CN113005173A - 一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用，本发明的粪便脱落细胞核酸保存试剂包括非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，渗透压调节剂，细胞膜稳定剂，螯合剂，pH缓冲液和水，还含有除臭剂。本发明的保存试剂可以有效裂解粪便中的人体脱落细胞，且不含有硫氰酸胍和异硫氰酸胍等有毒成分，从而提供一种从粪便上清中直接进行粪便基因组提取和检测的方法，可以有效避免粪便杂质的干扰，检测前无需再次对粪便样品进行沉淀处理。

Description

一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用

本申请为申请人2019年12月19日向国家知识产权局提交的申请号为201911319858.3、名称为“一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用。

背景技术

人体每天会有一定量的脱落细胞进入到粪便中，研究表明，这些脱落细胞中含有癌变信号，因此粪便样本是对某些癌症如消化道癌症进行无创检测的理想样本，在未来的癌症检测领域具有很大的应用前景，美国Exact sciences公司在2014年便推出了multitarget stool DNA test试剂盒，用于结直肠癌的无创检测。

粪便的成分非常复杂，其中含有动物DNA、植物DNA和种类繁多的细菌DNA，还含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，庞杂的背景使得从粪便中特异性地检测脱落细胞DNA面临挑战；另外，粪便中还含有大量的核酸酶如DNA酶、RNA酶等，可导致核酸降解，不利于下游核酸的检测；另一方面，粪便中的蛋白质在细菌的分解下会产生吲哚、粪臭素、硫氰化物等难闻气体，对实验操作人员的心理和身体都会产生不利影响。添加除臭剂可以缓解粪便样品的气味刺激。按照除臭机制可以将消臭剂分类四类，分别为遮蔽消臭类、物理消臭类、化学消臭类和生物消臭类。但由于不同种类的消臭剂，对生物样本的活性具有不可预期的影响，当前临床中粪便检测(如大便常规检测、大便隐血检测等)不进行除臭。因此，有效方便的粪便DNA检测特别依赖上游的粪便DNA保存技术。

现有的粪便保存条件多为低温保存，但考虑到运输和保存的便捷程度、样本的重复利用率等问题，常温保存更能节省成本。目前也有一些常温保存粪便样本的试剂和方法，如在中国专利申请20151067125.8中，其保存试剂的主要作用是维持细胞形态、防止细胞破裂，然而该技术没有去除异味的功效，且需要用细胞沉淀进行下一步的检测，沉淀中的粪便杂质极有可能会对检测产生不利影响。

发明内容

为了改善现有技术存在的问题，本发明提供了一种粪便脱落细胞核酸保存试剂，配制过程安全简便，避免使用有毒试剂，能长期有效保存粪便中的脱落细胞，使其核酸满足临床上疾病检测诊断要求，可直接用于下游检测。

本发明采用如下技术方案：

一种粪便脱落细胞核酸保存试剂，包括非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，渗透压调节剂，细胞膜稳定剂，螯合剂，pH缓冲液和水。

根据本发明，所述非离子表面活性剂在保存试剂中体积浓度为0.1％-1％。所述非离子表面活性剂选自Triton X-100或吐温20。

根据本发明，所述阴离子表面活性剂在保存试剂中质量体积浓度为0.1％-1％，例如0.1％。所述阴离子表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠SDS。

根据本发明，所述渗透压调节剂在保存试剂中摩尔浓度为100mM-200mM。所述渗透压调节剂选自氯化钠。

根据本发明，所述细胞膜稳定剂在保存试剂中质量体积浓度为1％-5％。所述细胞膜稳定剂选自甘露醇。

根据本发明，所述螯合剂选自EDTA，所述保存试剂中EDTA的摩尔浓度为30mM-80mM。

根据本发明，所述pH缓冲液选自Tris-HCl缓冲液，所述保存试剂中Tris的摩尔浓度为30mM-80mM。

根据本发明，所述保存试剂的pH为7.5-8.5。

根据本发明，所述保存试剂进一步含有除臭剂，所述除臭剂组分包括甲基丙烯酸月桂酯、乙醇、薄荷精油和茉莉精油；所述除臭剂中各组分的质量比为：(1-10):(4-200):(1-5):(1-10)。

在一个示例性实施方案中，以保存试剂的总体积计，包括0.1％-1％(v/v)TritonX-100，0.1-1％(w/v)SDS，30mM-80mM EDTA，30mM-80mM Tris，100mM-200mM氯化钠，1％-5％(w/v)甘露醇，0.05％-0.5％甲基丙烯酸月桂酯(w/v)、2％-10％乙醇(v/v)、0.05％-0.2％薄荷精油(w/v)，0.05％-0.5％茉莉精油(w/v)，余量为水。

本发明还提供所述保存试剂的制备方法，包括按比例称取或量取各组分，加入水定容到预定体积，调节pH。

本发明进一步提供一种粪便脱落细胞核酸保存方法，所述方法采用如上所述的保存试剂。

根据本发明，所述保存方法包括如下步骤：取检测对象的粪便样品，加入上述保存试剂，常温保存。

根据本发明，所述粪便样品与保存试剂的质量体积比为1:1-5。

根据本发明，所述检测对象为温血哺乳动物，包括人或其他灵长类动物；鸟类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；等。

根据本发明，所述保存方法可以用于消化道疾病诊断所需粪便样品的诊断，例如所述消化道疾病包括食管癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌等。

本发明还提供上述保存试剂在制备疾病诊断用粪便样品中的应用。在一个实施方案中，所述疾病为消化道疾病，包括但不限于食管癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌等。

有益效果：

(1)本发明提供的粪便保存试剂非离子型表面活性剂可以溶解脂质；阴离子表面活性剂可以断裂分子被和分子间的氢键，破坏蛋白质的结构；螯合剂螯合粪便中的金属离子，抑制核酸酶的活性，防止DNA的降解；氯化钠与甘露醇的作用是稳定溶液的离子强度、调节渗透压；且甘露醇可以增加细胞膜稳定性，减少细菌基因组释放到上清中。并且各组分在特定用量范围内协同作用，可以在常温下有效地保存人类粪便中的人类基因组，常温保存45天后，粪便样本中人类基因组的提取效果和下游的检测效果与新鲜样本中的效果无差异。

(2)本发明提供的粪便保存试剂可以有效裂解粪便中的人体脱落细胞，且不含有硫氰酸胍和异硫氰酸胍等有毒成分，从而提供一种从粪便上清中直接进行粪便基因组提取和检测的方法，可以有效避免粪便杂质的干扰，检测前无需再次对粪便样品进行沉淀处理，简化了下游操作步骤。

(3)本发明经大量研究发现通常在加入除臭剂时虽然可以达到除臭的目的，但同时对样品稳定性带来影响，除臭剂的成分对保存试剂的感官效果和样本稳定性均有相当大的影响。本发明的发明人意外地发现本发明的除臭剂不仅可以起到除臭的效果，而且对样品稳定性无任何负面影响，其有效成分能与各种异味分子迅速发生聚合、取代、置换、吸附等化学反应，且无毒、无腐蚀性、无二次污染，可达到感官效果和样品保存稳定性的双重效果。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1粪便保存试剂配方

粪便保存试剂1：0.5％Triton X-100，0.1％SDS，50mM EDTA，50mM Tris，150mM氯化钠，2％甘露醇，pH 8.0；

粪便保存试剂2：0.5％Triton X-100，0.1％SDS，50mM EDTA，50mM Tris，150mM氯化钠，2％甘露醇，0.1％甲基丙烯酸月桂酯、5％乙醇、0.1％薄荷精油，0.25％茉莉精油，pH8.0；

粪便保存试剂3：0.5％Triton X-100，0.1％SDS，50mM EDTA，50mM Tris，150mM氯化钠，pH 8.0；

粪便保存试剂4：0.5％Triton X-100，0.1％SDS，50mM EDTA，50mM Tris，150mM氯化钠，2％甘露醇，1％除臭剂A(蓝净除臭除味剂，购于济南德蓝化工有限公司，其主要成分为丝兰、银杏叶、茶多酚、葡萄籽、樟科植物、桉叶油、松油等植物提取有效成分)，pH 8.0。

实施例2保存试剂配制方法

粪便保存试剂1的配制方法：量取5mL Triton X-100，称取1g SDS粉末，6.06gTris粉末，14.61g EDTA粉末，8.77g氯化钠粉末，20g甘露醇粉末，加入纯化水定容到1L，用盐酸调节pH值为8.0。

粪便保存试剂2的配制方法：量取5mL Triton X-100，称取1g SDS粉末，6.06gTris粉末，14.61g EDTA粉末，8.77g氯化钠粉末，20g甘露醇粉末，1g甲基丙烯酸月桂酯、50mL乙醇、1g薄荷精油，2.5g茉莉精油，加入纯化水定容到1L，用盐酸调节pH值为8.0。

粪便保存试剂3的配制方法：量取5mL Triton X-100，称取1g SDS粉末，6.06gTris粉末，14.61g EDTA粉末，8.77g氯化钠粉末，加入纯化水定容到1L，用盐酸调节pH值为8.0。

粪便保存试剂4的配制方法：量取5mL Triton X-100，称取1g SDS粉末，6.06gTris粉末，8.77g氯化钠粉末，20g甘露醇粉末，10mL除臭剂A，加入纯化水定容到1L，用盐酸调节pH值为8.0。

实施例3粪便总DNA的提取

所用试剂盒为QIAamp DNA Stool Mini kit(QIAGEN)，具体操作步骤参见试剂盒说明书。

实施例4粪便人脱落细胞DNA的提取

将粪便样本按照1:3的比例加入粪便保存试剂，常温保存。粪便人脱落细胞DNA提取采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂(货号AA07)，试剂盒组分及操作步骤如下：

1.前处理：将采样装置中的样本充分振荡混匀，从中取10mL样本至一洁净的15mL离心管中，3500×g离心10min，从离心机中轻轻取出离心管，取上清至新的15mL离心管中。

2.吸附：加入PVPP(终浓度为50mg/mL)处理，涡旋振荡，使其充分混匀，3500×g离心10min。

3.结合：转移上清至新的15mL离心管中，向上清中加入等体积缓冲液B，轻柔地颠倒混匀。

4.核酸变性：置于90℃水浴或金属浴10min，迅速取出。

5.杂交孵育：加入捕获剂，颠倒混匀，室温静置孵育40min。

6.吸磁分离：吸磁5-10min，弃上清。

7.漂洗1：向2mL离心管加入1mL缓冲液C，震荡混匀5s，置于磁力架上吸磁2min，弃上清。

8.漂洗2：向2mL离心管中加入1mL缓冲液C，震荡混匀5s，置于磁力架上吸磁2min，弃上清。

9.洗脱：向2mL离心管中加入40μL洗脱液TE，轻轻震荡混匀，将上清转移至一洁净离心管中，即得所需DNA溶液。

实施例5PCR检测

用荧光PCR的方法检测中的β-actin基因，β-actin的检测引物和探针如下：

表1

引物/探针名称	碱基序列(5’-3’)
		β-actin正向引物	CAAGATGAGATTGGCATGGCT
β-actin逆向引物	TGTGAACTTTGGGGGATGCTC
		β-actin探针	CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC

用ABI7500进行荧光PCR检测，PCR反应体系如下：

表2

组分	规格	体积(μL)
			缓冲液	10×	2.5
dNTPs	各2.5mM	2
			β-actin正向引物	10μM	0.5
β-actin反向引物	10μM	0.5
			β-actin探针	10μM	0.5
DNA酶	5U/μL	0.5
			待测样本DNA	/	5
纯化水	/	补至25

荧光PCR反应条件如下：

表3

质量控制和结果读取：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，其中阴性对照为超纯水，阳性对照为β-actin质粒(浓度为1×10⁴copies/μL)，每次PCR完成后，调整基线和阈值，读取样本的Ct值，另外阴性对照要无明显指数增长期，Ct值为Undet/NoCt或Ct>40，阳性对照要有明显的指数增长期，且β-actin的Ct值满足26≤Ct≤30。

实验例1

选取5份不同捐赠者的粪便样本，按照实施例1和2所述方法配置粪便保存试剂1，每份样本分为两组：实验组和对照组，其中实验组加入粪便保存试剂1保存，对照组加入纯化水保存，对保存第0天、第3天、第7天的粪便样本按照实施例4和实施例5所述方法进行检测，分析每组样本β-actin基因的Ct值，结果如下表：

表4

由上表可以看出，在保存第0天时，样本1-5的实验组与对照组中β-actin基因的Ct无明显差异，在第3天和第7天时，对照组的Ct值明显大于实验组，在实验组中，保存第3天与第7天的Ct值与第0天无明显差别，该实验结果表明粪便保存试剂1能有效防止人体脱落细胞基因组的降解。

实验例2

选取4份不同捐赠者的粪便样本，按照实施例1和2所述方法配置粪便保存试剂1和粪便保存试剂2，每份样本分为两组：组1和组2，其中组1加入粪便保存试剂1保存，组2加入粪便保存试剂2保存，对保存第0天、第3天、第7天、第15天、第22天、第30天、第37天和第45天的粪便样本按照实施例4和实施例5所述方法进行检测，分析每组样本β-actin基因的Ct值，结果如下表：

表5

由上表可以看出，在保存第3天、第7天、第15天、第22天、第30天、第37天和第45天时，样本1-4的组1中β-actin基因的Ct值与组2中β-actin基因的Ct值与第0天相差均在±0.5的范围内，表明粪便保存试剂1和粪便保存试剂2的保存效果无差异，二者均能保存粪便中的人体脱落细胞不降解长达45天之久。保存试剂2和保存试剂1的唯一差别是加入了除臭剂，上述结果可进一步表明为本发明的除臭剂不会对基因组的稳定性造成负面影响。

实验例3

选取5份不同捐赠者的粪便样本，按照实施例1和2所述方法配置粪便保存试剂1和粪便保存试剂3，每份样本分为两组：组1和组2，其中组1加入粪便保存试剂1保存，组2加入粪便保存试剂3，对每组粪便样本按照实施例3所述方法进行提取和实施例5所述方法进行检测，分析每组样本基因组的浓度和β-actin基因的Ct值，结果如下表：

表6

由上表可以看出，粪便样本在加入保存试剂3(组2)后，其β-actin基因的Ct值和加入保存试剂1时(组1)相比明显降低，然而组2基因组的浓度却普遍高于组1，表明组2的基因组背景可能比较复杂，抑制了目的基因的扩增。

实验例4

选取5份不同捐赠者的粪便样本，按照实施例1和2所述方法配置粪便保存试剂2和粪便保存试剂4，每份样本分为两组：组1和组2，其中组1加入粪便保存试剂2，组2加入粪便保存试剂4，对每组粪便样本按照实施例4所述方法进行提取和实施例5所述方法进行检测，分析每组样本β-actin基因的Ct值，

结果如下表：表7

	组1(保存试剂2)	组2(保存试剂4)
			样本1	35.12	Undet
样本2	29.54	33.58
			样本3	33.98	Undet
样本4	27.11	31.52
			样本5	28.45	30.09

由上表可以看出，粪便样本在加入保存试剂4后，其β-actin基因的Ct值和加入保存试剂2时相比明显降低，表明保存试剂4的保存效果不如保存试剂2，而保存试剂2和4的差别在于除臭剂，该实验结果表明除臭剂A中可能含有不利于粪便DNA提取或者检测的成分。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种粪便脱落细胞核酸保存试剂，包括非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，渗透压调节剂，细胞膜稳定剂，螯合剂，pH缓冲液和水。

2.根据权利要求1所述的粪便脱落细胞核酸保存试剂，所述非离子表面活性剂在保存试剂中体积浓度为0.1％-1％；优选地，所述非离子表面活性剂选自Triton X-100或吐温20。

3.根据权利要求1或2所述的粪便脱落细胞核酸保存试剂，所述阴离子表面活性剂在保存试剂中质量体积浓度为0.1％-1％；优选地，所述阴离子表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠SDS。

4.根据权利要求1-3任一项所述的粪便脱落细胞核酸保存试剂，所述渗透压调节剂在保存试剂中摩尔浓度为100mM-200mM；优选地，所述渗透压调节剂选自氯化钠；

优选，所述细胞膜稳定剂在保存试剂中质量体积浓度为1％-5％。所述细胞膜稳定剂选自甘露醇。

5.根据权利要求1-4任一项所述的粪便脱落细胞核酸保存试剂，所述螯合剂选自EDTA，所述保存试剂中EDTA的摩尔浓度为30mM-80mM；

优选，所述pH缓冲液选自Tris-HCl缓冲液，所述保存试剂中Tris的摩尔浓度为30mM-80mM。

优选，所述保存试剂的pH为7.5-8.5。

6.根据权利要求1-5任一项所述的粪便脱落细胞核酸保存试剂，所述保存试剂进一步含有除臭剂，所述除臭剂组分包括甲基丙烯酸月桂酯乙醇，薄荷精油和茉莉精油；

优选地，所述粪便脱落细胞核酸保存试剂不含有硫氰酸胍和异硫氰酸胍。

7.根据权利要求1-6任一项所述的粪便脱落细胞核酸保存试剂，以保存试剂的总体积计，包括0.1％-1％(v/v)Triton X-100，0.1-1％(w/v)SDS，30mM-80mM EDTA，30mM-80mMTris，100mM-200mM氯化钠，1％-5％(w/v)甘露醇，0.05％-0.5％甲基丙烯酸月桂酯(w/v)，2％-10％乙醇(v/v)，0.05％-0.2％薄荷精油(w/v)，0.05％-0.5％茉莉精油(w/v)，余量为水。

8.如权利要求1-7任一项所述保存试剂的制备方法，包括按比例称取或量取各组分，加入水定容到预定体积，调节pH。

9.一种粪便脱落细胞核酸保存方法，所述方法采用如权利要求1-7任一项所述的保存试剂；优选地，所述保存方法包括如下步骤：取检测对象的粪便样品，加入上述保存试剂，常温保存；

优选，所述粪便样品与保存试剂的质量体积比为1:1-5。

10.权利要求1-7任一项所述的保存试剂在制备疾病诊断用粪便样品中的应用；优选，所述疾病为消化道疾病，例如食管癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌等；

优选地，所述粪便样品为粪便上清液。