CN107881213A - 一种尿液保存试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种尿液保存试剂及其应用。本申请的尿液保存试剂，包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；核酸缓冲液为Tris‑HCl，工作pH为7‑8；金属离子螯合剂为EDTA；防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲的至少一种；甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸的至少一种。本申请的尿液保存试剂，能有效保存尿液中游离DNA，避免其降解，为后续的游离DNA检测奠定基础；能阻止尿液中细胞破碎，减小基因组DNA背景，保障游离DNA检测结果准确性。本申请为尿液样本的保存提供了一种新的试剂，为尿液游离DNA临床检测提供了保障。

Description

一种尿液保存试剂及其应用

技术领域

本申请涉及尿液保存领域，特别是涉及一种尿液保存试剂及其应用。

背景技术

尿液经一系列组织(如膀胱)排出体外，其中存在着相关组织的脱落细胞及游离DNA。尿液是人体排出的一种成分复杂的代谢废弃物，包含各种有机、无机类代谢产物；很多病理性代谢产物还包括蛋白类、糖类物质等；部分病人存在极其严重的血尿现象。同时，尿液成分的复杂性使得许多微生物能够在其中快速繁衍，加上尿液本身的特点，使得其中的核酸极易发生降解。

临床上主要使用病灶组织、细胞来对肿瘤患者进行检测、监测等，其弊端在于组织的异质性、对病人的创伤性、取样的难度等。随着测序技术的发展，血液游离DNA(Cell freeDNA,cfDNA)或循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)越来越多的被用来进行癌症的早期筛查、靶向诊断、预后评估等。相关文献报道表明，尿液当中也存在游离DNA，并且其核酸突变情况可以有效预测患癌风险及预后评估，如膀胱癌等。

但是，尿液中的游离DNA含量很低，并且，在尿液环境下容易降解，与此同时，尿液中的白细胞破碎会释放大量的基因组DNA。这使得，一方面，提取的尿液核酸中游离DNA的含量极低，游离DNA大量降解而达不到检测水平；另一方面，大量的基因组DNA背景，影响检测结果的准确性。

因此，亟需研发一种尿液保存试剂，一方面能有效阻止尿液核酸降解，另一方面，又能够固定白细胞阻止其中的基因组DNA释放影响游离DNA检测。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的尿液保存试剂及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种尿液保存试剂，包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；核酸缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为7-8；金属离子螯合剂为EDTA；防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的至少一种；甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的至少一种。其中，EDTA即乙二胺四乙酸。

需要说明的是，本申请的尿液保存试剂，不仅可以对尿液中的游离DNA进行保护，防止其降解；而且，可以有效的阻止尿液中的细胞破碎，减小了因细胞破碎造成的基因组DNA背景。其中，核酸缓冲液为游离DNA提供了基础的存储环境，避免其自行降解；金属离子螯合剂则对尿液中的金属离子进行螯合，从而抑制尿液中各种酶的活性，维持尿液中的白细胞或其它脱落细胞的稳定性，同时，防止游离DNA被核酸酶降解；防腐剂同时具有抗凝血的作用，保障血细胞不致破裂，维持其稳定性；细胞固定剂用于固定尿液中的细胞，使得细胞维持自身形态结构，避免其核酸被释放出来；甲醛淬灭剂主要是与游离的甲醛反应，淬灭游离甲醛，避免其对游离DNA造成损伤，甲醛淬灭剂使得尿液中的游离DNA能够维持自身的结构稳定、保持生物学性能。以上各组分相互配合，起到保护游离DNA和避免细胞破碎释放基因组DNA的目的。本申请的尿液保存试剂能够将尿液在4℃的环境下保存至少10天，而其中的游离DNA不发生明显降解；在-20℃或-80℃下可以长期保存。不过，需要注意的是，如果需要-20℃或-80℃长期保存，应尽量避免反复冻融。

还需要说明的是，核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂各组分的用量，按照各组分的常规有效化学剂量使用即可，但是，在本申请的优选方案中，对各组分用量进行了特别限定，以达到更好的尿液中游离DNA的保存效果，详见以下方案。其中，常规有效化学剂量是指化学试剂能够正常发挥其理化功能的剂量，排除一些极端的浓度或用量情况。

优选的，Tris-HCl的浓度为1.25-2mmol/L。

优选的，EDTA的浓度为5-15mmol/L。

优选的，柠檬酸的浓度为1-1.50mmol/L，柠檬酸钠的浓度为3.25-4.0mmol/L。

更优选的，防腐剂同时采用柠檬酸和柠檬酸钠。

优选的，细胞固定剂的浓度为重量份0.05％-0.1％。

更优选的，细胞固定剂同时采用多聚甲醛、重氮烷基脲和咪唑烷基脲。

优选的，甲醛淬灭剂的浓度为20-40mmol/L。

更优选的，甲醛淬灭剂同时采用甘氨酸、赖氨酸和乙二胺。

本申请的另一面公开了本申请的尿液保存试剂在尿液或体液的保存中的应用。

本申请的尿液保存试剂，能够针对尿液环境，对其中的游离DNA进行有效保护，并且能够避免尿液中脱落细胞和白细胞破碎，减小基因组DNA对游离DNA的影响，从而为尿液中游离DNA的检测奠定了基础。可以理解，本申请的尿液保存试剂不仅可以用于尿液的保存，其它类似的体液，也可以采用本申请的尿液保存试剂。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的尿液保存试剂，一方面，能够有效的保存尿液中的游离DNA，避免其自身降解，也避免其被核酸酶降解，为后续的游离DNA检测奠定了基础；另一方面，能够阻止尿液中的细胞破碎，减小细胞破碎造成的基因组DNA背景，保障了游离DNA检测结果的准确性。本申请的尿液保存试剂，为尿液样本的保存提供了一种新的试剂，为尿液游离DNA的临床检测提供了保障。

附图说明

图1为本申请实施例中样本1分别添加本申请的尿液保存试剂、对比尿液保存试剂，以及不添加任何试剂直接保存，样本1的尿液经过离心处理，分别保存1天、3天、5天、7天和10天后提取的核酸浓度曲线图，图中，◆曲线为样本1试验一的曲线，■曲线为样本1试验二的曲线，▲曲线为样本1试验三的曲线；

图2为本申请实施例中样本2分别添加本申请的尿液保存试剂、对比尿液保存试剂，以及不添加任何试剂直接保存，样本2的尿液经过离心处理，分别保存1天、3天、5天、7天和10天后提取的核酸浓度曲线图，图中，◆曲线为样本2试验一的曲线，■曲线为样本2试验二的曲线，▲曲线为样本2试验三的曲线；

图3为本申请实施例中样本2分别添加本申请的尿液保存试剂、对比尿液保存试剂，以及不添加任何试剂直接保存，样本2的尿液不进行离心处理，分别保存1天、3天、5天、7天和10天后提取的核酸浓度曲线图，图中，◆曲线为样本2试验四的曲线，■曲线为样本2试验五的曲线，▲曲线为样本2试验六的曲线；

图1至图3中，横坐标为保存天数；纵坐标为核酸浓度，单位为ng/μL。

具体实施方式

虽然尿液中也存在游离DNA，可以作为膀胱癌等泌尿道相关癌症风险预测和预后评估，但是，尿液游离DNA量少，并且，相对于血液游离DNA而言，尿液游离DNA的环境更加复杂，检测难度更高，这极大的影响了尿液游离DNA的临床检测。

本申请经过研究发现，影响尿液游离DNA检测的关键因素有两个，一是尿液游离DNA容易降解，进一步减少了尿液游离DNA的量；二是基因组DNA背景严重，影响尿液游离DNA检测的准确性。本申请研究发现，造成尿液游离DNA降解的因素包括：(1)自身降解，(2)核酸酶降解；而基因组DNA背景主要来源于细胞破碎释放的DNA。基于以上认识，本申请创造性的研发了一种新的尿液保存试剂，用于保存尿液中的游离DNA，并减少基因组DNA背景。

本申请的尿液保存试剂有效的保障了后续游离DNA的检测，一方面，是因为尿液保存试剂可以有效的保存尿液中的游离DNA，避免其降解，保障了其含量，避免因降解而达不到检测水平；另一方面，通过阻止细胞破碎，减少细胞释放基因组DNA，从而减小了基因组DNA背景，保障了游离DNA检测的准确性。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例的尿液保存试剂由核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂组成，其中，核酸缓冲液为终浓度2mmol/L的Tris-HCl，工作pH为8；金属离子螯合剂为终浓度10mmol/L的EDTA；防腐剂由终浓度1.25mmol/L的柠檬酸和终浓度3.75mmol/L的柠檬酸钠组成；细胞固定剂由等量的多聚甲醛、重氮烷基脲和咪唑烷基脲组成，细胞固定剂的用量为总重量的0.1％；甲醛淬灭剂由等量的甘氨酸、赖氨酸和乙二胺组成，混合的总甲醛淬灭剂的终浓度为40mmol/L。

尿液保存试剂的制备方法如下：

将Tris溶于水中，用盐酸调节pH到7-8，制得80mmol/L的Tris-HCl溶液；将EDTA固体溶于上述Tris-HCl缓冲液中，制成0.4mol/L的EDTA溶液1；分别将多聚甲醛、重氮烷基脲和咪唑烷基脲溶于水中，制成各组分浓度为10％的细胞固定剂溶液2；将甘氨酸、赖氨酸和乙二胺溶于水中，制成各组分浓度为4mol/L的甲醛淬灭剂溶液3；将柠檬酸和柠檬酸钠溶于水中，制成柠檬酸和柠檬酸钠浓度分别为50mmol/L、150mmol/L的防腐剂溶液4；将溶液1、溶液2、溶液3、溶液4和溶液5，按照以上用量比例混合，过滤，即得到本例的尿液保存试剂，并采用盐酸或氢氧化钠调节pH为8。

本例分别采用健康人晨尿(以下简称样本1)和膀胱癌患者晨尿血尿(以下简称样本2)进行试验。

样本1中取三份进行如下试验：

样本1试验一：将其中一份尿液样本与本例制备的尿液保存试剂按照体积比，尿液样本:尿液保存试剂＝19:1的比例进行混合，分装于2mL离心管，16000rpm离心10min，取上清，4℃保存；其中，离心处理可以去除尿液中的细胞，最大限度的避免尿液中的细胞破碎释放基因组DNA，以下各组试验类同；

样本1试验二：将其中一份尿液样本与康为世纪生物科技有限公司的尿液保存试剂，按照其说明进行混合，分装于2mL离心管，16000rpm离心10min，取上清，4℃保存；

样本1试验三：其中一份尿液样本不添加任何保存液，直接分装于2mL离心管，16000rpm离心10min，取上清，4℃保存。

样本2中取六份进行如下试验：

样本2试验一：将其中一份尿液样本与本例制备的尿液保存试剂按照体积比，尿液样本:尿液保存试剂＝19:1的比例进行混合，分装于2mL离心管，16000rpm离心10min，取上清，4℃保存；

样本2试验二：将其中一份尿液样本与康为世纪生物科技有限公司的尿液保存试剂，按照其说明进行混合，分装于2mL离心管，16000rpm离心10min，取上清，4℃保存；

样本2试验三：其中一份尿液样本不添加任何保存液，直接分装于2mL离心管，16000rpm离心10min，取上清，4℃保存。

样本2试验四：将其中一份尿液样本与本例制备的尿液保存试剂按照体积比，尿液样本:尿液保存试剂＝19:1的比例进行混合，分装于2mL离心管，不离心，直接4℃保存；

样本2试验五：将其中一份尿液样本与康为世纪生物科技有限公司的尿液保存试剂，按照其说明进行混合，分装于2mL离心管，不离心，直接4℃保存；

样本2试验六：其中一份尿液样本不添加任何保存液，直接分装于2mL离心管，不离心，直接4℃保存。

本例采用磁珠法分别对以上9个试验的样品在4℃保存第1天、第3天、第5天、第7天、第10天进行核酸提取，每个试验每次提取3个平行，并对提取的核酸进行浓度测定。

本例的磁珠法提取核酸采用的试剂盒为金麦格游离DNA提取试剂盒，提取方法参考试剂盒说明书。按照说明书的提取流程，提取前样本预先进行16000rpm离心10min，取上清进行后续的核酸提取，该步骤可以离心去除样本中没有降解的完整细胞；可以确保提取的都是溶解的核酸，包括游离DNA和破碎的细胞释放的DNA。

核酸浓度采用Q-bit进行测定，结果如表1所示。

表1 尿液中提取的核酸的浓度测定结果(浓度单位：ng/μL)

表1的结果显示，在样本1的三个试验中，样本1试验一保存1、3、5、7和10天，五次提取所得的核酸，其浓度基本维持稳定，没有出现明显的降解；而加有康为世纪生物科技有限公司保护液的样本1试验二，随着保存时间的增长，所提取的核酸下降，在保存第10天所提取核酸甚至下降到低于检测限，说明其对尿液中的核酸保护效果较差；未添加任何保护液的样本1试验三，核酸降解严重，在第7天时所提核酸已经低于检测限。三个试验的结果如图1所示，图1中取重复1、重复2和重复3的平均值作图；可见，本例的尿液保存试剂，能够有效的保存尿液中的游离DNA，避免其降解，而样本1试验二和样本1试验三的核酸降解明显。

在样本2的六个试验中，其中样本2试验一、样本2试验二和样本2试验三，由于采用的是血尿样本，即当尿液尚未从膀胱排出体外时，就已经存在大量的细胞破损，释放出大量的基因组DNA，因此测定的核酸浓度远高于正常尿液样本，即远高于样本1的三个试验。从表1的测定结果来看，样本2试验一保存1、3、5、7和10天，五次提取所得的核酸浓度基本维持稳定，没有出现明显的降解；加有康为世纪生物科技有限公司保护液的样本2试验二，随着保存时间的增长，所提取的核酸下降，说明其对尿液中的核酸保护效果较差；未添加任何保护液的样本2试验三，核酸降解更为严重。该结果与样本1的三个试验结果结论相符，说明本例的尿液保存试剂，能够有效的保存尿液中的DNA，避免其降解。样本2的试验一、试验二和试验三的结果如图2所示，图2中取重复1、重复2和重复3的平均值作图；可见，本例的尿液保存试剂，能够有效的保存尿液中的游离DNA，避免其降解，而样本2试验二和样本2试验三的核酸降解明显。

样本2试验四、样本2试验五和样本2试验六，与样本2试验一、样本2试验二和样本2试验三相比，六个试验都是来源于同一样本，不同之处在于，样本2试验四至六的三个试验没有进行离心处理，即没有去除其中的包含有细胞的尿液沉淀。

样本2试验四至六的三个试验的结果可以看出，样本2试验四中加有本例的尿液保存试剂，因此，保存1、3、5、7和10天，五次所提取的核酸，其浓度基本维持稳定，说明尿液中存留的细胞几乎没有降解释放基因组DNA。而加有康为世纪生物科技有限公司保护液的样本2试验五，所提取的核酸浓度在保存第3天时出现成倍的增加，而后保存5、7和10天提取的核酸浓度又逐渐降低，说明该保护液不能有效的阻止细胞基因组DNA的释放，并且，也不能有效的保存DNA，避免其降解。样本2试验六的结果，与样本2试验五类似。样本2的试验四、试验五和试验六的结果如图3所示，图3中取重复1、重复2和重复3的平均值作图；可见，本例的尿液保存试剂，自始至终核酸浓度保持稳定，说明存留的细胞几乎没有降解释放基因组DNA；而样本2试验五和试验六的核酸在第3天都有明显的成倍增加，说明有细胞降解释放基因组DNA，试验六没有添加任何试剂，细胞降解释放的基因组DNA量尤为明显，保存5、7和10天后核酸浓度又逐渐下降，说明细胞降解释放的基因组DNA开始降解，同样的，没有添加任何试剂试验六核酸降解更为明显。

对于以上9个试验可见，第一，本例的尿液保存试剂能够有效的阻止核酸降解，保存游离DNA；第二，本例的尿液保存试剂能够有效的阻止尿液中的细胞破碎，避免其释放基因组DNA，从而减小基因组DNA对游离DNA检测造成的背景影响。

本申请的尿液保存试剂，除以上实施例的配方以外，其中，防腐剂可以只采用柠檬酸或柠檬酸钠；细胞固定剂还可以采用二乙基脲，或者只采用多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的一种或几种；甲醛淬灭剂还可以采用精氨酸，或者只采用甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的一种或几种。Tris-HCl的用量可以在1.25-2mmol/L范围内调整，EDTA的用量可以在5-15mmol/L范围内调整，柠檬酸的用量可以在1-1.50mmol/L范围内调整，柠檬酸钠的用量可以在3.25-4.0mmol/L范围内调整，细胞固定剂的用量可以在重量份0.05％-0.1％范围内调整，甲醛淬灭剂的用量可以在20-40mmol/L范围内调整，由此获得的尿液保存试剂，都可以达到本申请类似的效果，既能够保存尿液DNA，避免其降解；又能阻止尿液细胞破碎释放基因组DNA。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (7)

1.一种尿液保存试剂，其特征在于：包括核酸缓冲液、金属离子螯合剂、防腐剂、细胞固定剂和甲醛淬灭剂；

所述核酸缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为7-8；

所述金属离子螯合剂为EDTA；

所述防腐剂为柠檬酸和/或柠檬酸钠；

所述细胞固定剂选自多聚甲醛、重氮烷基脲、咪唑烷基脲和二乙基脲中的至少一种；

所述甲醛淬灭剂选自甘氨酸、赖氨酸、乙二胺和精氨酸中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的尿液保存试剂，其特征在于：所述Tris-HCl的浓度为1.25-2mmol/L。

3.根据权利要求1所述的尿液保存试剂，其特征在于：所述EDTA的浓度为5-15mmol/L。

4.根据权利要求1所述的尿液保存试剂，其特征在于：所述柠檬酸的浓度为1-1.50mmol/L，所述柠檬酸钠的浓度为3.25-4.0mmol/L。

5.根据权利要求1所述的尿液保存试剂，其特征在于：所述细胞固定剂的浓度为重量份0.05％-0.1％。

6.根据权利要求1所述的尿液保存试剂，其特征在于：所述甲醛淬灭剂的浓度为20-40mmol/L。

7.根据权利要求1-6任一项所述的尿液保存试剂在尿液或体液的保存中的应用。