CN114657069B - 一种粪便保存液及粪菌悬液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及粪菌保存技术领域，具体公开了一种粪便保存液及粪菌悬液的制备方法。所述的粪便保存液，其包含如下重量份的组分：甘油20～40份；水60～80份；乙二胺四乙酸二钠1～5份；氯化钠1～3份；柠檬酸钠1～3份；提取物1～3份。所述的粪菌悬液的制备方法，包含如下步骤：取粪便，然后加入粪便保存液，混合均匀后即得所述的粪菌悬液。本发明所述的粪便保存液可以有效的提高粪便中微生物DNA的稳定性，可以显著的延长粪便在常温下的保存时间；进而使得粪便无需在液氮冷冻的情况下在常温下能够长时间保存。进一步地，采用本发明所述的粪便保存液在低温下保存粪便，其具有更长的保存时间；能够长时间维持菌群的稳定和活性。
Description
技术领域
本发明涉及粪菌保存技术领域，具体涉及一种粪便保存液及粪菌悬液的制备方法。
背景技术
粪菌移植(Fecal microbiota transplantation，FMT)，是指将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，在患者肠道内重建新的肠道菌群，从而实现肠道及肠道外疾病的治疗。据现有技术报道，粪菌移植技术已经被用于治疗复发性或难治性艰难梭菌感染、功能性便秘、炎症性肠病肠易激综合征以及肝硬化和自闭症等疾病。
然而粪菌移植过程中，需要采集健康人的粪便，粪便离开人体后，其微生物菌群稳定性会受到影响；通常需要将采集后的粪便放置在液氮中进行速冻。然而对于采集后需要运输的粪便，在没有进行速冻的情况下，粪便中的微生物DNA是极不稳定的。因此，开发一种能够在常温下保存粪便，并且能够保证粪便中微生物DNA稳定的粪便保存液，具有重要的应用价值。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种粪便保存液及粪菌悬液的制备方法。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
本发明首先提供了一种粪便保存液，其包含如下重量份的组分：
甘油20～40份；水60～80份；乙二胺四乙酸二钠1～5份；氯化钠1～3份；柠檬酸钠1～3份；提取物1～3份。
本发明提供了一种全新组成的粪便保存液，所述的粪便保存液通过添加特定方法制备得到的提取物，可以有效的提高粪便中微生物DNA的稳定性，显著的延长了粪便在常温下的保存时间；进而使得粪便无需在液氮冷冻的情况下仅仅在常温下就能够长时间保存。
优选地，所述的粪便保存液，其包含如下重量份的组分：
甘油30～40份；水70～80份；乙二胺四乙酸二钠1～3份；氯化钠1～2份；柠檬酸钠1～2份；提取物2～3份。
最优选地，所述的粪便保存液，包含如下重量份的组分：
甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份。
优选地，所述的提取物通过如下方法制备得到：
取羊栖菜以及紫菜，然后用有机溶剂进行提取，得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:1～3；
最优选地，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2。
优选地，所述的有机溶剂由正丁醇与甲醇组成；其中正丁醇与甲醇的体积比为3～5:1；
最优选地，正丁醇与甲醇的体积比为4:1。
优选地，羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:5～15mL。
最优选地，羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8～10mL。
发明人在研究中发现，在粪便保存液中不是加入随意的提取物都能够提高或大幅提高微生物DNA的稳定性的；发明人在大量的实验过程中惊奇的发现：以羊栖菜和紫菜为原料，采用由正丁醇与甲醇组成的有机溶剂提取得到的提取物，可以大幅地提高微生物DNA的稳定性；然而，采用其它有机溶剂或其它有机溶剂的组合提取得到的提取物，对于微生物DNA的稳定性的提高程度远远不及采用由正丁醇与甲醇组成的有机溶剂提取得到的提取物。
本发明还提供了一种上述粪便保存液的制备方法，其包含如下步骤：
先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7～8，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
本发明还提供了一种粪菌悬液的制备方法，其包含如下步骤：取粪便，然后加入根据权利要求1～6任一项所述的粪便保存液，混合均匀后即得所述的粪菌悬液。
优选地，粪便与粪便保存液的用量比为1g:1～10mL。
最优选地，粪便与粪便保存液的用量比为1g:3～5mL。
优选地，所述的粪便为人的粪便。
有益效果：本发明提供了一种全新组成的粪便保存液，所述的粪便保存液通过添加了由本发明所述方法制备得到的提取物，可以有效的提高粪便中微生物DNA的稳定性，可以显著的延长粪便在常温下的保存时间；进而使得粪便无需在液氮冷冻的情况下在常温下能够长时间保存。进一步地，采用本发明所述的粪便保存液在低温下保存粪便，其具有更长的保存时间；能够长时间维持菌群的稳定和活性。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2；所述的有机溶剂由体积比为4:1的正丁醇与甲醇组成；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
实施例2粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油20份；水80份；乙二胺四乙酸二钠5份；氯化钠1份；柠檬酸钠1份；提取物1份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:1；所述的有机溶剂由体积比为3:1的正丁醇与甲醇组成；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:10mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7，再经灭菌后得所述的粪便保存液。
实施例3粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油40份；水60份；乙二胺四乙酸二钠1份；氯化钠3份；柠檬酸钠3份；提取物3份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:3；所述的有机溶剂由体积比为5:1的正丁醇与甲醇组成；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:15mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至8，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例1粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2；所述的有机溶剂为正丁醇；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1仅仅以正丁醇为有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物；而实施例1则是以正丁醇与甲醇组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物。
对比例2粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2；所述的有机溶剂为甲醇；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2仅仅以甲醇为有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物；而实施例1则是以正丁醇与甲醇组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物。
对比例3粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2；所述的有机溶剂为体积分数为95％的乙醇；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例3与实施例1的区别在于，对比例3以体积分数为95％的乙醇为有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物；而实施例1则是以正丁醇与甲醇组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物。
对比例4粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2；所述的有机溶剂由体积比为4:1的正丁醇与丙酮组成；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例4与实施例1的区别在于，对比例4以以正丁醇与丙酮组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物；而实施例1则是以正丁醇与甲醇组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物。
对比例5粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；提取物2份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：取干燥的羊栖菜以及紫菜，然后放入有机溶中在25℃下浸泡24h得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2；所述的有机溶剂由体积比为4:1的丙酮与甲醇组成；羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8mL；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例5与实施例1的区别在于，对比例5以丙酮与甲醇组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物；而实施例1则是以正丁醇与甲醇组成的有机溶剂对羊栖菜以及紫菜进行提取得提取物。
对比例6粪便保存液的制备
粪便保存液的原料重量份组成：甘油30份；水70份；乙二胺四乙酸二钠2份；氯化钠1.5份；柠檬酸钠1份；
粪便保存液的制备方法：先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠以及柠檬酸钠混合均匀，然后调节pH值至7.5，再经灭菌后即得所述的粪便保存液。
对比例6与实施例1的区别在于，对比例6的粪便保存液中不含有提取物。
实施例4粪菌悬液的制备
取同一份健康人的新鲜的粪便，分成9份，每份1g；然后在每份中粪便加入实施例1～3或对比例1～6制备得到的粪便保存液5mL，搅拌均匀后得粪菌悬液1～9；将制备得到的粪菌悬液1～9于室温保存30d后，用粪便DNA提取试剂盒提取各粪菌悬液中的DNA，接着进行NanoDrop检测，检测粪菌悬液中的DNA浓度；各粪菌悬液中的DNA浓度如表1所示。
表1.粪便保存液对粪菌悬液中微生物DNA稳定性的影响
| 粪便保存液 | DNA浓度 | |
| 粪菌悬液1 | 实施例1制备得到的粪便保存液 | 572ng/μL |
| 粪菌悬液2 | 实施例2制备得到的粪便保存液 | 508ng/μL |
| 粪菌悬液3 | 实施例3制备得到的粪便保存液 | 544ng/μL |
| 粪菌悬液4 | 对比例1制备得到的粪便保存液 | 237ng/μL |
| 粪菌悬液5 | 对比例2制备得到的粪便保存液 | 211ng/μL |
| 粪菌悬液6 | 对比例3制备得到的粪便保存液 | 154ng/μL |
| 粪菌悬液7 | 对比例4制备得到的粪便保存液 | 210ng/μL |
| 粪菌悬液8 | 对比例5制备得到的粪便保存液 | 167ng/μL |
| 粪菌悬液9 | 对比例6制备得到的粪便保存液 | 97ng/μL |
从表1实验数据可以看出，对比例6制备得到的粪便保存液中不加入提取物；粪便在其中于常温下保存60d后，其中DNA浓度仅仅为97ng/μL；然而，实施例1～3在粪便保存液中加入提取物后，其中DNA浓度均大于500ng/μL；与对比例6相比有着大幅提高；这说明：在粪便保存液中加入由正丁醇与甲醇组成的有机溶剂提取得到的提取物，可以大幅提高保存在粪便保存液中的微生物DNA的稳定性。
从从表1实验数据还可以看出，对比例1～5制备得到的粪便保存液其与对比例6相比，其中的DNA浓度虽然有提高，但是提高幅度远远小于实施例1～3制备得到的粪便保存液。这说明：以羊栖菜和紫菜为原料，采用的有机溶剂组成对于制备得到的提取物能否大幅提高保存在粪便保存液中的微生物DNA的稳定性起着重要的作用。上述研究表明：采用由正丁醇与甲醇组成的有机溶剂提取得到的提取物，其对保存在粪便保存液中的微生物DNA的稳定性的提高程度远远高于采用其它有机溶剂或其它有机溶剂的组合提取得到的提取物；在粪便保存液中只有加入由正丁醇与甲醇组成的有机溶剂提取得到的提取物才能大幅提高保存在粪便保存液中的微生物DNA的稳定性。
Claims (11)
1.一种粪便保存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：
甘油 20~40份；水 60~80份；乙二胺四乙酸二钠 1~5份； 氯化钠 1~3
份；柠檬酸钠 1~3份；提取物 1~3份；
所述的提取物通过如下方法制备得到：
取羊栖菜以及紫菜，然后用有机溶剂在25℃下浸泡24h进行提取，得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物；
其中，羊栖菜与紫菜的重量比为1:1~3；
所述的有机溶剂由正丁醇与甲醇组成；其中正丁醇与甲醇的体积比为3~5:1；
羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8~15mL。
2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，包含如下重量份的组分：
甘油 30~40份；水 70~80份；乙二胺四乙酸二钠 1~3份； 氯化钠 1~2
份；柠檬酸钠 1~2份；提取物 2~3份。
3.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述的粪便保存液，包含如下重量份的组分：
甘油 30份；水 70份；乙二胺四乙酸二钠 2份； 氯化钠 1.5份；
柠檬酸钠 1份；提取物 2份。
4.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，羊栖菜与紫菜的重量比为1:2。
5.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，正丁醇与甲醇的体积比为4:1。
6.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，羊栖菜以及紫菜的总重量与有机溶剂的用量比为1g:8~10mL。
7.根据权利要求1~6任一项所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
先将甘油和水混合均匀，然后加入乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、柠檬酸钠以及提取物混合均匀，然后调节pH值至7~8，再经灭菌后即得所述的粪便保存液；
所述的提取物通过如下方法制备得到：
取羊栖菜以及紫菜，然后用有机溶剂在25℃下浸泡24h进行提取，得提取液，将提取液浓缩干燥后即得所述的提取物。
8.一种粪菌悬液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：取粪便，然后加入权利要求1~6任一项所述的粪便保存液，混合均匀后即得所述的粪菌悬液。
9.根据权利要求8所述的粪菌悬液的制备方法，其特征在于，粪便与粪便保存液的用量比为1g:1~10mL。
10.根据权利要求9所述的粪菌悬液的制备方法，其特征在于，粪便与粪便保存液的用量比为1g:3~5mL。
11.根据权利要求8所述的粪菌悬液的制备方法，其特征在于，所述的粪便为人的粪便。
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