CN110272897B - 肠道内容物样本保存液及制备方法 - Google Patents

肠道内容物样本保存液及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肠道内容物微生物检测技术领域，尤其涉及肠道内容物样本保存液及制备方法，包括以下原料：2.6‑4.5M硫酸铵、0.15‰甲基氯异噻唑啉酮、5‑20mM柠檬酸钠、1‑10mM EDTA、5mM氟化钠、1‰Triton X‑100、2‰吐温‑80、0.5％溴酚红、0.02％二甲苯腈蓝FF。本发明的肠道内容物样本保存液，该保存液能够在较大的温度变化范围内确保样本中核酸的完整性，对所有动物肠道样本的兼容性较好，且无需冻存，使用该配方保存液可不受实验条件限制，在任意时间和地点均可进行采样并保存样本，同时也可用于样本的长距离运输。

Description

肠道内容物样本保存液及制备方法
技术领域
本发明涉及肠道内容物微生物检测技术领域，尤其涉及肠道内容物样本保存液及制备方法。
背景技术
人体微生物组与各种非慢性感染性疾病，如与代谢性疾病的关系是近年来生物医学研究领域的热门课题。数量庞大的微生物群体，通过长期与宿主的共进化，提供了宿主不具备的酶和生化代谢通路。肠道微生物不仅能降解食物中宿主不可消化的营养成分、提供宿主维生素等营养物质，还能促进肠上皮细胞的分化与成熟、激活肠道免疫系统以调节宿主能量储存与代谢。人体与肠道菌群之间形成互利共生的关系，宿主的生理表型及营养状态可以影响肠道菌群的结构，肠道菌群反过来也可以影响宿主的疾病与健康表型。因此，随着分子生物学试验方法的不断进步，当高通量测序技术不断发展完善的今天，决定样品测序质量的关键在于原始样本的保存方法和技术。但是，肠道内容物成分复杂多样，其含有大量的核酸酶及蛋白酶，同时也含有抑制核酸提取与PCR扩增的各种抑制剂，这对于后续下游试验的准确性有极大的影响。
肠道内容物样本由于其复杂的成分，加上取样地点及样品保存条件的限制无法立即纯化核酸，样品中的微生物细胞及肠道脱落物细胞会很快被降解和破坏，最终导致菌群丰度的变化，造成样本的损失。而从另一方面讲，现有的样品保存液含有的胍盐及脱水固定剂会极大的破坏细胞结构，导致样本可利用率降低，而其含有的去垢剂等成分也可能对环境造成污染。因此，开发一种新型无毒且环境友好的样品保存液具有极大的应用及推广前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供肠道内容物样本保存液及制备方法，能够在较大的温度变化范围内确保样本中核酸的完整性，对所有动物肠道样本的兼容性较好，且无需冻存，使用该配方保存液可不受实验条件限制，在任意时间和地点均可进行采样并保存样本，同时也可用于样本的长距离运输。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
肠道内容物样本保存液，其特征在于，包括以下原料：
Figure GDA0002896387520000021
进一步，所述保存液的pH值为5.2-6.0。优选的为pH值为5.6。
进一步，所述EDTA可以替换为乙二胺四乙酸二钠。
进一步，所述吐温-80可以替换为吐温-20或吐温-40。
本发明还公开了肠道内容物样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
S1：根据权利要求1的原料配方，分别称取硫酸铵、甲基氯异噻唑啉酮、柠檬酸钠、EDTA、氟化钠、Triton X-100和吐温-80按比例加入无核酸污染去离子水中，充分搅拌均匀溶解得到均一的溶液；
S2：向S1步骤制备得到的溶液中滴加浓硫酸，调整溶液pH至5.0-6.0；
S3：将调整pH后的溶液使用0.22μm水相微孔滤膜过滤后灭菌，然后加入溴酚红和二甲苯腈蓝FF，搅拌均匀得到肠道内容物样本保存液；
S4：将得到肠道内容物样本保存液与不同品牌的保存液进行对比试验，具体操作步骤如下：
(1)取不同品牌保存液各200μl，每份保存液与ZymoBIOMICS MicrobialCommunity Standard 75μl混合均匀后置避光处25℃恒温保存15天；
保存液A：含甲醇、乙醇、氯化钠、吐温及乙酸盐；
保存液B：含乙醇、Triton X-100及柠檬酸盐；
保存液C：含胍盐(盐酸胍或异硫氰酸胍)、柠檬酸盐；
(2)使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep纯化总DNA；
(3)使用ABM Bestaq DNA聚合酶对16S基因(27F/1492R引物)及ITS片段(ITS1/ITS4)进行扩增检测以及线性期扩增产物于1％琼脂糖凝胶分离后(5V/cm)检测。
本发明还公开了肠道内容物样本保存液的使用方法，具体为将待保存样本和保存液按照比例混合均匀后，于室温下密封保存。
进一步，所述待保存样本为动物肠道内食糜或粪便样本。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明的肠道内容物样本保存液，该保存液能够在较大的温度变化范围内确保样本中核酸的完整性，对所有动物肠道样本的兼容性较好，且无需冻存。使用该配方保存液可不受实验条件限制，在任意时间和地点均可进行采样并保存样本，同时也可用于样本的长距离运输。
2.本发明在保存液中加入了溴酚红和二甲苯腈蓝FF作为指示剂，当保存液处于规定pH值内时，保存液呈现浅绿色，否则会出现紫红色，以此能够直观的体现出当下保存液的状态，使用者能够清晰的知道该保存液是否满足使用要求。
附图说明
图1是实施例四中16S基因检测结果；
图2是实施例四中ITS片段检测结果；
其中，M:DL2000 DNA Marker；N:Non-Template Control；1：保存液A；2：保存液B；3：保存液C；4：RHONIN Tube保存液；
图3是实施例六中16S基因检测结果；
图4是实施例六中ITS片段检测结果；
其中，M:DL2000 DNA Marker；N:Non-Template Control；1：0天；2：15天；3：30天；4：60天；5：180天；
图5是实施例六中16S基因高通量测序结果；
图6是实施例六中ITS扩增子高通量测序结果。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例一～实施例三按照如表1所示的配方进行制备保存液：
表1：实施例一～实施例三保存液配方表
组分 实施例一 实施例二 实施例三
硫酸铵 3.52M 4.5M 2.6M
甲基氯异噻唑啉酮 0.15‰ 0.15‰ 0.15‰
柠檬酸钠 20mM 15mM 5mM
EDTA 10mM 1mM 5mM
氟化钠 5mM 5mM 5mM
Triton X-100 1‰ 1‰ 1‰
吐温-80 2‰ 2‰ 2‰
溴酚红 0.50％ 0.50％ 0.50％
二甲苯腈蓝FF 0.02％ 0.02％ 0.02％
根据表1所示配方分别制备实施例一～实施例三保存液，具体制备方法如下：
S1：根据原料配方，分别称取硫酸铵、甲基氯异噻唑啉酮、柠檬酸钠、EDTA、氟化钠、Triton X-100和吐温-80按比例加入无核酸污染去离子水中，充分搅拌均匀溶解得到均一的溶液；
S2：向S1步骤制备得到的溶液中滴加浓硫酸，调整溶液pH至5.0-6.0；
S3：将调整pH后的溶液使用0.22μm水相微孔滤膜过滤后灭菌，然后加入溴酚红和二甲苯腈蓝FF，搅拌均匀得到肠道内容物样本保存液。
实施例四与不同品牌的保存液之间的对比
将实施例一制备得到的保存液和现有的不同品牌的保存液进行对比试验，具体操作如下：
(1)取不同品牌保存液各200μl，每份保存液与ZymoBIOMICS MicrobialCommunity Standard 75μl混合均匀后置避光处25℃恒温保存15天；
保存液A：含甲醇、乙醇、氯化钠、吐温及乙酸盐；
保存液B：含乙醇、Triton X-100及柠檬酸盐；
保存液C：含胍盐(盐酸胍或异硫氰酸胍)、柠檬酸盐；
(2)使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep纯化总DNA；
(3)使用ABM Bestaq DNA聚合酶对16S基因(27F/1492R引物)及ITS片段(ITS1/ITS4)进行扩增检测，检测结果如图1所示。线性期扩增产物于1％琼脂糖凝胶分离后(5V/cm)检测，检测结果如图2所示。
实施例五不同pH样本对总DNA提取的影响
采集不同pH的样本，使用3.5ml实施例一制备得到的保存液与其充分混合，于25℃保存7天后，使用Zymo Research ZymoBIOMICS DNA Miniprep试剂盒纯化总DNA，具体步骤如下：
(1)取适量样本于ZR BashingBeadTMLysis Tubes中，添加750μlZymoBIOMICSTMLysis Solution，拧紧管盖；
(2)将含有样本的ZR BashingBeadTMLysis Tubes置于bead beater涡旋匀浆5min。如果不使用bead beater进行涡旋操作，可将匀浆处理时间延长至20min；
(3)匀浆后取出ZR BashingBeadTMLysis Tubes，10000x g离心1min；
(4)吸取400μl上清液于Zymo-SpinTMIII-F Filter(已填装于2ml收集管中)，8000xg离心1min，弃Zymo-SpinTMIII-F Filter；向收集管中的流穿液中加入：1.如果样本不是土壤，加入1200μl ZymoBIOMICSTMDNA Binding Buffer；2.如果样本是土壤，加入800μlZymoBIOMICSTMDNA Binding Buffer和400μl 95％乙醇。如纯化拭子/水体/空气样本省略这一步。
(5)吸取收集管中800μl流穿混合液于Zymo-SpinTMIC-Z Column(已填装于2ml收集管中)，10000xg离心1min，弃流穿液；重复该步骤至所有收集管中混合液过柱；
(6)在Zymo-SpinTMIC-Z Column中加入400μl ZymoBIOMICSTMDNA Wash Buffer 1，10000xg离心1min，弃流穿液；
(7)在Zymo-SpinTMIC-Z Column中加入700μl ZymoBIOMICSTMDNA Wash Buffer 2，10000xg离心1min，弃流穿液；
(8)在Zymo-SpinTMIC-Z Column中加入200μl ZymoBIOMICSTMDNA Wash Buffer 2，10000xg离心1min，弃流穿液；
(9)将Zymo-SpinTMIC-Z Column置于干净的1.5ml离心管中，在柱膜上滴加20μlZymoBIOMICSTMDNase/RNase Free Water于室温孵育1分钟，10000xg离心1min收集流穿DNA溶液；
(10)将Zymo-SpinTMII-μHRC Filter置于收集管中，加入600μl ZymoBIOMICSTMHRCPrep Solution，8000xg离心3min，弃流穿液；
(11)将上一步获得的DNA溶液滴加在Zymo-SpinTMII-μHRC Filter中(已更换新1.5ml离心管)，16000xg离心30s-3min，获得纯化后的DNA。
最终，使用Nano Drop核酸蛋白浓度计检测纯化获得的DNA的浓度和纯度，结果如表2所示：
表2.不同pH样本DNA纯化结果
样品来源 pH 样品量 gDNA得率<sup>*</sup>(μg) A260/280 A260/230
胃液 2 0.25ml 0.62±0.07μg 1.74 1.58
肠道 6 0.2g 1.86±0.06μg 1.92 1.94
拭子 6 N/A 0.42±0.03μg 1.72 1.68
肠道 7 0.2g 1.77±0.18μg 1.81 2.03
肠道 8 0.2g 2.17±0.69μg 1.92 1.85
土壤 8 0.2g 1.65±0.38μg 1.86 1.79
肠道 9 0.2g 1.94±0.42μg 1.92 2.11
实施例六样本保存时间对DNA纯化及下游实验的影响
(1)取6份200μl实施例一制备得到的保存液，每份保存液与ZymoBIOMICSMicrobial Community Standard 75μl混合均匀后置于避光处，25℃恒温保存0天、15天、30天、60天、180天；
(2)使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep纯化总DNA(详细步骤与实施例五相同)；
(3)使用ABM Bestaq DNA聚合酶对16S基因(27F/1492R引物)及ITS片段(ITS1/ITS4)进行扩增检测，检测结果如图3、图4所示。线性期扩增产物于1％琼脂糖凝胶分离后(5V/cm)检测；检测结果如图5所示。
对15天保存样本所得扩增子样本进行高通量测序，获取群落结构信息(测序模式：Illumina PE250；分析软件：Usearch)结果如图6所示。
综合以上结果表明，本发明所述肠道样本保存液在pH范围较大的情况下对多种生物来源样本均有较好的保存效果，并且其保存效果优于其他配方保存液。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.肠道内容物样本保存液，其特征在于，包括以下原料：
Figure FDA0002982050250000011
2.根据权利要求1所述的肠道内容物样本保存液，其特征在于，所述保存液的pH值为5.2-6.0。
3.根据权利要求1所述的肠道内容物样本保存液，其特征在于，所述EDTA可以替换为乙二胺四乙酸二钠。
4.根据权利要求2所述的肠道内容物样本保存液，其特征在于，所述吐温-80可以替换为吐温-20或吐温-40。
5.肠道内容物样本保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：根据权利要求1的原料配方，分别称取硫酸铵、甲基氯异噻唑啉酮、柠檬酸钠、EDTA、氟化钠、Triton X-100和吐温-80按比例加入无核酸污染去离子水中，充分搅拌均匀溶解得到均一的溶液；
S2：向S1步骤制备得到的溶液中滴加浓硫酸，调整溶液pH至5.0-6.0；
S3：将调整pH后的溶液使用0.22μm水相微孔滤膜过滤后灭菌，然后加入溴酚红和二甲苯腈蓝FF，搅拌均匀得到肠道内容物样本保存液；
S4：将得到肠道内容物样本保存液与不同品牌的保存液进行对比试验，具体操作步骤如下：
(1)取不同品牌保存液各200μl，每份保存液与ZymoBIOMICS Microbial CommunityStandard 75μl混合均匀后置避光处25℃恒温保存15天；
保存液A：含甲醇、乙醇、氯化钠、吐温及乙酸盐；
保存液B：含乙醇、Triton X-100及柠檬酸盐；
保存液C：含胍盐、柠檬酸盐；
(2)使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep纯化总DNA；
(3)使用ABM Bestaq DNA聚合酶对16S基因及ITS片段进行扩增检测以及线性期扩增产物于1％琼脂糖凝胶分离后5V/cm检测。
6.根据权利要求1-4任一项所述的肠道内容物样本保存液的使用方法，其特征在于，所述使用方法为：将待保存样本和保存液按照比例混合均匀后，于室温下密封保存。
7.根据权利要求6所述的肠道内容物样本保存液的使用方法，其特征在于，所述待保存样本为动物肠道内食糜或粪便样本。
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