CN110607372B - lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用 - Google Patents

lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNA SLC7A11‑AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用，涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了lncRNA SLC7A11‑AS1在作为胃癌病人耐药诊断标志物的应用。本发明还构建了的包含一对特异性检测引物的胃癌耐药诊断试剂或试剂盒，用于检测组织标本或血浆、血清、血小板等血液样本。本发明具有良好的临床应用价值，在对胃癌耐药诊断具有较好的检测效果。

Description

lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用。
背景技术
中国是胃癌发病率最高的国家之一，胃癌的新发病例占全世界的40％以上，胃癌是恶性肿瘤死亡率的第三位病因。近年来，随着诊疗技术不断提高，虽然胃癌的死亡率有所下降，预后明显改善，在我国大的医疗中心胃癌5年的生存率已有显著提高。但相对于日本的数据，仍有相当大的差距。如何有效提高胃癌的诊治水平，一直是临床医生关注的热点和难点问题。虽然诊疗技术在不断提高，但胃癌患者的生存率仍然很低，主要是由于大多数的病人确诊已处于中晚期。因此，化疗作为重要的治疗措施，在进展期胃癌的治疗过程中具有重要的地位。而化疗又常常因为其较大的毒副作用和耐药而导致失败，所以有效地阐明肿瘤耐药的分子机制，并针对性地制定出治疗策略，才能够明显提高患者生存和改善患者的预后。随着基因组学、蛋白质组学和功能分析技术的应用，使我们可以有条件对胃癌的特点、治疗效果进行基因指纹的分析，以探索胃癌耐药的分子机制和治疗前的分子分型。
目前认为细胞在受到各种内源性和外源性刺激时，产生活性氧类物质(reactiveoxygen species,ROS)超过细胞的自生承受能力打破细胞的氧化还原稳态，此时细胞产生氧化应激。然而，目前已证实在大多数的肿瘤细胞ROS的胞内含量比正常细胞高，表现出高水平的氧化应激特性。为了适应增强的氧化应激，肿瘤细胞通过增强自身的抗氧化能力来调节ROS介导的损伤机制，从而赋予了肿瘤细胞对放、化疗的耐受特性，并且胞内增高的ROS水平，还可促进细胞的增殖以及抑制细胞的凋亡。放、化疗主要通过增加外源性氧化应激，提高肿瘤细胞内的ROS水平，从而对肿瘤细胞起杀伤作用。肿瘤细胞通过提高谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平增加ROS的清除能力，维持高水平的ROS动态平衡而逃避放、化疗的杀伤作用。并且增高的GSH还会诱导抗氧化酶的表达，从而增加肿瘤细胞在高氧化应激情况下的生存能力和提高对抗癌药物的耐受性。我们可以通过打破肿瘤细胞的这种氧化还原稳态，来抑制肿瘤细胞的耐药性，提高放化、疗的敏感性，同时抑制肿瘤细胞的增殖能力，诱导肿瘤细胞凋亡，可有效地提高肿瘤的治疗效果，为肿瘤治疗提供一种新的思路。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用，具体为提供lncRNA SLC7A11-AS1在作为胃癌耐药性诊断标志物的应用，以及检测lncRNA SLC7A11-AS1表达量的试剂在制备用于胃癌耐药性诊断的试剂或试剂盒中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
lncRNA SLC7A11-AS1在作为胃癌耐药诊断标志物中的应用。
检测上述lncRNA SLC7A11-AS1的试剂在制备胃癌耐药的检测试剂或试剂盒中的应用。
进一步地，胃癌耐药为胃癌顺铂耐药。
进一步地，检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncRNA SLC7A11-AS1的表达量。
进一步地，检测试剂或试剂盒包括：对lncRNA SLC7A11-AS1具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
进一步地，对lncRNA SLC7A11-AS1具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-CATCCTGTGGCTGGAGAGAT-3'；
下游引物：5'-AGCACTCGGAAAATGGTGAA-3'。
在正常细胞中，适度的增加ROS的水平，不仅能增加细胞的增殖能力，还能促进细胞的分化。然而，过量的ROS则导致细胞脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，线粒体的功能障碍，原癌基因的活化及异常的代谢。
因此，维持正常的ROS稳态对细胞的生长及生存有着重大的意义。肿瘤细胞为了维持高水平的ROS的稳态，主要通过调节ROS的产生和清除。其中，其中L-半胱氨酸是合成GSH的必须原料，内源性的L-半胱氨酸不足以用于GSH合成，这就需要外源性地摄取以二硫化物形式存在的L-半胱氨酸(即胱氨酸)。xCT(又名SLC7A11)作为ROS主要清除者，是胱氨酸-谷氨酸逆向转移载体的轻链组成部分，主要功能是向胞内摄取胱氨酸。肿瘤细胞通过上调xCT表达增加对胱氨酸的摄取，从而增加GSH的合成来维持高水平氧化还原稳态，使胞内增高的ROS含量维持在细胞损伤阈值之下但又比正常细胞水平高。通过清除肿瘤细胞外源性L-半胱氨酸和胱氨酸，能够减少肿瘤细胞还原型谷胱甘肽的合成，显著抑制多种肿瘤细胞的增殖生长，是一种安全而有效的肿瘤治疗方法。
LncRNA SLC7A11-AS1作为xCT的反义RNA，通过胃癌组织和配对邻近正常胃组织进行LncRNAs和mRNAs联合Microarray分析，发现SLC7A11-AS1和xCT在胃癌中表达存在明显的差异，并通过前期的预实验将胃癌组织和配对邻近正常胃组织的对比研究，证实SLC7A11-AS1在胃癌组织中表达降低，而xCT在胃癌组织中增高,并且SLC7A11-AS1通过吸附miRNA-33a-5p调控xCT介导胃癌细胞的ROS保护及调控肿瘤细胞顺铂耐药。
综上所述，本发明提供的lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物，特异性好，敏感性高，为诊断胃癌耐药提供了新的临床手段，有助于对耐药的监测，避免进一步的无效治疗，具有良好的转化医学前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为顺铂耐药株与非耐药株胃癌细胞在不同顺铂(DDP)浓度下细胞活性的变化图；
图2为xCT表达情况在胃癌细胞顺铂耐药与顺铂非耐药株的电镜图；
图3为顺铂耐药的胃癌细胞株与非耐药胃癌细胞株的lncRNA SLC7A11-AS1的表达情况图；
图4为下调SLC7A11-AS1后细胞活性图；
图5为下调SLC7A11-AS1后xCT表达情况的电镜图；
图6为顺铂耐药的胃癌细胞株与非耐药胃癌细胞株的GSH水平图；
图7为顺铂耐药的胃癌细胞株与非耐药胃癌细胞株的ROS水平图；
图8为SLC7A11-AS1在顺铂耐药病人肿瘤组织和顺铂非耐药病人肿瘤组织中的表达水平图；
图9为SLC7A11-AS1在顺铂耐药病人肿瘤组织和顺铂非耐药病人肿瘤组织中的表达情况电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
lncRNA SLC7A11-AS1在作为胃癌耐药诊断标志物中的应用。
检测上述lncRNA SLC7A11-AS1的试剂在制备胃癌耐药的检测试剂或试剂盒中的应用。
胃癌耐药为胃癌顺铂耐药。
检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncRNA SLC7A11-AS1的表达量；通过实时定量PCR技术检测lncRNA SLC7A11-AS1的表达量。
生物样品选自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。
检测试剂或试剂盒包括：对lncRNA SLC7A11-AS1具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
对lncRNA SLC7A11-AS1具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-CATCCTGTGGCTGGAGAGAT-3'；
下游引物：5'-AGCACTCGGAAAATGGTGAA-3'。
本发明用于检测lncRNA SLC7A11-AS1的检测方法，具体步骤如下：
(1)组织标本采集
胃癌组织：于肿瘤上切取直径为0.5-1.0cm左右的胃癌组织。
癌旁组织：距肿瘤边缘大于5cm以上，切取0.5-1.0cm大小正常胃组织。
为防止RNA的降解，在手术切下时立即切取标本，用PBS清洗两次后放入冻存管立即置入液氮，最后转运至-80℃冰箱长期保存；
(2)总RNA的抽提
1)组织匀浆
取出待测样本放于冰上解冻，称取5g胃癌组织样本，将其绞碎加入1mL Trizol，于冰上组织均浆机8000r/min，均浆2min，使组织充分磨碎；
2)于冰上静置10-15min，使细胞充分裂解；
3)按5:1的比例，加入200μL氯仿，充分混匀后在室温下静置15min；
4)4℃，12000rpm离心15min至液体分层；
5)吸取约700μL上清液至新的EP管中；
6)加入700μL异丙醇，充分混匀室温静置30min；
7)4℃，12000rpm离心10min，至管底出现沉淀，弃去上清液；
8)加入1mL 75％乙醇，混匀，室温静置5min；
9)4℃，8000rpm离心10min，弃去上清液；
10)打开EP管盖，于室温放置10min，使乙醇充分挥发；
11)加入50-100μL 0.01％DEPC水，轻柔吹打使RNA完全溶解于DEPC水中；
12)使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度；
(3)总RNA逆转录
1)反应体系如下：
总RNA量(0.5-5ng) X；
Oligo(dT)15引物 1μL；
Random引物 1μL；
5×Buffer 5μL；
25mM MgCl2 4μL；
逆转录酶 1μL；
逆转录酶抑制剂 1μL；
PCR Nucleotide Mix 1.25μL；
无核酸水 3.75μL；
Total 25μL。
2)反应条件如下：
72℃ 5min；
42℃ 60min；
72℃ 15min；
4℃ ∞。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
分别对于顺铂耐药的胃癌细胞株SGC-7901/DDP与非耐药胃癌细胞株SGC-7901在不同顺铂(DDP)浓度下细胞活性进行测试，并通过电镜观察，结果如图1和图2所示。可知，SGC-7901/DDP在相同浓度的DDP中细胞活性比SGC-7901高，SGC-7901/DDP IC50也高于SGC-7901。
实施例2
分别对于顺铂耐药的胃癌细胞株SGC-7901/DDP与非耐药胃癌细胞株SGC-7901的lncRNA SLC7A11-AS1的表达量进行测定，结果如图3所示。可知SLC7A11-AS1和SLC7A11参与胃癌细胞顺铂的耐药。
实施例3
分别对于顺铂耐药的胃癌细胞株SGC-7901/DDP与非耐药胃癌细胞株SGC-7901用腺病毒感染，并通过电镜观察，结果如图4和图5所示。腺病毒感染下，SLC7A11-AS1下调，而下调SLC7A11-AS1后细胞活性增加，可知SLC7A11-AS1参与胃癌细胞顺铂的耐药。
实施例4
分别测试顺铂耐药的胃癌细胞株SGC-7901/DDP与非耐药胃癌细胞株SGC-7901的GSH水平，结果如图6所示。顺铂耐药株SGC-7901/DDP与非耐药株胃癌细胞SGC-7901相比GSH的水平明显增高；下调SLC7A11-AS1增加GSH水平。可知SLC7A11-AS1通过GSH调节顺铂耐药。
实施例5
分别测试顺铂耐药的胃癌细胞株SGC-7901/DDP与非耐药胃癌细胞株SGC-7901的ROS水平，结果如图7所示。顺铂耐药株SGC-7901/DDP与非耐药株胃癌细胞SGC-7901相比ROS的水平明显增高；下调SLC7A11-AS1增加ROS水平；可知SLC7A11-AS1通过GSH调节ROS水平介导顺铂耐药。
实施例6
分别测试SLC7A11-AS1在顺铂耐药病人肿瘤组织和顺铂非耐药病人肿瘤组织中的表达水平，并用电镜观察，结果如图8和图9所示，其中，R为顺铂耐药病人肿瘤组织；S为顺铂非耐药病人肿瘤组织。
由图可知，SLC7A11-AS1在顺铂耐药病人肿瘤组织中的表达水平低于顺铂非耐药病人肿瘤组织；SLC7A11在顺铂耐药病人肿瘤组织中的表达水平高于顺铂非耐药病人肿瘤组织。可知SLC7A11-AS1及SLC7A11参与胃癌病人的顺铂耐药。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> lncRNA SLC7A11-AS1作为胃癌耐药诊断标志物的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catcctgtgg ctggagagat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcactcgga aaatggtgaa 20
<210> 3
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgtctggc aagcgccgcg cgcatcctcg gttcccgccg cgccgttgcc gccgctcctc 60
tccctcctca cctccccgca agctgaggga gccggctctg gccttggcca gcccagaaag 120
gggctcccac agtgcagcgg tgagctgaag ggttcctcaa gcgcggccag agtgggcgcc 180
aaggccgagg aggcgcccag agccagcgag ggctgccagc aagctgtcac ctctcaatag 240
gaactggtac caacctactt acgaagaagt atttgtttta acctgaacct gggggaaaaa 300
caacatgaac tgttcgtcta tctatatcgt cattattttt tacctcatgg attgaaacaa 360
attttaaagg aaaaaagaat gttaagaaag agcagcactt actatcaggg aggcacctca 420
cgagcattgt aaacactcag gctcgctgct ttctgaagga catgccaatc atgcacagca 480
cttactagaa actgcaagac tgcacaacat gatggtattt attccaggaa caggagccag 540
tcctgggcac acacataaag ggacttcctt cactccccag aagaagagaa agcatgctga 600
cacacatctg cccaagcaat cagaaggcag ctaaagccgc cacagtcttc actcaccaac 660
agttagacct tttcaattga ttttattgaa gaaagtgagt gctgagcacc atgagttctc 720
ataaacaatc cattttggca aatgctttaa gaatgttggt taattgcagt taggcagcat 780
cgacgtattt tattttttgg aaagcaagaa gctggcttac caacattaag ttaaacaaca 840
tgtaagggtt agaaatatga atcaacaaac tattagggtg gtaccatctc tttataataa 900
aacaatgtag attgattaag tatagcctaa aagtttacca caaatcataa ctacatttaa 960
gctttgaatt tcatgactag tgattaattt tgcatgtcaa cttgactgag cttatagaat 1020
gcccaggtat ctgattaaac gttatttctg gaggtgtctg tgagggtgtt tctgtaagag 1080
attagcatct gaaggccagg tgtggtggct catgcctgta atcctagtac tttgggaggc 1140
cgaggtgggc agattgcctg agctcaggag tctgagacca gcctgggcaa catggcaaaa 1200
caccgtctgt actaaaaaat acaaagttta gccggatgtg gtggcacaca cctgtagtcc 1260
cagctactag ggaggctaag gcatgagaat ttcctgagcc tgcgaggcgg aggttgtggt 1320
aagccaagat tgtactccag cctgggtgat aaagtgagac cctatctcat aaaaaacaaa 1380
aaaacaaaaa agaaaaaagg agaagaaaga gacacagatt agcatttgaa tgggtggact 1440
gagtaaagca gatggccctc gtcagtgttg gtgggaattg tcctatccat tgagggctta 1500
aatgaaacaa agactgagga aggctgaatt caatctctgc tgactgctgg ggctgagaca 1560
tcaatcttct ccggctctca gtgctcttcc agactcagac tggaatgtac actatcagct 1620

Claims (3)

1.检测lncRNASLC7A11-AS1表达量的试剂在制备胃癌顺铂耐药的检测试剂或试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒包括：对lncRNASLC7A11-AS1具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述对lncRNASLC7A11-AS1具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-CATCCTGTGGCTGGAGAGAT-3'；
下游引物：5'-AGCACTCGGAAAATGGTGAA-3'。
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