CN107988076B - 一种粪便保存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粪便保存液及其应用。本发明的粪便保存液利用乙醇作为固定剂、柠檬酸钠作为固定辅助剂、EDTA‑二钠为抗凝剂、Tris‑HCl为缓冲液、NaCl为离子强度维持剂，并配方有十二烷基硫酸钠，经过合理组方，能够稳定粪便样品中微生物的数量、组成和丰度，可以保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存，相对于现有的保存液，不仅保存效果好，而且不含有硫氰酸胍等有毒成分，操作更安全。

Description

一种粪便保存液及其应用

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种粪便保存液及其应用。

背景技术

肠道微生物是指动物肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠动物的肠道生活，同时帮助寄主完成多种生理生化功能。传统的肠道微生物研究，主要通过DGGE、FISH、qPCR等方法，随着测序技术的发展，肠道宏基因组测序已成为研究肠道微生物的有力手段。肠道宏基因组测序可以分析肠道菌群的组成、多样性和相对丰度，进而分析微生物与肠道微环境、疾病、药物、治疗之间的关系，还能发现具有特定功能的基因。肠道宏基因组测序又分为扩增子测序和全基因组测序，其中扩增子测序可以通过对人体肠道菌群16S rRNA基因可变区域进行扩增，对得到的扩增子进行测序和生物信息分析，获得肠道菌群的组成、多样性和相对丰度等信息。

肠道微生物在离体后，因取样地点与实验条件的限制，无法进行及时的核酸提取，会导致菌群的数量、种类及丰度发生变化，粪便是提取肠道微生物核酸的来源，如何在收集粪便后保证肠道菌群的稳定，是提高肠道宏基因组测序分析准确性的关键。传统采用冷藏法保存粪便，即粪便采集后存放于-20℃或更低的温度中，使其中的肠道微生物处于低代谢速率下，在一段时间内稳定菌群的数量与组成，然而冷藏法依然受限于采样条件，对于样品运输来说需要更高的成本，并且保存质量会因为是否冷藏及时产生较大的影响。因此，开发一种能够有效保持粪便样品中肠道菌群的稳定性，且无毒或腐蚀成分，不妨碍下游检测，操作安全方便的粪便保存液，具有很高的市场价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种粪便保存液，包括：固定剂60％～70％(v/v)、固定辅助剂0.5％～1％(w/v)、抗凝剂1％～2％(w/v)、缓冲液2～20mM、离子强度维持剂0.5％～1％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.01％～0.1％(w/v)，余量为水。

优选的，所述固定剂为乙醇。

优选的，所述固定辅助剂选自柠檬酸盐。

优选的，所述十二烷基硫酸钠含量为0.02％～0.05％(w/v)。

其中，抗凝剂选自EDTA及其可溶性盐；缓冲液选自Tris-HCl、磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液；离子强度维持剂选自氯化钠、氯化钾。

更进一步优选的，一种粪便保存液，包括：乙醇60％～70％(v/v)、柠檬酸盐0.5％～1％(w/v)、EDTA-二钠1％～2％(w/v)、Tris-HCl 2～20mM、NaCl 0.5％～1％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.01％～0.1％(w/v)，余量为水。

作为一种示例，所述粪便保存液包括：乙醇60％(v/v)、柠檬酸钠0.74％(w/v)、EDTA-二钠1.5％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.9％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.05％(w/v)，余量为水。

作为一种示例，所述粪便保存液包括：乙醇70％(v/v)、柠檬酸钠1％(w/v)、EDTA-二钠1.86％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.75％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.02％(w/v)，余量为水。

作为上述优选的方式，所述粪便保存液的pH为7.5～8。

本发明的又一目的在于提供上述的粪便保存液的制备方法，将配方中难溶于固定剂的组分用水溶解，再加入固定剂，最后用水定容，调节pH后，灭菌即得粪便保存液。

本发明的再一目的在于提供上述的粪便保存液保存粪便的方法，每1g粪便样本至少添加2mL粪便保存液。

本发明的有益效果是：

本发明的粪便保存液利用乙醇作为固定剂、柠檬酸钠作为固定辅助剂、EDTA-二钠为抗凝剂、Tris-HCl为缓冲液、NaCl为离子强度维持剂，并配方有十二烷基硫酸钠，经过合理组方，能够稳定粪便样品中微生物的数量、组成和丰度，可以保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存，相对于现有的保存液，不仅保存效果好，而且不含有硫氰酸胍等有毒成分，操作更安全。

附图说明

图1是门水平组成分析图；

图2是PCA分析图；

图3是PCoA分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步解释本发明，但不限于此。实施例中未注明具体技术或条件的，按本领域内文献描述或产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明产商的，均可通过市购获得。

实施例1

一种粪便保存液(以下简称保存液1)包括：乙醇60％(v/v)、柠檬酸钠0.74％(w/v)、EDTA-二钠1.5％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.9％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.05％(w/v)，余量为去离子水。将配方中难溶于醇的组分用去离子水溶解，再加入乙醇，最后用去离子水定容，调节pH至8.0后，灭菌即得。

实施例2

一种粪便保存液(以下简称保存液2)包括：乙醇70％(v/v)、柠檬酸钠1％(w/v)、EDTA-二钠1.86％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.75％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.02％(w/v)，余量为去离子水。将配方中难溶于醇的组分用去离子水溶解，再加入乙醇，最后用去离子水定容，调节pH至7.5后，灭菌即得。

对比例1

一种粪便保存液(以下简称对比液1)包括：柠檬酸钠0.74％(w/v)、EDTA-二钠1.5％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.9％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.05％(w/v)，余量为去离子水。将配方中的组分用去离子水溶解、定容，调节pH至8后，灭菌即得。

对比例2

一种粪便保存液(以下简称对比液2)包括：乙醇70％(v/v)、柠檬酸钠0.74％(w/v)、EDTA-二钠1.86％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.9％(w/v)，余量为去离子水。将配方中难溶于醇的组分用去离子水溶解，再加入乙醇，最后用去离子水定容，调节pH至7.5后，灭菌即得。

对比例3

一种粪便保存液(以下简称对比液3)包括：乙醇50％(v/v)、柠檬酸钠0.74％(w/v)、EDTA-二钠1.5％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.9％(w/v)，吐温-20 0.05％(v/v)，余量为去离子水。将配方中难溶于醇的组分用去离子水溶解，再加入乙醇，最后用去离子水定容，调节pH至7.5后，灭菌即得。

诺辉保存液

参考专利CN104073564A，配制一种粪便样品稳定液(以下检测诺辉保存液)，包括：EDTA-二钠0.24％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.75％(w/v)，硫氰酸胍0.05M，余量为去离子水。将配方中的组分用去离子水溶解、定容，调节pH至7.5后，灭菌即得。

实验例

以一名健康的志愿者为例，粪便中段取样(>10g)放入采集盒中，先取200mg新鲜样本进行后续检测，作为起始检测结果，其余平行分成7份，分别进行如下处理：设置保存液1组、保存液2组、对比液1组、对比液2组、对比液3组、诺辉保存液组，以上各组均按1g粪便样本加入4mL对应的保存液，室温储存；-80℃组则取1g粪便样本，直接-80℃冻存；在7d、14d和30d进行统一测试，未添加保存液的样本测试前按1g粪便样本添加4mL无菌去离子水混匀后进行测定。

测试1、粪便DNA提取

采用天根粪便DNA提取试剂盒，具体步骤如下：

1.震荡混匀样本，吸取750ul样本至2mL离心管，5000rpm 5min；

2.弃上清，加入1.4mL缓冲液GSL，间歇震荡至样本混匀，干浴95℃10min；

3.涡旋震荡15s，12000rpm离心1min；

4.转移全部上清液至2mL离心管，加入1个抑制剂吸附片Inhibit EX，震荡至吸附片打开重悬，室温孵育1min，12000rpm离心3min，

5.转移上清液至1.5mL离心管，12000rpm离心3min，

6.转移上清液至新的1.5mL离心管，加入15ul Proteinase k，加入200ul缓冲液GB，加入2ul RNA酶，涡旋15s，干浴70℃孵育30min(简短离心以收集壁上和盖上的液体)，

7.轻甩几秒，加入200ul无水乙醇，涡旋混匀(简短离心以收集壁上和盖上的液体)，取样本于吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，之后再将收集管的液体倒回吸附柱CR2，12000rpm离心30s，

8.倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中，加入500ul缓冲液GD(使用前应注意是否已加入无水乙醇)，12000rpm 30s，之后将废液倒回吸附柱CR2，12000rpm离心30s，倒掉废液，换个收集管，加入500ul缓冲液GD，12000rpm 30s，

9.倒掉废液，换个收集管，加入600ul漂洗液PW(使用前应注意是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，

10.再倒掉废液，换个收集管，再加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，

11.换个收集管，再12000rpm离心3min，倒掉废液，

12.将吸附柱装入一个1.5mL的干净的离心管，打开盖子静置2min，

13.向吸附膜的中间部位加入50ul洗脱液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min。

按上述方法获得的提取产物进行Nanodrop检测，起始检测结果为686.491ng/μL，监控时间点检测结果如下表1所示，可见7d后，保存液1组、保存液2组、对比液1组、诺辉保存液组均呈现不同程度的DNA浓度下降，但趋于稳定，其中保存液1组的效果最佳，保存液2组次之；而对比液2组和对比液3组在保存7d时DNA浓度大幅下降之余，14d和30d检测出现DNA浓度逐步提高，说明在这两种保存液下，并不能稳定微生物的数量。

表1、提取产物Nanodrop检测结果

测试2、门水平和属水平组成分析

将各组提取的粪便DNA用于扩增16S rRNA基因的V3高变区序列，通过分析16SrRNA基因V3高变区序列信息，得出人肠道菌群的组成和相对丰度。具体是采用PCR法构建16S rRNA基因V3区的扩增子文库、磁珠法筛选目的片段、文库质检、One Touch 2乳液PCR、ES纯化、Ion Proton上机测序，对获得的测序数据进行生物信息学分析。

图1给出各组的门水平组成分析结果，随着时间的推移，对比液1组和诺辉保存液组可见显著的门组成比例变化。进一步根据各组输出的属水平组成分析结果，将各个监控节点的结果与原始检测结果进行相关性分析，获得相关系数如表2所示，可见保存液1、保存液2、对比液2、对比液3均显示出较好的维持属相对丰度的作用，与门水平分析一致。

表2、属水平相关系数

测试3、PCA和PCoA

主成分分析(PCA)是一种统计方法。通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。发明人在门水平下，基于原始的物种组成矩阵，对高维数据进行降维，去除噪声，用R语言中的软件包vegan,ggplot2完成分析和作图。

图2给出各组及初始检测结果在不同监控点下的PCA分析结果，随着时间的推移，对比液1组的点和诺辉保存液组的点开始慢慢远离初始点，表示对比液1和诺辉保存液保存的菌群组成随着时间的推移发生了变化。

主坐标分析(PCoA)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。发明人基于Unifrac分析得到的有权重的距离矩阵，通过PCoA观察不同处理间的差异，用R语言中的软件包ape,ggplot2完成分析和作图。

图3给出各组及初始检测结果在不同监控点下的PCoA分析结果，随着时间的推移，对比液1组的点和诺辉保存液组的点开始慢慢远离初始点，表示对比液1和诺辉保存液保存的菌群组成随着时间的推移发生了变化。

根据以上测试，对比液2组和对比液3组不能稳定粪便样品中微生物的数量，对比液1和诺辉保存液不能稳定粪便样品中微生物的组成和丰度，综合而言，保存液1和保存液2能稳定粪便样品中微生物的数量、组成和丰度，可以保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存。

Claims (7)

1.一种粪便保存液，包括：固定剂60％～70％(v/v)、固定辅助剂0.5％～1％(w/v)、抗凝剂1％～2％(w/v)、缓冲液2～20mM、离子强度维持剂0.5％～1％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.01％～0.1％(w/v)，余量为水；其中，固定剂为乙醇，固定辅助剂为柠檬酸盐。

2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于：所述十二烷基硫酸钠含量为0.02％～0.05％(w/v)

3.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于：包括：乙醇60％(v/v)、柠檬酸钠0.74％(w/v)、EDTA-二钠1.5％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.9％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.05％(w/v)，余量为水。

4.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于：包括：乙醇70％(v/v)、柠檬酸钠1％(w/v)、EDTA-二钠1.86％(w/v)、Tris-HCl 10mM、NaCl 0.75％(w/v)、十二烷基硫酸钠0.02％(w/v)，余量为水。

5.根据权利要求1～4任一项所述的粪便保存液，其特征在于：所述粪便保存液的pH为7.5～8。

6.权利要求1～5任一项所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于：将配方中难溶于固定剂的组分用水溶解，再加入固定剂，最后用水定容，调节pH后，灭菌即得粪便保存液。

7.权利要求1～5任一项所述的粪便保存液保存粪便的方法，其特征在于：每1g粪便样本至少添加2mL粪便保存液。