CN112813137A - 一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，属于分子生物学、体外分子诊断技术领域，所述方法包括如下步骤：(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置5‑30分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.02‑1.7％；(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀；(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含10‑200个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；(4)将核酸酶灭活；(5)富集目标微生物2。可以检测出浓度低至约2.0CFU/mL的致病菌，满足对诸如血流感染等感染性疾病的临床诊断要求；本发明所使用的试剂和设备少，成本低，工艺简单，应用范围广泛。

Description

一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学、体外分子诊断技术领域，具体涉及一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法。
背景技术
致病微生物如细菌、支原体、衣原体、立克次氏体及螺旋体是导致感染以及传染疾病的主要致病因素，其通过接触或其他媒介进入人体，引起疾病的发生。在感染疾病发展的过程中，部分病原体通过各种途径可进入患者血液循环，或出现在不同类型的体液之中如脑脊液、体内器官的积液、脓液等，或出现在通过医学手段刻意获得的器官灌洗液如支气管肺泡灌洗液之中。因此，从这些不同来源获取的液体生物样本成为了诊断存在于体内的感染病原体的有效途径。
然而，能够进入上述各类生物液体之中的病原体数量通常很少，尤其是在疾病发展的初期。例如，在血液感染的患者中，血液样本中致病菌浓度可能仅为每毫升样品含1-5个集落形成单位(CFU)。同时，血液样本中含有大量的宿主细胞及细胞碎片如红细胞、白细胞、血小板等，其中白细胞数量可超过每毫升4,000,000个。
通过检测病原体的核酸而达到诊断样本中病原体的存在，分子生物学诊断技术能够快速、灵敏和特异地检测存在于液体生物样本中的病原微生物。当前流行的方法是，首先裂解液体生物样本中所有的细胞包括宿主细胞及目标致病微生物，而后提取样本中的总核酸用于分子诊断。但液体生物样本如血液中存在大量的宿主细胞及其碎片和释放的游离核酸，加之作为检测目标的病原微生物数量稀少，使得分子生物学方法诊断导致诸如血液感染之类疾病的致病微生物变得十分困难。具体原因包括：
第一，样本中宿主细胞裂解时释放的高浓度的宿主核酸会竞争核酸捕获材料，影响病原微生物核酸的提取效率。
第二，高浓度的宿主核酸在目标病原微生物核酸序列的扩增反应(PCR反应)过程中会竞争反应的引物、酶等试剂，可能导致大量非特异性扩增产物的生成，抑制目标病原微生物核酸序列的扩增。
第三，在使用高通量测序(NGS)方法检测目标病原微生物时，高浓度的宿主核酸会导致宿主核酸序列占据大部分的测序数据，从而挤占并压缩目标病原微生物核酸序列的测序数据量，降低检测的灵敏度和准确性。由于上述原因，目前可获得的分离和检测生物样本中目标微生物的方法和试剂盒大多不适用于液体生物样本，因此，目前的检验医学领域对适用于分离和鉴定大体积液体生物样本中极微量致病微生物的方法及试剂盒存在强烈需求。
发明内容
针对上述现有的可获得的分离和检测生物样本中目标微生物的方法和试剂盒大多不适用于液体生物样本的缺陷，本发明提供一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法。
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置5-30分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.02-1.7％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含10-200个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；
(4)将核酸酶灭活；
(5)富集目标微生物2。
所述液体生物样品包括细胞壁结构完整的目标微生物和非目标成分，所述非目标成分包括样品中游离的核酸、不含有细胞壁结构的细胞和含有核酸的细胞碎片。
本申请的技术方案中：首先皂苷对液体生物样本中的宿主细胞进行了裂解，得到混合物，经高速离心得到第一沉淀，在加核酸酶消化，之后对核酸酶灭活，富集得到目标微生物2。
本申请中，一方面，皂苷在裂解液体生物样本中的宿主细胞时使用的有效终浓度为0.02％-1.7％之间，并且，当皂苷终浓度大于1.7％时，目标微生物核酸的提取收益将剧烈下降，甚至达到检测不到的程度，另一方面，对所用的核酸酶灭活去除。
本发明的方法可以检测出浓度低至约2.0CFU/mL的致病菌，满足对诸如血流感染等感染性疾病的临床诊断要求。
本发明所使用的试剂和设备少，成本低，工艺简单，应用范围广泛。
优选的，所述核酸酶包括DNA消化酶和/或RNA消化酶。
优选的，步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，之后进行步骤(4)。
更为优选的，生物缓冲液包括PBS、TE、TBE、TAE、Tris-glycine缓冲液中的一种。
优选的，步骤(1)中混合物中皂苷的终浓度为0.02-1.0％。
更为优选的，步骤(1)中混合物中皂苷的终浓度为0.04-0.85％。
优选的，步骤(2)中离心的转速为4000–10000rpm，时间为20-30分钟。
优选的，步骤(3)中核酸酶包含50-150个酶单位。
优选的，重复步骤(3)至少一次。
更为优选的，重复步骤(3)2次。2次使用核酸酶处理样本，此流程大大减少消化宿主核酸所需核酸酶的数量及反应所耗时间，最大限度地保护样本中的目标微生物，并获得良好的目标微生物核酸提取收益。
优选的，步骤(2)得到的第一沉淀与核酸酶反应液及核酸酶混匀后，置于37℃下反应30分钟，之后于12000rpm离心5分钟，弃去上清液，得到第二沉淀；
向第二沉淀中加入核酸酶反应液及核酸酶，混合均匀后，置于37℃下反应30分钟，之后加入100mM EDTA 25-100μL，混匀后40-80℃下保持2-15分钟，之后于12000rpm离心5分钟，弃去上清，得到第三沉淀。
第三沉淀中包含有本发明方法处理的液体生物样本中的部分或全部目标微生物，可用于进一步检测和/或定量液体生物样本中的目标微生物，检测和/或定量的方法包括但不限于多聚酶链式反应(PCR)、反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)反应、基于核酸杂交的反应如DNA芯片杂交等、DNA测序、微生物培养鉴定。
更为优选的，重复步骤(3)3次。
优选的，步骤(4)中核酸酶灭活的方法包括添加EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或DEPC和/或胍。
优选的，步骤(4)中核酸酶灭活的方法为温度升高到40-80℃并保持2-15分钟。
更为优选的，步骤(4)中核酸酶灭活的方法为温度升高到60℃并保持10分钟
所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
本申请的技术方案中：
PBS：Phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液；
TE：Tris-HCl-EDTA；
TBE：Tris-borate-EDTA；
TAE：Tris-acetate-EDTA；
EDTA：乙二胺四乙酸；
EGTA：乙二醇双四乙酸；
DTT：二硫苏糖醇；
DEPC：焦炭酸二乙酯；
CFU代表集落形成单位；
宿主：液体生物样本来源的生物个体，尤其是人类；
宿主细胞：为液体生物样本中包含的产生于宿主的细胞；
宿主细胞核酸或宿主核酸对应于上述宿主细胞或其碎片中包含的核酸(DNA和RNA)；
目标微生物：包括不含容易裂解的胆固醇外膜的所有微生物，其可能是致病性的，尤其是对人类，这些微生物包括病毒(除包膜病毒外)、细菌、真菌、衣原体、支原体、立克次体，并且还包括显微镜可见的其他动物；
目标微生物核酸对应于上述目标微生物的细胞或颗粒中包含的核酸(DNA和RNA)；
液体生物样品为包含目标微生物的液体样品，选自：羊水、房水、胆汁、血液、乳腺分泌物、支气管肺灌洗液、脑脊液、乳糜、食糜、粪便、组织液、淋巴、月经液、黏液、血浆、胸膜液、胸腹水、脓、唾液、皮脂、精子、血清、痰液、汗、滑液、泪、尿液和玻璃体液。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明组合使用不同的化学试剂以达到从小(1mL)至大体积(5mL)的液体生物样本如血液中去除液体生物样本中的宿主核酸，使得使用分子生物学方法鉴定样本中极少量的目标微生物成为可能，例如，检测出含量低至2.0CFU/mL的细菌；
(2)皂苷在裂解液体生物样本中的宿主细胞时使用的有效终浓度为0.02％-1.7％之间，并且，当皂苷终浓度大于1.7％时，目标微生物核酸的提取收益将剧烈下降，甚至达到检测不到的程度；
(3)本发明确定皂苷在其与液体生物样本形成的混合液中优选的终浓度不宜超过0.85％，否则目标微生物核酸提取的收益会下降；
(4)本发明的方法可以检测出浓度低至约2.0CFU/mL的致病菌，满足对诸如血流感染等感染性疾病的临床诊断要求；
(5)本发明所使用的试剂和设备少，成本低，工艺简单，应用范围广泛；
(6)2次使用核酸酶处理样本，此流程大大减少消化宿主核酸所需核酸酶的数量及反应所耗时间，最大限度地保护样本中的目标微生物，并获得良好的目标微生物核酸提取收益；
(7)第三沉淀中包含有本发明方法处理的液体生物样本中的部分或全部目标微生物，可用于进一步检测和/或定量液体生物样本中的目标微生物，检测和/或定量的方法包括但不限于多聚酶链式反应(PCR)、反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)反应、基于核酸杂交的反应如DNA芯片杂交等、DNA测序、微生物培养鉴定；
(8)本发明的方法还可以应用于在制备诊断试剂盒中。
附图说明
图1是试验例1中皂苷浓度对细菌回收效率的影响；
图2是试验例2中不同数量的细菌的回收情况；
图3是试验例3中不同数量的细菌的回收情况。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置5分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为1.7％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀，离心的转速为4000rpm，时间为30分钟；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含10个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，生物缓冲液为PBS；重复步骤(3)3次，具体为步骤(2)得到的第一沉淀与核酸酶反应液及核酸酶混匀后，置于37℃下反应30分钟，之后于12000rpm离心5分钟，弃去上清液，得到第二沉淀，重复三次，第三次不离心操作；
(4)将核酸酶灭活，核酸酶灭活的方法包括添加EDTA；
(5)富集目标微生物2。
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
实施例2
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置10分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.04％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀，离心的转速为4200rpm，时间为28分钟；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含50个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，生物缓冲液为PBS；重复步骤(3)2次，具体为步骤(2)得到的第一沉淀与核酸酶反应液及核酸酶混匀后，置于37℃下反应30分钟，之后于12000rpm离心5分钟，弃去上清液，得到第二沉淀；向第二沉淀中加入核酸反应酶及核酸酶，混合均匀后，置于37℃下反应30分钟；
(4)将核酸酶灭活，核酸酶灭活的方法包括添加EDTA；
(5)富集目标微生物2。
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
实施例3
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置15分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.85％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀，离心的转速为4500rpm，时间为26分钟；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含100个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，生物缓冲液为PBS；重复步骤(3)2次，具体为步骤(2)得到的第一沉淀与核酸酶反应液及核酸酶混匀后，置于37℃下反应30分钟，之后于12000rpm离心5分钟，弃去上清液，得到第二沉淀；向第二沉淀中加入核酸反应酶及核酸酶，混合均匀后，置于37℃下反应30分钟；
(4)将核酸酶灭活，核酸酶灭活的方法包括添加EDTA；
(5)富集目标微生物2。
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
实施例4
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置20分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为1.0％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀，离心的转速为4800rpm，时间为24分钟；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含150个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，生物缓冲液为PBS；重复步骤(3)2次，具体为步骤(2)得到的第一沉淀与核酸酶反应液及核酸酶混匀后，置于37℃下反应30分钟，之后于12000rpm离心5分钟，弃去上清液，得到第二沉淀；向第二沉淀中加入核酸酶反应液及核酸酶，混合均匀后，置于37℃下反应30分钟；
(4)将核酸酶灭活，核酸酶灭活的方法包括添加EDTA；
(5)富集目标微生物2。
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
实施例5
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置30分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.02％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀，离心的转速为10000rpm，时间为20分钟；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含200个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，生物缓冲液为PBS；重复步骤(3)1次，具体为步骤(2)得到的第一沉淀与核酸酶反应液及核酸酶混匀后，置于37℃下反应30分钟；
(4)将核酸酶灭活，核酸酶灭活的方法包括添加EDTA；
(5)富集目标微生物2。
一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
试验例1
皂苷浓度对细菌回收效率的影响：在一系列15mL的无菌离心管中，向3000μL皂苷水溶液中加入1000μL含大肠杆菌的培养基，培养基中含菌量为1000CFU。颠倒混匀样本，混合后溶液中皂苷的终浓度分别为0％、0.1％、0.4％、0.85％、1.7％、2.55％。室温下放置15分钟后，于4000rpm离心15分钟。吸去上清后用500μL PBS重悬沉淀，并转移到新的1.5mL EP管中，再加入500μL PBS。于12,000rpm离心5分钟，弃去上清。加入1mL PBS洗涤沉淀，于12,000rpm离心5分钟，弃去上清，得到含有细菌的沉淀。使用生工
Figure BDA0002275598490000103
柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取沉淀中的DNA，最终产物使用25μL无菌水洗脱。使用10μL洗脱物进行细菌16SrRNA基因序列的PCR扩增反应以检测回收细菌的存在及对回收细菌大致定量，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
图1为皂苷浓度(％)对细菌回收效率的影响的琼脂糖凝胶电泳图。图中标记的泳道M为Marker D2000、泳道N为PCR阴性对照反应产物(PCR反应模板为ddH2O)，其余泳道的PCR反应产物如图1标所示。图1显示，当溶液中皂苷终浓度小于1.7％时，溶液中的细菌被稳定地回收。当溶液中皂苷终浓度等于或大于1.7％时，溶液中细菌的回收率极低或回收失败。因此，皂苷用于分离液体生物样本中的目标微生物的目的时，其使用的终浓度不应超过1.7％。
试验例2
使用皂苷及核酸酶从1mL全血中回收不等量的金黄色葡萄球菌
在1-10号试管中，按下表混合1mL的人全血和不等量的金黄色葡萄球菌(sau)。
表1全血样本含菌量
Figure BDA0002275598490000101
在1-10号管中加入3mL ACK红细胞裂解液，混匀后于4℃裂解15分钟。将试管于4,000rpm离心20分钟，弃去上清。用500μL ACK重悬沉淀，并转移到新的试管中。加入500μLACK，于12,000rpm离心5分钟，弃去上清。在1-8号试管中按以下配方加入各成分：
Figure BDA0002275598490000102
Figure BDA0002275598490000111
在9-10号试管中按以下配方加入各成分：
Figure BDA0002275598490000112
将试管内容混匀，于37℃孵育30分钟。向所有反应中加入EDTA(25mM)20μL，混匀后置于65℃孵育15分钟。于12,000rpm离心5分钟，弃去上清。加入1mL PBS洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，弃去上清，留下含有细菌的沉淀。使用生工
Figure BDA0002275598490000114
柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取沉淀中的DNA，最终产物使用25μL无菌水洗脱。使用10μL洗脱物进行细菌16SrRNA基因序列的PCR扩增反应以检测回收细菌的存在及对回收细菌大致定量，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
图2为不同数量的细菌的回收情况的琼脂糖凝胶电泳图。图中标记的泳道M为Marker D2000、泳道N为PCR阴性对照反应产物(PCR反应模板为ddH2O)，其余泳道的PCR反应产物对应图标所示的表1中的样本号。图2显示，在0.85％的皂苷终浓度下，全血中不同数量的金黄色葡萄球菌得到有效的回收。实验中分别使用两种不同的核酸酶量：15和20个酶单位，两者的细菌回收效率无明显区别。
试验例3
使用0.85％的皂苷及核酸酶从5mL全血中回收不等量的金黄色葡萄球菌
在1-5号15mL管中，按下表混合5mL的人全血和不等量的金黄色葡萄球菌(sau)
表2全血样本含菌量
Figure BDA0002275598490000113
Figure BDA0002275598490000121
每个样本中加入5mL 1.7％的皂苷水溶液，使皂苷终浓度达到0.85％。混匀后置于室温下5min。于4,000rpm下离心20分钟，倒掉上清。
将1号样本管于4,000rpm下离心2分钟后吸去上清液体，留下沉淀。加入400μL无菌水，吹打悬浮沉淀后转移到1.5mL试管中，再加入400μL无菌水。按以下配方加入各成分：
Figure BDA0002275598490000122
向2-5号样本管按以下配方加入各成分：
Figure BDA0002275598490000123
混匀后于37℃孵育30分钟。于4,000rpm离心5分钟，将液体和沉淀全部转移到1.5mL试管中，再加入400μL无菌水。于12,000rpm离心5分钟，弃去上清，留下沉淀。
向所有样本管按以下配方加入各成分：
Figure BDA0002275598490000124
将样本混匀，置于37℃孵育30min。向样本加入100mM EDTA 25μL，混匀后置于室温下5分钟。于12,000rpm离心5分钟，弃去上清。加入1mL H2O洗涤沉淀，于12,000rpm离心5分钟，弃去上清，留下含有细菌的沉淀。使用生工
Figure BDA0002275598490000131
柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取沉淀中的DNA，最终产物使用25μL无菌水洗脱。使用10μL洗脱物进行细菌16S rRNA基因序列的PCR扩增反应以检测回收细菌的存在及对回收细菌大致定量，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
图3为不同数量的细菌的回收情况的琼脂糖凝胶电泳图。图中标记的泳道M为Marker D2000、泳道N为PCR阴性对照反应产物(PCR反应模板为ddH2O)，泳道P为阳性对照(PCR反应模板为细菌16S rRNA基因DNA片段)，其余泳道的PCR反应产物对应图标所示的表2中的样本号。图3显示，在0.85％的皂苷终浓度下，全血中不同数量的金黄色葡萄球菌得到有效的回收。实验中第一次核酸酶消化时，分别使用两种不同的核酸酶浓度：150U/1050μL和150U/650μL，后者的细菌回收效率明显低于前者。实验表明，可检测到细菌回收的样本细菌含量可低至2CFU/mL。
试验例4
使用1.70％的皂苷及核酸酶从5mL全血中回收不等量的金黄色葡萄球菌
在15mL的无菌离心管中，向用EDTA抗凝的5mL全血中加入1500、750、375、188、94、47、24、12、0(阴性对照)CFU的金黄色葡萄球菌，细菌的CFU数目通过在血琼脂平板上涂布培养进行确认。向每个离心管中加入5mL过滤后的1.70％皂苷溶液，将离心管颠倒混匀，室温反应5min，3200g离心20min，弃去上清。向沉淀物中加入800μL无菌水、100μL的Buffer(100mM Tris-HCl(pH 7.5at 25℃),25mM MgCl2,1mM CaCl2)和150μL DNaseⅠ(1U/μL)，涡旋混匀溶液和沉淀，在37℃反应30min，每5min涡旋混匀一次。将反应混合物转移至1.5mL试管中，12000rpm离心5min，弃去上清液，再次加入400μL无菌水、50μL的Buffer(100mM Tris-HCl(pH 7.5at 25℃),25mM MgCl2,1mM CaCl2)和50μL DNaseⅠ(1U/μL)，涡旋混匀溶液和沉淀，在37℃反应30min，每5min涡旋混匀一次。向溶液中加入25μL 100mM EDTA，涡旋混匀。12000rpm离心5min，弃去上清液。使用生工
Figure BDA0002275598490000132
柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取沉淀中的DNA，最终产物使用25μL无菌水洗脱。
使用10μL洗脱物进行PCR扩增，将扩增产物使用测序技术进行物种鉴定。加入1500、750、375、188、94、47、24、12CFU的金黄色葡萄球菌的样本中均能鉴定到金黄色葡萄球菌的序列信息，但是加入0(阴性对照)CFU的金黄色葡萄球菌的样本中未检测到金黄色葡萄球菌的序列信息。实验表明，可检测到细菌回收的样本细菌含量可低至2.5CFU/mL。
以上所述实施例和试验例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置5-30分钟，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.02-1.7％；
(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀；
(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含10-200个酶单位；
(4)将核酸酶灭活；
(5)富集目标微生物2。
2.根据权利要求1所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：步骤(3)后富集目标微生物1，使用水和/或生物缓冲液冲洗目标微生物1，之后进行步骤(4)。
3.根据权利要求2所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：生物缓冲液包括PBS、TE、TBE、TAE、Tris-glycine缓冲液中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：步骤(1)中混合物中皂苷的终浓度为0.04-0.85％。
5.根据权利要求1所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：步骤(2)中离心的转速为4000–10000rpm，时间为20-30分钟。
6.根据权利要求1所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：步骤(3)中核酸酶包含50-150个酶单位。
7.根据权利要求2所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：重复步骤(3)至少一次。
8.根据权利要求7所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，其特征在于：重复步骤(3)2次。
9.权利要求1-8任一项所述的一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法在制备诊断试剂盒中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述诊断试剂盒用于在液体生物样品中分离目标微生物和/或分离目标微生物的核酸，所述液体生物样品包括目标微生物、非靶标细胞和任选存在的目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述诊断试剂盒包括至少一种皂苷制剂，至少一种能够裂解核酸的酶，EDTA和/或EGTA和/或DTT和/或β-巯基乙醇和/或DEPC和/或胍。
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