CN116590283B - 一种细胞结合增强剂和去除人源游离核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞结合增强剂和去除人源游离核酸的方法。所述细胞结合增强剂由甲醛、无机盐和水组成,所述无机盐为NaCl和KCl;以所述细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为0.5~4.0wt%;所述细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:50~500mM NaCl和50‑500mM KCl。所述方法在血浆中加入一种特定的细胞结合增强剂,用于增强核小体组蛋白和人源游离核酸复合物的结构稳定性,随后利用磁珠吸附法进行核小体组蛋白的清除,以去除核小体组蛋白绑定的人源游离核酸,从而实现了长时间离体的血浆样本病原检测灵敏度提升、血浆mNGS测序成本降低等目的,其中,长时间为5天以上,优选11天以上。
Description
技术领域
本发明涉及宏基因组二代测序的检测技术领域,具体涉及一种细胞结合增强剂和用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法。
背景技术
宏基因组二代测序(metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)技术自2014年首例用于诊断中枢神经系统钩体病患者以来逐步用于临床。当我们对一份临床样本进行mNGS检测后,我们可以同时获得人类的基因序列和微生物的基因序列。除了在痰液、咽拭子、肺泡灌洗液、脑脊液等标本中有良好的检测性能外,血液标本也是mNGS的重要应用领域,为解决临床疑难感染患者的诊断难题提供了有效的解决方案。目前血液样本的NGS检测手段,主要是针对血浆中的游离核酸(cfDNA)。然而已知血液中白细胞的数目为6-9x106/mL, 而病原体的数目极少,可能只有几十CFU/mL,在这种情况下病原菌的cfDNA很容易受到高浓度人源宿主cfDNA的稀释影响,降低病原菌检测的灵敏度,或者提升测序成本。因此能够找到一种高效、快速、彻底去除血浆人源核酸的方法,成为了血液病原菌检测流程中重要的一环。
同样是游离DNA,人源cfDNA和病原菌cfDNA最大的不同在于人源cfDNA多以DNA和8个组蛋白包裹结合的复合物形式存在,仅极少数为游离的裸露DNA片段。人源cfDNA的这种复合结构并非一成不变,一般5天甚至更长时间放置的血液样本中,这种核小体-DNA的复合结构会从紧密包裹,缓慢变成一种松散缠绕的状态,随着时间的推移,这种松散的结构占比持续增加,并最终完全瓦解,最后裸露的核酸被血浆中残留的核酸酶切割成小片段。目前市场上有一些特殊作用的采血管,可以维持细胞形态及血液成分稳定,保护游离核酸不被降解;但是它的技术原理是抑制核酸酶的活性,并不能阻止核小体与cf DNA物理结构的解体,且价格昂贵,且需要单独购买,且不同厂家的质量参差不齐,给使用者及运输方带来不方便。另外,细菌等原核生物因为缺乏细胞核及核小体等结构,其游离DNA多以一些碱性的Hu蛋白结合形成复合物,与人源包裹的蛋白从结构到性质均有较大差别。
目前血浆样本中去除人源宿主核酸的方法记录较少,主要是离心、过滤等方法。比如过滤法,将样本通过微滤膜进行过滤,取过滤后样本进行宏基组测序,这类方法主要针对的是完整的白细胞与游离核酸的大小或者沉降系数不同而进行区分,无法区分已经存在在血浆中的cfDNA,尤其是当面对一份离体时间较长、其白细胞大量破碎的样本来说,该方法几乎没有用武之地;另外还有酶解法,将样本直接用酶去除暴露的DNA,仅留下完整的微生物细胞用于下游分析。后者的做法牺牲了一些菌的cfDNA,可能造成漏检及报告假阴性。
CN115386573A公开了一种去除血浆中宿主核酸的方法、试剂盒及应用。将磁珠与组蛋白单克隆抗体偶联,制成捕获磁珠,将捕获磁珠与血浆进行孵育,将核小体上的组蛋白捕获,去除宿主核酸。然而此技术不能解决对长时间离体血浆中病原菌cfDNA的检测灵敏度如何提升问题。
由于目前的mNGS检测技术的血浆样本通常为新鲜冰冻血浆或长时间离体血浆。新鲜冰冻血浆要求在全血采集6至8小时内将血浆分离出来并于-20℃甚至更低环境以下保存得到,对于操作环境和时间要求都极为苛刻。对于长时间离体血浆而言,现有血浆处理过程中通常加入常规的结构增强剂,但其对于血浆离体时间有严格要求,不能超过5天以上,否则病原菌的cfDNA很容易受到高浓度人源宿主cfDNA的稀释影响,降低病原菌检测的灵敏度,或者提升测序成本。
基于现有技术的缺陷,提供一种适用于长时间离体血浆处理的细胞结合增强剂及人源核酸去除方法。
发明内容
针对以上问题,本发明提供一种细胞结合增强剂和用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法。所述方法在血浆中加入一种特定配方的细胞结合增强剂,用于增强核小体组蛋白和人源游离核酸复合物的结构稳定性,随后利用磁珠吸附法进行核小体组蛋白的清除,以去除核小体组蛋白绑定的人源游离核酸,从而实现了长时间离体11天后的血浆样本病原检测灵敏度提升、血浆mNGS测序成本降低等目的。
本发明的技术方案如下:
本发明提供一种细胞结合增强剂,由甲醛、无机盐和水组成,所述无机盐为NaCl和KCl;
以所述细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为0.5~4.0%;所述细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:50~500mM NaCl和50-500mM KCl。
进一步优选地,以所述细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为2.5%;所述细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:300mM NaCl和400mM KCl。
本发明提供一种去除人源游离核酸的方法,所述方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在所述血液样本离体5天以上时,将上层的血浆和下层的血细胞分开,获得血浆;
步骤S2:向步骤S1得到的所述血浆中加入等体积的所述细胞结合增强剂,在冰上孵育5-20min后,再加入甘氨酸以终止核小体和所述细胞结合增强剂的交联;
步骤S3:将外加抗体加入到含有Tween 20的PBS溶液中得到稀释后的外加抗体溶液,然后将所述外加抗体溶液加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转所述新离心管并培养15-60min后,随后将所述新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
步骤S4:在步骤S2的包含所述细胞结合增强剂的血浆溶液中,再加入步骤S3得到的所述磁珠-抗体复合物,混合均匀,并于室温下孵育杂交20min-1.5h,得到孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示所述磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到所述磁力架上,去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白,从而实现人源核酸的去除。
进一步地,所述方法还包括在对人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白进行清除后,对剩余细菌基因组进行解交联,然后进行病原菌cfDNA的提取。
进一步地,所述磁珠为商业化磁珠或其他具有同等功能的磁珠。
进一步地,所述外加抗体为组蛋白H3多克隆抗体(Histone H3 PolyclonalAntibody)或其他具有同等的功能的多克隆抗体。
进一步地,所述组蛋白H3多克隆抗体用Tween20稀释在200µL PBS中,加入到所述磁珠中,在室温下旋转培养30分钟,得到所述磁珠-抗体复合物。
进一步地,步骤S2中,所述甘氨酸加入到所述血浆中的终浓度为2%,基于步骤S2得到的溶液总质量计。
进一步地,步骤S2中,终止交联后,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在室温混匀后,置于冰上孵育5-20min,优选10min。
进一步地,步骤S3中,所述磁珠是预先通过以下方法进行洗涤的:
将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;
以每500mL初始血浆加入磁珠悬液50μL为基准,将重悬磁珠取出50μL转于新离心管中;
将所述新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下所述新离心管。
进一步地,步骤S3中,得到的所述磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗所述磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,所述清洗步骤包括:
从磁力架上取出所述新离心管,用200μL PBS, Tween 20 轻柔吹吸重悬所述磁珠-抗体复合物,然后将所述新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液。
步骤3中,“重悬”意指“重新悬浮”,具体操作是用适当的缓冲液或培养液将离心或沉降等方法得到的固体(沉淀、细胞、活性物质等)重新悬浮。
进一步优选地,步骤S4中,室温下孵育杂交40min。
进一步地,所述去除人源游离核酸的方法还包括如下步骤:
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃孵育10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,所述上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向所述上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的所述上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
进一步地,S8步骤是将病原核酸DNA吸附到吸附柱上。步骤S9、步骤S10是为了洗掉吸附柱上吸附的杂质。步骤S11是为了将病原DNA核酸从吸附柱上洗脱下来,以回收病原DNA核酸。
本发明的有益效果如下:
(1)目前文献中基本没有血液cfDNA去宿主的方法记录,市面上更没有成熟产品。主要原因就是细菌cfDNA和人基因cfDNA在核酸层面差别很小,导致任何一种方案都不能精准打击到人基因组的cfDNA;而核小体去除的方案利用两者结构不同,抗体捕获具有完整核小体的人基因组cfDNA,达到去宿主的目的。但是血液随着离体时间增长,人基因组cfDNA-其结构可能会松散瓦解,那么这部分人基因组cfDNA就很难被除去。本发明的细胞结合增强剂可以很好地固化长时间离体血液样本中的核小体组蛋白和cfDNA的结构,即便是离体时间超过5天以上(更优选地是11天以上)的血液依然可以达到65%的去除效果。
(2)本发明的细胞结合增强剂中,所用无机盐是为了保持血浆总体结构的平衡;所用甲醛可以与核小体的组成成分组蛋白发生烷基化缩合反应,使其保持稳定性和耐久性,从而使缠绕在组蛋白上的核酸也保持稳定性,而不易从组蛋白上脱落,使其核小体结构更加稳定。通过多个实验验证,采用具有一定配比的甲醛和无机盐的细胞结合增强剂处理不同离体时间(0天、3天、5天、7天、9天)的血液样本,其中,在血浆离体11天时,人RNaseP基因Ct值仍较高且稳定32.1,病原(肺炎克雷伯菌)Ct稳定在30左右,说明血浆加入本发明的结合增强剂对宿主去除效果比较稳定,人源核酸的去除效果不随血浆离体时间而改变。
(3)本发明的方法,配合了特定的处理条件,从而实现长时间离体血浆有效去除人源游离核酸的效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细说明,但不用来限制本发明的的范围。
以下实施例中,磁珠为商业化磁珠,商购自INVITROGEN™ Dynabeads™的10009D,或其他具有同等的功能的磁珠。
外加抗体为组蛋白H3多克隆抗体(Histone H3 Polyclonal Antibody)(INVITROGEN,PA5-17697)或其他具有同等的功能的多克隆抗体。
实施例1
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为0.1wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:10mM NaCl和10mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例2
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为0.5wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:50mM NaCl和50mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例3
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为2.5wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:300mM NaCl和400mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例4
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为4wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:500mM NaCl和500mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例5
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为0.1wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:500mM NaCl和500mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例6
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为0.5wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:300mM NaCl和400mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例7
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为2.5wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:50mM NaCl和50mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
实施例8
一种细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为4wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:10mM NaCl和10mM KCl。
细胞结合增强剂用于去除长时间离体血浆中人源游离核酸的方法包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的结合增强剂,将包含结合增强剂的长时间离体血浆在在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL(1.5 mg)转于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR(检测),计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比。
测试例1
通过qPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)将实施例1至8(加入细胞结合增强剂)所提取新鲜离体血浆,以及对照组(未加细胞结合增强剂)的新鲜离体血浆,进行人源核酸及病原体(肺炎克雷伯菌)核酸的Ct值测试,所有数据总结在以下表1中。人RNaseP基因Ct值越小说明宿主核酸残留越高,Ct值越大说明宿主核酸去除效果越好;病原(肺炎克雷伯菌)Ct值越小,说明经过这种方法处理其回收效率越高。
表1 实施例1至8和对照组的人源核酸Ct值和病原体核酸Ct值
测试例2
通过qPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)测试加入实施例3的细胞结合增强剂(2.5%甲醛;300mM NaCl;400mM KCl)的血液样本和不加细胞结合增强剂的血液样本,对比不同离体时间(0天、3天、5天、7天、9天)后的血液样本中,加入结合增强剂对宿主去除效果的影响。
表2 对比不同离体时间(0天、3天、5天、7天、9天)后的血液样本中,加入结合增强剂对宿主去除效果的影响
检测结果说明随着血浆离体时间延长,不加结合增强剂,其人源核酸去除效果逐渐变差(Ct值变小),而加结合增强剂组人源去除效果不随血浆离体时间而改变。
以上,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作任何其他形式的限制,而依据本发明的技术实质所作的任何修改或等同变化,仍属于本发明所要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种去除人源游离核酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤S1:在血液样本中加入抗凝剂,保存在2-8℃下,在血液样本离体0天时即新鲜状态,将血浆和血细胞分开;
步骤S2:在长时间离体后的血浆中加入等体积的细胞结合增强剂,将包含细胞结合增强剂的长时间离体血浆在室温混匀后在冰上孵育10min后,加入甘氨酸以终止核小体和细胞结合增强剂的交联,甘氨酸加入到血浆中的终浓度为2%;
步骤S3:洗涤磁珠:将磁珠重悬漩涡30秒以上或颠倒5分钟;将重悬磁珠取出50μL转移于新离心管中;将新离心管放在磁力架上,从而将磁珠从上述溶液中分离出来,然后取出上层清液,从磁力架上取下新离心管;
制得磁珠-抗体复合物:将外加抗体加入到含有Tween™20的PBS溶液中,然后将稀释后的外加抗体加入到装有经预先洗涤后的磁珠的新离心管中,在室温下旋转新离心管并培养30min后,随后将新离心管放在磁力架上,去除上清液,得到磁珠-抗体复合物;
清洗磁珠-抗体复合物:磁珠-抗体复合物还需要重复1次以上的清洗步骤,从而清洗磁珠-抗体复合物表面残留的未与磁珠结合的抗体,清洗步骤包括:
从磁力架上取出新离心管,用200μL PBS, Tween™20 轻柔吹吸重悬磁珠-抗体复合物,然后将新离心管放置在磁力架上直到上述悬浊液澄清,吸出上清液;
步骤S4:将步骤S2的包含细胞结合增强剂的血浆重悬磁珠-抗体复合物,并于室温下孵育杂交40min;
步骤S5:将孵育杂交后的磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物放到磁力架上,直至液体澄清,表示磁珠-核小体组蛋白-外加抗体的复合物都吸附到磁力架上,即可去除人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白;
步骤S6:取步骤S5的上清液,转移至新管中,将蛋白酶加入到上清液溶液中,吹打混匀,56℃水浴10min,12000rpm离心去除杂质沉淀10min,取上清液,上清液中主要含有的是病原核酸;
步骤S7:向上清液溶液中加入异丙醇200μL,促进病原核酸DNA析出;
步骤S8:将步骤S7的上清液溶液全部转移到套放在2ml 收集管上的吸附柱中,在10000rpm下离心1min,洗脱出病原核酸DNA;
步骤S9:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,并加入400μL洗液洗掉杂质,在8000rpm下离心1min;
重复步骤S8,再次洗涤;
步骤S10:取出吸附柱,并倒掉废液,将吸附柱重新放回收集管,在空管10000rpm下离心1min,去除残留的洗液;
步骤S11:将吸附细菌核酸的吸附柱放入新的无菌1.5ml EP管中,加入50μL 洗脱液,静置2min,在12000rpm下离心1min;
步骤S12:1.5ml EP管内液体即为血清病原菌DNA,在-20℃保存;
步骤S13:进行QPCR检测,计算人源核酸及病原菌在核酸中的占比;
所述细胞结合增强剂,由甲醛、NaCl、KCl和水组成,其中甲醛、NaCl和KCl的终浓度为:以细胞结合增强剂的总质量计,甲醛的终浓度为2.5wt%;细胞结合增强剂中NaCl和KCl的摩尔浓度分别为:300mM NaCl和400mM KCl。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括在对人源游离核酸缠裹的核小体组蛋白进行清除后,对剩余细菌基因组进行解交联,然后进行病原菌cfDNA的提取。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述外加抗体为组蛋白H3多克隆抗体。
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