CN116064735A - 一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法 - Google Patents

一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法，包括细胞裂解液、DNA酶、DNA酶缓冲液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶、玻璃珠和提取裂解液；细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷溶液；所述DNA酶为Ultra Nuclease；DNA酶缓冲液包括MgCl2、Tris‑HCl、BSA；采用了低浓度的皂苷和低浓度的β辛基硫代葡萄糖苷，在保证去宿主效果较好的情况下，兼顾各种病原微生物的检出。联合使用化学法和物理法双重作用对微生物细胞进行破壁，提高了临床上病原微生物的阳性检出率，并且弥补了目前只检测血浆样本cfDNA造成病原微生物漏检的空白。

Description

一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及微生物分子生物学分子检测领域，具体涉及一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法。
背景技术
血流感染(blood stream infection，BSI)是各种病原微生物(包括细菌、真菌等)入侵血液所引起的感染，包括菌血症与败血症。其中菌血症是指细菌短暂入血，而临床表现上无明显的毒血症症状；败血症则是由于病原微生物及毒素共同入血所引起的全身炎症反应综合征。尽管医学科学取得了极大进展，但是血流感染仍是全球公共卫生领域越来越严重的问题。脓毒症或脓毒症休克患者中，有40％是由血流感染引起的。ICU感染患者中，有20％是血流感染。当这类患者的感染源控制延迟、抗生素给药不及时的时候，治疗效果通常很差。
现阶段，血培养是血流感染诊断的金标准，但血培养依赖临床预判、培养周期长且检测阳性率较低。宏基因组二代测序(mNGS)技术凭借周期短、灵敏度高、检测范围全面等优势受到感染领域的极大关注，在血流感染的检测方面也已得到广泛的应用。目前，业类都是采集患者血浆中的游离核酸(cfDNA)进行血流感染的mNGS检测，提高了感染的阳性检出率。但是，病原既以cf-DNA的形式存在于血浆之中，也以颗粒的形式混迹于血细胞之中，仅检测血浆会造成漏检。所以，有必要检测血细胞中的病原靶标。
大多数的临床样本，比如肺泡灌洗液、痰液、血细胞等，含有大量人源细胞，且人细胞基因组为病原体微生物的10-10000倍，导致宏基组测序得到的测序数据90％以上的测序序列为人源序列，从而大大影响宏基因组病原微生物检出灵敏度。在高人源DNA的背景下，检出低丰度病原菌序列非常困难，更不必说检出一些难破壁的病原微生物，比如革兰氏阳性菌、隐球菌、结核分枝杆菌等。
目前，有一些针对肺泡灌洗液、痰液和呼吸道样本的去除宿主的专利报道，但是没有针对血细胞去宿主的研究报道。已公开的消除宿主DNA的方法主要有以下几种，但都存在一些不足：1)采用表面活性剂和DNase联合的温柔型消化法，将宿主基因组释放于溶液中，获得保留完整细胞壁结构的微生物，实现去宿主化微生物核酸提取。此种办法PBS清洗DNase时间较长，操作复杂，且难免残留DNase和损失病原微生物；2)有报道为了增加去除人源的效率，表面活性剂用了好几种，而且其浓度很高。结果，造成革兰氏阴性菌、病毒、支原体和衣原体等一些细胞较脆弱的病原微生物的丢失；3)针对前面一种方法需要离心的情况，有报道称改变了清除DNase残留的方法，利用EDTA终止作用来代替PBS的清洗，终止后全部用于后续提取，但是残留的EDTA会对后续的提取用的酶造成很大的影响，而且此种方法去除效率低；4)基于渗透裂解及叠氮碘化丙锭处理的化学方法去除宿主污染，此方法同样需要较长时间，而且需要特定的光源，目前并未被广泛应用；5)针对人基因组上广泛存在的重复序列，提前设计好捕获探针，然后用于人源基因组的去除。此种方法效率很低，而且捕获探针需要提前制备，工艺复杂。
因此急需提供一种针对血细胞的，各种微生物提取兼容性好的，简单、高效提取难破壁微生物的去宿主化提取试剂盒和方法。
发明内容
本发明的目的是针对现在的迫切需求，提供一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒和方法。
为实现上述目的，本发明的一个方面是提供一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括细胞裂解液、DNA酶、DNA酶缓冲液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶、玻璃珠和提取裂解液；
所述细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷混合溶液；
所述DNA酶为Ultra Nuclease；
所述DNA酶缓冲液包括MgCl2、Tris-HCl、BSA；
所述提取裂解液包括Tris-HCl、氯化钠、盐酸胍和SDS。
进一步的，细胞裂解液中皂苷的质量百分比浓度为1.6％，β辛基硫代葡萄糖苷的质量百分比浓度为0.4％。
进一步的，DNA酶缓冲液的pH值为6-9，提取裂解液的pH值为6-7。
目前发表的皂苷去除宿主细胞的方法，其中皂苷的工作浓度都很高，达到2.5％及以上，这样高的工作浓度下对微生物细胞的破坏作用很大，尤其是对革兰氏阴性菌、衣原体、支原体和病毒的破坏作用很大。因为这几种病原体的细胞结构较脆弱，容易在宿主细胞裂解的同时被破坏掉，从而影响了检出。本发明创造性地在宿主裂解的过程中使用了低浓度的皂苷和低浓度的β辛基硫代葡萄糖苷，并经过大量优化测试工作，调整了两者的比例，既保证了宿主细胞的去除，又不至于浓度太高破坏结构脆弱的病原体。
本发明的另一个方面是提供一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，所述方法包括如下步骤：
S1.宿主裂解：在样本管中加入细胞裂解液，室温颠倒混匀，离心后去除上清液；
S2.宿主核酸去除：往样本管中加入DNA酶缓冲液和DNA酶，混匀孵育；加入蛋白酶K，充分混匀后孵育，反应结束后离心弃掉上清，无需PBS清洗；
S3.微生物菌体破壁：加入溶菌酶和溶壁酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的离心管中，孵育，涡旋混匀处理；
S4.微生物核酸提取：离心管离心后加入提取裂解液和蛋白酶K，涡旋混匀后孵育；高速离心后，转移全部上清至一新的离心管中，加入无水乙醇，上下颠倒混匀后，溶液全部转移至已装入收集管的吸附柱中，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入清洗液Buffer WS1，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入清洗液Buffer WS2，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入新的离心管中，向吸附柱中加入无核酸酶水，室温放置，离心，收集DNA溶液于-20℃条件下保存。
进一步的，所述样本类型为血细胞。
进一步的，所述细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷溶液；所述DNA酶为UltraNuclease；所述DNA酶缓冲液包括MgCl2、Tris-HCl、BSA；所述提取裂解液包括Tris-HCl、氯化钠、盐酸胍和SDS。
进一步的，所述皂苷的终浓度为0.8％，β辛基硫代葡萄糖苷的终浓度为0.2％。
进一步的，所述Ultra Nuclease的终浓度为2-5U/μL，DNA酶缓冲液中各成分的终浓度分别为MgCl2 1-10mM，Tris-HCl 10-50mM，BSA0.1-0.5mg/ml。
进一步的，所述溶菌酶的终浓度为5-20mg/ml，溶壁酶的终浓度为0.1-0.5U/μL。
进一步的，所述提取裂解液中各成分的终浓度分别为Tris-HCl 40-100mM、氯化钠100-500mM、盐酸胍2-4M和SDS 0.5％-2％质量百分比。
本发明去宿主过程中，使用了Ultra Nuclease，其是一种全能核酸酶，不仅可以降解DNA，还可以降解RNA，在应用这一方法进行RNA病原体检测的时候也能提升RNA病原体的检出率。
革兰氏阳性菌的细胞壁含有较高比例的肽聚糖，真菌细胞壁含有较高比例的几丁质，溶菌酶、溶壁酶可以特异性的作用于肽聚糖、几丁质，本发明微生物菌体破壁中，联合应用溶菌酶和溶壁酶，对病原体细胞裂解更充分。
更进一步地，本发明联合使用化学法(溶菌酶和溶壁酶)和物理法(玻璃珠机械研磨)对微生物细胞进行破壁，双重破壁效果更充分，病原体检出率更高。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明特异针对血细胞样本类型而研发，弥补了目前只检测血浆样本cfDNA造成病原微生物漏检的空白；
2、本发明创造性地在宿主裂解的过程中使用了低浓度的皂苷和低浓度的β辛基硫代葡萄糖苷，并经过大量优化测试工作，调整了两者的比例，既保证了宿主细胞的去除，又不至于浓度太高破坏结构脆弱的病原体。
3、本发明去宿主过程中，使用了Ultra Nuclease，其是一种全能核酸酶，不仅可以降解DNA，还可以降解RNA，在应用这一方法进行RNA病原体检测的时候也能提升RNA病原体的检出率。
4、本发明联合使用化学法(溶菌酶和溶壁酶)和物理法(玻璃珠机械研磨)对微生物细胞进行破壁，双重破壁效果更充分，病原体检出率更高。
附图说明
图1为本发明病原微生物去宿主核酸提取的方法流程的示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的用法，下面将展示具体的实施方法和实施例，从而将技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方法仅仅是本发明的一种实施方法，而不是全部的实施方法。
下述实施方法和实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方法和实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
具体的实施方法步骤如下，流程可参照图1：
1、核酸提取
S1.宿主裂解：取600μL血细胞样本于1.5ml的样本管中，加入600μL细胞裂解液，室温上下颠倒混匀10min，10000rpm离心3min后去上清液；
S2.宿主核酸去除：往样本管中加入197μL DNA酶缓冲液和3μL DNA酶，充分吸打混匀，37℃孵育15min。使各组分的终浓度分别为Ultra Nuclease的终浓度为2U/μL，MgCl22mM，Tris-HCl 20mM，BSA0.1mg/ml。再加入20μL蛋白酶K，充分混匀后56℃孵育10min，使其终浓度为2mg/ml。反应结束后离心弃掉上清，无需PBS清洗；
S3.微生物菌体破壁：加入10μL溶菌酶和10μL溶壁酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有0.2g玻璃珠的离心管中，将离心管置于37℃孵育30min，涡旋混匀处理15min，使溶菌酶的终浓度为5mg/ml，溶壁酶的终浓度为0.2U/μL；
S4.微生物核酸提取：离心管短暂离心后加入200μL提取裂解液和20μL蛋白酶K，涡旋混匀后56℃孵育10min，使得各成分终浓度分别为Tris-HCl 50mM、氯化钠200mM、盐酸胍4M和SDS 0.5％。高速离心后，转移全部上清至一新的离心管中，加入200μL无水乙醇，上下颠倒混匀后，溶液全部转移至已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心30sec，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer WS1，12000rpm离心30sec，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer WS2，12000rpm离心30sec，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，12000rpm离心2min后，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入新的离心管中，向吸附柱中加入25μL无核酸酶水，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液于-20℃条件下保存。
2、文库构建
本实施方法中使用的DNA建库试剂盒为南京实践医学检验有限公司的One ShotMax DNALib Prep Kit for MGI(货号PDM601)
具体流程如下：
(1)将Frag Enzyme Mix、ERA Enzyme Mix取出，解冻并手指轻弹混匀，不可涡旋，FEA Reaction Buffer解冻并混匀；所有试剂短暂离心收集至管底，置于冰上备用；
(2)按照表1设置PCR仪，热盖温度设置为80度；开始程序，等温度达到4度后按暂停；
表1片段化程序
温度(℃) 时间
4 1min
37 22min
72 30min
4 Hold
(3)将放置在冰上包含样本DNA的离心管中按照表2所示配置反应体系：
表2片段化反应体系
组分 体积(μl)
DNA 28.8
FEA Reaction Buffer 10
ERA Enzyme Mix 1.2
Frag Enzyme Mix 10
Total 50
(4)使用移液器轻柔吹打混匀10-15次，注意冰上操作，不要旋涡震荡；
(5)短暂离心至管底后马上转移到已经预冷的PCR仪中，点击Resume重新运行程序；
(6)程序运行至最后4℃Hold步骤时，从PCR仪上取下管子。取出Ligation Buffer、DNA Adapter X和DNA Ligase，按照表3所示，配置接头连接的反应体系：
表3连接反应体系
Figure BDA0004102672590000071
Figure BDA0004102672590000081
使用移液器轻柔吹打混匀10-15次，并短暂离心收集至管底；
注：接头使用量请参照表4
表4接头使用量推荐表
Input DNA 预稀释倍数
100ng-200ng 不稀释
25ng-100ng 1:2
5ng-25ng 1:10
100pg-5ng 1:30
(7)放置于PCR仪上执行表5程序：
表5连接反应程序
温度(℃) 时间
20 15min
4 Hold
(8)结束后加入64μl的磁珠(确保在室温平衡30min以上)混合均匀；
(9)室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；
(10)放置于磁力架上静置澄清后弃上清液；
(11)加入200μl的80％乙醇，静置30sec后弃上清；
(12)加入200μl的80％乙醇，静置30sec后弃上清；
(13)快速离心后用10μl的移液器弃去残余乙醇，室温放置，晾干；
(14)从磁力架上取下管子，加入21.5μl的无核酸酶水重悬磁珠，充分混合均匀，室温放置2min，快速离心5sec放置于磁力架上2min，取20μl上清转移至新的PCR管中，切勿触碰磁珠；
(15)将PCR Primer Mix for MGI、HiFi Amplification Mix解冻后颠倒混匀，短暂离心收集至管底，于干净的PCR管中配制表6反应：
表6 PCR扩增反应体系
组分 体积(μl)
上步产物 20
PCR Primer Mix for MGI 5
HiFi Amplification Mix 25
Total 50
(16)使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底；
(17)执行表7PCR反应：
表7 PCR扩增反应程序
Figure BDA0004102672590000091
(18)结束后加入32.5μl的磁珠至上述的50μl PCR产物中，混合均匀；
(19)室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；
(20)放置于磁力架上静置澄清后，把上清液转移到干净的PCR管中，丢弃磁珠；
(21)加入25μl的磁珠至上述的上清中，混合均匀；
(22)室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；
(23)放置于磁力架上静置澄清后弃上清液；
(24)加入200μl的80％乙醇，静置30sec后弃上清；
(25)加入200μl的80％乙醇，静置30sec后弃上清；
(26)快速离心后用10μl的移液器弃去残余乙醇，室温放置，晾干；
(27)从磁力架上取下管子，加入20μl的无核酸酶水重悬磁珠，充分混合均匀，室温静置2min，快速离心5sec放置于磁力架上2min，取上清转移至新的PCR管中，切勿触碰磁珠。
3、DNB制备
3.1试剂准备
取出文库、TE缓冲液、DNB制备缓冲液、DNB聚合酶I混合液和DNB终止缓冲液，置于冰盒上约0.5h，待融化后，使用漩涡振荡器震荡混匀5s后，短暂离心置于冰盒上备用；
3.2制备过程
(1)pool样：取用0.2mL八连管或PCR管，在冰上配制；文库总进入量为120fmol，体系按表8配制：
表8文库pooling反应体系
组分 加入体积(μl)
文库dsDNA X
TE缓冲液 20-X
DNB制备缓冲液 20
总体积 40
(2)将反应Mix用漩涡振荡器震荡混匀，迷你离心机离心5s，置于PCR仪中反应，反应条件表9：
表9文库pooling后反应程序
温度℃ 时间(min)
热盖(105℃) On
95 3
40 3
4 Hold
(3)取出DNB聚合酶II混合液置于冰盒上，短暂离心5s，置于冰盒上备用；
(4)当PCR仪达到4℃后取出PCR管，迷你离心机离心5s后，在冰上加入如表10组份：
表10 DNA聚合酶反应体系
组分 加入体积(μl)
DNB聚合酶I混合液 40
DNB聚合酶II混合液 4
(5)反应Mix用移液器轻轻吹打混匀，迷你离心机离心5s，即刻置于PCR仪中，反应条件如表11：
表11 DNB反应程序
温度℃ 时间(min)
热盖(40℃) On
30 25
4 Hold
(6)当PCR仪温度达到4℃后立即加入20μL DNB终止缓冲液，用阔口吸头缓慢地吹打混匀5-8次，切勿震荡及剧烈吹打；
4、DNB浓度测定
DNB制备完成后，用
Figure BDA0004102672590000112
ssDNA Assay Kit仪器进行浓度检测。浓度8ng/μL以上为合格，浓度不合格的需重新制备。
5、上机测序
6、测序数据生信分析
实施例1
细胞裂解液中不同质量百分比浓度的皂苷或β辛基硫代葡萄糖苷的测试
取8管平行600μl血细胞样本，按表12进行编号，通过提取中皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷不同浓度，进行对比。按实施方法对样本进行核酸提取-文库构建-上机测序-数据分析流程，其中不同浓度配见表12。
表12单独皂苷/β辛基硫代葡萄糖苷细胞裂解液编号和配方
Figure BDA0004102672590000111
Figure BDA0004102672590000121
实验结果如表13所示，随着两种裂解液浓度提升，宿主细胞裂解效果增强，但提高至一定浓度以上，宿主细胞去除作用反而减弱。从结果来看，1.5％皂苷的去除宿主效果最佳。β辛基硫代葡萄糖苷也有一定的去除效果，但是没有皂苷那么明显。
表13单独皂苷/β辛基硫代葡萄糖苷裂解液宿主裂解效果对比
编号 总reads数 宿主reads数(占比)
1 12809321 12320005(96.18％)
2 22208874 19514938(87.87％)
3 21985476 8077464(36.74％)
4 25339591 11078469(43.72％)
5 27099319 25587177(94.42％)
6 24440377 22294512(91.22％)
7 13931522 8948217(64.23％)
8 40943086 33647028(82.18％)
实施例2
细胞裂解液中不同质量百分比浓度配比的皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷的测试
取10管平行600μl血细胞样本，按表14进行编号，通过提取中皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷不同浓度的配比，并与1.5％皂苷的结果进行对比。按实施方法对样本进行核酸提取-文库构建-上机测序-数据分析流程，其中不同浓度配比见表14。
表14不同皂苷/β辛基硫代葡萄糖苷配比的细胞裂解液编号和配方
编号 细胞裂解液终浓度配方
1 1.5％皂苷
2 0.8％皂苷+0.2％β辛基硫代葡萄糖苷
3 0.8％皂苷+0.3％β辛基硫代葡萄糖苷
4 0.8％皂苷+0.4％β辛基硫代葡萄糖苷
5 1.0％皂苷+0.2％β辛基硫代葡萄糖苷
6 1.0％皂苷+0.3％β辛基硫代葡萄糖苷
7 1.0％皂苷+0.4％β辛基硫代葡萄糖苷
8 1.5％皂苷+0.2％β辛基硫代葡萄糖苷
9 1.5％皂苷+0.3％β辛基硫代葡萄糖苷
10 1.6％皂苷+0.4％β辛基硫代葡萄糖苷
实验结果如表15所示，高浓度的裂解液裂解效果更强，对结构脆弱的微生物伤害较大，效果最好的组合是0.8％皂苷+0.2％β辛基硫代葡萄糖苷，能兼顾各种微生物的检出。
表15不同皂苷/β辛基硫代葡萄糖苷配比的裂解液宿主裂解效果对比
Figure BDA0004102672590000131
实施例3
随机选取5例临床血细胞样本，按照本发明方法进行宏基因组提取、建库和二代测序，以未去宿主处理样本的二代测序结果作为对照。结果如下表16所示。
表16去宿主方法与未去宿主的二代宏基因组测序结果对比
Figure BDA0004102672590000141
结果说明：采用本发明的去宿主流程，相比较未去宿主流程能有效富集样本中细环病毒、人类疱疹病毒1型、人疱疹病毒5型、琼氏不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎支原体、黑曲霉等各种微生物菌体，对结构脆弱病原体几乎无损伤，且整体微生物丰度提升效果明显。
结论：本发明是针对血细胞样本研发的去宿主提取试剂盒和方法，采用了低浓度的皂苷和低浓度的β辛基硫代葡萄糖苷，在保证去宿主效果较好的情况下，兼顾各种病原微生物的检出。联合使用化学法(溶菌酶和溶壁酶)和物理法(玻璃珠机械研磨)双重作用对微生物细胞进行破壁，提高了临床上病原微生物的阳性检出率，并且弥补了目前只检测血浆样本cfDNA造成病原微生物漏检的空白。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞裂解液、DNA酶、DNA酶缓冲液、蛋白酶K、溶菌酶、溶壁酶、玻璃珠和提取裂解液；
所述细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷混合溶液；
所述DNA酶为Ultra Nuclease；
所述DNA酶缓冲液包括MgCl2、Tris-HCl、BSA；
所述提取裂解液包括Tris-HCl、氯化钠、盐酸胍和SDS。
2.根据权利要求1所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒，其特征在于，细胞裂解液中皂苷的质量百分比浓度为1.6％，β辛基硫代葡萄糖苷的质量百分比浓度为0.4％。
3.根据权利要求1所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取试剂盒，其特征在于，DNA酶缓冲液的pH值为6-9，提取裂解液的pH值为6-7。
4.一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.宿主裂解：在样本管中加入细胞裂解液，室温颠倒混匀，离心后去除上清液；
S2.宿主核酸去除：往样本管中加入DNA酶缓冲液和DNA酶，混匀孵育；加入蛋白酶K，充分混匀后孵育，反应结束后离心弃掉上清，无需PBS清洗；
S3.微生物菌体破壁：加入溶菌酶和溶壁酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的离心管中，孵育，涡旋混匀处理；
S4.微生物核酸提取：离心管离心后加入提取裂解液和蛋白酶K，涡旋混匀后孵育；高速离心后，转移全部上清至一新的离心管中，加入无水乙醇，上下颠倒混匀后，溶液全部转移至已装入收集管的吸附柱中，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入清洗液Buffer WS1，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入清洗液Buffer WS2，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，离心，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入新的离心管中，向吸附柱中加入无核酸酶水，室温放置，离心，收集DNA溶液于-20℃条件下保存。
5.根据权利要求4所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述样本类型为血细胞。
6.根据权利要求4所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述细胞裂解液为皂苷和β辛基硫代葡萄糖苷溶液；所述DNA酶为Ultra Nuclease；所述DNA酶缓冲液包括MgCl2、Tris-HCl、BSA；所述提取裂解液包括Tris-HCl、氯化钠、盐酸胍和SDS。
7.根据权利要求4所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述皂苷的终浓度为0.8％，β辛基硫代葡萄糖苷的终浓度为0.2％。
8.根据权利要求4所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述Ultra Nuclease的终浓度为2-5U/μL，DNA酶缓冲液中各成分的终浓度分别为MgCl2 1-10mM，Tris-HCl 10-50mM，BSA0.1-0.5mg/ml。
9.根据权利要求4所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述溶菌酶的终浓度为5-20mg/ml，溶壁酶的终浓度为0.1-0.5U/μL。
10.根据权利要求4所述的一种血细胞病原微生物去宿主核酸提取方法，其特征在于，所述提取裂解液中各成分的终浓度分别为Tris-HCl 40-100mM、氯化钠100-500mM、盐酸胍2-4M和SDS 0.5％-2％质量百分比。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590283A (zh) * 2023-07-17 2023-08-15 北京微岩医疗器械有限公司 一种细胞结合增强剂和去除人源游离核酸的方法
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