CN102382904A

CN102382904A - 脊髓灰质炎病毒的检测方法

Info

Publication number: CN102382904A
Application number: CN2011103259616A
Authority: CN
Inventors: 杨明; 裘文慧; 许海; 沈杨; 潘辰苑; 吴明红
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2012-03-21

Abstract

本发明公开了一种脊髓灰质炎病毒的检测方法。该方法以样待测样品中提取的核酸物质为反应模板，以脊髓灰质炎病毒特异性序列为引物，经反转录-PCR反应程序和嵌套PCR反应程序进行聚合酶链式反应扩增，得到PCR产物，经检测，若该PCR产物中有PCR特异性扩增产物，则说明待测样品中含有脊髓灰质炎病毒。本发明不仅具有特异性好、灵敏度高、抗干扰抗杂志能力强等优点，而且还能提供环境介质中脊髓灰质炎病毒潜在的感染效应等信息，为快速检测环境介质中脊髓灰质炎病毒、评估环境中灰质病毒感染风险、预防脊髓灰质疾病爆发提供强有力的技术支持。

Description

脊髓灰质炎病毒的检测方法

技术领域

本发明涉及一种脊髓灰质炎病毒的检测方法，特别是一种采用RT-PCR方法检测脊髓灰质炎病毒的方法。

背景技术

脊髓灰质炎病毒是引起脊髓灰质炎的病毒，该疾病传播广泛，是一种急性传染病。脊髓灰质炎病毒属于微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。全世界每年由于肠道感染引起痢疾的病例多达40 亿人次，死亡人数多达220 万人，成为全球疾病之首。脊髓灰质炎病毒体积较小，约22～30nm，具有单链RNA基因组，是缺少外膜的肠道病毒。其按免疫性可分为三种血清型，其中Ⅰ型最容易导致瘫痪，也最容易引起流行。脊髓灰质炎是一种急性病毒性传染病，其临床表现多种多样，包括程度很轻的非特异性病变，无菌性脑膜炎(非瘫痪性脊髓灰质炎)和各种肌群的弛缓性无力(瘫痪性脊髓灰质炎)。脊髓灰质炎病人，由于脊髓前角运动神经元受损，使与之有关的肌肉失去了神经的调节作用而发生萎缩，同时皮下脂肪，肌腱及骨骼也萎缩，最终使整个机体变细。

脊髓灰质炎病毒可在水体中存活，其主要通过粪口途径传给其唯一天然宿主——人类，因此，对饮用水、环境水源乃至各级污水中污染病毒的检测，是预防控制疾病，评估水源卫生质量、环境卫生情况的一项有价值的工作。然而，在对饮用水、环境水源和各级污水中检测脊髓灰质炎病毒存在着诸多问题，如病毒含量低、干扰因子复杂等都给检测方法带来了巨大的挑战。

脊髓灰质炎病毒的检测方法有电镜观察、细胞培养、核酸杂交等，但是电镜观察、核酸杂交的灵敏度相对都很低，还不能单独用于检测；细胞培养法的操作繁琐，需时间较长，一般需要一周才能观察到细胞的病理反应。因此，发展快速、灵敏度高、操作简单的分子生物学检测方法及其试剂盒对于脊髓灰质炎病毒的检测和预防具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有传统检测技术的不足之处，提供一种脊髓灰质炎病毒的检测方法.

PCR是一种体外DNA 扩增技术，在模板DNA、引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。脊髓灰质炎病毒的PCR检测方法通过应用PCR扩增原理，根据已知病毒基因序列设计出特异性很强的引物，以极低浓度的病毒RNA为模板扩增出特异的基因片段，从而达到检测病毒的目的。

根据上述原理，本发明采用如下技术方案：

一种脊髓灰质炎病毒的检测方法，其特征在于该方法的具体步骤为提取带检测样品中的核酸物质为反应模板，以脊髓灰质炎病毒特异性序列为引物，经反转录-PCR反应程序和嵌套PCR反应程序进行聚合酶链式反应扩增，得到PCR产物，经检测，若该PCR产物中有PCR特异性扩增产物，则说明待测样品中含有脊髓灰质炎病毒；所述的异性序列为引物为：5′-ATTGGATTGGCCATCCGGTG-3′、5′-GCATTACACTGTACGTGCAC-3′和5′-TCCACCACCACCCTCTCGACTC-3′。

上述反转录-PCR反应程序的具体步骤为：50 ℃ 30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，30 cycles； 72 ℃延伸 5 min。

上述的嵌套PCR反应程序的具体步骤为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，30 cycles； 72 ℃延伸 5 min。

上述的PCR特异性扩增产物为：

TTGGATTGGCCATCCGGTGAGTGTTGTGTCAGGTATACAACTGTTTGTTGGAACCACTGTGTTAGCTTTACTTCTCATTTAACCAATTAATCAAAAACAATACGAGGATAAAACAACAATACTACAATGGGCGCCCAAGTTTCATCACAGAAAGTTGGAGCCCACGAAAATTCAAACAGAGCCTATGGCGGGTCCACCATCAATTACACTACAATCAATTACTATAGGGACTCTGCAAGCAATGCAGCAAGCAAGCAAGATTTTGCACAAGATCCGTCCAAGTTCACCGAACCCATTAAGGACGTCCTTATTAAGACCGCTCCCATGCTAAACTCCCCAAACATTGAGGCGTGTGGTTATAGTGACAGGGTAATGCAGCTAACTCTGGGCAATTCAACGATCACCACCCAAGAAGCGGCCAATTCTGTTGTTGCCTACGGTAGATGGCCTGAATACATCAGAGATACCGAGGCAAATCCTGTAGACCAACCAACCGAGCCCGATGTAGCCGCGTGCAGGTTCTACACATTAGATACCGTCACTTGGCGCAAGGAGTCGAGAGGGTGGTGGTGGA。

本发明提供的是一种利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）监测脊髓灰质炎病毒的方法。可以用于水中、土壤等各类环境中脊髓灰质炎病毒的检测，特别适用于水中低丰度的脊髓灰质炎病毒的检测，该方法具有灵敏度高、速度快、简便、准确、检测周期短等特点。而且具有特异性好、灵敏度高、抗干扰抗杂志能力强等优点，同时还能提供环境介质中脊髓灰质炎病毒潜在的感染效应等信息，为快速检测环境介质中脊髓灰质炎病毒、评估环境中灰质病毒感染风险、预防脊髓灰质疾病爆发提供强有力的技术支持。

附图说明

图1为阴性对照中检测脊髓灰质炎病毒电泳图（M：Marker；1：阴性对照检测脊髓灰质炎病毒电泳图）。阴性对照水样由500ml无菌去离子水组成，以阴性对照为对比确定水样中是否含髓灰质炎病毒。

图2为脊髓灰质炎病毒标准品RT-nest-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图(M：Marker；1：一步法巢式PCR扩增产物；2：巢式PCR扩增产物)。

图3为模拟水样和阴性对照中检测脊髓灰质炎病毒电泳图(M：Marker；1：阴性对照检测脊髓灰质炎病毒电泳图；2：模拟水样检测脊髓灰质炎病毒电泳图)。阴性对照水样由500ml无菌去离子水组成，模拟水样由在500 mL无菌去离子水中人工添加0.2 mL脊髓灰质炎减毒活疫苗获得。从此图中可以看出，模拟水样中因人工添加0.2 mL脊髓灰质炎减毒活疫苗而在电泳图中出现明显亮带被检出，阴性对照则没有。说明此方法能有效的检出脊髓灰质炎病毒。

图4为环境水样检测脊髓灰质炎病毒电泳图。环境水样取自上海市内某污水处理厂（A厂）的进水口的水样且在这个进水口有检出脊髓灰质炎病毒。

具体实施方式

实施例一：本实施例以上海市A污水处理厂进水样的脊髓灰质炎病毒的检测为例来说明本发明方法

脊髓灰质炎减毒活疫苗（猴肾细胞）由中国医学科学院医学生物学研究所生产。我们对脊髓灰质炎病毒标准品进行了一巢步法式PCR和巢式PCR两种分析，其结果如图2所示。对于一般环境中存在的微量脊髓灰质炎病毒，一步法RT-PCR不能准确检出而巢式PCR检测限更低，精确度更高，能够非常准确的检测出。模拟水样由在500 mL无菌去离子水中人工添加0.2 mL脊髓灰质炎减毒活疫苗获得，阴性对照水样由500ml无菌去离子水组成。实际水样取自上海市内某污水处理厂（A厂）的进水口的水样。

（1）水体病毒的RNA提取

1000ml待测水体经浓缩后得到病毒浓缩液，取140 μL病毒浓缩液经病毒RNA提取试剂盒（TIANamp Virus RNA Kit）收集水体中病毒RNA。

（2）病毒核酸的RT-nest-PCR检测

取0.5~1 μg待检RNA样品，依此加入25 μL 2 × 1 Step Buffer， 2 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix，20 pmol引物1，20 pmol引物2，加入Rnase free dd 水至50 μL。在PCR仪上按照以下程序完成RT-PCR反应：50 ℃ 30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，30 cycles； 72 ℃延伸 5 min。反应结束后取反应液1 μL，依次加入2.5 μL 2 × PCR Buffer，0.5 μL dNTP Mixture (10 mM each)，16 pmol引物1，16 pmol引物3，0.25 μLTakara ExTaq HS (5 U/ul)，加入Rnase free dd 水至25 μL。在PCR仪上按照以下程序完成巢式PCR（nestPCR）反应：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，30 cycles； 72 ℃延伸 5 min。

（3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

反应结束后，取适量反应液用1.2％（m/V）琼脂糖凝胶电泳在紫外凝胶成像仪上检测实验结果。若在500-750间出现明亮的反应条带，则为脊髓灰质炎病毒阳性，否则为阴性。模拟水样由在500 mL无菌去离子水中人工添加0.2 mL脊髓灰质炎减毒活疫苗获得，阴性对照水样由500ml无菌去离子水组成。阴性对照的检测结果如图1所示，没有在500-750间出现明亮的反应条带，为阴性；模拟水样和阴性对照的检测结果如图3所示，模拟水样在500-750间出现明亮的反应条带，为脊髓灰质炎病毒阳性。上海市内某污水处理厂（A厂）的进水口的水样检测结果如图4，在500-750间出现明亮的反应条带，为脊髓灰质炎病毒阳性。图4中 M为Marker；1为A污水处理厂进水口水样。

<110> 上海大学

<120> 脊髓灰质炎病毒的检测方法

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

ATTGGATTGG CCATCCGGTG

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

GCATTACACT GTACGTGCAC

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

TCCACCACCA CCCTCTCGAC TC。

Claims

1.一种脊髓灰质炎病毒的检测方法，其特征在于该方法的具体步骤为提取带检测样品中的核酸物质为反应模板，以脊髓灰质炎病毒特异性序列为引物，经反转录-PCR反应程序和嵌套PCR反应程序进行聚合酶链式反应扩增，得到PCR产物，经检测，若该PCR产物中有PCR特异性扩增产物，则说明待测样品中含有脊髓灰质炎病毒；所述的异性序列为引物为：5′-ATTGGATTGGCCATCCGGTG-3′、5′-GCATTACACTGTACGTGCAC-3和5′-TCCACCACCACCCTCTCGACTC-3′。

2.根据权利要求1所述的脊髓灰质炎病毒的检测方法方法，其特征在于所述反转录-PCR反应程序的具体步骤为：50 ℃ 30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，30 cycles； 72 ℃延伸 5 min。

3.根据权利要求1所述的脊髓灰质炎病毒的检测方法方法，其特征在于所述的嵌套PCR反应程序的具体步骤为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，30 cycles； 72 ℃延伸 5 min。

4.根据权利要求1所述的脊髓灰质炎病毒的检测方法，其特征在于所述的PCR特异性扩增产物为：