CN107794260A - 一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，所述的提取方法为：S1、浓缩，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，弃上清；S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并高温孵育；S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸。本法提取的DNA样品，具有高得率、高纯度，可适用于荧光定量PCR等对模板要求较高的检测，增加了后续样本检测通用性。

Description

一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法

技术领域

本发明涉及核酸DNA的提取技术行业，尤其是涉及一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法。

背景技术

循环核酸是一种细胞外游离状态的核酸，在人体血浆／血清中存在循环DNA、RNA和微RNA，这些核酸分子是在细胞凋亡或死亡后释放到外周血中，具有片段小和含量低的特点。许多疾病状态下，比如中风、心肌梗塞、糖尿病及许多恶性肿瘤患者血浆游离gDNA会显著升高。肿瘤患者体内循环肿瘤 DNA（ctDNA）直接来自肿瘤细胞，对其进行基因分析可以获得肿瘤恶性程度的全部信息，可以为临床上肿瘤的早期诊断与鉴别、预后判断及疗效观察提供重要依据。孕妇外周血循环中存在胎儿游离DNA（cffDNA），开启了基于cffDNA的无创产前检测（NIPT）的新思路，尤其适用于高风险孕妇人群，因此血浆游离gDNA分析还可以作为产前诊断的重要方法。

由于循环核酸具有含量低，片段小等特点，在提取过程中容易丢失，需具有较高灵敏度与得率的提取方法才能应用于定量和相关检测。cfDNA（血液中游离的DNA片段）存在血浆/血清中，在从血浆/血清中提取cfDNA之前，通常需要从（抗）凝血中通过低速离心分离，分液后再裂解洗涤得到浓缩足够纯度的核酸。循环核酸的提取方法多样，但大都建立在胞核DNA提取方法之上，包括酚-氯仿抽提、硅胶或者磁珠载体分离法等。其中酚-氯仿提取法基于层析的原理，通过酚-氯仿混合物萃取蛋白质类有机物质，而保留DNA于液相溶液中。酚-氯仿抽提法成本低，但提取效率低，重复性差，苯酚-氯仿对皮肤有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经系统，对人体损伤较大，且获得的多是大片段DNA，不适用于小片段循环核酸的提取。

外周血游离DNA中ctDNA和cffDNA检测时，由于外周血中ctDNA和cffDNA含量极低，需要单次提取大体积样本，而市面上硅胶柱法或磁珠法单次提取大都在小体积（1ml）内，因此迫切需要无毒且操作步骤简单，大体积提取时间短的提取试剂和方法。

发明内容

本发明提供一种从大体积无细胞体液中高效提取游离核酸的方法，它杜绝了有毒试剂的使用，操作步骤简单，并适用于磁珠法、柱式法及离心法等，对核酸自动提取仪具有更好通用性。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，所述的提取方法为：

S1、浓缩 ，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，弃上清；

S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并高温孵育；

S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸。

进一步具体的，在所述的步骤S1中沉淀剂为二价阳离子试剂，所述的沉淀剂的浓度为0.1M～1M。

进一步具体的，所述的二价阳离子试剂为钙离子试剂、铜离子试剂、镁离子试剂以及二价铁离子试剂中的一种。

进一步具体的，所述的步骤S1中的离心速度为5000r/min～10000r/min，离心时间为1min～10min。

进一步具体的，所述的步骤S2中的裂解液的主要成分为盐酸胍、Tween-20以及Triton X-100，其浓度盐酸胍为0.5M～5M，Tween-20的浓度为1%～15%，Triton X-100的浓度为0.2%～5%。

进一步具体的，所述的步骤S2中的蛋白酶K的浓度为1mg/ml～5mg/ml。

进一步具体的，在所述的步骤S2中高温孵育的温度为50℃～80℃，孵育的时间为5min～30min。

进一步具体的，在所述的步骤S3中洗液内包含去蛋白液以及浓度为80%的乙醇。

进一步具体的，在所述的步骤S3中采用吸附柱的柱式法的纯化步骤为，

D1、将部分混有异丙醇的悬液转移至带有收集管的离心柱内，在室温下以12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复D1步骤直至悬液完全转移；

D2、在离心柱内加入去蛋白液，在室温下以12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复D2步骤一次；

D3、在离心柱内加入乙醇，在室温下以12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复D3步骤一次；

D4、更换离心柱下方的收集管并以13000r/min离心3min，用于干燥离心柱内的硅胶膜；

D5、将离心柱转移至一新的离心管内，取在70℃环境下预热后的TE缓冲液滴在硅胶膜上，室温静置3min，以12000r/min离心1min进行洗脱。

进一步具体的，在所述的步骤S3中采用磁珠的磁珠法的纯化步骤为，

T1、向混有异丙醇的悬液中加入磁珠，颠倒混匀，室温放置5min使核酸充分与磁珠结合，期间不时颠倒混匀，重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体；

T2、将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入去蛋白液，轻微振荡混匀重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复T2步骤一次；

T3、向离心管中加入乙醇，轻微振荡混匀重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复T3步骤1次，室温晾干5min～10min；

T4、将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入在70℃环境下预热后的TE缓冲液，移液器吹打混匀，重悬磁珠，在58℃环境下孵育10min，并且每隔5min轻弹管底悬浮磁珠，以防磁珠成团；

T5、将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，将cfDNA溶液转移至新的离心管。

本发明的有益效果是：1）本发明不使用酚、氯仿等对人体健康有害的化学物质，使用安全无毒的试剂和缓冲液对无细胞体液进行预处理；2）本发明通过对无细胞体液进行浓缩处理可以对1ml～5ml的大量样本单次完成提取，节约成本，提高效率；3）本发明可采用柱式法和磁珠法等不同吸附纯化方法对1ml～5ml无细胞体液的cfDNA的提取，简便快捷，有效利用可用资源，灵活改变实验方法，可行性更高。

本法提取的DNA样品，具有高得率、高纯度，可适用于荧光定量PCR等对模板要求较高的检测，增加了后续样本检测通用性。

附图说明

图1是本发明提取方法的流程框图；

图2是本发明血浆中cfDNA提取与全血浆中cfDNA提取的对照图；

图3是本发明不同体积沉淀剂cfDNA提取优化比较图；

图4是本发明不同体积裂解液cfDNA提取优化比较图；

图5是本发明血清中cfDNA提取与全血清中cfDNA提取的对照图；

图6是本发明1ml血浆与5ml血浆中cfDNA提取的对照图；

图7是本发明1ml血浆中cfDNA柱式法提取与磁珠法提取的对照图；

图8是本发明游离胎儿DNA（cffDNA）的提取PCR扩增曲线与溶解曲线图；

图9是本发明游离胎儿DNA（cffDNA）的提取PCR凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，所述的提取方法为：

S1、浓缩，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，离心速度为5000r/min～10000r/min，离心时间为1min～10min，弃上清；沉淀剂的浓度为0.1M～1M，沉淀剂采用钙离子试剂、铜离子试剂、镁离子试剂以及二价铁离子试剂等二价阳离子中的一种。

S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并在50℃～80℃环境中孵育5min～30min；裂解液的主要成分为盐酸胍、Tween-20以及Triton X-100，其浓度盐酸胍为0.5M～5M，Tween-20的浓度为1%～15%，Triton X-100的浓度为0.2%～5%；蛋白酶K的浓度为1mg/ml～5mg/ml。

S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸；洗液内包含去蛋白液以及浓度为80%的乙醇。

对提取的cfDNA含量进行荧光定量PCR检测，以提取的cfDNA作为模板，加入如下反应体系中：

PCR反应体系各成分和终浓度为：10×PCR Buffer，dNTP 0.2mM， MgCl₂ 1.5mM，基因组ACTB上游引物 0.5mM，基因组ACTB下游引物 0.5mM，基因组ACTB探针0.1mM，50×ROX（Invitrogen 12223-012），不足18ul用无RNase水补齐，模板2ul，总体积20ul。

检测待测cfDNA含量判断标准如下：

有明显S曲线且Ct小于等于35，则待测样本中含有cfDNA，若荧光定量PCR反应不符合上述条件，则待测样本中不含有cfDNA；扩增曲线荧光值超过阈值所对应的Ct值可以作为判断待测样本中cfDNA含量多少的依据，Ct值越小，待测样本中cfDNA含量越多；Ct值越大，待测样本中cfDNA含量越少。

实施例1：不浓缩与浓缩提取血浆cfDNA的对比

1）不浓缩提取血浆cfDNA

1.取1ml血浆加入2ml的离心管中，后加入1ml的裂解液和50ul蛋白酶K混匀，重悬混合液并在58℃的环境中孵育1小时；

2.在重悬液中加入400ul异丙醇，颠倒混合；吸取700ul的样品加入带有2ml收集管的离心柱，轻盖盖子，高速离心机12000 r/min离心1min，弃尽穿流液，吸取剩余样品至此离心柱中重复此操作步骤，至样品全部转移完成；

3.在离心柱中加入700ul去蛋白液，在高速离心机上以12000 r/min离心1min，弃尽穿流液，重复该步骤一次；

4. 在离心柱中加入700ul浓度为80%的乙醇，在高速离心机上以12000 r/min离心1min，用移液器弃尽穿流液，重复该步骤一次；

5.更换离心柱下方的收集管，将离心机速度调高至13000 r/min离心3min，用于干燥硅胶膜，完全去除洗液对最后的溶解是非常重要的，洗液的残留会影响最终洗脱；

6.将离心柱转移至一新的1.5ml离心管中，用移液器往硅胶膜中央滴加50ul的1xTE缓冲液(提前在70℃环境下预热)，轻盖管盖，室温静置3min，之后用高速离心机以12000 r/min离心1min，洗脱得到不浓缩直接进行提取的血浆cfDNA。

2）经过浓缩后提取血浆cfDNA

1.取1ml血浆加入2ml的离心管中，后加入140ul的沉淀剂与228ul的缓冲液涡旋混匀，室温放置1分钟，用高速离心机10000r/min离心3min，弃上清；

2.在沉淀物中加入700ul的灭菌水，颠倒混匀三次，用高速离心机12000r/min离心3min，弃上清；

3.在沉淀物中加入400ul裂解液与50ul的蛋白酶K，重悬沉淀物，置于58℃环境中孵育15min；

之后重复1）中步骤2～6后得到经过浓缩提取的血浆cfDNA。

通过cfDNA含量荧光定量PCR检测，对比结果如图2所示，1ml的血浆样品经过浓缩后完全不影响血浆cfDNA的提取，可以采取浓缩的方式进行提取。

实施例2：浓缩提取血浆cfDNA过程对沉淀剂用量的优化

1.将2ml血浆分装至2个2ml的离心管中，每管1ml的血浆，分别加入70ul的沉淀剂与114ul的缓冲液、140ul的沉淀剂与228ul的缓冲液，之后分别对每个离心管进行涡旋混匀，室温放置1min，用高速离心机10000r/min离心3min，弃上清；

对上述两管血浆分别进行以下操作，

2.在沉淀物中加入700ul的灭菌水，颠倒混匀三次，用高速离心机12000r/min离心3min，弃上清；

3.在沉淀物中加入400ul裂解液与50ul的蛋白酶K，重悬沉淀物，置于58℃环境下孵育15min；

4.在重悬液中加入400ul的异丙醇，颠倒混匀，吸取700ul样品加入带有2ml收集管的离心柱，轻盖盖子，用高速离心机12000r/min离心1min，弃尽穿流液，吸取剩余样品至此离心柱中重复此操作步骤，至样品全部转移；

5.在离心柱中加入700ul去蛋白液，用高速离心机12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复该步骤一次；

6.在离心柱中加入700ul 浓度为80%的乙醇，在高速离心机上以用高速离心机12000r/min离心1min，用移液器弃尽穿流液，重复该步骤一次；

7.更换离心柱下方的收集管，将离心机速度调高至用高速离心机13000r/min离心3min，用于干燥硅胶膜，完全去除洗液对最后的溶解是非常重要的，洗液的残留会影响最终洗脱；

8.将离心柱转移至一新的1.5ml的离心管中，用移液器往硅胶膜中央滴加50ul的1xTE(提前在70℃环境下预热)的缓冲液，轻盖管盖，室温静置3min，之后用高速离心机以12000r/min离心1min洗脱得到不同沉淀剂用量优化提取的血浆cfDNA。

通过cfDNA含量荧光定量PCR检测，对比结果如图3所示，大体积沉淀剂与缓冲液浓缩效果优于小体积沉淀剂与缓冲液的浓缩效果，两者差别显著。

实施例3：浓缩提取血浆cfDNA过程对裂解液用量的优化

1.将4ml血浆分装至4个2ml的离心管中，每管1ml的血浆并分别加入140ul沉淀剂与228ul缓冲液，涡旋混匀，室温放置1min，用高速离心机10000r/min离心3min，弃上清；

2.在上述4个离心管的沉淀物中分别加入700ul的灭菌水，颠倒混匀三次，用高速离心机12000r/min离心3min，弃上清；

3. 在上述4个离心管的沉淀物中分别加入4种不同体积的裂解液：200ul裂解液、300ul裂解液、400ul以及500ul裂解液，之后再分别加入50ul的蛋白酶K，重悬沉淀物，置于58℃环境下孵育15min；

将上述4个离心管中的重悬液分别进行以下操作，

4.在重悬液中加入400ul的异丙醇，颠倒混匀，吸取700ul的样品加入带有2ml收集管的离心柱，轻盖盖子，用高速离心机12000r/min离心1min，弃尽穿流液，吸取剩余样品至此离心柱中重复此步骤操作，至完全转移；

5.在离心柱中加入700ul去蛋白液，用高速离心机12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复该步骤一次；

6.在离心柱中加入700ul 浓度为80%的乙醇，在高速离心机上以用高速离心机12000r/min离心1min，用移液器弃尽穿流液，重复该步骤一次；

7.更换离心柱下方的收集管，将离心机速度调高至13000r/min离心3min，用于干燥硅胶膜；

8.将离心柱转移至一新的1.5ml的离心管中，用移液器往硅胶膜中央滴加50ul的1xTE(提前在70℃环境下预热)的缓冲液，轻盖管盖，室温静置3min，之后用高速离心机以12000r/min离心1min洗脱得到不同裂解液用量优化提取的血浆cfDNA。

通过cfDNA含量荧光定量PCR检测，对比结果如图4所示，裂解液在体积超过400ul以上时，提取效率没有显著增加，故针对1ml血浆样品的提取裂解液体积为400ul。

实施例4：不浓缩与浓缩提取血清cfDNA

1）不浓缩提取血清cfDNA

1.取1ml血清加入2ml的离心管中，并在其内加入1ml的裂解液和50ul的蛋白酶K混匀，重悬混合液并在58℃环境下孵育1小时；

2.在重悬液中加入400ul异丙醇，颠倒混合；吸取700ul样品加入带有2ml收集管的离心柱，轻盖盖子，用高速离心机12000r/min离心1min，弃尽穿流液，吸取剩余样品至此离心柱中重复此步骤操作，至完全转移；

3.在离心柱中加入700ul去蛋白液，用高速离心机12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复该步骤一次；

4.在离心柱中加入700ul浓度为 80%的乙醇，在高速离心机上以12000r/min离心1min，用移液器弃尽穿流液，重复该步骤一次；

5.更换离心柱下方的收集管，将离心机速度调高至13000 r/min离心3min，用于干燥硅胶膜；

6.将离心柱转移至一新的1.5ml离心管中，用移液器往硅胶膜中央滴加50ul的1xTE(提前在70℃环境下预热)的缓冲液，轻盖管盖，室温静置3min，之后用高速离心机以12000r/min离心1min洗脱得到不浓缩直接进行提取的血清cfDNA。

2）经过浓缩后提取血清cfDNA

1.取1ml血清加入2ml的离心管中，再加入140ul的沉淀剂与228ul的缓冲液，涡旋混匀，室温放置1min，用高速离心机10000 r/min离心3min，弃上清；

2.在沉淀物中加入700ul的灭菌水，颠倒混匀三次，用高速离心机12000 r/min离心3min，弃上清；

3.在沉淀物加入400ul裂解液与50ul的蛋白酶K，重悬沉淀物，置于58℃的环境中孵育15min；

之后重复1）中步骤2～6后得到经过浓缩提取的血清cfDNA。

通过cfDNA含量荧光定量PCR检测，对比结果如图5所示，1ml血清样品的浓缩完全不影响血清cfDNA的提取。

实施例5：大量体积5ml血浆的cfDNA的提取

1. 取5ml血浆加入15ml的离心管中，加入350ul沉淀剂与570ul的缓冲液，涡旋混匀，室温环境下放置10min，高速离心机以5000 r/min离心10min，弃上清；

2. 在沉淀物中加入5ml的灭菌水，颠倒三次，用高速离心机5000 r/min离心5min，弃上清；

3. 在沉淀物加入800ul的裂解液与100ul的蛋白酶K，重悬沉淀，置于58℃环境下孵育15min；

4. 在重悬液中加入 600ul异丙醇，颠倒混匀；吸取700ul样品加入带有2ml收集管的离心柱，轻盖盖子，用高速离心机12000 r/min离心1min，弃尽穿流液，吸取剩余样品至此离心柱中重复此步骤操作，至完全转移；

5.在离心柱中加入700ul去蛋白液，用高速离心机12000 r/min离心1min，弃尽穿流液，重复该步骤一次；

6.在离心柱中加入700ul浓度为 80%的乙醇，在高速离心机上以12000 r/min离心1min，用移液器弃尽穿流液，重复该步骤一次；

7.更换离心柱下方的收集管，将离心机速度调高至13000 r/min离心3min，用于干燥硅胶膜；

8.将离心柱转移至一新的1.5ml的离心管中，用移液器往硅胶膜中央滴加50ul的1xTE(提前在70℃环境下预热)缓冲液，轻盖管盖，室温静置3min，之后用高速离心机以12000 r/min离心1min洗脱得到经过浓缩提取的血浆cfDNA。

通过cfDNA含量荧光定量PCR检测，将实施例1中1ml血浆中提取的cfDNA与本实施例中5ml血浆中提取的cfDNA进行对比如图6所示，提取5ml血浆样品所得到的cfDNA检测ACTB的Ct值为19.82，提取1ml血浆样品所得到的cfDNA检测ACTB的Ct值为21.24，说明本发明可在大体积血浆样品中获得更大量的cfDNA。

实施例6：磁珠法用于1ml血浆cfDNA的提取

1.取1ml血浆加入2ml的离心管中，再加入140ul的沉淀剂与228ul的缓冲液，涡旋混匀，室温放置1min，用高速离心机10000 r/min离心3min，弃上清；

2.在沉淀物中加入700ul的灭菌水，颠倒混匀三次，用高速离心机12000 r/min离心3min，弃上清；

3.在沉淀物中加入400ul的裂解液与50ul的蛋白酶K，重悬沉淀物，置于58℃的环境下孵育15min；

4.向重悬液中添加50ul的磁珠，颠倒混匀，室温放置5min使核酸充分与磁珠结合，期间不时颠倒混匀，重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸弃液体；

5.将离心管从磁力架上取下，加入1ml的去蛋白液，轻微振荡混匀，重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体，该步骤重复一次。

6.加入1ml 浓度为80%的乙醇，轻微振荡混匀，重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体，该步骤重复一次；在第二次时待磁珠完全吸附后，充分吸弃液体（不要有残留），室温晾干5min～10min。

7. 将离心管从磁力架上取下，加入1xTE(提前在70℃预热)的缓冲液，用移液器吹打，重悬磁珠，在58℃环境下孵育10min，期间每隔5min轻弹管底悬浮磁珠，以防磁珠成团。

8. 将离心管从58℃环境中移开，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后小心将cfDNA溶液转移至新的离心管，得到磁珠法提取的血浆cfDNA。

通过cfDNA含量荧光定量PCR检测，将实施例1中采用柱式法提取的cfDNA与本实施例中采用磁珠法提取的cfDNA进行对比如图7所示，柱式法提取1ml血浆样品所得到的cfDNA检测ACTB的Ct值为21.52，用本发明的磁珠法提取1ml血浆样品所得到的cfDNA检测ACTB的Ct值为21.63，说明本发明对血浆血清的浓缩裂解处理可以兼顾柱式纯化和磁珠纯化方法的需要。

实施例7：游离胎儿DNA（cffDNA）的提取和检测

1.取1ml通过理化鉴定为孕男胎的孕妇血浆加入2ml离心柱内，再加入140ul沉淀剂与228ul缓冲液，涡旋混匀，室温放置1min，用高速离心机10000 r/min离心3min，弃上清；

2.在沉淀物中加入700ul的灭菌水，颠倒混匀三次，用高速离心机12000 r/min离心3min，弃上清；

3.在沉淀物中加入400ul的裂解液与50ul的蛋白酶K，重悬沉淀，置于58℃环境下孵育15min；

4.在重悬液中加入400ul的异丙醇，颠倒混匀，吸取700ul样品加入带有2ml收集管的离心柱，轻盖盖子，用高速离心机12000 r/min离心1min，弃尽穿流液，吸取剩余样品至此离心柱中重复此步骤操作，至完全转移；

5.在离心柱中加入700ul去蛋白液，用高速离心机12000 r/min离心1min，弃尽穿流液，重复该步骤一次；

6.在离心柱中加入700ul浓度为80%的乙醇，在高速离心机上以12000 r/min离心1min，用移液器弃尽穿流液，重复该步骤一次；

7.更换离心柱下方的收集管，将离心机速度调高至13000 r/min离心3min，用于干燥硅胶膜；

8.将离心柱转移至一新的1.5ml离心管中，用移液器往硅胶膜中央滴加50ul的1xTE(提前在70℃环境下预热)缓冲液，轻盖管盖，室温静置3min，之后用高速离心机以12000 r/min离心1min洗脱得到游离胎儿DNA；

9.检测是否含有胎儿cfDNA含量判断标准如下：

如图8所示荧光定量PCR扩增曲线有明显S形曲线，溶解曲线有符合预期大小的主峰，而且如图9所示电泳图有符合预期大小的主带，则待测样本中含有胎儿cfDNA；若荧光定量PCR反应不符合上述条件，则待测样本中不含有cfDNA。

需要强调的是：以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的提取方法为：

S1、浓缩 ，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，弃上清；

S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并高温孵育；

S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸。

2.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S1中沉淀剂为二价阳离子试剂，所述的沉淀剂的浓度为0.1M～1M。

3.根据权利要求2所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的二价阳离子试剂为钙离子试剂、铜离子试剂、镁离子试剂以及二价铁离子试剂中的一种。

4.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的离心速度为5000r/min～10000r/min，离心时间为1min～10min。

5.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的裂解液的主要成分为盐酸胍、Tween-20以及Triton X-100，其浓度盐酸胍为0.5M～5M，Tween-20的浓度为1%～15%，Triton X-100的浓度为0.2%～5%。

6.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的蛋白酶K的浓度为1mg/ml～5mg/ml。

7.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S2中高温孵育的温度为50℃～80℃，孵育的时间为5min～30min。

8.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S3中洗液内包含去蛋白液以及浓度为80%的乙醇。

9.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S3中采用吸附柱的柱式法的纯化步骤为，

D1、将部分混有异丙醇的悬液转移至带有收集管的离心柱内，在室温下以12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复D1步骤直至悬液完全转移；

D2、在离心柱内加入去蛋白液，在室温下以12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复D2步骤一次；

D3、在离心柱内加入乙醇，在室温下以12000r/min离心1min，弃尽穿流液，重复D3步骤一次；

D4、更换离心柱下方的收集管并以13000r/min离心3min，用于干燥离心柱内的硅胶膜；

D5、将离心柱转移至一新的离心管内，取在70℃环境下预热后的TE缓冲液滴在硅胶膜上，室温静置3min，以12000r/min离心1min进行洗脱。

10.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S3中采用磁珠的磁珠法的纯化步骤为，

T1、向混有异丙醇的悬液中加入磁珠，颠倒混匀，室温放置5min使核酸充分与磁珠结合，期间不时颠倒混匀，重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体；

T2、将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入去蛋白液，轻微振荡混匀重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复T2步骤一次；

T3、向离心管中加入乙醇，轻微振荡混匀重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸弃液体，重复T3步骤1次，室温晾干5min～10min；

T4、将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入在70℃环境下预热后的TE缓冲液，移液器吹打混匀，重悬磁珠，在58℃环境下孵育10min，并且每隔5min轻弹管底悬浮磁珠，以防磁珠成团；

T5、将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，将cfDNA溶液转移至新的离心管。