CN107980763A - 一种粪便保存试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种粪便保存试剂及其应用。本申请的粪便保存试剂，包括细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂；细胞缓冲液为Tris‑HCl，工作pH范围为8‑10；细胞固定剂选自SDS、Triton X‑100和PEG‑2000中的至少一种；金属离子螯合剂为EDTA和/或EDTA‑Na2；防腐剂为NaCl。本申请的粪便保存试剂，通过各组分相互配合，能对粪便中的脱落细胞进行有效保护，避免脱落细胞降解，为粪便中脱落细胞的检测提供了有利条件；并且，添加本申请的粪便保存试剂进行保存的粪便样本，其混合物可以直接用于提取DNA或核酸检测，使用简单方便。此外，本申请的粪便保存试剂，不影响下游的粪便检测。

Description

一种粪便保存试剂及其应用
技术领域
本申请涉及粪便保存领域，特别是涉及一种粪便保存试剂及其应用。
背景技术
近年来，人粪便当中脱落细胞的检测由于无创无痛且特异性高等特征，常用于结直肠癌等疾病的初筛普查，较之化学法或免疫法的粪便隐血试验、全直肠镜检查等方法更能达到“早发现、早诊断、早治疗”的目的。
但人粪便中的脱落细胞含量较少、易降解、粪便样本保存条件受限都是制约粪便脱落细胞检测的瓶颈。其中，粪便样本保存条件受限是指，粪便样本通常需要在-20℃保存，以避免脱落细胞的降解或其它生化反应。但是，粪便样本采集很多时候并不是在实验室中进行，也就是说，采集的粪便样本或多或少都需要在常温下放置一段时间才能放入冰箱中-20℃保存；这个过程容易造成原本就很少量的脱落细胞进一步损失，从而影响后续检测。
因此，亟需研发一种能够有效保持粪便样本中脱落细胞的粪便保存试剂，并且，粪便保存试剂必须不影响下游的粪便检测。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的粪便保存试剂及其应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种粪便保存试剂，包括细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂；细胞缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为8-10；细胞固定剂选自SDS、Triton X-100和PEG-2000中的至少一种；金属离子螯合剂为EDTA和/或EDTA-Na2；防腐剂为NaCl。
需要说明的是，本申请的粪便保存试剂，一方面，可以有效的保存粪便中的脱落细胞，避免其降解；另一方面，粪便保存试剂的各组分不会影响后续的粪便样本检测。本申请的粪便保存试剂中，细胞缓冲液保持粪便样本pH值在8-10，为脱落细胞提供了存储环境，有效的防止脱落细胞破裂，并防止核酸降解；细胞固定剂用于固定粪便样本中的脱落细胞；金属离子螯合剂用于螯合粪便样本中的金属离子，从而抑制其中的各种酶活性，维持粪便样本中脱落细胞的稳定性，同时也防止粪便中的游离DNA被核酸酶降解；防腐剂使粪便样本中的微生物不致过渡增殖，防止脱落细胞被微生物破坏。本申请的粪便保存试剂通过各组分相互配合，起到了保护粪便中脱落细胞的效果，并且，本申请的粪便保存试剂可以在常温下对人粪便样本进行保存21天，而其中的脱落细胞不发生明显降解；在-20℃或-80℃下可以长期保存。不过，需要注意的是，如果需要-20℃或-80℃长期保存，应尽量避免反复冻融。
还需要说明的是，粪便保存试剂中细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂各组分的用量，按照各组分的常规有效化学剂量使用即可，但是，在本申请的优选方案中，对各组分用量进行了特别限定，以达到更好的粪便中脱落细胞的保存效果，详见以下方案。其中，常规有效化学剂量是指化学试剂能够正常发挥其理化功能的剂量，排除一些极端的浓度或用量情况。
优选的，Tris-HCl的浓度为0.1-1mol/L。
优选的，SDS的浓度为0.01％-10％，Triton X-100的浓度为0.01％-10％，PEG-2000的浓度为0.01％-10％。
优选的，金属离子螯合剂的浓度为1-150mmol/L。
优选的，NaCl的浓度为0.1-10mol/L。
本申请的一种实现方式中，优选的，细胞缓冲液的浓度为0.02mol/L、工作pH值为8；细胞固定剂的浓度为1.3％；金属离子螯合剂的浓度为0.025mol/L；防腐剂的浓度为0.17mol/L。
本申请的另一面公开了本申请的粪便保存试剂在人粪便或其它动物粪便的保存中的应用。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的粪便保存试剂，通过各组分相互配合，能够对粪便中的脱落细胞进行有效保护，避免脱落细胞降解，为粪便中脱落细胞的检测提供了有利条件；并且，添加本申请的粪便保存试剂进行保存的粪便样本，其混合物可以直接用于提取DNA或核酸检测，使用简单方便。此外，本申请的粪便保存试剂，不影响下游的粪便检测。
附图说明
图1为本申请实施例中没添加任何试剂的人粪便样本保存1天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图2为本申请实施例中没添加任何试剂的人粪便样本保存7天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图3为本申请实施例中没添加任何试剂的人粪便样本保存14天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图4为本申请实施例中没添加任何试剂的人粪便样本保存21天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图5为本申请实施例中添加粪便保存试剂的人粪便样本保存1天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图6为本申请实施例中添加粪便保存试剂的人粪便样本保存7天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图7为本申请实施例中添加粪便保存试剂的人粪便样本保存14天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
图8为本申请实施例中添加粪便保存试剂的人粪便样本保存21天，提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图；
具体实施方式
粪便样本中的脱落细胞，不同于在粪便中繁殖的微生物，脱落细胞自脱落开始就已经处于一个难以为继的生态环境，因此，对脱落细胞的保存相对于粪便样本微生物的保存，有更高的难度和要求。通常粪便样本直接采用-20℃保存，目的也是为了在低温下冻结细胞和微生物的生化代谢，达到脱落细胞保存的目的。而本申请的粪便保存试剂，为脱落细胞提供了一个有效的生存环境，使其不易降解、破坏，也能够抑制各种酶的活性、抑制各种微生物的过渡增殖，使脱落细胞能够在常温下保存至少21天，并可以在-20℃或-80℃下长期保存。并且，本申请的粪便保存试剂，其组分不会影响下游的粪便检测，为粪便样本的保存和粪便样本脱落细胞的临床检测奠定了基础。
本申请的专业术语解释如下：
SDS是十二烷基硫酸钠，英文名Sodium dodecyl sulfate，缩写为SDS。
Triton X-100即聚乙二醇辛基苯基醚。
PEG-2000即聚乙二醇2000。
EDTA即乙二胺四乙酸，EDTA-Na2即乙二胺四乙酸钠。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的粪便保存试剂由细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂组成，其中，细胞缓冲液为终浓度0.02mol/L的Tris-HCl，工作pH为8；细胞固定剂为SDS和TritonX-100，细胞固定剂的用量为总重量的1.3％；金属离子螯合剂为终浓度0.025mol/L的EDTA；防腐剂为终浓度0.17mol/L的NaCl。
粪便保存试剂的制备方法如下：
称取SDS和Triton X-100，将SDS溶于Triton X-100中，制成SDS浓度为20％的溶液1；将Tris溶于水中，用盐酸调节pH为8-10，制得2mol/L的Tris-HCl溶液2；将NaCl固体溶于水中，制得5mol/L的NaCl溶液3；将EDTA固体溶于水中，用浓度为1M的NaOH调节固体溶解，制得1mol/L的溶液4；将溶液1、溶液2、溶液3、溶液4，按照以上终浓度进行混合，过滤，即得到本例的粪便保存试剂，并采用盐酸或氢氧化钠调节pH为8-10。
本例分别对三个粪便样本进行了试验，每个粪便样本平均分为两份，一份添加本例的粪便保存试剂，粪便保存试剂:粪便样本的体积比为3:1，即1体积的粪便样本分散到3倍体积的粪便保存试剂中；另一份粪便样本不添加任何试剂。
本例分别对三个粪便样本在添加粪便保存试剂和没有添加任何试剂的情况下，常温保存1、7、14、21天的样本进行DNA提取，测量DNA含量。并采用实时荧光PCR检测提取的DNA中肌动蛋白基因(缩写b-actin)。其中，b-actin是人源性基因，可以反映提取的DNA中是否含有来自于人的基因，从而反映粪便样本中是否包含人源性的脱落细胞。
DNA提取采用STRATEC BIOMEDICAL AG公司PSP Spin Stool DNAKit，具体步骤参考说明书。DNA含量测量采用Nanodrop_2000，提取完成的DNA直接点样检测。
b-actin实时荧光PCR检测采用的引物，其上下游引物分别为Seq ID No.1和SeqID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列。
b-actin上游引物F：
Seq ID No.1：5’-TGTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3’
b-actin下游引物R：
Seq ID No.2：5’-CCAAAATTCACAATATAACCGAAAAC-3’
b-actin探针P：
Seq ID No.3：5’-CTGGTGGCCGCCTCCCTCCTTC-3’
其中，探针的5’端进行VIC荧光标记，3’端进行BQ1荧光淬灭标记。
b-actin实时荧光PCR检测的反应体系为50μL，包括：Hot start Taq 2U、10mM的dNTPs 0.4μL、50mM的Mg2+1.5μL、10×standard PCR buffer 5μL、10mM的上游引物1μL、10mM的下游引物1μL、10mM的探针0.5μL、提取的DNA模板1μL，补充ddH2O至50μL。
反应条件为：50℃2min、95℃5min；然后进入15个循环的预扩增：95℃15s、60℃30s；预扩增后进入30个循环：95℃变性15s、60℃退火延伸30s，在退火延伸步骤收集荧光；循环结束后20℃2min。
DNA含量测试结果如表1和表2所示，b-actin实时荧光PCR检测的Ct值如表1和表2所示，实时荧光PCR部分扩增曲线如图1至图8所示。
表1未添加任何试剂的粪便样本中DNA含量和b-actin检测Ct值
表2添加粪便保存试剂的样本中DNA含量和b-actin检测Ct值
注：表1中，NA表示没有检测到b-actin
表1和表2的结果可见：
(1)未加本例的粪便保存试剂的三个粪便样本：提取的DNA含量随时间增加呈现升高趋势，特别是样本1和样本3，DNA含量增加明显；而b-actin检测的Ct值随时间增加Ct值增高，样本1和样本3在14天后没有检测Ct，样本2在21天后也没有检测Ct，如表1所示。Ct值是实时荧光PCR反映样本中靶标DNA相对量的一个值，靶标DNA含量越高，Ct值越低。因此，b-actin检测的Ct值随时间增加而增高，说明b-actin的量在减少，表示人源性的核酸含量在减少，即脱落细胞随着时间增加而发生降解，以至于人源性核酸含量减少。可见，在没添加粪便保存试剂的情况下，常温保存粪便样本，其中的脱落细胞会随着时间增加而快速降解，通常14天脱落细胞就会降解殆尽。而DNA含量的增加，说明粪便样本中微生物数量在增加，以至于获得的DNA总量增加。
(2)添加本例的粪便保存试剂的三个粪便样本：提取的DNA含量随时间增加呈现降低趋势，b-actin检测Ct值初期有细微增高，而后呈稳定趋势，三个样本在第21天依然可以检测到较为稳定的人源性b-actin，表明粪便样本中的脱落细胞依然稳定存在。可见，本例的粪便保存试剂能够稳定的保存粪便样本中的脱落细胞，并且，有效的抑制其中的微生物过渡繁殖。
样本1的实时荧光PCR扩增曲线如图1至图8所示，图1至图4是未加本例的粪便保存试剂的粪便样本1，分别保存1、7、14、21天提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图。图5至图6是添加本例的粪便保存试剂的粪便样本1，分别保存1、7、14、21天提取的DNA进行b-actin实时荧光PCR检测的结果图。图1至图4的结果可见，未加本例的粪便保存试剂的粪便样本1，在保存1天和7天都有检出人源性b-actin基因，但是，14后则未有检出，说明人源性的脱落细胞已经降解殆尽。而图5至图6的结果可见，保存1、7、14、21天都有稳定的检出人源性b-actin基因，说明粪便样本中有稳定含量的人源性脱落细胞存在。
本申请的粪便保存试剂，除以上实施例的配方以外，细胞固定剂可以采用SDS、Triton X-100和PEG-2000中的至少一种，即可以单独使用SDS、Triton X-100或PEG-2000，也可以两两组合或者三者一起组合使用，单独使用时，SDS的用量为总重量的0.01％-10％，Triton X-100的用量为总重量的0.01％-10％，PEG-2000的用量为总重量的0.01％-10％。金属离子螯合剂还可以采用EDTA-Na2，EDTA和EDTA-Na2可以单独使用，也可以组合使用。Tris-HCl的浓度在0.1-1mol/L范围内、金属离子螯合剂的浓度在1-15mmol/L范围内、NaCl的浓度在0.1-10mol/L范围内，均可适用于粪便样本保存。以上配方即可以有效的保存脱落细胞，又不会影响下游的粪便检测。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种粪便保存试剂及其应用
<130> 17I25328
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtggacttg ggagaggact gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaaaattca caatataacc gaaaac 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggtggccg cctccctcct tc 22

Claims (6)

1.一种粪便保存试剂，其特征在于：包括细胞缓冲液、细胞固定剂、金属离子螯合剂和防腐剂；
所述细胞缓冲液为Tris-HCl，工作pH范围为8-10；
所述细胞固定剂选自SDS、Triton X-100和PEG-2000中的至少一种；
所述金属离子螯合剂为EDTA和/或EDTA-Na2；
所述防腐剂为NaCl。
2.根据权利要求1所述的粪便保存试剂，其特征在于：所述Tris-HCl的浓度为0.1-1mol/L。
3.根据权利要求1所述的粪便保存试剂，其特征在于：所述SDS的浓度为总重量的0.01％-10％，所述Triton X-100的浓度为总重量的0.01％-10％，所述PEG-2000的浓度为总重量的0.01％-10％。
4.根据权利要求1所述的粪便保存试剂，其特征在于：所述金属离子螯合剂的浓度为1-150mmol/L。
5.根据权利要求1所述的粪便保存试剂，其特征在于：所述NaCl的浓度为0.1-10mol/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的粪便保存试剂在人粪便或其它动物粪便的保存中的应用。
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