CN110004212A - 粪便保存液及其制备方法和保存粪便的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了粪便保存液及其制备方法和保存粪便的方法，粪便保存液包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris base)0.10‑0.20M；乙二胺四乙酸(EDTA)0.25‑0.75M；氯化钠(NaCl)10mM～常温饱和；二甲基亚砜(DMSO)5‑15％；乙醇2.5‑10％；甘油5‑20％；其中，所述粪便保存液的pH为7.0‑9.0。本发明的粪便保存液能够稳定常温保存粪便样品中微生物多样性并提高DNA浓度，可以保证肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存运输，相对于现有的保存液，不仅保存效果好，而且不含有硫氰酸胍等有毒成分，操作更安全。
Description
技术领域
本发明涉及粪便保存液及其制备方法和保存粪便的方法。
背景技术
人体含有数目巨大的细菌，甚至比人体细胞数目(1013)还要高10倍。这些细菌分布于人体肠道及不同组织中，肠道尤其是大肠是细菌寄居的主要部位。这些微生物的存在对人体病理生理学存在至关重要的影响，研究者甚至将其称之为人体的一个“器官”，它们与人体形成了共生关系。细菌既能摄取人体摄入的食物也能合成氨基酸、维生素和短链脂肪酸等物质被人体摄入，从而促进健康。同时，病原菌或条件致病菌则会引发损害以致疾病发生。近年来人们对肠道菌群的认知逐渐深入，发现多种疾病如代谢类疾病肥胖、糖尿病、粥样动脉硬化症和癌症等疾病均与肠道微生物稳态紧密相关。
人的粪便产自肠道，其中携带了大量的肠道微生物。当前多个研究均以粪便为样本，提取DNA后采用测序技术和生物信息学分析，探讨疾病和肠道菌群之间的关系。人的粪便离开身体之后，从无氧环境变成了有氧环境，占比大部分的厌氧菌将会迅速死亡，少部分非厌氧菌还能继续代谢和生长。所以，需要对粪便样品采取保护措施，使其微生物构成稳定在离体时的状态才能代表肠道微生物的构成。
当前对于粪便微生物保存最常见的方法就是低温冷冻保存，但是低温保存需要大型设备，适用性较差。开发适合的DNA保存液是较为可行的方法。现有的保护液中，含有异硫酸氰酸胍，具有一定毒性；或者成分单一，对细胞保护作用较弱。故需改良开发适合粪便微生物DNA保存的粪便保存液。
发明内容
本发明提供了一种有利于保护微生物DNA的粪便保存液的配方，将采集的粪便直接置于粪便保存液中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物DNA的作用。使用该粪便保存液保存粪便样本可以在常温下接近冻存粪便样本的效果，从而使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存，也能够用于粪便样本的长途运输。
本发明提供了一种粪便保存液，包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris base)0.10-0.20M；乙二胺四乙酸(EDTA)0.25-0.75M；氯化钠(NaCl)10mM～常温饱和；二甲基亚砜(DMSO)5-15V/V％；乙醇2.5-10V/V％；甘油5-20V/V％；其中，所述粪便保存液的pH为7.0-9.0。
在上述粪便保存液中，包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris base)0.15M，乙二胺四乙酸(EDTA)0.5M,常温饱和状态的氯化钠(NaCl)，二甲基亚砜(DMSO)8V/V％，乙醇5V/V％，甘油10V/V％，其中，所述粪便保存液的pH为8.0。
本发明还提供了一种制备上述粪便保存液的方法，包括：按照以上配方称取各成分，使用无菌去离子水溶解后，过滤除菌，室温保存。
本发明还提供了一种保存粪便的方法，包括：采集粪便样品；使用上述粪便保存液浸泡保存所述粪便样品，每1g粪便保存在2～5ml粪便保存液中。
本发明的粪便保存液能够稳定常温保存粪便样品中微生物多样性并提高DNA浓度和完整性，可以保证肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存运输，相对于现有的保存液，不仅保存效果好，而且不含有硫氰酸胍等有毒成分，操作更安全。
附图说明
图1示出了A志愿者门水平菌群构成分析图。
图2示出了B志愿者门水平菌群构成分析图。
图3示出了C志愿者门水平菌群构成分析图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明的粪便保存液的配方如下：三羟甲基氨基甲烷(Tris base)0.10-0.20M，乙二胺四乙酸(EDTA)0.25-0.75M,氯化钠(NaCl)10mM～饱和(常温饱和)，二甲基亚砜(DMSO)5-15V/V％，乙醇2.5-10V/V％，甘油5-20V/V％，pH 7.0-9.0。
作为一种示例，粪便保存液包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris base)0.15M，乙二胺四乙酸(EDTA)0.5M,氯化钠(NaCl)饱和溶液，二甲基亚砜(DMSO)8％，乙醇5％，甘油10％，pH8.0.
按照以上配方称取各成分，用无菌去离子水溶解后，调节pH，过滤除菌，室温保存。
本发明还涉及使用粪便保存液进行粪便细菌保存的方法，步骤如下：
采集新鲜粪便样品，使用本发明的粪便保存液浸泡保存样品，1g粪便保存在2～5ml保存液中。
实施例1.样品来源及保存方式
采集了3位志愿者的粪便样本。每个志愿者的样品分装为4份，分别做4种不同处理，每种处理3份样本：
(1)冻存一周：称取0.2g粪便样品，-80℃下密封，避光，保存一周，然后再进行DNA提取，备用；
(2)配方1保存一周：称取0.2g粪便样品，使用对照保存液配方(配方1)，室温下(25℃)密封，避光，保存一周，然后再进行DNA提取，备用；
(3)配方2保存一周：称取0.2g粪便样品，使用本发明的保存液配方(配方2)，室温下(25℃)密封，避光，保存一周，然后再进行DNA提取，备用；
(4)室温保存一周：称取0.2g粪便样品，不加任何保护液，室温下(25℃)密封，避光，保存一周，然后再进行DNA提取，备用。
保存液的配方见表1。
表1保存液配方
保存液均使用NaOH溶液调pH至8.0。
本发明保存液中使用的DMSO为细胞保护剂，它可以穿透细胞膜进入细胞，延缓细胞冻存过程，减少冰晶形成，也可以抑制细胞生长，防止微生物丰度发生变化；乙醇既可作为变性剂使微生物蛋白发生变性，又可作为抑菌剂使微生物丰度稳定；甘油作为防冻液在低温下可以保存微生物样品，也兼有抑制酶反应和防止氧化的效果。
实施例2.粪便样本处理方法
对上述每个志愿者的4份粪便样本的处理过程如下：
(1)向粪便样品管中加入200mg氧化锆，冰上放置；
(2)加入540μL SLX-Mlus Buffer(DNA提取采用Omega E.Z.N.A.Stool DNA Kit，货号D4015-02，提取过程的试剂均来自该试剂盒)，60μL DS Buffer和20μL Proteinase KSolution，放入组织研磨机，60HZ，90s。
(3)70℃，500rpm金属浴孵育10min。
(4)加入400μL SP2Buffer，放入组织研磨机，60HZ，30s，冰上放置5min。
(5)离心机20000g离心15min。
(6)小心吸取800μL上清至新的1.5mL离心管中。
(7)加入400μL cHTR Reagent，漩涡震荡10s。
(8)室温静置2min后，20000g离心2min。
(9)转移400μL上清到新的1.5mL的离心管中。
(10)加入10μL RNase A，漩涡混匀，37℃孵育3min。
(11)加入400μL BL Buffer和400μL无水乙醇，漩涡震荡10s。
(12)将HiBind DNA迷你柱插入2mL收集管中。
(13)将步骤(11)中的全部样品转移到迷你柱中，20000g离心1min。
(14)弃掉滤液和收集管，将迷你柱插入新的2mL收集管中。
(15)加入500μL VHB Buffer，20000g离心1min，弃掉滤液，保留收集管。
(16)加入700μL DNA Wash Buffer，20000g离心1min，弃掉滤液，保留收集管。
(17)重复步骤16，进行第二次DNA洗脱。
(18)将DNA迷你柱以20000g空离2min，将迷你柱转移到一个新的1.5mL离心管。
(19)将Elution Buffer加热到65℃，取70μL直接加入到迷你柱中。
(20)室温静置2min，20000g离心1min，-20℃保存。
实施例3.样品DNA浓度检测
采用分光光度计对提取后的DNA样本进行浓度测定。如表2所示，配方2保存一周的DNA浓度和冻存一周的浓度结果较为接近，而配方1保存一周的浓度结果则差于冻存一周以及配方2保存一周，而室温保存一周的浓度明显增加，这可能由于其菌群构成并未固定在取样初始状态，发生了增殖所致。
表2提取产物酶标仪检测结果
A、B和C代表3位志愿者，1表示冻存方式，2表示配方1保存，3表示配方2保存，4表示室温保存。
实施例4.样品菌群多样性比较
提取后的DNA样本送测序公司进行建库测序，获得测序数据后进行生物信息学分析，计算物种香农多样性指数，进行比较。如表3所示，配方2保存一周的细菌丰富度和冻存一周处理的结果较为接近，而配方1保存一周与室温保存一周的结果则差于冻存一周以及配方2保存一周。
表3香农多样性指数检测结果
| 样本 | 香农指数 |
| A1 | 0.713641 |
| A2 | 1.034451 |
| A3 | 0.585388 |
| A4 | 1.122933 |
| B1 | 0.535533 |
| B2 | 0.986228 |
| B3 | 0.570547 |
| B4 | 0.822239 |
| C1 | 0.749811 |
| C2 | 1.049295 |
| C3 | 0.779756 |
| C4 | 0.834787 |
A、B和C代表3位志愿者，1表示冻存方式，2表示配方1保存，3表示配方2保存，4表示室温保存。
实施例5.门水平菌群构成的异同分析
提取后的DNA样本送测序公司进行建库测序，获得测序数据后进行生物信息学分析，计算每个样本中的细菌分属哪些菌门，进行比较。
基于门水平的细菌相对丰度构成如图1-3所示，每一幅图是其中一位志愿者的粪便样本在4种保存方式下门水平细菌构成，每一个柱子代表一种处理方式，处理方式可见图注。某种细菌占比多，则其在柱子中所占的比例就更大。结果表明，配方2保存一周的细菌丰富度和冻存一周处理的结果较为接近，而配方1保存一周与室温保存一周的结果则差于冻存一周以及配方2保存一周。
基于DNA提取浓度、细菌丰富度分析和门水平菌群构成异同结果，得知本发明的保存液配方，其对粪便微生物保存效果较为接近冻存处理，且明显优于对照配方以及室温不做任何处理的保存方案。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
Claims (4)
1.一种粪便保存液，其特征在于，包括：
三羟甲基氨基甲烷(Tris base)0.10-0.20M；
乙二胺四乙酸(EDTA)0.25-0.75M；
氯化钠(NaCl)10mM～常温饱和；
二甲基亚砜(DMSO)5-15V/V％；
乙醇2.5-10V/V％；
甘油5-20V/V％；
其中，所述粪便保存液的pH为7.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，包括：三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)0.15M，乙二胺四乙酸(EDTA)0.5M,常温饱和状态的氯化钠(NaCl)，二甲基亚砜(DMSO)8％，乙醇5％，甘油10％，其中，所述粪便保存液的pH为8.0。
3.一种制备根据权利要求1或2所述的粪便保存液的方法，其特征在于，包括：
按照以上配方称取各成分，使用无菌去离子水溶解后，调节pH,过滤除菌，室温保存。
4.一种保存粪便的方法，其特征在于，包括：
采集粪便样品；
使用权利要求1或2所述的粪便保存液浸泡保存所述粪便样品，每1g粪便保存在2～5ml粪便保存液中。
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