CN108977372B - 一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用 - Google Patents

一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108977372B
CN108977372B CN201810662867.1A CN201810662867A CN108977372B CN 108977372 B CN108977372 B CN 108977372B CN 201810662867 A CN201810662867 A CN 201810662867A CN 108977372 B CN108977372 B CN 108977372B
Authority
CN
China
Prior art keywords
preservation solution
sample
preservation
solution
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810662867.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108977372A (zh
Inventor
孙佳瑞
王翔
王玲
刘超
李强
任红燕
胡瑞连
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Itechgene Technology Co ltd
Perfect China Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Itechgene Technology Co ltd
Perfect China Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Itechgene Technology Co ltd, Perfect China Co Ltd filed Critical Shanghai Itechgene Technology Co ltd
Priority to CN201810662867.1A priority Critical patent/CN108977372B/zh
Publication of CN108977372A publication Critical patent/CN108977372A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108977372B publication Critical patent/CN108977372B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用。该保存方法采集含细菌样品，并将其与含若干呈化学惰性的球状体的保存液混合，摇匀后保存。通过利用若干呈化学惰性的球状体对保存液中的含细菌样品进行匀质化操作，可实现保存液与含细菌样品的充分混合，进而有效保存含细菌样品中微生物的相对含量，避免微生物因含细菌样品结块等因素所造成的相对比例发生变化的问题。同时该保存液通过合理配置各原料，能有效维持样本中微生物的相对含量不变和有效保存遗传物质。

Description

一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用。
背景技术
目前，对含细菌样品，特别是粪便细菌的研究除了直接采集新鲜粪便样本研究外，还需要采用化学试剂，对细菌进行破坏，丰度固定或保护，避免细菌核酸等遗传物质在保护期间受到破坏。常见的是将采集的粪便样本放置于保存液中或者将保存液以灌注的方式加入到采集好的粪便样本中。利用保存液冲刷粪便样本或搅拌保存液中粪便样本的模式，进行粪便样本在保存液中的匀质化操作。
但不同人群粪便的性状不同，例如，硬便、稀糊状、冻状便、陶土样便等。粪便样本在保存液中保存时无法利用保存液自身冲刷或搅拌模式完成充分混匀操作，导致粪便样本在保存液中存在结块现象，结块内部的微生物菌群未受到保存液的包裹，会由于外界条件的变化导致微生物组成发生变化。特别是有些带有一定黏着性的样本，搅拌或手动摇匀的方式，效果会非常差。同时，现有技术中采用的保存液的组成一般为氯丁醇和EDTA-Na2等，其保护粪便中的细菌组成及维持细菌相对比例的稳定的能力有限。
另外，保存液要与粪便中的微生物细胞充分接触方能发挥更好的作用。在粪便充分混匀(匀质)的基础上，更有利于保持微生物相对比例(充分固定微生物)不变，且有效保存遗传物质(核酸)。在保存液中不能充分混匀的结块内部正是保存液不能发挥作用的部分，进而会影响到整个粪便样本的结果，使其结果不能完全代表样本。
发明内容
为此，本发明所要解决的是现有含细菌样品的保存方法不能有效维持样本中微生物的相对含量不变和有效保存遗传物质的缺陷，进而提供一种能有效维持样本中微生物的相对含量不变和有效保存遗传物质的含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明所提供的保存液，其包括如下浓度的原料：
Figure BDA0001706895140000021
进一步地，所述保存液的pH为7.5～8.5。
例如，1L保存液中含有150-220g氯化钠、1.65-101g乙二胺四乙酸、100-300mL二甲基亚砜、1.45-7.36g柠檬酸钠，用水补至1L。
此外，本发明还提供了上述保存液的制备方法，包括如下步骤：
将上述各原料混合，并补水，得到混合液；
调节所述混合液的pH至7.5～8.5，再进行过滤，得到所述保存液。
进一步地，所述过滤为将调节pH后的混合液通过0.22μm滤膜进行过滤。
此外，本发明还提供了上述保存液在保存含细菌样品中的应用。
进一步地，所述含细菌样品为粪便、唾液、土壤、沙石、沙土或肥料。优选为粪便。
此外，本发明还提供了一种试剂盒，包括上述保存液。
进一步地，所述保存液中包括呈化学惰性的球状体。
进一步地，将所述保存液分装于储样装置中，所述保存液的体积为所述储样装置体积的0.5-0.7倍，优选为0.6倍；
所述球状体的直径为所述储样装置内径的0.8倍以下，优选为0.5倍以下。
优选地，所述储样装置为螺口管。
进一步地，所述球状体的直径为0.01-5cm。
进一步地，所述球状体为锆珠、玻璃珠或陶瓷珠中的至少一种。优选为锆珠。
此外，本发明还提供了一种含细菌样品的保存方法，包括如下步骤：
采集含细菌样品，并将其与含呈化学惰性的球状体的保存液混合，摇匀后保存。
进一步地，所述保存方法，包括如下步骤：
向储样装置中加入所述球状体和保存液；
再向所述储样装置中加入含细菌样品，摇匀，室温静置保存。
进一步地，所述保存液的体积为所述储样装置体积的0.5-0.7倍，优选为0.6倍；
所述球状体的直径为所述储样装置内径的0.8倍以下，优选为0.5倍以下。
进一步地，所述球状体的直径为0.01-5cm。
优选地，所述储样装置为螺口管。
进一步地，所述球状体为锆珠、玻璃珠或陶瓷珠中的至少一种。优选为锆珠。
进一步地，所述含细菌样品体积为所述保存液的体积的0.25倍以下。
进一步地，所述室温是指15-30℃，优选为20-25℃。
进一步地，所述保存液中包括如下浓度的原料：
Figure BDA0001706895140000041
进一步地，所述保存液的pH为7.5～8.5。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所提供的保存液，通过合理配置各原料，利用特定含量的二甲基亚砜增加生物膜的通透性，从而可携带保存液体系中的物质顺利通过微生物细胞膜，进而能保护细胞内的核酸；利用高含量的氯化钠能够使得保存液与微生物细胞更好的接触以便于发挥保护作用，同时，高含量的氯化钠有助于匀质，也可以使微生物细胞快速脱水，进而固定了样本体系中微生物的组成；将乙二胺四乙酸、柠檬酸钠和二甲基亚砜按特定配比配合使用，使得乙二胺四乙酸和柠檬酸钠可以通过微生物细胞膜，使其快速与生物膜内外的二价离子结合或形成络合物，抑制核酸酶活性，更有利于保护和稳定核酸。
(2)本发明所提供的含细菌样品的保存方法，采集含细菌样品，并将其与含若干呈化学惰性的球状体的保存液混合，摇匀后保存。通过利用若干呈化学惰性的球状体对保存液中的含细菌样品进行匀质化(混匀)操作，可实现保存液与含细菌样品的充分混合，进而有效保存含细菌样品(粪便样本)中微生物的相对含量，避免微生物因含细菌样品结块等因素所造成的相对比例发生变化的问题。
(3)本发明所提供的含细菌样品的保存方法，优化保存液的体积为所述试样管体积的比例、球状体的直径与试样管内径的比例、含细菌样品体积与保存液的体积的比例，能更进一步地提高保存液与含细菌样品的匀质程度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明实施例中志愿者L属水平物种分布情况；
图1b为本发明实施例中志愿者S属水平物种分布情况；
图2a为本发明实施例中基于Bray curtis距离的PCoA分析结果；
图2b为本发明实施例中基于unweighted unifrac距离的PCoA分析结果；
图2c为本发明实施例中基于weighted unifrac距离的PCoA分析结果；
图2d为本发明实施例中基于Bray curtis距离Average方法的hcluster tree分析结果。
图2e为本发明实施例中志愿者L属水平物种分布图；
图2f为本发明实施例中志愿者S属水平物种分布图；
图3a为本发明实施例中基于Bray curtis距离的PCoA分析结果；
图3b为本发明实施例中基于unweighted unifrac距离的PCoA分析结果；
图3c为本发明实施例中基于weighted unifrac距离的PCoA分析结果；
图3d为本发明实施例中基于Bray curtis距离Average方法的hcluster tree分析结果；
图3e为本发明实施例中志愿者L属水平物种分布图；
图3f为本发明实施例中志愿者S属水平物种分布图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述各实施例和试验例中所用的P1保存液为RNAlater Stabilization Solution(货号：AM7021)；P2保存液为DNA-EZ Reagents F DNA(货号：B6447711-0025)；P4保存液为Stool Collection Tube with DNA stabilizer(货号：1038111200)。
一、保存液及其制备方法：
实施例1
本实施例提供了一种保存液及其制备方法。该1L保存液中含有200g氯化钠、100mM(33.621g)乙二胺四乙酸、200mL二甲基亚砜、25mM(7.3525g)柠檬酸钠，用水补至1L；同时，该保存液的pH维持在8.0；
上述保存液的制备方法，包括如下步骤：
先用去离子水将氯化钠配制成氯化钠水溶液；
再向其中加入乙二胺四乙酸、二甲基亚砜和柠檬酸钠，并补水至1L，放在磁力搅拌器上进行充分混匀；
最后，采用氢氧化钠调节其pH至8.0，当无可溶性沉淀后，采用0.22μm滤膜进行过滤，得到保存液。
实施例2
本实施例提供了一种保存液及其制备方法。该1L保存液中含有220g氯化钠、1.65g乙二胺四乙酸、300mL二甲基亚砜、1.45g柠檬酸钠，用水补至1L；同时，该保存液的pH维持在7.5；
上述保存液的制备方法，包括如下步骤：
先用去离子水将氯化钠配制成氯化钠水溶液；
再向其中加入乙二胺四乙酸、二甲基亚砜和柠檬酸钠，并补水至1L，放在磁力搅拌器上进行充分混匀；
最后，采用氢氧化钠调节其pH至7.5，当无可溶性沉淀后，采用0.22μm滤膜进行过滤，得到保存液。
实施例3
本实施例提供了一种保存液及其制备方法。该1L保存液中含有150g氯化钠、101g乙二胺四乙酸、100mL二甲基亚砜、4.32g柠檬酸钠，用水补至1L；同时，该保存液的pH维持在8.5；
上述保存液的制备方法，包括如下步骤：
先用去离子水将氯化钠配制成氯化钠水溶液；
再向其中加入乙二胺四乙酸、二甲基亚砜和柠檬酸钠，并补水至1L，放在磁力搅拌器上进行充分混匀；
最后，采用氢氧化钠调节其pH至8.5，当无可溶性沉淀后，采用0.22μm滤膜进行过滤，得到保存液。
实施例4
本实施例提供了一种保存液及其制备方法。该1L保存液中含有210g氯化钠、50.45g乙二胺四乙酸、250mL二甲基亚砜、3.21g柠檬酸钠，用水补至1L；同时，该保存液的pH维持在8.2；
上述保存液的制备方法，包括如下步骤：
先用去离子水将氯化钠配制成氯化钠水溶液；
再向其中加入乙二胺四乙酸、二甲基亚砜和柠檬酸钠，并补水至1L，放在磁力搅拌器上进行充分混匀；
最后，采用氢氧化钠调节其pH至8.2，当无可溶性沉淀后，采用0.22μm滤膜进行过滤，得到保存液。
实施例5
本实施例提供了一种保存液及其制备方法。该1L保存液中含有170g氯化钠、10.68g乙二胺四乙酸、128mL二甲基亚砜、5..05g柠檬酸钠，用水补至1L；同时，该保存液的pH维持在7.8；
上述保存液的制备方法，包括如下步骤：
先用去离子水将氯化钠配制成氯化钠水溶液；
再向其中加入乙二胺四乙酸、二甲基亚砜和柠檬酸钠，并补水至1L，放在磁力搅拌器上进行充分混匀；
最后，采用氢氧化钠调节其pH至7.8，当无可溶性沉淀后，采用0.22μm滤膜进行过滤，得到保存液。
二、试剂盒：
实施例6
本实施例提供了一种试剂盒，其包括上述实施例1-5中任一项所述保存液。进一步地，该保存液中包括呈化学惰性的球状体。
在制备试剂盒时，将上述实施例1-5中任一项所述保存液分装于储样装置中，所述保存液的体积为所述储样装置体积的0.5-0.7倍，优选为0.6倍；
所述球状体的直径为所述储样装置内径的0.8倍以下，优选为0.5倍以下。例如，球状体的直径为0.01-5cm，球状体为锆珠、玻璃珠或陶瓷珠中的至少一种，优选为锆珠，所述储样装置为螺口管。
实施例6-1、一种具体的实施方式是将上述实施例1-5中任一项所述保存液在超净工作台中将其分装到25mL无菌的无色透明螺口管，管内含0.5cm无菌锆珠三颗，每管分装至管体刻度线13mL处，备用。
三、含细菌样品的保存方法：
实施例7
本实施例提供了一种含细菌样品的保存方法，包括如下步骤：
采集管选择25mL无菌的无色透明螺口管，在其中加入直径为0.5cm的锆珠三颗，并加入13mL上述实施例1中的保存液，并保证锆珠的直径为采集管内径的0.8倍以下；
用小勺挖取新鲜粪便样本转入含有锆珠和保存液的螺口管中，使得液面达到20mL刻度线，并保证新鲜粪便样本体积为保存液的体积的0.25倍以下，拧紧管盖，用手充分摇匀，室温静置保存。
实施例8
本实施例提供了一种含细菌样品的保存方法，包括如下步骤：
采集管选择25mL无菌的无色透明螺口管，在其中加入直径为0.2cm的锆珠两颗，并加入12.5mL上述实施例2中的保存液，并保证锆珠的直径为采集管内径的0.8倍以下；
用小勺挖取新鲜粪便样本转入含有锆珠和保存液的螺口管中，并保证新鲜粪便样本体积为保存液的体积的0.25倍以下，拧紧管盖，用手充分摇匀，室温静置保存。
实施例9
本实施例提供了一种含细菌样品的保存方法，包括如下步骤：
采集管选择25mL无菌的无色透明螺口管，在其中加入直径为0.01cm的锆珠四颗，并加入17.5mL上述实施例3中的保存液，并保证锆珠的直径为采集管内径的0.8倍以下；
用小勺挖取新鲜粪便样本转入含有锆珠和保存液的螺口管中，并保证新鲜粪便样本体积为保存液的体积的0.25倍以下，拧紧管盖，用手充分摇匀，室温静置保存。
实施例10
本实施例提供了一种含细菌样品的保存方法，包括如下步骤：
采集管选择25mL无菌的无色透明螺口管，在其中加入直径为0.4cm的锆珠一颗，并加入15mL上述实施例4中的保存液，并保证锆珠的直径为采集管内径的0.8倍以下；
用小勺挖取新鲜粪便样本转入含有锆珠和保存液的螺口管中，并保证新鲜粪便样本体积为保存液的体积的0.25倍以下，拧紧管盖，用手充分摇匀，室温静置保存。
实施例11
本实施例提供了一种含细菌样品的保存方法，包括如下步骤：
采集管选择25mL无菌的无色透明螺口管，在其中加入直径为0.1cm的锆珠三颗，并加入15mL上述实施例5中的保存液，并保证锆珠的直径为采集管内径的0.8倍以下；
用小勺挖取新鲜粪便样本转入含有锆珠和保存液的螺口管中，并保证新鲜粪便样本体积为保存液的体积的0.25倍以下，拧紧管盖，用手充分摇匀，室温静置保存。
四、试验例：
试验例1
采集两名志愿者(L、S)的新鲜粪便样本(采集时，先排尽尿液避免尿液污染粪便，挖取排出粪便的中段，避免肛门微生物的污染，且能够更好的反映肠道微生物的情况及分布)。采用实施例1中的保存液(P3)将新鲜粪便采集到分装好的保存液中。操作方法如下：将新鲜粪便采集分装至管中，直至液面到达20mL刻度线，用手充分摇晃管体，至无悬浮颗粒为止。其他三种保存液(P1、P2、P4)按照说明进行采集操作。时间点设置：0天(新鲜粪便)，3天，7天，15天，30天。按照时间点设置对样本进行对应管数的分装并常温保存。新鲜样本采集后直接进行DNA抽提操作，其他分装于保存液中的样本待到达设置时间时，进行DNA(基因组)抽提操作；
(一)、样本核酸(DNA)抽提、16S rRNA基因PCR扩增、DNA文库建库及高通量测序：
将上述保存液样本，混匀后吸取1mL放置于2mL螺口管中，14,000rpm，离心5min，获得沉淀，去除上清液进行后续DNA抽提操作，其他不同保存液根据操作说明进行后续DNA抽提操作。核酸抽提采用Stool DNAKit(货号：D4015，Omega Bio-Tek)，在核酸裂解部分加入0.1mm玻璃珠(品牌：BioSpec)，采用25Hz/s击打10min。将抽提DNA样本按照10ng/μL进行稀释操作，采用1μL为模板进行16S rRNA基因V3-V4可变区扩增(21cycles)，紧接着完成接头及Index扩增的建库操作，进而形成文库，将PCR产物进行纯化、定量、等摩尔体积混合后，形成测序文库，将测序文库纯化后，采用Illumina Miseq测序平台对文库进行测序。
(二)、生物信息学及统计学分析：
将测序获得的原始数据(Rawdata)经过质控、拼接后获得优化序列(Cleandata)，质控标准如下：1)标签序列必须完全匹配；2)双端序列重叠区(Overlap)小于50bp的序列舍弃；3)重叠区错误率大于0.1的序列舍弃；4)拼接后短于400bp的序列舍弃。
经过如上质控后获得的优化序列进行OTU聚类，分类注释后，观测本示例两位志愿者在本示例保存液(P3)样本属水平(高通量测序常用于讨论问题的分类学水平)与新鲜样本物种分布比较结果，如图1a-1b和表1a-1b。图1中横坐标代表不同样本，纵坐标代表不同颜色色块代表不同物种在样本中所占的百分比，从两位志愿者不同时间点的样本观测后，各物种比例浮动不大，即说明两个自愿者不同时间点的样本具有一定相似性；
表1a志愿者L属水平主要物种丰度百分比
Taxon L-Fresh L-3d L-7d L-15d L-30d
Prevotella 34％ 43％ 39％ 28％ 26％
Ruminococcaceae_uncultured 16％ 12％ 14％ 23％ 26％
Succinivibrio 14％ 15％ 16％ 14％ 13％
Faecalibacterium 5％ 7％ 9％ 11％ 12％
Lachnospiraceae_incertae_sedis 3％ 3％ 2％ 2％ 2％
S24-7_norank 3％ 2％ 2％ 3％ 2％
Bacteroides 2％ 1％ 1％ 2％ 2％
Alloprevotella 2％ 3％ 1％ 1％ 1％
表1b志愿者S属水平主要物种丰度百分比
Taxon S-Fresh S-3d S-7d S-15d S-30d
Prevotella 47％ 49％ 47％ 44％ 41％
Faecalibacterium 13％ 11％ 17％ 21％ 22％
Lachnospira 5％ 4％ 3％ 3％ 3％
Bacteroides 5％ 7％ 4％ 5％ 5％
Dialister 3％ 2％ 2％ 1％ 1％
Alloprevotella 3％ 5％ 3％ 3％ 4％
Lachnospiraceae_incertae_sedis 3％ 3％ 3％ 2％ 2％
Pseudobutyrivibrio 3％ 1％ 2％ 2％ 2％
Ruminococcaceae_uncultured 2％ 4％ 4％ 5％ 5％
Roseburia 2％ 1％ 1％ 1％ 1％
Coprococcus 2％ 1％ 1％ 2％ 3％
Subdoligranulum 2％ 1％ 1％ 1％ 1％
Lachnospiraceae_unclassified 1％ 3％ 4％ 4％ 3％
(三)、两名志愿者自身样本在不同保存液(P1～P4)、不同保存时间样本的beta(β)多样性分析：
β多样性分析常用于分析不同样本间的差异程度，因此基于高通量测序结果，进行了多种β多样性分析，用于说明在个体志愿者不同保存液样本中随着时间变化，样本的差异程度(图2a～图2d)，同时对属水平物种分布进行了比较(图2e～图2f)。采用基于Braycurtis距离，Unifrac距离(加权weighted和非加权unweighted)进行平行分析。通过PCoA，hcluster Tree(average方法)两种展现形式分析结果相似性。其中Bray Curtis距离常用于衡量物种组成差异度，计算基于样本中不同物种组成的数量特征。Unifrac距离是基于系统进化关系的算法，用于衡量样本群落之间的进化关系。Unweighted Unifrac(非加权Unifrac距离)考虑了样本中物种种类的有无，Weighted U nifrac(加权Unifrac距离)考虑了样本中物种种类及丰度。利用属水平柱状图观察样本间相似程度(图2e～图2f)。
以上结果可以看出，志愿者L和志愿者S不同保存液的不同时间点均可以聚类成两个部分，说明不同保存液不用时间点对志愿者L和S的粪便菌群均具有一定保护和维持作用，但本实施例1保存液(P3)，与新鲜样本(Fresh)的在图中的距离相对较近，其他种类保存液(P1、P2、P4)个别在短期内跟新鲜样本距离相对较近，说明本实施例1中的保存液(P3)中样本菌群在不同时间点的相似度与新鲜样本(Fresh)更为接近(图2a～图2c)。从聚类分析结果上看，也能观测出本实施例1中保存液(P3)的样本可以与新鲜样本聚成一类而其他种类保存液样本个别在短期内跟新鲜样本聚成一类。同时，志愿者L和志愿者S属水平物种组成及丰度使用本实施例1中保存液(P3)，在30天内，物种组成与新鲜样本(L_Fresh和S_Fresh)较为接近(图2e)。进而印证，本实施例1中保存液不同时间点的样本与新鲜样本群类分布种类和丰度更为相似。
试验例2
含锆株的本实施例1中保存液与不含锆珠的本实施例1中的保存液样本间的beta(β)多样性分析：为说明锆珠在本实施例1中的作用，进行了重新测试，选择了两名志愿者(L和S)重新进行粪便采集并进行后续实验，实验时间点设置0天(新鲜粪便样本)、7天、15天、30天四个时间节点，每个节点设置三次重复。按照本实施例1配置保存液(并采用实施例6-1配制成试剂盒)和不含锆珠的保存液，按照实施例7进行样本采集；按照试验例1(一)和试验例1(二)进行实验操作和生物信息学分析。采用基于Bray curtis距离，Unifrac距离(加权weighted和非加权unweighted)进行平行分析。通过PCoA，hcluster Tree(average方法)两种展现形式分析结果相似性以及属水平柱状体观测物种分布的相似性(图3a-图3f)。
结合以上结果可以看出，基于Bray curtis距离PCoA分析看出本实施例1配置保存液(并采用实施例6-1配制成试剂盒，含锆珠，Beads)保存液样本更倾向于与新鲜样本(Fre)菌群组成更加相似(图3a)。其中，志愿者L的30天测试样本有些偏移，但还是与不含锆珠保存液样本15d内的菌群结果更加相似，说明加入锆珠进行匀质化，更有利于维持样本菌群的稳定(图2a-L组)。基于Unifrac距离的PCoA分析中，在仅仅考虑物种有无情况的UnweightedUnifrac PCoA分析中，两位志愿者L和S在本实施例1配置保存液(含锆珠)样本和不含锆珠保存液样本中物种有无情况相当，即菌群种类十分相似导致样本点无法形成分开趋势，说明保存液可以给予样本菌群种类上的维持和稳定(图3b)；在考虑物种有无和物种丰度情况的Weighted Unifrac PCoA分析中，本实施例1配置保存液(含锆珠)样本与新鲜样本组成与丰度更为接近，在图中样本点更加靠近(图3c)。同样地，基于Bary Curtis距离的UclusterTree分析中，可以看出本实施例1配置保存液(含锆珠)样本与新鲜样本的聚类更加接近，甚至出现相互穿插，说明物种种类和数量上更加接近(图3d)。再者，通过志愿者S和志愿者L属水平物种分布图，观测到本实施例1配置保存液(含锆珠)与不含锆珠保存液物种组成上十分接近，然而，在物种丰度上，不含锆珠的保存液个别物种的丰度变化波动较大，而本实施例1配置保存液(含锆珠)相对较为稳定(图3e～图3f)。综上，本实施例1配置保存液(含锆珠)对维持物种种类和物种丰度上具有较好的维持性和稳定性。
同样，采用实施例8-11中的含细菌样品的保存方法，得到了与试验例1和2相似，甚至相同的结论，再次印证本发明的保存液和保存方法能有效维持样本中微生物的相对含量不变和保存遗传物质。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种含细菌的粪便样品的保存液，其特征在于，所述保存液中的组分如下：
氯化钠 200g/L
乙二胺四乙酸 100mM/L
二甲基亚砜 200ml/L
柠檬酸钠 25mM/L；
所述保存液的pH为8.0；
所述保存液中加入呈化学惰性的球状体。
2.权利要求1所述的保存液的制备方法，包括如下步骤：
将上述各原料混合，并补水，得到混合液；
调节所述混合液的pH至8.0，再进行过滤，得到所述保存液。
3.权利要求1所述的保存液在保存含细菌的粪便样品中的应用。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的保存液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，将所述保存液分装于储样装置中，所述保存液的体积为所述储样装置体积的0.5-0.7倍；
所述球状体的直径为所述储样装置内径的0.8倍以下。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述球状体的直径为0.01-5cm。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述球状体为锆珠、玻璃珠或陶瓷珠中的至少一种。
8.一种含细菌样品的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集含细菌的粪便样品，并将其与权利要求1中所述的含呈化学惰性的球状体的保存液混合，摇匀后保存。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
向储样装置中加入所述含球状体的保存液；
再向所述储样装置中加入含细菌的粪便样品，摇匀，室温静置保存。
10.根据权利要求9所述的保存方法，其特征在于，所述保存液的体积为所述储样装置体积的0.5-0.7倍。
11.根据权利要求9或10所述的保存方法，其特征在于，所述含细菌的粪便样品体积为所述保存液的体积的0.25倍以下。
CN201810662867.1A 2018-06-25 2018-06-25 一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用 Active CN108977372B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810662867.1A CN108977372B (zh) 2018-06-25 2018-06-25 一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810662867.1A CN108977372B (zh) 2018-06-25 2018-06-25 一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108977372A CN108977372A (zh) 2018-12-11
CN108977372B true CN108977372B (zh) 2021-04-06

Family

ID=64538205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810662867.1A Active CN108977372B (zh) 2018-06-25 2018-06-25 一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108977372B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110272897B (zh) * 2019-06-26 2021-05-07 成都罗宁生物科技有限公司 肠道内容物样本保存液及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575286A (zh) * 2009-04-20 2012-07-11 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 生物样本采集/运输组合物及方法
CN105543095A (zh) * 2016-03-04 2016-05-04 微基生物科技（上海）有限公司 一种富含有机质的微生物样品的保存试剂、包含该保存试剂的试剂盒及其应用
CN106755442A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 苏州普瑞森基因科技有限公司 一种粪便微生物样品dna保存液
CN107988076A (zh) * 2017-12-19 2018-05-04 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种粪便保存液及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575286A (zh) * 2009-04-20 2012-07-11 长角牛疫苗和诊断有限责任公司 生物样本采集/运输组合物及方法
CN105543095A (zh) * 2016-03-04 2016-05-04 微基生物科技（上海）有限公司 一种富含有机质的微生物样品的保存试剂、包含该保存试剂的试剂盒及其应用
CN106755442A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 苏州普瑞森基因科技有限公司 一种粪便微生物样品dna保存液
CN107988076A (zh) * 2017-12-19 2018-05-04 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种粪便保存液及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
粪微生态制品保存方法;王健等;《中国微生态学杂志》;20180615;第30卷(第6期);659-662页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108977372A (zh) 2018-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Advances in metagenomics and its application in environmental microorganisms
Liang et al. Long-term soil transplant simulating climate change with latitude significantly alters microbial temporal turnover
Semenov Metabarcoding and metagenomics in soil ecology research: achievements, challenges, and prospects
Zhou et al. The preceding root system drives the composition and function of the rhizosphere microbiome
Yoo et al. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis
CN103993007B (zh) 一种从土壤样品中高效提取dna的简易方法
US11401561B2 (en) Primer composition for analyzing intestinal flora and application thereof
Yuan et al. Single-cell genomic analysis in plants
CN104769111A (zh) 用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法
Puchta et al. Low RIN value for RNA-seq library construction from long-term stored seeds: a case study of barley seeds
CN105543095A (zh) 一种富含有机质的微生物样品的保存试剂、包含该保存试剂的试剂盒及其应用
CN107904296A (zh) 一种基于深度测序检测玉米根际土壤微生物的方法及系统
CN108977372B (zh) 一种含细菌样品的保存方法、保存液、制备方法及应用
Wegl et al. Toward best practice in livestock microbiota research: a comprehensive comparison of sample storage and DNA extraction strategies
Bandopadhyay et al. Structural and functional responses of soil microbial communities to biodegradable plastic film mulching in two agroecosystems
CN110358816B (zh) 一种用于鸡来源细胞pcr检测的引物组、试剂盒及应用
Wang et al. Distribution and co-occurrence patterns of antibiotic resistance genes in black soils in Northeast China
Levin et al. Optimization for sequencing and analysis of degraded FFPE-RNA samples
Ma et al. Single-cell RNA sequencing of plant-associated bacterial communities
CN113265453A (zh) 一种全流程质控的菌群高通量测序检测方法及应用
CN105296466A (zh) 一种单细胞全基因组扩增方法
CN107365840A (zh) 基于dna条形码的鹿科动物快速鉴定试剂盒及其应用
Wang et al. Studying safe storage time of orange peel (Citrus reticulata) using high‐throughput sequencing and conventional pure culture
CN113528614B (zh) 一种植物叶际表面微生物宏基因组检测方法
Goss-Souza et al. Biogeographic responses and niche occupancy of microbial communities following long-term land-use change

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant