CN109750029B

CN109750029B - 一种适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液dna保存液

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Publication number: CN109750029B
Application number: CN201811647751.7A
Authority: CN
Inventors: 朱兴彪; 葛毅媛; 管亚伟; 谢龙旭; 王博; 徐爱娟
Original assignee: Chaozhou Kaipu Biochemistry Co ltd; Guangzhou Hybribio Medicine Technology Ltd; Guangzhou Hybribio Biotech Ltd
Current assignee: Chaozhou Kaipu Biochemistry Co ltd; Guangzhou Hybribio Medicine Technology Ltd; Guangzhou Hybribio Biotech Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109750029A

Abstract

本发明公开了一种适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液。该保存液由乙二胺四乙酸二钠(EDTA^.Na₂)、Tris‑HCl、亚硫酸氢钠、Proclin300组成。该保存液成分安全可靠，可在常温条件下保存尿液，保存条件温和，无需严格限制保存温度，常温即可；使用简单，直接把新鲜的尿液样品与本产品混合即可；而且保存时间长达6个月，在6个月内高效、长期保整DNA的完整性；提取纯化后DNA的长度在20～50 Kb之间，DNA无化学修饰；被保存的尿液非常适用于提取DNA用于生殖道病原菌的检测，具有很好的应用价值和推广前景。

Description

一种适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液

技术领域

本发明属于生物化学技术领域。更具体地，涉及一种适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液。

背景技术

尿液检查是医学的一种检测方式，因其获取简便、收集无创和可提供大量生理变化发展进程的信息，被临床广泛运用。尿液中存在许多潜在的生物标记物，包括代谢物质、细胞、蛋白、核酸等。这些生物标记物在检测药品的安全性、监测急慢性肾脏疾病和其他泌尿道感染等情况上具有突出的作用。

尿液是一种不稳定的物质，一经排出就会发生某些化学变化。为了发现新的生物标记物以及分析这些生物标记物的特异性和灵敏度，除了依靠高精密的现代化仪器和技术(蛋白组学、多肽组学、脂质组学、代谢组学)，高质量的样本更是必不可少，建立高质量的尿液标本保存体系是开展代谢性疾病、病原菌感染等重大疾病的重要环节。

现有针对该问题主要是加入特定的化学防腐剂，同时冷藏保存。现有的尿液保存液各有优缺点，存在保存效果欠佳、含对人体有害的物质、成分复杂、适用范围差异化等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有尿液保存液的缺陷和不足，提供一种可在常温条件下保存尿液的保存液，可在常温下保存尿液中脱落细胞DNA的完整，被保存的尿液非常适用于提取DNA用于生殖道病原菌的检测。

本发明目的是提供一种适于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液，由乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na₂)、Tris-HCl、亚硫酸氢钠、Proclin300组成。

优选地，乙二胺四乙酸二钠：Tris-HCl：亚硫酸氢钠的摩尔比＝0.5～1.5：1～1.5：4～6。

更优选地，乙二胺四乙酸二钠：Tris-HCl：亚硫酸氢钠的摩尔比＝1：1.25：5。

优选地，Proclin300的用量比按照如下比例计：1M乙二胺四乙酸二钠与Proclin300的体积比为3～5：3。

更优选地，Proclin300的用量比按照如下比例计：1M乙二胺四乙酸二钠与Proclin300的体积比为4：3。

另外，优选地，保存液的pH7.5～8.5。

更优选地，保存液的pH8.0。

基于上述保存液配方，可以组建一种适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液试剂盒，含有如下组分(各组分母液)：0.5M～1.5M pH7.5～8.5的乙二胺四乙酸二钠溶液、1M～1.5M pH7.5～8.5的Tris-HCl、2M～3M的亚硫酸氢钠溶液、Proclin300。

优选地，试剂盒中各组分母液浓度如下：1M pH8.0的乙二胺四乙酸二钠溶液、1.25M pH8.0的Tris-HCl、2.5M的亚硫酸氢钠溶液、Proclin300。

优选地，各溶液的溶剂均为超纯水。

上述非冻型尿液DNA保存液的制备方法是：将各组分混合后的溶液震荡混匀即可。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的尿液保存液，保存条件温和，无需严格限制保存温度，常温即可；使用简单，直接把新鲜的尿液样品与本产品混合即可；而且保存液成分安全可靠。

本发明的保存液对尿液样品的保存时间长达6个月，在6个月内高效、长期保整DNA的完整性，提取纯化后DNA的长度在20～50Kb之间，DNA无化学修饰；被保存的尿液非常适用于提取DNA用于生殖道病原菌的检测。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1非冻型尿液DNA保存液

1、一种非冻型尿液DNA保存液，各组分母液浓度如下：

(1)1M EDTA.Na₂(pH8.0)：

称取EDTANa₂·2H₂O 186.12g，加超纯水800mL，加热，剧烈搅拌，用约20～30gNaOH颗粒调pH至8.0，定容至1000mL。(EDTA二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时，才会溶解)。

(2)1.25M Tris-HCl(pH8.0)：

称取Tris碱121.2g，加超纯水800mL溶解，滴加浓HCL约40.0～50.0mL调pH至8.0，定容至1000mL。

(3)2.5M亚硫酸氢钠溶液：

称取亚硫酸氢钠260g加超纯水800mL溶解，定容至1000mL。

(4)proclin 300：市购。

2、上述非冻型尿液DNA保存液的工作液配方如表1。

表1工作液配方(1050mL)：

母液成分	母液体积
		1.0MEDTA.Na<sub>2</sub>	400mL
1.25MTris-HCl	400mL
		2.5M亚硫酸氢钠	200mL
proclin300	50mL

实施例2非冻型尿液DNA保存液

1、一种非冻型尿液DNA保存液，各组分母液浓度如下：

(1)0.5M EDTA.Na₂(pH8.0)：配制方法同实施例1。

(2)1M Tris-HCl(pH8.0)：配制方法同实施例1。

(3)2M亚硫酸氢钠溶液：配制方法同实施例1。

(4)proclin 300：市购。

2、上述非冻型尿液DNA保存液的工作液配方如表2。

表2工作液配方(1050mL)：

母液成分	母液体积
		0.5MEDTA.Na<sub>2</sub>	400mL
1MTRIS-HCl	400mL
		2M亚硫酸氢钠	200mL
proclin300	50mL

实施例3非冻型尿液DNA保存液

1、一种非冻型尿液DNA保存液，各组分母液浓度如下：

(1)1.5M EDTA.Na₂(pH8.0)：配制方法同实施例1。

(2)1.5M Tris-HCl(pH8.0)：配制方法同实施例1。

(3)3M亚硫酸氢钠溶液：配制方法同实施例1。

(4)proclin 300：市购。

2、上述非冻型尿液DNA保存液的工作液配方如表3。

表3工作液配方(1050mL)：

实施例4尿液保存实验

以实施例1的产品为例，验证本发明非冻型尿液DNA保存液对尿液的保存效果。同时以市购的华越洋生物的非冻型尿液DNA保存液(产品编号GK088013)为对照组进行实验对比。

1、尿液样本收集保存

分别取清晨首次尿(或至少1小时的长时间不排尿后的首段尿)，分为两组进行实验，每组尿液5～10mL，倒入含有各保存液(约1mL)的收集管中，混匀后常温保存。

使用Qubit3.0检测保存6个月内不同时间段的尿液中游离DNA的含量，多个并列测试结果取平均值。结果如表4所示。

表4两组尿液样品中DNA浓度(ng/μL)

表4可以看出，以加入保存液0天的浓度值为参考，两组保存半年内的游离DNA浓度变化均无显著差异，没有明显的基因组DNA释放和降解现象产生。

2、尿液保存后检测

在保存6个月内的不同时间段，分别提取各组尿液中脱落细胞的DNA，用于生殖道病原菌的检测。尿液DNA提取步骤如下：

(1)取含有保存液的样本收集管，低温冷冻离心机5000rpm离心5min，去上清，约剩＜1500uL，转移至1.5mL离心管；

(2)8000rpm离心5min，去上清，加入200μL溶液P或生理盐水；

(3)加入20μL蛋白酶K，混匀；

(4)加入200μL的溶液L，震荡混匀，75℃温浴10min；

(5)加入100μL异丙醇，充分混匀后，将液体转入带硅胶柱的2mL离心管中，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(6)在硅胶柱中加入500μL溶液W1(使用前先检查是否加入4mL无水乙醇(≥95％))，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

(7)在硅胶柱中加入500μL溶液W2(使用前先检查是否加入24mL无水乙醇(≥95％))，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(8)在硅胶柱中加入500μL溶液W2(使用前先检查是否加入24mL无水乙醇(≥95％))，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(9)将吸附柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，倒掉收集管中的废液；

(10)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，开盖静置1至2min，往吸附柱中心加入60～100μL的TE洗脱液(55～60℃预热)，静置2～5min，12000rpm离心2min，弃柱得DNA。

其中，需注意：为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。获得的DNA应保存在-20℃，以防DNA降解。

3、尿液检测结果

提取的DNA进行NG/CT/UU的检测以及HCMV的检测。检测结果显示，实验组的同一样本保存3个月、6个月后，提取DNA的病原检测结果和尿液样本刚收集时的检测结果完全一致，DNA降解率低于10％。

而对照组的检测结果显示，对于NG/CT/UU和HCMV的检测，保存6个月的样本DNA检测结果出现了明显的问题：样本常温保存3个月、6个月后实验检测结果和尿液样本刚收集时的检测结果相比较，各出现二例样本(总共10例样本)检测结果前后不一致的情况，该试剂可能在做荧光PCR的检测中可能存在不稳定因素；6个月后DNA的浓度降解率为15％左右。

表明本发明的尿液样本保存液用于尿液的保存，不仅保存条件温和(无需严格限制保存温度，常温即可)，且保存时间长达6个月；被保存的尿液非常适用于提取DNA用于生殖道病原菌的检测。

实施例5保存液配方的优化实验

分别以乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸替换乙二胺四乙酸二钠；分别以醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液替换Tris-HCl；分别以抗坏血酸、半胱氨酸盐、谷胱甘肽、、亚硒酸钠、硫脲替换亚硫酸氢钠；进行单因素实验和正反交实验，并同时对各组分的配比进行单因素实验和正反交实验，以实施例4中表4的指标进行筛选本发明的尿液DNA保存液配方。

结果显示，各组分及其配比需要严格控制，不合适的变化会引起保存液产品对尿液保存效果的本质影响。

并通过大量验证实验明确了，本发明的适用于生殖道病原菌检测的非冻型尿液DNA保存液，应由乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na₂)、Tris-HCl、亚硫酸氢钠、Proclin300组成。保存液的pH7.5～8.5。

配方比例如下：乙二胺四乙酸二钠：Tris-HCl：亚硫酸氢钠的摩尔比＝0.5～1.5：1～1.5：4～6；Proclin300的用量比按照如下比例计：1M乙二胺四乙酸二钠与Proclin300的体积比为3～5：3。

最佳配方比例为：乙二胺四乙酸二钠：Tris-HCl：亚硫酸氢钠的摩尔比＝1：1.25：5；Proclin300的用量比按照如下比例计：1M乙二胺四乙酸二钠与Proclin300的体积比为4：3。保存液的pH8.0。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种组合物在检测生殖道病原菌完整细胞DNA中的应用，其特征在于，所述组合物由乙二胺四乙酸二钠、Tris-HCl、亚硫酸氢钠、Proclin300组成；所述乙二胺四乙酸二钠：Tris-HCl：亚硫酸氢钠的摩尔比=1：1.25：5。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Proclin300的用量比按照如下比例计：1M乙二胺四乙酸二钠与Proclin300的体积比为3～5：3。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，Proclin300的用量比按照如下比例计：1M乙二胺四乙酸二钠与Proclin300的体积比为4：3。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，组合物的pH7.5～8.5。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，组合物的pH8.0。

6.一种非冻型尿液DNA保存液试剂盒，其特征在于，含有如下组分：0.5M～1.5M pH7.5～8.5的乙二胺四乙酸二钠溶液、1M～1.5M pH7.5～8.5的Tris-HCl、2M～3M的亚硫酸氢钠溶液、Proclin300。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，含有如下组分：1M pH8.0的乙二胺四乙酸二钠溶液、1.25M pH 8.0的Tris-HCl、2.5M的亚硫酸氢钠溶液、Proclin300。

8.根据权利要求6或7所述试剂盒，其特征在于，溶液的溶剂为超纯水。