CN117802086A - 一种核酸提取试剂盒以及核酸提取方法 - Google Patents

一种核酸提取试剂盒以及核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸提取试剂盒以及核酸提取方法，涉及核酸提取技术领域。核酸提取试剂组合包括：裂解液、第一漂洗液和第二漂洗液。本发明提供的核酸提取试剂组合用于核酸提取洗脱时，可以提高核酸的产率、纯度，提高核酸的提取洗脱效率。本发明提供的试剂组合用于核酸提取时，具有操作简便、快速、成本低廉的技术优势，并且易于开发为自动化检测系统，便于对大量样品进行高通量筛检。

Description

一种核酸提取试剂盒以及核酸提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体而言，涉及一种核酸提取试剂盒以及核酸提取方法。
背景技术
分子检测技术(包括荧光定量PCR技术、NGS技术、等温扩增技术等)在新冠防治领域起到了举足轻重的作用。随着新冠病毒对世界的影响，分子检测技术逐渐被大众熟悉，并在更多检测领域中得到应用。而核酸提取工作是分子检测的基础性技术，核酸提取质量的优劣和效率，直接影响到分子检测的性能，甚至直接影响分子检测的结果。
到目前为止，主流的核酸提取技术主要包括两种类型技术：一个是“离心柱+胍盐”核酸提取技术，另一个是“磁珠法+胍盐”核酸提取技术。前者由于要使用离心柱配套高通量自动化离心设备，导致成本过高，因此普及程度不如后者。但是，尽管离心柱法和磁珠法使用的纯化介质有差异，但是试剂的组成和核酸提取原理是一样的。其基本原理是胍盐作为细胞裂解液和离液盐的前提下，首先将组织或细胞进行裂解，将核酸分子从细胞中游离出来。然后在离液盐的作用下，核酸分子(DNA&RNA)会由线性压缩成球状，暴露出核酸骨架上的负电基团与反应体系中的阳离子连接。然后在磁珠外层负电基团的作用下，形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，使核酸分子被特异性地吸附到磁珠或者离心柱介质上。而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。然后再通过多个漂洗步骤将介质上的蛋白、多糖、盐等物质除净。最后再用洗脱液将结合到磁珠或者离心柱的核酸洗脱下来，这个过程就是我们常规的核酸提取制备过程。
但是，现有依托胍盐作为细胞裂解液和离液盐构建的核酸提取试剂体系中，DNA核酸提取回收效率比较低，而RNA提取效率高。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸提取试剂盒以及核酸提取方法，进而解决胍盐存在的核酸提取效率问题。
基于胍盐存在的核酸提取效率问题，发明人研究发现：主要是因为在胍盐作为细胞裂解液和离液盐条件下，DNA核酸，与磁珠结合形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构非常稳定。采用常规高pH或物理加热的方式，很难将结合到磁珠上的DNA核酸有效洗脱下来，存在核酸洗脱效率低的问题。只有采用碱或者酸的化学洗脱方法，才能有效将盐桥打开，并有效地洗脱下来。而采用碱或者酸的化学洗脱下来的核酸，又不能与后续分子检测技术进行结合。因此，采用常规胍盐作为细胞裂解液和离液盐的核酸提取试剂盒，在分子高敏检测领域(比如乙肝、丙肝、艾滋病等传染病检测领域)，往往由于核酸产率低、纯度低，影响病原微生物的高敏检测要求。为解决依托胍盐构建的核酸提取试剂体系的弊端，本发明尿素和碘化钾构建双盐核酸提取体系的新架构，进而解决胍盐存在的核酸提取效率问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种核酸提取试剂组合，其包括：裂解液、第一漂洗液和第二漂洗液；裂解液包括3-5M尿素、3-5M碘化钾、1-10mM Tris-HCl(pH＝8.5-8.8)、1-10mMEDTA、体积百分比为0.5-2.0％的Triton X-100和体积百分比为5-20％的异丙醇；
第一漂洗液包括：3-5M尿素、异硫氰酸胍、1-10mM Tris-HCl(pH＝6.3-6.8)、1-10mM EDTA、体积百分比为0.1-0.5％的Triton X-100和体积百分比为20-40％的异丙醇；
第二漂洗液包括：0.1-0.3mol/L氯化钠，1-10mM Tris-HCl(pH＝7.0-7.5)，60-80％乙醇。
为了彻底解决核酸提取洗脱的难题，保证分子检测的灵敏度和可靠性。本发明创新性的提出了“尿素+碘化钾”双盐法核酸提取技术方法，由高浓度尿素发挥细胞裂解和蛋白变性的功能，将核酸从细胞中释放出来。由高浓度碘化钾为磁珠和核酸结合，提供离液盐环境。第一漂洗液采用中等浓度尿素和胍盐搭配的方式，以对磁珠进行第一次洗涤以清洗蛋白。再次，第二漂洗液采用低浓度中性盐，完成二次洗涤，具有清洗盐的功能；选择氯化钠作为第二漂洗液的中性盐，具有更好的洗涤盐的效果。最后进行洗脱。本发明提供的核酸提取试剂组合用于核酸提取洗脱时，可以提高核酸的产率、纯度，提高核酸的提取洗脱效率。
本发明为解决经典胍盐法存在的技术问题，奠定了理论和实践基础。从而为实现真正的核酸高敏检测技术，特别是DNA相关方面的高敏技术研究，提供新的方法学支持。该发明适用于医学、遗传学、检验检疫学等多个领域的核酸定性和定量检测。
本发明在解决DNA核酸提取洗脱问题的同时，不影响RNA核酸的得率和洗脱效率。
上述试剂组合中的组分比较简单，无需添加胍盐这种强烈蛋白变性剂，试剂对于操作人员化学伤害程度低，试剂安全可靠。
本发明提供的试剂组合用于核酸提取时，具有操作简便、快速、成本低廉的技术优势，并且易于开发为自动化检测系统，便于对大量样品进行高通量筛检。适用于检测的样品包括不限于：植物、动物、人体组织、微生物，以及人和动物的血液、精液、唾液等样本。是一种新型的核酸提取检测试剂和技术方法。
在一种可选的实施方式中，裂解液包括3M、4M或5M的尿素。在一种可选的实施方式中，裂解液包括3M、4M或5M的碘化钾，在一种可选的实施方式中，裂解液包括1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM Tris-HCl，在一种可选的实施方式中，裂解液包括1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM EDTA，在一种可选的实施方式中，裂解液包括体积百分比为0.5％、1％、1.5％或2.0％的Triton X-100，在一种可选的实施方式中，裂解液包括体积百分比为5％、8％、10％、12％、15％或20％的异丙醇。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一漂洗液中的Tris-HCl的pH为6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8。上述第二漂洗液中的Tris-HCl的pH为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述裂解液的pH为8.5；
第一漂洗液的pH为6.3-6.8，第二漂洗液的pH为7.0-7.5。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述裂解液的溶剂为水；第一漂洗液和第二漂洗液的溶剂为水。
上述核酸提取试剂组合中，裂解液、第一漂洗液和第二漂洗液的形态为液体、固体或半固体。
第二方面，本发明还提供了一种核酸提取试剂盒，其包括上述的核酸提取试剂组合。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取试剂盒还包括核酸助沉剂。
在一种可选的实施方式中，核酸助沉剂选自多聚糖、核酸混合物和线性化丙烯酰胺中的至少一种。
核酸助沉剂，Carrier RNA,中文名载体RNA。在核酸提取环节,提取使用到的离心管壁多是聚丙烯的材料,管壁上有静电,会吸附核酸。在提取纯化过程中采用Carrier RNA可帮助核酸去除静电效应,保证核酸能很好被吸附到纯化柱上，提高洗脱效率，从而达到尽可能多的回收样本中核酸。
多聚糖如选自糖原，作用原理：RNA在高盐、无水乙醇环境中溶解度很低，通过高速离心可发生沉淀。当RNA浓度很低时，微量RNA不足以形成沉淀。在上述环境条件下，糖原也不可溶并可与RNA共沉淀，形成可视化沉淀。
线性化丙烯酰胺，作用原理：减少吸附损失。
在一种可选的实施方式中，核酸混合物选自PolyA钾盐、大肠杆菌总RNA、酵母总RNA和tRNA中的至少一种。可以减少吸附损失，进而提高微量的核酸纯化柱上的结合和洗脱效率。同时降低了提取环境中的RNase降解微量RNA的概率。
在一种可选的实施方式中，核酸助沉剂选自1-5mg/mL线性丙烯酰胺或者1-10μg/ml tRNA。
在一种可选的实施方式中，核酸助沉剂选自1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL线性丙烯酰胺。
在一种可选的实施方式中，核酸助沉剂选自1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml或10μg/ml tRNA。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取试剂盒还包括洗脱液；
在一种可选的实施方式中，洗脱液选自水或10mM Tris-HCl(pH＝8.5)。在其他实施方式中，洗脱液也可以是高pH的缓冲液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取试剂盒还包括磁性固相载体液；磁性固相载体为：聚苯乙烯磁珠、琼脂糖磁珠、二氧化硅磁珠、MOF金磁珠、MOF汞磁珠或MOF铅磁珠。
在一种可选的实施方式中，磁性固相载体的表面修饰有活性基团。
在一种可选的实施方式中，活性基团选自氧化硅羟基、羧基或活化羧基、醛基、氨基、巯基、甲苯磺酸基或环氧基；或，活性基团为链霉亲和素、生物素或吡啶二硫化物。
在一种可选的实施方式中，磁性固相载体液中磁性固相载体的浓度为10～40mg/ml。
在一种可选的实施方式中，磁性固相载体液中磁性固相载体的浓度为10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml或40mg/ml。
在一种可选的实施方式中，磁性固相载体液中磁性固相载体的直径为0.1-1μm。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取试剂盒还包括蛋白酶K。
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH范围(4-12.5)内及高温(50-70℃)均有活性，用于质粒或基因组DNA、RNA的分离。在DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中，随后使用不同的方法对蛋白进行抽提，除去杂质，收集DNA。
第三方面，本发明还提供了一种核酸提取方法，其包括如下步骤：
裂解：采用上述的核酸提取试剂组合或上述的核酸提取试剂盒中的裂解液、磁性固相载体液与核酸待提取样本混合，温育后，离心，经磁吸附处理，弃上清；
漂洗：采用第一漂洗液和第二漂洗液依次对提取容器内的提取物进行漂洗；
漂洗后进行洗脱。
上述核酸提取方法简单易行，采用该方法提取获得的核酸纯度高、收率高、提取洗脱效率高。
在本发明应用较佳的实施方式中，裂解步骤中的温育是在60-75℃温浴5-20分钟。
例如在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、68℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃温浴5-20分钟。在上述条件下，有助于核酸更好地从细胞中释放出来，在碘化钾等离液盐的作用下，核酸分子(DNA&RNA)会由线性压缩成球状，暴露出核酸骨架上的负电基团与反应体系中的阳离子连接。然后在磁珠外层负电基团的作用下，形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，使核酸分子被特异性地吸附到磁珠或者离心柱介质上。而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。然后再通过多个漂洗步骤将介质上的蛋白、多糖、盐等物质除净。最后再用洗脱液将结合到磁珠或者离心柱的核酸洗脱下来。
在一种可选的实施方式中，漂洗的条件为：将待漂洗的提取物与第一漂洗液混合，混匀，离心，进行磁吸附；弃上清后与第二漂洗液混合，混匀，离心，进行磁吸附；弃上清后用于洗脱。
在一种可选的实施方式中，洗脱的条件为：将洗脱液与待洗脱物混合，混匀后室温静置。
第四方面，本发明还提供了核酸提取试剂组合或核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明创新性的提出了“尿素+碘化钾”双盐法核酸提取技术方法，由高浓度尿素发挥细胞裂解和蛋白变性的功能，将核酸从细胞中释放出来。由高浓度碘化钾为磁珠和核酸结合，提供离液盐环境。第一漂洗液采用中等浓度尿素和胍盐搭配的方式，以对磁珠进行第一次洗涤以清洗蛋白。再次，第二漂洗液采用低浓度中性盐，完成二次洗涤，具有清洗盐的功能；选择氯化钠作为第二漂洗液的中性盐，具有更好的洗涤盐的效果。最后进行洗脱。本发明提供的核酸提取试剂组合用于核酸提取洗脱时，可以提高核酸的产率、纯度，提高核酸的提取洗脱效率。
本发明为解决经典胍盐法存在的技术问题，奠定了理论和实践基础。从而为实现真正的核酸高敏检测技术，特别是DNA相关方面的高敏技术研究，提供新的方法学支持。该发明适用于医学、遗传学、检验检疫学等多个领域的核酸定性和定量检测。
本发明在解决DNA核酸提取洗脱问题的同时，不影响RNA核酸的得率和洗脱效率。
本发明提供的核酸提取试剂组合中的组分比较简单，无需添加胍盐这种强烈蛋白变性剂，试剂对于操作人员化学伤害程度低，试剂安全可靠。
本发明提供的试剂组合用于核酸提取时，具有操作简便、快速、成本低廉的技术优势，并且易于开发为自动化检测系统，便于对大量样品进行高通量筛检。适用于检测的样品包括不限于：植物、动物、人体组织、微生物，以及人和动物的血液、精液、唾液等样本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明和对照试剂提取HBV核酸的扩增比对图；
图2为本发明HBV样本重复性测试结果扩增图；
图3为本发明HBV灵敏度样本测试结果扩增图；
图4为本发明和对照试剂提取HCV核酸样本的扩增比对图；
图5为本发明HCV样本重复性检测结果图；
图6为本发明HCV灵敏度样本测试结果扩增图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种HBV DNA的核酸提取试剂盒以及提取方法。
核酸提取试剂盒包括核酸提取试剂组合、核酸助沉剂、洗脱液、磁性固相载体液(即为磁珠悬液)。
核酸提取试剂组合包括：裂解液、漂洗液A(即为第一漂洗液)和洗液B(即为第二漂洗液)。
裂解液、磁珠悬液、漂洗液，洗脱液各组成如下：
裂解液具体组成为：3M尿素、3.5M碘化钾、10mM Tris-HCl(pH＝8.5)、2mM EDTA、体积百分比为2.0％的Triton X-100和体积百分比为20％的异丙醇；
第一漂洗液组成为：3M尿素、3.5M异硫氰酸胍、10mM Tris-HCl(pH＝6.6)、2mMEDTA、体积百分比为0.5％的Triton X-100和体积百分比为40％的异丙醇；
第二漂洗液组成为：0.25mol/L氯化钠，2mM Tris-HCl(pH＝7.5)，70％乙醇。
磁珠悬液为含有20mg/ml硅羟基磁珠。
洗脱液为无菌水
核酸助沉剂选自：线性丙烯酰胺，浓度为5mg/ml。
核酸提取方法如下：
(1)裂解：取适量1.5mL离心管，每管中加入400μL裂解液、200μL待测样本和10μL磁珠悬液和20μL蛋白酶K，震荡混匀10秒钟后，65℃温浴10分钟，瞬时离心，将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液；
(2)加入漂洗液A(即为第一漂洗液)600μL，震荡混匀10秒钟后，瞬时离心，然后磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
(3)加入漂洗液B(即为第二漂洗液)600μL，震荡混匀10秒钟后，瞬时离心，然后磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
(4)洗脱：加入洗脱液60μL，震荡混匀10秒钟，室温静止2分钟；将离心管置于磁力架上约2分钟，上清即为核酸，建议立即使用，若暂不使用，则要保存在-20±5℃条件下。
待测试样本为中检院“乙型肝炎病毒核酸国家标准品”。HBV病毒浓度为1.0X108IU/ml。
实施例2
本实施例提供了一种HCV RNA的核酸提取试剂盒以及提取方法。
核酸提取试剂盒包括核酸提取试剂组合、核酸助沉剂、洗脱液、磁性固相载体液(即为磁珠悬液)。
裂解液具体组成为：3M尿素、3.5M碘化钾、10mM Tris-HCl(pH＝8.5)、2mM EDTA、体积百分比为2.0％的Triton X-100和体积百分比为20％的异丙醇；
第一漂洗液组成为：3M尿素、3.5M异硫氰酸胍、10mM Tris-HCl(pH＝6.6)、2mMEDTA、体积百分比为0.5％的Triton X-100和体积百分比为40％的异丙醇；
第二漂洗液组成为：0.25mol/L氯化钠，2mM Tris-HCl(pH＝7.5)，70％乙醇。
磁珠悬液为含有20mg/ml硅羟基磁珠。
洗脱液为无菌水
核酸助沉剂选自：线性丙烯酰胺，浓度为5mg/ml。
核酸提取方法如下：
(1)裂解：取适量1.5mL离心管，每管中加入400μL裂解液、200μL待测样本和10μL磁珠悬液，20μL蛋白酶K和2μl线性丙烯酰胺，震荡混匀10秒钟后，65℃温浴10分钟，瞬时离心，将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液；
(2)漂洗：加入漂洗液A600μL，震荡混匀10秒钟后，瞬时离心，然后磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
加入漂洗液B 600μL，震荡混匀10秒钟后，瞬时离心，然后磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
(3)洗脱：加入洗脱液60μL，震荡混匀10秒钟，室温静止2分钟；将离心管置于磁力架上约2分钟，上清即为核酸，建议立即使用，若暂不使用，则要保存在-20±5℃条件下。
待测试样本为中检院“丙型肝炎病毒核酸国家参考品”。HCV病毒浓度为3.0X106IU/ml。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于，对照提取试剂盒为达安基因生产的“核酸提取或纯化试剂盒”产品，该产品为胍盐法核酸提取试剂类型。产品货号：DA0623。
对照试剂盒提取流程如下：
(1)取适量1.5mL离心管，每管中加入500μL裂解液、200μL待测样本和10μL磁珠悬液和20μl蛋白酶K，震荡混匀10秒钟后，72℃温浴10分钟，瞬时离心，将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液；
(2)加入漂洗液A500μL，震荡混匀10秒钟后，瞬时离心，然后磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
(3)加入漂洗液B 600μL，震荡混匀10秒钟后，瞬时离心，然后磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液；
(4)加入洗脱液60μL，震荡混匀10秒钟，然后72℃温育2分钟；将离心管置于磁力架上约2分钟，上清即为核酸，建议立即使用，若暂不使用，则要保存在-20±5℃条件下。
对比例2
与实施例2相比，区别仅在于，对照提取试剂盒为东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂盒”产品，该产品为胍盐法核酸提取试剂类型。产品货号：DYSW：ET001。
实验例1
将中检院“乙型肝炎病毒核酸国家标准品”按照如下方法进行稀释，按照对比例1和实施例1提供的核酸提取方法进行核酸提取，采用达安基因生产的“乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)”产品(货号：DA0126)进行核酸检测。
乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒的荧光定量检测核酸的方法如下：
PCR扩增体系配制表1：
组分 HBV反应液A HBV反应液B HBV反应液C 总体积
用量 2μl 3μl 15μl 20μl
表.1HBV PCR反应配置表
将各组分充分混合，混合好后之后将20μl扩增体系分装到PCR管中。然后，吸取上述提取样本40μl加入到PCR反应液中。
以ABI7500为例，扩增程序设置如表2：
表2HBV PCR反应程序设置表
(1)国家标准品定量测试
首先，用血清将中检院“乙型肝炎病毒核酸国家标准品”进行稀释，稀释浓度分别为1.0X104IU/ml，1.0X103IU/ml，1.0X102IU/ml，分别标记为L1-L3。然后，采用实施例1和对比例1的方法分别进行核酸提取纯化，然后用达安基因生产的“乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)”进行检测。
检测结果如图1。最后分析两种方法学检测国家标准品的定量检测值的差异。实验结果如表3，实施例1与对比例1相比，DNA核酸提取效率要高接近40-50％左右。
表3本发明和对照试剂的HBV样本扩增比对结果
(2)样本的重复性测试
首先，用血清将中检院“乙型肝炎病毒核酸国家标准品”进行稀释，稀释浓度分别为5.0X104IU/ml，5.0X103IU/ml，5.0X102IU/ml，分别标记为R1-R3。然后，用实施例1和对比例1的方法分别提取R1-R3样本，每个样本重复测试三次(检测1、检测2和检测3)，结果如图2和表4所示。CT值的变异系数分别为0.093％，0.586％，0.395％，变异系数均控制在1％以内，表明运用实施例1的方法检测HBV血清样本的重复性很好。
样品 检测1(Ct) 检测2(Ct) 检测3(Ct) CT值的变异系数CV％
R1 27.14 27.12 27.17 0.093
R2 30.48 30.37 30.72 0.586
R3 33.82 33.74 33.56 0.395
表4HBV样本重复性测试结果
(3)灵敏度样本测试
以中检院“乙型肝炎病毒核酸国家标准品”为初始样本，用血清将其稀释到10IU/ml制备成为灵敏度血清样本，样本重复测试20次，结果如图3。采用实施例1提供的核酸提取方法进行核酸提取，结果显示10IU/m灵敏度样本的阳性检出率为100％。表明本发明的DNA核酸提取效率能够满足临床诊断的使用。
实验例2
将中检院“乙型肝炎病毒核酸国家标准品”按照如下方法进行稀释，按照对比例2和实施例2提供的核酸提取方法进行核酸提取，采用达安基因生产的“丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)”产品【DA0621】进行核酸检测。
丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒的荧光定量检测核酸的方法如下：
PCR扩增体系配制如表5：
组分 酶mix HCV反应液 总体积
用量 1.5μl 28.5μl 30μl
表.5HCV PCR反应配置表
将各组分充分混合，混合好后之后将30μl扩增体系分装到PCR管中。然后，吸取上述提取样本20μl加入到PCR反应液中。
以ABI7500为例，扩增程序设置如表6：
表6HCV PCR反应程序设置表
(1)国家标准品定量测试
首先，用血清将中检院“丙型肝炎病毒核酸国家参考品”进行稀释，稀释浓度分别为2.5X105IU/ml，2.5X104IU/ml，2.5X103IU/ml，分别标记为L1-L3。然后，采用实施例2和对比例2的方法分别进行核酸提取纯化，采用东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(荧光探针法)”产品进行检测。
检测结果如图4。最后分析两种方法学检测国家标准品的定量检测值的差异。实验结果如表7，实施例2与对比例2相比，RNA核酸提取效率非常接近，两个方法学的偏差处于±5％区间。
样品 本发明检测值 对照产品检测值 核酸提取效率提高比例(100％-对照/本发明)
L1 2.46X105IU/ml 2.39X105IU/ml +2.85％
L2 2.52X104IU/ml 2.42X104IU/ml +3.96％
L3 2.48X103IU/ml 2.57X103IU/ml -3.63％
表.7本发明和对照试剂的HCV样本扩增比对结果
(2)样本的重复性测试
以本实验例上述步骤(1)中的L1-L3为测试样本。使用实施例2的方法提取核酸，每个样本重复测试三次，检测结果如图5和表8所示。CT值的变异系数分别为0.26％，0.469％，0.779％，变异系数均控制在1％以内，表明运用本发明方法检测HCV血清样本的重复性很好。
样品 检测1(Ct) 检测2(Ct) 检测3(Ct) CT值的变异系数CV％
L1 26.08 26.21 26.11 0.260
L2 29.27 29.53 29.48 0.469
L3 32.59 32.92 32.42 0.779
表8本发明HCV样本重复性测试结果
(3)灵敏度样本测试
以中检院“丙型肝炎病毒核酸国家参考品”为初始样本，用血清将其稀释到20IU/ml制备成为灵敏度血清样本，样本重复测试20次，采用实施例2提供的核酸提取方法进行核酸提取，结果如图6。本发明20IU/m灵敏度样本的阳性检出率为100％。表明本发明的RNA核酸提取效率能够满足临床诊断的使用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸提取试剂组合，其特征在于，其包括：裂解液、第一漂洗液和第二漂洗液；所述裂解液包括3-5M尿素、3-5M碘化钾、1-10mM Tris-HCl(pH＝8.5-8.8)、1-10mM EDTA、体积百分比为0.5-2.0％的Triton X-100和体积百分比为5-20％的异丙醇；
所述第一漂洗液包括：3-5M尿素、异硫氰酸胍、1-10mM Tris-HCl(pH＝6.3-6.8)、1-10mM EDTA、体积百分比为0.1-0.5％的Triton X-100和体积百分比为20-40％的异丙醇；
所述第二漂洗液包括：0.1-0.3mol/L氯化钠，1-10mM Tris-HCl(pH＝7.0-7.5)，60-80％乙醇。
2.根据权利要求1所述的核酸提取试剂组合，其特征在于，所述裂解液的pH为8.5；所述第一漂洗液的pH为6.3-6.8；第二漂洗液的pH为7.0-7.5。
3.根据权利要求1或2所述的核酸提取试剂组合，其特征在于，所述裂解液的溶剂为水；所述第一漂洗液和所述第二漂洗液的溶剂为水。
4.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的核酸提取试剂组合。
5.根据权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括核酸助沉剂；
优选地，所述核酸助沉剂选自多聚糖、核酸混合物和线性化丙烯酰胺中的至少一种；
优选地，所述核酸混合物选自PolyA钾盐、大肠杆菌总RNA、酵母总RNA和tRNA中的至少一种；
优选地，所述核酸助沉剂选自1-5mg/mL线性丙烯酰胺或者1-10μg/ml tRNA。
6.根据权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括洗脱液；
优选地，所述洗脱液为水或10mM Tris-HCl(pH＝8.5)。
7.根据权利要求5或6所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括磁性固相载体液；所述磁性固相载体为：聚苯乙烯磁珠、琼脂糖磁珠、二氧化硅磁珠、MOF金磁珠、MOF汞磁珠或MOF铅磁珠；
优选地，所述磁性固相载体的表面修饰有活性基团；
优选地，所述活性基团选自氧化硅羟基、羧基或活化羧基、醛基、氨基、巯基、甲苯磺酸基或环氧基；或，所述活性基团为链霉亲和素、生物素或吡啶二硫化物；
优选地，所述磁性固相载体液中磁性固相载体的浓度为10～40mg/ml；
优选地，所述磁性固相载体液中磁性固相载体的直径为0.1-1μm。
8.根据权利要求5或6所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括蛋白酶K。
9.一种核酸提取方法，其特征在于，其包括如下步骤：
裂解：采用权利要求1-3任一项所述的核酸提取试剂组合或权利要求4-8任一项所述的核酸提取试剂盒中的裂解液、磁性固相载体液与核酸待提取样本混合，温育后，离心，经磁吸附处理，弃上清；
漂洗：采用所述第一漂洗液和第二漂洗液依次对提取容器内的提取物进行漂洗；
漂洗后进行洗脱；
优选地，所述裂解步骤中的温育是在60-75℃温浴5-20分钟；
优选地，所述漂洗的条件为：将待漂洗的提取物与所述第一漂洗液混合，混匀，离心，进行磁吸附；弃上清后与所述第二漂洗液混合，混匀，离心，进行磁吸附；弃上清后用于洗脱；
优选地，所述洗脱的条件为：将洗脱液与待洗脱物混合，混匀后室温静置。
10.如权利要求1-3任一项所述的核酸提取试剂组合或权利要求4-8任一项所述的核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用。
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