CN115851701A - 一种提取微生物dna的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种提取微生物DNA的试剂盒及其使用方法，包括裂解液和平衡液，裂解液包括异硫氰酸胍、5‑氯‑2‑甲基‑4‑异噻唑啉‑3‑酮、2‑甲基‑4‑异噻唑啉‑3‑酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2‑(N‑吗啉代)乙磺酸、溴酚红和二甲苯青FF；平衡液包括3‑(2‑氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1‑(4‑磺酸苯基)‑4‑(4‑磺酸苯基偶氮)‑5‑吡唑啉酮‑3‑羧酸三钠和三羟甲基氨基甲烷，使用时将生物样本与裂解液充分混匀，并涡旋振荡后室温静置，得到混合溶液；向混合溶液中加入平衡液，充分混匀后室温静置，得到粗提液；将粗提液离心，取上清液，本发明的试剂盒在室温条件下即可完成操作，提取快速，解决了现有的微生物DNA提取耗时较多的问题。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种提取微生物DNA的试剂盒及其使用方法。
背景技术
环境微生物总DNA的纯化为本领域所熟知，并且在生态学、诊断及药学研究中有极为广泛的应用。随着分子生物学及生态学研究的不断进步，从环境样本中纯化的DNA可直接用于微生物基因组研究、微生物多样性的分析，进而用于动植物疾病的发生发展研究。在这些应用中，首先需要纯化DNA，随后进行聚合酶链式扩增反应或DNA序列测定，从而揭示样本中微生物多样性变化，最终用于微生物多样性研究。
但是，环境微生物样本来源多样，干扰物复杂是无法避免的情况。现有技术方法通常包含直接法与间接法进行DNA提取。直接法采用直接裂解样本中微生物细胞的方法，这种方法获得的主要是DNA粗提液，可根据后续试验应用直接使用或进行进一步纯化使用，但是该类方法需要高温处理，通常需要温度控制仪器辅助才能进行；而间接法需要通过机械破碎样本、样本匀浆、不同缓冲溶液进行细胞壁和细胞膜的裂解、最终通过乙醇沉淀或羟基/羧基材料吸附纯化得到DNA，但是该方法需要更多的专业仪器，并且操作步骤繁复，导致耗时较多，不适合进行高通量DNA样本的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取微生物DNA的试剂盒及其使用方法，旨在解决现有的微生物DNA提取耗时较多的问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种提取微生物DNA的试剂盒，包括裂解液和平衡液，
所述裂解液包括异硫氰酸胍、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2-(N-吗啉代)乙磺酸、溴酚红和二甲苯青FF；
所述平衡液包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠和三羟甲基氨基甲烷。
其中，所述裂解液的pH为5.8～6.4。
其中，所述平衡液的pH为8.6～10。
其中，所述裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.001％～12％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％～10％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、100～200mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.1～0.5％的溴酚红、0.01～0.5％的二甲苯青FF。
其中，所述平衡液包括0.01～15％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、50～200mM的三羟甲基氨基甲烷。
第二方面，本发明提供了一种提取微生物DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，并涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；
向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液；
将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液，得到提取微生物。
本发明的一种提取微生物DNA的试剂盒，包括裂解液和平衡液，所述裂解液包括异硫氰酸胍、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2-(N-吗啉代)乙磺酸、溴酚红和二甲苯青FF；所述平衡液包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠和三羟甲基氨基甲烷，使用时将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，并涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液；将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液，得到提取微生物，本发明的试剂盒在室温条件下即可完成操作，提取快速，解决了现有的微生物DNA提取耗时较多的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的一种提取微生物DNA的试剂盒的使用方法实施例1～实施例3所提取的微生物DNA的扩增16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明提供的一种提取微生物DNA的试剂盒的使用方法的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
第一方面，本发明提供一种提取微生物DNA的试剂盒，包括裂解液和平衡液，
所述裂解液包括异硫氰酸胍、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2-(N-吗啉代)乙磺酸、溴酚红和二甲苯青FF；
所述平衡液包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠和三羟甲基氨基甲烷。
具体的，使用时将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，并涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液；将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液，得到提取微生物，本发明的试剂盒在室温条件下即可完成操作，提取快速，解决了现有的微生物DNA提取耗时较多的问题。
进一步的，所述裂解液的pH为5.8～6.4。
具体的，所述裂解液的pH优选为6.0。
进一步的，所述平衡液的pH为8.6～10。
具体的，所述平衡液的pH优选为9.0。
进一步的，所述裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.001％～12％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％～10％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、100～200mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.1～0.5％的溴酚红、0.01～0.5％的二甲苯青FF。
具体的，优选所述裂解液包括0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF。
进一步的，所述平衡液包括0.01～15％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、50～200mM的三羟甲基氨基甲烷。
具体的，优选所述平衡液包括0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷。
请参阅图1至图2，第二方面，本发明提供了一种提取微生物DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，并涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；
具体的，所述生物样本可来自于人体、动物、植物、藻类、土壤、空气、水体或石油。
人体或动物的生物样本来源包括但不限于皮肤、口腔、消化道内容物、粪便、体液、尿道、阴道、内脏、腹腔。
体液包括但不限于血液、脑脊髓液、胃液、胆汁、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。
S2向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液；
S3将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液，得到提取微生物。
本发明提供的一种提取环境微生物DNA的试剂盒的使用方法，该方法在室温条件下即可完成操作，提取快速，且该方法提取的DNA不含有RNA的干扰、通量高；经过纯化获得的DNA可直接用于下游分子生物学试验，这对于没有昂贵试验设施设备的试验室进行微生物监测具有极大的优势；与此同时，该方法可直接观测反应液颜色判定是否可进行后续试验，对于样品快速处理提供了可视化直观操作的可能性，本发明提供的提取微生物DNA的试剂盒，其中裂解液及平衡液可高效抑制微生物的生长，这对于处理和运输含有感染性来源的样本有极大的优势。
实施例一
提取微生物DNA的试剂盒包括：
裂解液：0.6M异硫氰酸胍、0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF，
平衡液：0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷，
从小鼠粪便中提取微生物DNA的方法：
S101将0.05g粪便样本与0.1ml裂解液充分混匀，高速涡旋振荡后室温静置1分钟,得到混合溶液；
S102向S101步骤得到的混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，取上层裂解液备用。
实施例二
提取微生物DNA的试剂盒包括：
裂解液：0.6M异硫氰酸胍、0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF。
平衡液：0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷。
从小鼠粪便中提取微生物DNA的方法：
S111将0.05g粪便样本与0.1ml裂解液充分混匀，高速涡旋振荡后室温静置1分钟,得到混合溶液；
S112向S111步骤得到的混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到出提液。
S113将S112步骤所得粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液备用。
实施例三
使用QIAamp PowerFecal DNAKit从小鼠粪便中提取微生物DNA
与实施例一相同，取0.05g粪便样本，按如下流程进行DNA提取
1、在DryBead Tube中加入0.25g粪便样本，750μl PowerBead Solution和60μlSolution C1，充分混匀后65℃孵育10min，拧紧管盖后涡旋振荡10min。
2、13000xg离心1min后吸取400-500μl上清至2ml收集管中，加入250μl SolutionC2，低速涡旋或颠倒混匀后于2-8℃静置5min(低温静置步骤可省略)。
3、13000xg离心1min后吸取600μl上清至2ml收集管中，加入200μl Solution C3，低速涡旋或颠倒混匀后于2-8℃静置5min(低温静置步骤可省略)。
4、13000xg离心1min后吸取750μl上清至2ml收集管中，加入1200μl Solution C4并颠倒充分混匀(Solution C4使用前需充分溶解混匀)。
5、在MB Spin Column中加入2.1.3.4步骤中的混合液675μl，10000x g离心1min，弃流穿液。重复该步骤至所有收集管中混合液过柱。
6、在MB Spin Column中加入500μl Solution C5，10000xg离心1min后弃流穿液。
7、10000xg离心1min后在MB Spin Column(置于新的2ml收集管中)中央加入50-100μl Solution C6，室温孵育1min后10000xg离心30s。流穿液即为DNA溶液。
实施例四
将实施例1～3所提取的微生物DNA粗提液进行16S rRNA基因的扩增
使用16S rRNA基因扩增引物进行V4区扩增，扩增体系见表1，PCR反应条件为，98℃10s，55℃10s，68℃30s；30个循环。扩增结果如图1所示，其中实施例1～3均得到了目标扩增子。
图1中，泳道M：Trans2Kplus DNA marker；泳道C1:通过实施例1获得DNA样本的PCR产物结果；泳道C2:通过实施例2获得DNA样本的PCR产物结果；泳道P2:通过实施例3获得DNA样本的PCR产物结果。
其中，使用的扩增引物为：
U515F：5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’
U806R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’
表1PCR扩增体系
将实施例1～3中获得的16S rRNA基因V4区扩增子片段进行高通量测序，通过数据分析，检测不同DNA提取方法获得的微生物群落结构分析结果。结果如图2所示，本发明所述提取方法可快速获得微生物DNA，其获得的微生物DNA完整性和结构与高品质试剂盒一致，且重复性较高。
以上所揭露的仅为本发明一种提取微生物DNA的试剂盒及其使用方法较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，包括裂解液和平衡液，
所述裂解液包括异硫氰酸胍、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2-(N-吗啉代)乙磺酸、溴酚红和二甲苯青FF；
所述平衡液包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠和三羟甲基氨基甲烷。
2.如权利要求1所述的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，
所述裂解液的pH为5.8～6.4。
3.如权利要求2所述的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，
所述平衡液的pH为8.6～10。
4.如权利要求3所述的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，
所述裂解液包括5M异硫氰酸胍、0.001％～12％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％～10％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、100～200mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.1～0.5％的溴酚红、0.01～0.5％的二甲苯青FF。
5.如权利要求4所述的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，
所述平衡液包括0.01～15％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、50～200mM的三羟甲基氨基甲烷。
6.一种提取微生物DNA的试剂盒的使用方法，采用权利要求5所述的提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，并涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；
向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液；
将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液，得到提取微生物。
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