振荡后产生一些泡沫，但快速消散，以及甚至如实例1中所述，在

20存在下强烈涡旋时产生即使有也很少的泡沫。因此，根据实例1使用

FSA表面活性剂，因为通过基本上消除由发泡产生的干扰，其使用可减少非特异性背景且有助于改良缓冲液的去除。

实例4

RNase A

进行一项实验，以确定杂交期间使用的RNase A的最佳量。用无菌DI水制备以下RNase A-RPA级稀释液：1μg/μl、200ng/μl、40ng/μl、8ng/μl和1.6ng/μl。每个反应都用以下组份制成杂交混合物：75μl杂交缓冲液[200mM MOPS、3M氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠和0.2％

FSA(v/v)，pH 6.9]；10μl 100ng/μl大肠杆菌rRNA；5μl探针1(SEQ ID NO.：1)；2μl AP信号探针的1∶100稀释液[(5′-CGGTGC TTC TTC TGC GTT TTT TTT TT-3′(SEQ ID NO.：3)，与250皮摩尔/微升碱性磷酸酶结合于AP保存缓冲液(3M氯化钠、30mM Tris、1mM氯化镁和0.1mM氯化锌)中且用AP稀释缓冲液(100mM Tris、100mM氯化钠、5mM氯化镁、0.01％叠氮化钠(pH 9.0)和0.15μl

FSA)稀释]；5μL探针2(SEQID NO.：2)；和51.9μl无菌DI水，使杂交混合物体积高达149μl。每种RNase A稀释液进行两个反应，总共10个反应。杂交混合物与

阻断缓冲液一起加入Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的高结合力透明8孔带的10个孔中(每孔149μl杂交混合物)。1微升各RNase A稀释液加入各复本中。将这些带放在31℃水浴中30分钟。接着用250μl洗涤缓冲液[100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％

FSA(v/v)，pH 7.2]洗涤各反应物。接着通过轻弹的动作，排出洗涤缓冲液，以去除基本上所有液体；重复洗涤过程5次，每次洗涤使用250μl洗涤缓冲液。Attoglow^TM AP底物-450LB以1∶10用AP稀释缓冲液稀释，200μl经稀释的底物加入各孔中，且在室温下避光培育20分钟。接着将200μl底物转移至Celsis Advance^TM试管中。试管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：不使用注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对RLU的校正因子为0.6。

结果表明针对以上所示的参数，10-40ng之间的RNase A为最佳。

实例5

1mM柠檬酸钠平衡的illustra^TM Nap-5柱对比未平衡的illustra^TM Nap-5柱

如实例1中所述的溶解产物已用经1mM柠檬酸钠(pH 6.4)预平衡的illustra^TM Nap-柱纯化。为轻易地制造和组装最终试剂盒构造，申请者更喜欢避免柱的预平衡。

比较经预平衡的illustra^TM Nap-5柱和未平衡的illustra^TM Nap-5柱。如先前实例1中所指示，进行溶解和过滤，其中例外在于过滤过程中使用经平衡和未平衡的illustra^TMNap-5柱。使用如实例1中所述的检测检验分析样品。

认为阳性结果为平均阴性对照组RLU的2倍。革兰氏阴性生物体嗜麦芽寡养单胞菌、皮氏罗尔斯顿菌和仙人掌杆菌都呈阳性，而革兰氏阳性生物体仙人掌杆菌呈阴性。虽然所有未平衡样品的RLU都稍低，但其未显著低至足以批准对平衡柱进行额外修改。在水性悬浮液中制备的具有例如0.15％Kathon^TM CG/ICP杀生物剂等各种杀生物剂溶液的illustra^TM Nap-5或等效柱适于核酸净化。

实例6

关于捕捉杂交复合物，比较抗生蛋白链菌素涂布的试管与皮尔斯抗生蛋白链菌素涂布的孔

完成对具有

阻断缓冲液的皮尔斯Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的高结合力透明8孔带与抗生蛋白链菌素涂布的试管的比较，以确定是否可获得在信号和比率方面超过背景的任何增益。

按照实例1的样品制备、溶解和过滤部分中所概述的步骤，制备在莱森肉汤中生长的大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌的新鲜核酸分离物。

对每一杂交反应，组装具有以下组份的杂交混合物：75μl杂交缓冲液[200mMMOPS、1mM氯化镁、3M氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.2％

FSA(v/v)(pH 6.9)、25ng/75μl RNase A-RPA级]；5μl探针1与探针2的混合物(分别为SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2)(探针1和探针2已以每微升各1皮摩尔的浓度组合)；2μl具有AP保存缓冲液[3M氯化钠、30mM Tris、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌、0.05％叠氮化钠]的1.25皮摩尔/微升探针3(SEQ ID NO.：3)(表2)。

为进行杂交反应，将82μl杂交混合物连同68μl分离的核酸样品一起放在聚丙烯试管中。也检验两个对照组：阴性对照组由68μl水组成，且阳性对照组由1μl探针4(SEQID NO.：4)连同67μl水一起组成。将含有杂交混合物和样品或对照组的聚丙烯试管放在例如

模块式干浴恒温箱(飞世尔科学公司)等模块式干浴恒温箱中，在42℃下放置30分钟。接着从干浴恒温箱中移出试管，且将样品转移至具有

阻断缓冲液的皮尔斯Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的高结合力透明8孔带，或转移至抗生蛋白链菌素涂布的试管中。不同的试管和孔尺寸需要各自通过如下所述的不同方式进行处理。

皮尔斯Reacti-Bind^TM

将大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌的复本转移至具有

阻断缓冲液的Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的高结合力透明8孔带的个别孔中，且在室温下培育30分钟，以便进行杂交且捕捉至孔上。接着用250μl洗涤缓冲液[100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％

FSA(v/v)，pH 7.2]洗涤每个孔。接着通过轻弹的动作，排出孔内含物，以去除基本上所有液体。重复洗涤过程5次，每次洗涤使用250μl洗涤缓冲液。在排出最终洗涤液后，将200μlAP底物加入各孔中。在室温下底物在各孔中培育20分钟，同时用铝箔避光。底物培育完成时，将200μl底物转移至放于Celsis Advance^TM光度计仪器中的Celsis Advance^TM试管中。

抗生蛋白链菌素涂布的试管

将大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌的复本转移至个别经抗生蛋白链菌素涂布的试管中，且在室温下培育30分钟，以便进行杂交且捕捉至试管上。接着通过盖上试管且倒置混合，用2.0ml洗涤缓冲液(100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％

FSA(v/v)，pH 7.2)洗涤每个孔。接着通过轻弹的动作，排出试管内含物，以去除基本上所有液体；重复洗涤过程5次，每次洗涤使用2.0ml洗涤缓冲液。在最终洗涤后，将试管倒置在纸巾上且吸干。接着将200μlAP底物加入各试管中。在室温下底物在各试管中培育20分钟，且用铝箔避光。

结果

将皮尔斯孔与Celsis试管两者的试管都放在Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：无注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对RLU的校正因子为0.6。

表4.皮尔斯Reacti-Bind^TM与抗生蛋白链菌素涂布的试管之间的比较结果

样品身份	RLU1	RLU2	平均RLU	比率	读取日期
						单独1X AP底物	113	136	125	NA	11/7/07
大肠杆菌试管	861592	821155	841374	464.3	11/7/07
						洋葱伯克堆尔德菌试管	33391	30184	31788	17.5	11/7/07
枯草杆菌试管	4818	1388	3103	1.7	11/7/07
						表皮葡萄球菌试管	1211	1271	1241	0.7	11/7/07
阴性对照试管	2873	750	1812	1.0	11/7/07
						阳性对照试管	2430116	2407562	2418839	1334.9	11/7/07
大肠杆菌皮尔斯	31786	28155	29971	54.0	11/7/07
						洋葱伯克霍尔德菌皮尔斯	2496	2310	2403	4.3	11/7/07
枯草杆菌皮尔斯	542	534	538	1.0	11/7/07
						表皮葡萄球菌皮尔斯	690	644	667	1.2	11/7/07
阴性对照皮尔斯	582	527	555	1.0	11/7/07
						阳性对照皮尔斯	206430	216630	211530	381.1	11/7/07

使用相同的方法计算比率，相较于皮尔斯Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的孔，抗生蛋白链菌素涂布的试管使得革兰氏阴性生物体的RLU信号增加，且革兰氏阴性生物体RLU信号与阴性对照RLU信号的比率增加。相较于皮尔斯孔中大肠杆菌的比率，Celsis试管中大肠杆菌的比率增加8.6倍。洋葱伯克霍尔德菌的比率增加4.0倍。对于这两种捕捉方法，枯草杆菌与表皮葡萄球菌的革兰氏阳性生物体测试呈阴性，不及平均阴性对照组RLU的2倍。

实例7

在抗生蛋白链菌素涂布的试管中42℃对比室温捕捉

本实例的目的在于，通过比较捕捉温度从环境温度增加到42℃所产生的结果，评估检验信号的差异。

根据实例1制备存储于-80℃下的大肠杆菌和枯草杆菌的核酸分离物，且用于分析。

对每一杂交反应，组装具有以下组份的杂交混合物：75μl杂交缓冲液[200mMMOPS、1mM氯化镁、3M氯化钠、0.05％Tween 20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.2％

FSA(v/v)，pH 6.9]；25ng/75μl RNase A-RPA级)；5μl探针1与探针2的混合物(分别为SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的探针1与探针2(表2)已以每微升各自1皮摩尔的浓度组合)；和2μl用AP保存缓冲液(3M氯化钠、30mM Tris、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌、0.05％叠氮化钠)稀释至1.25皮摩尔/微升的探针3((表2)SEQ ID NO.：3)。

杂交

除大肠杆菌反应平行测定四次外，所有反应都一式两份进行。为进行各杂交反应，将82μL杂交混合物连同75μl分离的样品核酸一起放在聚丙烯试管中。也检验两个对照组：阴性对照组由75μl水组成，且阳性对照组由1μl探针4(SEQ ID NO.：4)连同75μl水一起组成。含有杂交混合物和样品或对照组的聚丙烯试管放在模块式干浴恒温箱上，在42℃下放置30分钟。接着从干浴恒温箱中移出试管，且将样品转移至抗生蛋白链菌素涂布的试管中。两个大肠杆菌样品在室温下培育30分钟；其它反应在干浴恒温箱中在42℃下培育30分钟，以便进行杂交且捕捉至试管上。接着用1.0ml洗涤缓冲液[100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠和0.1％

FSA(v/v)，pH 7.2]洗涤各孔，且每次洗涤都涡旋10秒。接着通过轻弹的动作，排出试管内含物，以去除基本上所有液体；重复洗涤过程3次，每次洗涤使用1.0ml洗涤缓冲液。接着将200μl AP底物加入各试管中。在室温下底物在各试管中培育20分钟，且用铝箔避光。

结果

Celsis试管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：无注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对RLU的校正因子为0.6。

表5.42℃对比室温捕捉的RLU结果

样品身份	结果	RLU1	RLU2	RLU	读取日期
						单独AP底物	阴性	127	119	123	11/20/2007
大肠杆菌，室温	阳性	499768	476363	488066	11/20/2007
						大肠杆菌，42	阳性	646417	670797	658607	11/20/2007
枯草杆菌，42	阴性	554	454	504	11/20/2007
						阴性对照组，42	阳性	585	1535	1060	11/20/2007
阳性对照组，42	阳性	2569863	2381859	2475861	11/20/2007

意外地，在42℃下捕捉的大肠杆菌样品的RLU比在室温下捕捉的样品的RLU高35％。

实例8

进行杂交以模拟区别革兰氏阴性生物体与革兰氏阳性生物体

使用合成单股DNA作为模拟变性或单股DNA的模板进行以下实验。设计5种DNA模板来代表以下细菌种属的标靶区：杆菌、葡萄球菌、链球菌(Streptococcus)和利斯特菌属(Listeria)，连同设计合成DNA寡聚物来代表大部分肠杆菌科革兰氏阴性生物体的标靶区。

每个反应都用以下组份组装杂交混合物：5μl探针1(SEQ ID NO.：1)；2μl AP信号探针5′-CGG TGC TTC TTC TGC GTT TTT TTT TT-3′(SEQ ID NO.：3)的1∶100稀释液，此信号探针与250皮摩尔/微升碱性磷酸酶结合于AP保存缓冲液(3M氯化钠、30mM Tris、1mM氯化镁、0.1mM氯化锌、0.05％叠氮化钠)中，用AP稀释缓冲液(100mM Tris、100mM氯化钠、5mM氯化镁、0.01％叠氮化钠，pH 9.0)稀释；1μl 250ng/μLRNase A；75μl杂交缓冲液[200mM MOPS、3M氯化钠、0.05％Tween 20(v/v)、0.01％叠氮化钠(pH 6.9)、0.1％

FSA]；和66μl无菌DI水，使杂交混合物体积高达149μl。杂交混合物加入具有

阻断缓冲液的皮尔斯Reacti-Bind^TM抗生蛋白链菌素涂布的高结合力透明8孔带的24个孔中(每孔149μl杂交混合物)。5个合成DNA标靶和一个阴性对照组加入孔中，其中每个标靶和对照组进行4个反应；每个反应使用1μl 0.5皮摩尔/微升的各标靶。无菌DI水(1μl)用于阴性对照组。12个孔(各标靶和阴性对照组的复本)放在31℃水浴中30分钟(表6-水)。其它12个孔(各标靶和阴性对照组的复本)放在31℃恒温箱(型号120，实验室仪器公司(Lab-Line Instruments Inc.)，伊利诺斯州梅尔罗斯公园(Melrose Park))中30分钟(表6-公司)。接着用250μl洗涤缓冲液[100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％Tween 20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％(v/v)，pH 7.2]洗涤各孔。接着通过轻弹的动作，排出洗涤缓冲液，以去除基本上所有液体；重复洗涤过程5次，每次洗涤使用250μl洗涤缓冲液。在排出最终洗涤液后，将200μl以1∶10用AP稀释液缓冲液稀释的Attoglow^TM AP底物-450^LB加入各孔中，在室温下培育20分钟且用铝箔避光。底物培育完成时，用移液管将200μl底物转移至Celsis Advance^TM试管中。试管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：不使用注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对RLU的校正因子为0.6。底物具有过多背景，因此再用250μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次，且使用另一底物。针对第二次读取，将200μl

底物加入各孔中。在室温下培育底物20分钟，用铝箔避光。底物培育完成时，用移液管将200μl底物转移至Celsis Advance^TM试管中。试管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中。仪器以下列参数操作：不使用注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对RLU的校正因子为0.6。探针展示使用代表性DNA区段时，对革兰氏阴性生物体的标靶区的特异性超过革兰氏阳性生物体。

表6.使用合成单股DNA标靶的检验结果

样品身份	RLU1	RLU2	平均RLU
				罗氏底物	105	110	108
公司-革兰氏阴性	41532	33310	37421
				公司-杆菌	224	175	200
公司-链球菌	126	193	160
				公司-葡萄球菌	146	137	142
公司-利斯特菌	154	154	154
				公司-阴性	124	122	123
水-革兰氏阴性	39517	43247	41382
				水-杆菌	276	208	242
水-链球菌	118	134	126
				水-葡萄球菌	142	158	150
水-利斯特菌	175	157	166
				水-阴性	121	121	12l

公司-31℃恒温箱；水-31℃水浴

表7.合成单股DNA标靶的序列

实例9

用于核酸分离的物种特异性培养物

在莱森培养基中，繁殖如上文表1和实例1中所述的以下物种特异性培养物供核酸分离用：大肠杆菌、枯草杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、表皮葡萄球菌、仙人掌杆菌、皮氏罗尔斯顿菌、鹑鸡肠球菌、白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、屎肠球菌、藤黄微球菌和嗜麦芽寡养单胞菌。

溶解过夜培养物

通过将3ml各过夜培养物等分至个别无菌3.5ml 55mm×12mm聚苯乙烯管(莎斯特公司(Sarstedt))中且在2,000×g下离心3分钟，使以上各培养物的细胞成丸粒状。倾析上清液且弃去。将500μl溶解/提取缓冲液加入各丸粒中，且接着轻轻涡旋以使各丸粒再悬浮，且接着转移至含有0.5g无水0.5mm氧化锆/二氧化硅珠粒(百思产品公司(BioSpec Products)；俄克拉荷马州(OK)巴特而斯维尔(Bartlesville))的相应1.5mL有缘锥形管(斯坡特)中。以上所使用的溶解/提取缓冲液由以下各物构成：100mM 3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸(MOPS)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1％SDS、5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5％基于硅酮聚合物的消泡剂(例如消泡剂A(西格玛奥德里奇))、0.5％设计用于控制水性系统中的泡沫的水可稀释的消泡剂(例如30％活性硅酮乳液消泡剂Y-30(西格玛奥德里奇))和50μM以Alumion^TM(西格玛奥德里奇)出售的金精三羧酸(或其盐，例如铵盐)，组合试剂的最终pH值为7.0。

接着将溶解管放在Deluxe PulseVortex混合器(飞世尔科学公司)中，且以3000×rpm的脉冲设定涡旋30秒，且静置10秒，按规划在10分钟的时间内重复此过程。溶解后，将含有溶解产物的管放在一旁，用于脱盐。

脱盐和过滤

通过拧开下端拉手，翻转顶部螺丝帽四分之一个圈，且接着将各柱放在由Celsis Advance^TM试管(55mm×12mm聚苯乙烯管)组成的收集管中，且在1,000×g下离心每一柱-管组件1分钟，来制备脱盐离心柱(生物风险公司)用于去除存储缓冲液。收集管作为废物弃去，且接着将每一个经离心的离心柱转移至新的Celsis Advance^TM试管中，形成离心柱-管组件。

接着使用100μL通过脉冲涡旋获得的各细胞溶解产物，通过转移至个别和相应制备的离心柱-管组件中，使溶解产物脱盐，其中每一种溶解产物一式两份进行处理。接着在1000×g下使施加有溶解产物的每一组件离心2分钟，且柱滤液收集在组件的管部分中。每一种施加的溶解产物都在其各别收集管中产生约100μL滤液。随后通过凝胶电泳评估各溶解产物的核酸，且75μL各滤液用于下文所述的杂交反应和检测反应中。

凝胶电泳

使用凝胶电泳证实以上所收集的100μL各样品的柱滤液中rRNA的存在。使用4μl滤液等分试样和1μL甲醛样品缓冲液(龙沙公司)，制备供在例如

RNA盒(龙沙公司，美国缅因州罗克兰)等1.2％琼脂糖凝胶上执行电泳用的样品。1微升

RNA标记物用作尺寸标记物，其含有0.5至9kb大小的RNA片段(0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6和9kb)(龙沙公司)和4μL甲醛样品缓冲液。使制备的样品在65℃下变性5分钟，且接着负载至

RNA盒上的个别孔中，且在225伏特下电泳8分钟。按照凝胶制造商所建议的方案，将

RNA盒染色约20分钟。将

RNA盒放在高性能紫外线透照仪上，且用Kodak Gel Logic 100照相机(柯达公司，美国纽约州罗切斯特)捕捉影像。

电泳分析结果

在凝胶照片中，通过适当尺寸和相对强度的rRNA条带的观测和外观以及基因组DNA的存在，指示阳性结果。电泳结果表明，用于培养、溶解和核酸分离的方法产生适量的rRNA和基因组DNA，其质量足够用于分析。

检测检验

通过本发明中所述的方法，检验从上述物种特异性培养物中分离的核酸，这些方法由用一组探针进行杂交和固相捕捉组成，这组探针设计用于优先区别和检测革兰氏阴性生物体与其它微生物生物体的16S rRNA。

杂交和捕捉

对于各杂交反应，将75μl来自上文所述的经溶解和离心柱净化的物种特异性培养物的各滤液与75μl杂交缓冲液组合于含有两个各以5皮摩尔存在(基于A260)的冻干探针(塞尔斯公司)的杂交管中。一个探针由经生物素标记的DNA寡核苷酸捕捉探针组成，且另一个探针由经碱性磷酸酶标记的DNA寡核苷酸信号探针组成，两者都是设计用于与符合本发明中描述的革兰氏阴性生物体的16S rRNA的区段杂交。杂交缓冲液包含200mM MOPS、3M氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.2％

FSA(阴离子型羧酸锂氟表面活性剂)(v/v)、1mM氯化镁、25ng RNase A(沃辛顿生物化学公司(Worthington Biochemical)，美国新泽西州莱克伍德(Lakewood))，最终pH值为7.5。以上使用的RNase来自由以下组成的储备溶液：1mg/ml RNaseA溶于10mMHEPES、20mM氯化钠、1mM EDTA、0.1％Triton-X、50％甘油，pH 6.9。这两个用于检测本实例中利用的革兰氏阴性生物体的探针的序列与表2中列出的捕捉和信号探针不同。利用由75μl 1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4)组成的阴性对照组、和阳性对照组来监测检验性能。阳性对照组由75μl 1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4)和2.5皮摩尔DNA寡核苷酸组成，此DNA寡核苷酸准确对应于革兰氏阴性生物体中与杂交管中存在的两个冻干探针互补且为其标靶的16S rRNA的区段。将含有杂交缓冲液和培养物溶解产物滤液或对照组的杂交管放在

模块式干浴恒温箱(飞世尔科学公司)中，在42℃下放置30分钟。接着从干浴恒温箱中移出各杂交管，且将个别杂交混合物转移至相应的个别经抗生蛋白链菌素涂布的捕捉试管(塞尔斯公司)中，且接着将捕捉试管放在模块式干浴恒温箱中，在42℃下放置30分钟。接着洗涤每个所培育的捕捉试管3次。通过将1ml由100mM Tris、150mM氯化钠、0.05％

20(v/v)、0.01％叠氮化钠、0.1％

FSA(v/v)(pH 7.2)组成的洗涤缓冲液涡旋10秒，进行各次洗涤。接着通过轻弹的动作，排出最终洗涤液内含物，以去除实质上所有洗涤液体。接着将200μl碱性磷酸酶底物AP底物(密歇根诊断产品公司，密歇根州皇家橡树园)加入各试管中。接着在Celsis Advance^TM光度计上快速分析含有底物的试管。

分析和结果

将含有底物的塞尔斯抗生蛋白链菌素试管放于Celsis Advance^TM光度计仪器中进行分析。仪器以下列参数操作：无注射器，10秒读数，0校正截止值，和针对RLU(相对光单位)的校正因子为0.6。将从光度计中获得的关于所处理的细胞培养物和对照组的结果制成表格，且每个样品类型的一式两份(RLU1和RLU2)读数和其平均值(平均RLU)呈现在下表8中。

表8.来自15种生物体的核酸的革兰氏情况分析

样品身份	结果	RLU1	RLU2	平均RLU
					阴性对照组	阴性	746	650	698
皮氏罗尔斯顿菌	阳性	192112	342736	267424
					仙人掌杆菌	阴性	1040	997	1019
鹑鸡肠球菌	阴性	695	647	671
					白色念珠菌	阴性	820	854	837
酿酒酵母	阴性	743	1203	973
					铜绿假单胞菌	阳性	609805	884702	747254
荧光假单胞菌	阳性	658193	942273	800233
					恶臭假单胞菌	阳性	1200965	947134	1074050
屎肠球菌	阴性	980	1147	1064
					藤黄微球菌	阴性	1632	1478	1555

大肠杆菌	阳性	1173016	1567230	1370123
					嗜麦芽寡养单胞菌	阳性	59480	58730	59105
洋葱伯克霍尔德菌	阳性	235707	263621	249664
					枯草杆菌	阴性	1861	2410	2136
表皮葡萄球菌	阴性	3224	2882	3053
					阳性对照组	阳性	2155546	2302713	2229130

用于阴性结果的截止值设定为5000RLU或更低，且认为革兰氏阴性生物体的阳性检测为5001RLU或更高。所有用革兰氏阴性生物体接种的物种特异性培养物的平均RLU都超过5001RLU，因此得出阳性结果。所有用非革兰氏阴性生物体接种的物种特异性培养物的平均RLU都小于5000RLU，因此得出阴性结果。唯有从革兰氏阴性生物体中获得的溶解产物得出阳性结论。

评估其它探针组的冻干

设计一组由经生物素标记的DNA寡核苷酸捕捉探针和经碱性磷酸酶标记的DNA寡核苷酸信号探针组成的探针，以优先区别和检测金黄色葡萄球菌与其它微生物生物体的16S rRNA，在聚丙烯管(塞尔斯公司)中冻干此组探针，每个管使用5皮摩尔各探针，以提供含有冻干探针组的杂交管供检测金黄色葡萄球菌用。同样，如上所述，使用5皮摩尔来自各别探针组的各探针，制备含有冻干探针的杂交管供检测革兰氏阴性变形细菌门(proteobacteria)生物体或真菌用，以提供供分别检测革兰氏阴性变形细菌门或真菌的杂交管。

按照实例9中所述的溶解过夜培养物和脱盐过滤部分中所概述的步骤，制备大肠杆菌、枯草杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、表皮葡萄球菌、仙人掌杆菌、皮氏罗尔斯顿菌、鹑鸡肠球菌、白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、屎肠球菌、藤黄微球菌和嗜麦芽寡养单胞菌的溶解产物。针对革兰氏阴性变形细菌门、金黄色葡萄球菌和真菌，通过实例9中所述的方法，使用以上溶解产物、如以上实例9中的阴性对照组和阳性对照组，进行反应和分析。

通过RLU超过5001的金黄色葡萄球菌阳性对照组和所有具有阴性结果(RLU为5000或更低)的生物体，区别金黄色葡萄球菌阳性对照组与所分析的生物体。随后，发现基本上如实例9中的方法所述而分离的金黄色葡萄球菌16S rRNA核酸具有阳性结果，其RLU超过5001。

通过RLU超过5001的白色念珠菌和酿酒酵母以及所有具有阴性结果(RLU为5000或更低)的其它生物体，区别白色念珠菌和酿酒酵母与其它所分析的生物体。

结果表明这些探针组可冻干且随后用于反应，而不会折损其检测各别生物体的功能性和效用且不会引入交叉反应性或未特异性结合。

实例10

进行一项实验，以确定基本上使用实例9中所述的方法，设计用于与革兰氏阴性生物体的16S rRNA杂交的探针、设计用于杂交金黄色葡萄球菌的16S rRNA的探针和设计用于与真菌的18S rRNA杂交的探针是否可组合在一个杂交反应中，从而允许选择性测定标靶生物体，而这些探针不会彼此干扰或产生虚假的非特异性和干扰信号。

溶解和过滤

基本上按照实例9中所述的溶解过夜培养物和脱盐过滤部分中所概述的步骤，制备大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的溶解产物。

三个探针组的组合反应物

针对各溶解产物、阴性对照组和阳性对照组，将含有三个不同探针组的组合的反应物一式两份组装在聚丙烯管中。反应物由75μl如实例9中所述的杂交缓冲液组成，所述缓冲液含有以下各物：5皮摩尔经生物素标记的DNA寡核苷酸捕捉探针和5皮摩尔经碱性磷酸酶标记的DNA寡核苷酸信号探针，设计用于与革兰氏阴性生物体的16S rRNA杂交；5皮摩尔经生物素标记的DNA寡核苷酸捕捉探针和5皮摩尔经碱性磷酸酶标记的DNA寡核苷酸信号探针，设计用于与金黄色葡萄球菌的16S rRNA杂交；5皮摩尔经生物素标记的DNA寡核苷酸捕捉探针和5皮摩尔经碱性磷酸酶标记的DNA寡核苷酸信号探针，设计用于与白色念珠菌、黑曲霉菌和酿酒酵母或类似真菌所共有的18S rRNA同源区段杂交。对于各溶解产物反应，将75μl溶解产物加入含有杂交缓冲液和三个探针组的杂交管中。阴性对照组由75μl 1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4)组成。阳性对照组基本上由75μl 1mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.4)和三个合成DNA寡核苷酸标靶组成，这些标靶由以下组成：准确对应于革兰氏阴性生物体中与设计用于与革兰氏阴性变形细菌门生物体(下文表示为革兰氏阴性)的16S rRNA杂交的捕捉探针和信号探针互补且为其标靶的16S rRNA的区段的DNA寡核苷酸、准确对应于金黄色葡萄球菌中与设计用于与金黄色葡萄球菌的16S rRNA杂交的捕捉探针和信号探针互补且为其标靶的16SrRNA的区段的DNA寡核苷酸、和准确对应于白色念珠菌、黑曲霉菌和酿酒酵母或类似真菌(下文表示为真菌)所共有的18S rRNA的同源区段的DNA寡核苷酸，各为0.5皮摩尔。

个别探针组反应物

使用75μl含有5皮摩尔经生物素标记的捕捉探针和5皮摩尔经碱性磷酸酶标记的信号探针的杂交缓冲液和75μl来自如下表9中所示的各别相应标靶生物体的培养物的溶解产物，在聚丙烯管中制备含有上述三个探针组的组合中所用的靶向革兰氏阴性变形细菌门生物体、金黄色葡萄球菌或真菌的个别探针组的反应物，各一式两份。

杂交和捕捉

通过所述的方法，培育、洗涤和制备含有杂交缓冲液、探针和溶解产物或对照组的杂交管用于分析。

实例11

结果

表9

样品身份	探针	结果	RLU1	RLU2	平均RLU
						阴性对照组	革兰氏阴性、金黄色葡萄球菌、真菌	阴性	1045	1084	1065
白色念珠菌	真菌	阳性	74877	80543	77710
						白色念珠菌	革兰氏阴性、金黄色葡萄球菌、真菌	阳性	85814	94358	90086
金黄色葡萄球菌	金黄色葡萄球菌	阳性	44921	45731	45326
						金黄色葡萄球菌	革兰氏阴性、金黄色葡萄球菌、真菌	阳性	45422	54401	49912
大肠杆菌	革兰氏阴性	阳性	1521405	1362559	1441982
						大肠杆菌	革兰氏阴性、金黄色葡萄球菌、真菌	阳性	1179717	1278683	1229200
表皮葡萄球菌	革兰氏阴性、金黄色葡萄球菌、真菌	阴性	3905	2970	3438
						阳性对照组	革兰氏阴性、金黄色葡萄球菌、真菌	阳性	1730593	1641460	1686027

用于阴性结果的截止值设定为5000RLU或更低，且认为革兰氏阴性变形细菌门生物体、金黄色葡萄球菌或真菌的阳性检测为5001RLU或更高。当所有三个探针组组合在同一反应中时，革兰氏阳性生物体表皮葡萄球菌具有阴性RLU。当三个探针组组合时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都维持阳性RLU。数据显示，设计用于与革兰氏阴性变形细菌门生物体或金黄色葡萄球菌的16S rRNA或真菌的18S rRNA杂交的探针可组合在同一反应中，且维持其对各别标靶的特异性，而背景信号不会有任何显著增加。

虽然上文已经描述本发明的各种实施例，但应了解，这些揭示内容仅仅是举例说明且没有限制性。因此，本发明的宽度和范围不应受到任何上述例示性实施例限制，而应仅根据以下权利要求书和其等效物加以界定。

现已充分地描述本发明，所属领域的一般技术人员应了解，可在不影响本发明的范围或其任何实施例的情况下在条件、调配物和其它参数的广泛且等效的范围内进行本发明。本文中引用的所有专利、专利申请案和公开案都以全文引用的方式充分并入本文中。

Claims (29)

1.一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含：

a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；

b)通过组合以下各物，产生混合物：

i)所述样品，

ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和

iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；

其中所述核酸酶在所述探针加入之前或与之同时加入所述样品中；

其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和

c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关序列。

2.一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含：

a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；

b)通过组合以下各物，产生混合物：

i)所述样品，和

ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针与能够降解所述相关序列的核酸酶的组合；

其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和

c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关序列。

3.一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含：

a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；

b)通过组合以下各物，产生混合物：

i)所述样品，

ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和

iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；

其中所述探针在选定时期内加入所述样品中；

其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和

c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述选定时期为所述核酸酶加入之后的约0至约15分钟。

5.一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含：

a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；

b)通过组合以下各物，产生混合物：

i)所述样品，

ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和

iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；

其中所述核酸酶在所述相关序列与所述探针杂交之前加入所述样品与所述探针中，产生选定杂交百分比；

其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和

c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述选定杂交百分比为约5％至约95％。

7.一种检测样品中至少一种相关核苷酸序列的存在的方法，其包含：

a)提供可能含有至少一种相关核苷酸序列的样品；

b)通过组合以下各物，产生混合物：

i)所述样品，

ii)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针，和

iii)能够降解所述相关序列的核酸酶；和

iv)至少一种氟表面活性剂；

其中复合物在所述相关序列与所述探针之间形成；和

c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述氟表面活性剂是选自阴离子型氟表面活性剂、阳离子型氟表面活性剂、两性氟表面活性剂、非离子型氟表面活性剂、两性离子型氟表面活性剂和其混合物的群组。

9.根据权利要求1、2、3或5中任一权利要求所述的方法，其另外包含将至少一种氟表面活性剂加入所述混合物中。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种氟表面活性剂是选自由阴离子型氟表面活性剂、阳离子型氟表面活性剂、两性氟表面活性剂、非离子型氟表面活性剂、两性离子型氟表面活性剂和其混合物组成的群组。

11.根据权利要求1、2、3、5或7中任一权利要求所述的方法，其另外包含在产生所述混合物之前从所述样品中提取所述相关核苷酸序列。

12.根据权利要求1、2、3、5或7中任一权利要求所述的方法，其中所述核酸酶是选自由RNase A、RNase T1、RNase I和S1核酸酶组成的群组。

13.根据权利要求1、2、3、5或7中任一权利要求所述的方法，其中所述复合物经固定。

14.根据权利要求13所述的方法，其另外包含用洗涤缓冲液洗涤所述复合物。

15.根据权利要求1、2、3、5或7中任一权利要求所述的方法，其另外包含将试剂底物加入所述复合物中。

16.根据权利要求1、2、3、5或7中任一权利要求所述的方法，其中所述探针包含经生物素标记的捕捉探针和经碱性磷酸酶标记的信号探针。

17.根据权利要求16所述的方法，其另外包含将试剂底物加入所述复合物中，其中所述试剂底物是选自由磷酸金刚烷基1，2-二氧杂环丁烷(adamantyl-1，2-dioxetane phosphate)、磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯/硝基蓝四氮唑和磷酸对硝基苯酯组成的群组。

18.一种试剂盒，其包含：

a)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针；

b)至少一种氟表面活性剂；和

c)能够降解相关核苷酸序列的核酸酶。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其另外包含所述试剂盒的使用说明书。

20.根据权利要求18所述的试剂盒，其另外包含底物试剂。

21.一种检测样品中相关标靶的存在的方法，其包含：

a)提供可能含有相关标靶的样品；

b)通过组合以下各物，产生混合物：

i)所述样品；

ii)至少一种以可检测标记作标记的探针；和

iii)至少一种氟表面活性剂；

其中复合物在所述相关标靶与所述探针之间形成；和

c)测量所述复合物中所述可检测标记的含量，其中所述复合物中存在所述可检测标记指示存在所述相关标靶。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种氟表面活性剂是选自由阴离子型氟表面活性剂、阳离子型氟表面活性剂、两性氟表面活性剂、非离子型氟表面活性剂、两性离子型氟表面活性剂和其混合物组成的群组。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述相关标靶是选自由蛋白质、肽、小化学分子、碳水化合物、脂多糖、多糖和脂质组成的群组。

24.一种减少细胞、亚细胞器、生物分子或化学分子的非特异性结合的方法，其包含：

a)将至少一种氟表面活性剂加入缓冲液中；和

b)使所述细胞、亚细胞器、生物分子或化学分子与所述缓冲液接触；

其中所述至少一种氟表面活性剂的存在会减少所述细胞、亚细胞器、生物分子或化学分子与表面或彼此的非特异性结合。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种氟表面活性剂是选自由阴离子型氟表面活性剂、阳离子型氟表面活性剂、两性氟表面活性剂、非离子型氟表面活性剂、两性离子型氟表面活性剂和其混合物组成的群组。

26.根据权利要求24所述的方法，其中应用是选自由免疫检验、微流体检验、容器表面钝化和细胞培养组成的群组。

27.一种用于根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法中的试剂盒，其包含：

a)至少一种以可检测标记作标记的核酸探针；

b)至少一种氟表面活性剂；和

c)能够降解相关序列的核酸酶。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其另外包含所述试剂盒的使用说明书。

29.根据权利要求27所述的试剂盒，其另外包含底物试剂。

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