CN114869823B - 一种青钱柳的微生物发酵提取方法及提取物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种青钱柳的微生物发酵提取方法及提取物用途，涉及植物微生物发酵提取技术领域。本发明的提取方法包括以下步骤，菌株活化、发酵培养基制备、第一阶段发酵培养、第二阶段发酵培养、青钱柳提取物和提取物残渣。本发明的青钱柳提取方法获得的青钱柳提取物中多糖、总黄酮、总三萜等含量高，应用于个人护理品具有抗氧化、保湿、细胞损伤修复等功效，而且提取残渣中蛋白质或虾青素含量高，青钱柳综合利用率高。
Description
技术领域
本发明属于植物微生物发酵提取技术领域，涉及一种青钱柳的微生物发酵提取方法及提取物用途。
背景技术
青钱柳叶中主要含有多糖、黄酮类、三萜类等多种活性物质，使得青钱柳具有抗氧化、降糖、降脂、免疫调节等作用。
采用微生物发酵方法对植物中的有效成分或活性物质进行提取，可以提高提取效果，活性物质成分、生物转化效率等能达到较好的结果，提高了综合利用效果。但研究人员发现，对于不同的植物，发酵提取所采用的微生物或微生物来源不同、发酵工艺不同，提取效果也有明显的区别。
另外，常规的青钱柳微生物发酵方法获得青钱柳提取物后，剩余的残渣都当做废物丢弃，没有充分利用青钱柳的价值。
为了提高青钱柳的微生物发酵提取效果，达到综合利用青钱柳的目的，提出了本发明创造。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种青钱柳的微生物发酵提取方法，本发明人经过大量的试验发现，通过对所用微生物的选择，可以使得青钱柳的综合利用非常高，不但能获得提取物，而且残渣也能综合利用。
本发明再一个目的在于提供一种青钱柳提取物用途。
本发明的技术方案如下：
一种青钱柳的微生物发酵提取方法，包括以下步骤：
S1、菌株活化：将低温保存的乳酸菌、酵母菌，解冻；
将上述乳酸菌和酵母菌分别采用划线法接种于固体平板上，所述乳酸菌单菌落接种于培养基后培养获得乳酸菌种子培养液，所述酵母菌单菌落接种于培养基后培养获得酵母菌种子培养液；
S2、发酵培养基制备：将1-5重量份青钱柳叶粉加入到100体积份水中，灭菌，获得发酵培养液；
S3、第一阶段发酵培养：将1-5体积份步骤S1获得乳酸菌种子培养液接入装有100体积份步骤S2中获得的发酵培养液进行发酵培养；
S4、第二阶段发酵培养：在所述第一阶段发酵培养完成后，继续接入3-8体积份步骤S1获得的酵母菌种子培养液进行发酵培养；
S5、步骤S4发酵培养后获得的发酵液进行灭菌、离心，收集上清液，即为所述青钱柳发酵提取物。
优选的，所述乳酸菌选自海洋源乳酸菌。
更优选的，所述乳酸菌选自植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种。
优选的，所述酵母菌选自海洋源酵母菌。
更优选的，所述酵母菌选自红法夫酵母和酿酒酵母中的至少一种。
优选的，在步骤S2中，所述灭菌前，进行破壁处理。
优选的，步骤S3中所述发酵培养的条件为，30-40℃，100-300rpm转速，培养1-3天。
优选的，步骤S4中所述发酵培养的条件为，25-30℃，100-300rpm转速，培养3-5天。
优选的，步骤S5中所述收集上清液后剩余的提取残渣作为添加剂应用于饲料。
一种上述任一项实施方案所述的微生物发酵提取方法获得的青钱柳提取物在个人护理品方面的应用。
本发明的有益效果是：
(1)海洋微生物种类多，包括细菌、丝状真菌、酵母、古菌、噬菌体等，可在高盐、低温、高压寡营养等极端环境下存活，往往能产生结构新颖、功能独特的生物活性物质。本发明采用海洋源乳酸菌和海洋源酵母菌进行两阶段的发酵培养，获得的青钱柳提取物中富含抗氧化、保湿、细胞损伤修复活性成分，相比一阶段海洋源乳酸菌和海洋源酵母菌混合发酵培养和非海洋源乳酸菌和酵母菌的两阶段发酵培养，活性成分的提取率更高，提取效果更好。
(2)本发明采用两阶段发酵培养方法，青钱柳中活性成分提取率高，提取物具有良好的抗氧化、细胞损伤修复、保湿等功效，可应用于个人护理品，提高抗氧化、细胞损伤修复、保湿等功效；提取残渣中富含蛋白质、虾青素等，是良好的饲料添加剂，可应用于猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼、虾等的饲料。因此，本发明的两阶段发酵培养方法能综合利用青钱柳，提取物可应用于个人护理品，提取物残渣可应用于饲料添加剂，综合利用率非常高。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
本发明提出一种青钱柳的微生物发酵提取方法，包括以下步骤：
S1、菌株活化：将低温保存的乳酸菌、酵母菌，解冻；本发明中，乳酸菌和酵母菌在解冻前一般保存在-80℃或更低的温度，解冻可以为在室温下自然解冻。
将上述乳酸菌和酵母菌分别采用划线法接种于固体平板上，所述乳酸菌单菌落接种于培养基后培养获得乳酸菌种子培养液，所述酵母菌单菌落接种于培养基后培养获得酵母菌种子培养液；该步骤中，乳酸菌所用的培养基为乳酸菌常用的培养基，可以为MRS液体培养基，培养温度30-37℃，培养时间可以为10-15小时；酵母菌所用的培养基为酵母菌常用的培养基，可以为YPD液体培养基，培养温度可以为25-30℃，培养时间可以为30-36小时。
S2、发酵培养基制备：将1-5重量份青钱柳叶粉加入到100体积份水中，灭菌，获得发酵培养液；该步骤中，灭菌温度为80-120℃，时间为10秒-5分钟，水中加入10-35g/L葡萄糖、3-14g/L酵母粉、2-20g/L玉米浆粉、5-12g/L氯化钠；
S3、第一阶段发酵培养：将1-5体积份步骤S1获得乳酸菌种子培养液接入装有100体积份步骤S2中获得的发酵培养液进行发酵培养；
S4、第二阶段发酵培养：在所述第一阶段发酵培养完成后，继续接入3-8体积份步骤S1获得的酵母菌种子培养液进行发酵培养；
S5、步骤S4发酵培养后获得的发酵液进行灭菌、离心，收集上清液，获得青钱柳提取物。本步骤中，灭菌条件无特别的限制，温度可以为60-80℃，时间可以为0.5-10分钟；离心采用离心机，转速为10000-20000rpm，离心时间为5-20分钟。
在本发明一个优选的实施例中，乳酸菌选自海洋源乳酸菌。本发明中，海洋源乳酸菌是指从海洋植物或海洋动物(主要是海洋鱼类)肠道中提取的乳杆菌。更优选的，海洋源乳杆菌可以选自植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。
在本发明一个更优选的实施例中，所述乳酸菌选自植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种。本发明中，植物乳杆菌可以从鲍鱼肠道中提取，鼠李糖乳杆菌可以从红树林沉积物中提取。
在本发明一个优选的实施例中，所述酵母菌选自海洋源酵母菌。本发明中，海洋源酵母菌是指源自海洋或海水的酵母菌，可以选自红法夫酵母或酿酒酵母。
在本发明一个更优选的实施例中，所述酵母菌选自红法夫酵母和酿酒酵母中的至少一种。本发明中，红法夫酵母可以源自海水养殖池，酿酒酵母可以源自红树林沉积物。
在本发明一个优选的实施例中，在步骤S2中，所述灭菌前，进行破壁处理。发明人发现，对青钱柳叶粉进行破壁处理可以进一步提高提取效果，可能是更有利于活性物质的溶出和提取。
在本发明一个优选的实施例中，步骤S3中所述发酵培养的条件为，30-40℃，100-300rpm转速，培养1-3天。
在本发明一个优选的实施例中，步骤S4中所述发酵培养的条件为，25-30℃，100-300rpm转速，培养3-5天。
在本发明一个优选的实施例中，步骤S5中所述收集上清液后剩余的提取残渣作为添加剂应用于饲料。青钱柳采用本发明的微生物发酵提取方法后，提取残渣富含蛋白质或虾青素等。本发明中发现，第二阶段采用酿酒酵母进行发酵培养，提取残渣干粉中蛋白质含量可以达到40％，是良好的蛋白质饲料添加剂；第二阶段采用红法夫酵母进行发酵培养，提取残渣干粉中虾青素含量可以达到3.8mg/g，是良好的虾青素饲料添加剂。
本发明还提出一种上述任一项实施方案所述的微生物发酵提取方法获得的青钱柳提取物在个人护理品方面的应用。本发明的青钱柳微生物发酵提取方法，通过采用海洋源乳酸菌和海洋源酵母菌，并结合二阶段的发酵培养，获得的提取物中富含抗氧化、保湿和细胞损伤修复活性成分，因此可用于个人护理品中，提高抗氧化、保湿和细胞损伤修复功效。
以下根据各实施例对本发明的技术方案更进一步进行描述和说明。如无特别指明，以下各实施例中所述份数为重量份数。
实施例1
1、菌株活化
从低温保存管中(-80℃)取出保存的海洋源植物乳杆菌和海洋源红法夫酵母，植物乳杆菌分离自鲍鱼肠道，红法夫酵母分离自海水养殖池，自然解冻后备用。取解冻后的菌液采用固态培养基划线法进行接种。乳杆菌单菌落接种于MRS固体平板后置于30-37℃下培养12-14h；红法夫酵母单菌落接种于YPD固体平板后置于25-30℃下培养30-36h。
2、种子培养液制备
将固体平板上的乳杆菌单菌落接种于MRS液体培养基后置于30-37℃下培养12-14h后获得乳酸菌种子培养液，红法夫酵母接种于YPD液体培养基后置于25-30℃下培养30-36h后获得酵母菌种子培养液。
3、发酵培养基制备
将青钱柳叶干燥、粉碎、过60-100目筛，所得的青钱柳叶粉按20g/L加入装有60L水的发酵罐(100L发酵罐)中，其它培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、玉米浆粉10g/L、氯化钠10g/L，90℃灭菌2min，得到青钱柳叶发酵培养基。
4、第一阶段发酵培养
将所制备的乳杆菌种子培养液按照3％体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在30℃、转速为200rpm条件下培养2天。
5、第二阶段发酵培养
将所制备的红法夫酵母种子培养液按照5％体积比的接种量接入经过乳杆菌发酵2天的发酵罐继续进行发酵，此阶段设置发酵温度25℃下、转速200rpm，继续培养4天。
6、青钱柳叶发酵提取物的制备
将经过两阶段发酵所得的发酵液升温至80℃进行菌株灭活1.5分钟，进一步采用管式离心机进行连续离心，转速16000rpm，离心时间20min，离心后所得到的上清液即为青钱柳叶发酵提取物。
将离心剩余的固体残渣采用80℃、4h烘干后进行粉碎过筛，得到混合菌发酵残渣干粉。
实施例2
将实施例1中的海洋源植物乳杆菌替换为等量的海洋源鼠李糖乳杆菌，分离自红树林沉积物，其余步骤保持不变。
实施例3
将实施例1中的海洋源红法夫酵母替换为等量的海洋源酿酒酵母，分离自红树林沉积物，其余步骤保持不变。
实施例4
将实施例1中的海洋源植物乳杆菌替换为等量的海洋源鼠李糖乳杆菌，海洋源红法夫酵母替换为等量的海洋源酿酒酵母，其余步骤保持不变。
实施例5
实施例1的发酵培养基制备步骤中，青钱柳叶粉加入到发酵罐中后进行破壁处理(破壁转速5000rpm)，再进行灭菌。
对比例1
将实施例1中的海洋源植物乳杆菌替换为等量的非海洋源植物乳杆菌，购买自中国工业微生物菌种保藏中心，编号Lactobacillus plantarum CICC 21801，其余步骤保持不变。
对比例2
将实施例1中的海洋源红法夫酵母替换为等量的非海洋源红法夫酵母，购买自中国工业微生物菌种保藏中心，编号Phaffia rhodozyma CICC 33064，其余步骤保持不变。
对比例3
将实施例1中的海洋源植物乳杆菌替换为等量的非海洋源植物乳杆菌，海洋源红法夫酵母替换为等量的非海洋源红法夫酵母，其余步骤保持不变。
对比例4
将实施例1中的第一阶段发酵培养步骤和第二阶段发酵培养步骤合并为一个发酵培养步骤，具体如下：
将所制备的乳杆菌种子培养液和红法夫酵母种子培养液分别按照3％和5％的体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在30℃、转速为200rpm条件下培养4天。
其余步骤保持不变。
对比例5
将对比例4中的海洋源植物乳杆菌替换为等量的非海洋源植物乳杆菌，海洋源红法夫酵母替换为等量的非海洋源红法夫酵母，其余步骤保持不变。
结果测试
青钱柳提取物中多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法进行测定，并以葡萄糖为标准品绘制标准曲线。取上述制备的青钱柳提取物1mL于试管中，加入5％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再沿壁加入浓硫酸5.0mL。振荡5min后再静止5min，置于沸水浴中加热10min，取出冷却至室温，采用可见分光光度计在490nm处测定吸光度值，按照标准曲线计算多糖含量。结果如表1所示。
青钱柳提取物中总黄酮含量的测定：采用硼酸-柠檬酸比色法进行测定，并以芦丁为标准品绘制标准曲线。取上述制备的发酵提取物2mL于试管中，加5mL等体积混合的硼酸-柠檬酸显色液，用无水丙酮定容至25mL，采用可见分光光度计在400nm处测定吸光度值，按照标准曲线计算总黄酮含量。结果如表1所示。
青钱柳提取物中总三萜含量的测定：采用冰醋酸-香草醛-高氯酸分光光度法测定，并以齐墩果酸为标准品绘制标准曲线。精确移取对照品溶液0.1mL置于5mL容量瓶中，加热挥发掉全部溶剂，加入新制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL再加入高氯酸0.8mL摇匀，于70℃恒温水浴上保温反应15min，流水冷却至室温再加入乙酸乙酯定量到5mL，摇匀，同时作试剂空白，采用可见分光光度计在551nm处测定吸光度值，按照标准曲线计算总三萜含量。结果如表1所示。
青钱柳提取物抗氧化活性：采用分光光度法测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率以代表抗氧化活性。取不同浓度样品溶液2mL和DPPH溶液2mL加入到试管中摇匀、室温静置30min，采用可见分光光度计在517nm处测定吸光度值。分别取0、0.5、1、2、3、4、5mL的0.2mM DPPH溶液，用无水乙醇补足至5mL，在517nm处测定吸光度值，建立标准曲线。结果如表1所示。
表1
由表1结果可知，相比采用非海洋源乳酸菌和/或非海洋源酵母菌的发酵培养方法或者一阶段发酵培养方法，采用海洋源乳酸菌和海洋源酵母菌的两阶段发酵培养方法，获得的青钱柳提取物中，多糖含量、总黄酮含量、总三萜含量都更高，抗氧化性能更好。
青钱柳提取物保湿效果：采用CM825型皮肤油水酸碱测试仪，参照化妆品保湿功效的测定皮肤水合度法进行测定。选取60位年龄为20～40岁、皮肤肤色L值接近的志愿者，均分为6组，每组10人，测试环境温度为25±1℃，湿度为40％～60％，测试部分为手臂内侧2cm×5cm区。测定每组志愿者初始的皮肤含水量(取平均值)，再分别检测1h、4h、8h的皮肤含水量。结果如表2所示。
表2皮肤含水量/％
由上表2的数据可知，采用不同菌种和混合发酵方式获得的青钱柳提取物均具有一定的保湿效果，但采用本发明的提取方法获得的青钱柳提取物的保湿效果最好，随着时间延长，保湿效果有所降低，但仍然维持较好的保湿性。
青钱柳叶发酵提取物细胞损伤修复效果：采用人成纤维细胞进行实验。将10μL密度为5×105个/mL的成纤维细胞接种在96孔板的孔中，在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24h。在新鲜培养基中同时加入1.5mM的H2O2与青钱柳提取物各10μL作为实验组，单独加入1.5mM的H2O2作为阳性对照，未处理细胞作为阴性对照，各取10μL样品液及阳性和阴性对照液加入相应样品组和对照组孔板的培养液中，继续培养24h，然后每孔加入20μL噻唑蓝溴化四唑(MTT)，培养4h后，弃培养基，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，在酶标仪490nm波长下检测吸光度值。细胞活力以百分数表示。结果如表3所示。
青钱柳叶发酵残渣成分检测将离心收集的固体残渣采用80℃、4h烘干后进行粉碎过筛，得到混合菌发酵残渣干粉，检测蛋白质含量或虾青素含量。结果如表3所示。
表3
由表3的数据可知，实施例3和实施例4的第二阶段发酵培养采用海洋源酿酒酵母，获得的提取残渣中的蛋白质含量更高，达到46％以上，可作为优质的蛋白质饲料添加剂。实施例1和2的第二阶段发酵培养采用海洋源红法夫酵母，获得提取残渣中的虾青素含量达到3.8mg/g以上，可作为优质的虾青素饲料添加剂。
因此，本发明的微生物发酵提取方法能综合利用青钱柳，获得的青钱柳提取物可用于个人护理品，残渣可用于饲料添加剂。
如上所述，显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例仅为本发明的较佳实施例而已，不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (3)
1.一种青钱柳的微生物发酵提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、菌株活化：将低温保存的乳酸菌、酵母菌，解冻；
将上述乳酸菌和酵母菌分别采用划线法接种于固体平板上，所述乳酸菌单菌落接种于培养基后培养获得乳酸菌种子培养液，所述酵母菌单菌落接种于培养基后培养获得酵母菌种子培养液；
所述乳酸菌选自海洋源植物乳杆菌或海洋源鼠李糖乳杆菌，所述海洋源植物乳杆菌分离自鲍鱼肠道，所述海洋源鼠李糖乳杆菌分离自红树林沉积物；
所述酵母菌选自海洋源红法夫酵母或海洋源酿酒酵母，所述海洋源红法夫酵母分离自海水养殖池，所述海洋源酿酒酵母分离自红树林沉积物；
S2、发酵培养基制备：将1-5重量份青钱柳叶粉加入到100体积份水中，灭菌，获得发酵培养液；
S3、第一阶段发酵培养：将1-5体积份步骤S1获得乳酸菌种子培养液接入装有100体积份步骤S2中获得的发酵培养液进行发酵培养；
所述发酵培养的条件为，30-40℃，100-300rpm转速，培养1-3天；
S4、第二阶段发酵培养：在所述第一阶段发酵培养完成后，继续接入3-8体积份步骤S1获得的酵母菌种子培养液进行发酵培养；
所述发酵培养的条件为，25-30℃，100-300rpm转速，培养3-5天；
S5、步骤S4发酵培养后获得的发酵液进行灭菌、离心，收集上清液，获得青钱柳提取物。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵提取方法，其特征在于：在步骤S2中，所述灭菌前，进行破壁处理。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵提取方法，其特征在于：步骤S5中所述收集上清液后剩余的提取残渣作为添加剂应用于饲料。
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| CN114869823A (zh) | 2022-08-09 |
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