CN110923321B - 一种环状rna检测试剂盒预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反应性 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预测三阴性乳腺癌新辅助化疗敏感性的环状RNA，所述环状RNA为hsa_circRNA_038632，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供一种预测三阴性乳腺癌新辅助化疗敏感性的试剂盒。本发明首次发现了hsa_circRNA_038632与三阴性乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性之间的相关性，通过检测hsa_circRNA_038632的表达水平可以预测三阴性乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性，从而有助于医生确定三阴性乳腺癌患者的化疗方案。

Description

一种环状RNA检测试剂盒预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反 应性

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及使用一种环状RNA检测试剂盒预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反应性。

背景技术

乳腺癌是全世界发病率最高的女性恶性肿瘤。三阴乳腺癌(triple-negativebreast cancer,TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体-2(HER-2)表达均阴性的乳腺癌，占整个乳腺癌群体的15％-20％。与激素受体阳性或HER2阳性的乳腺癌相比较，大部分的三阴乳腺癌临床特征表现为侵袭性强，组织学分级较高，预后差，易发生内脏转移。由于三阴性乳腺癌缺乏ER、PR和HER2受体的表达，常规的内分泌治疗与HER2靶向治疗不敏感，化疗仍是其除手术外最为主要的治疗手段。因此，三阴性乳腺癌患者的预后情况在很大程度上依赖于患者对于化疗药物的敏感性。而化疗敏感性以及化疗耐药是一个多因素参与的表型，涉及到肿瘤特征，药物的效应以及患者机体对药物治疗的反应。找寻到与三阴性乳腺癌化疗敏感性相关的指标，将有助于治疗选择以及成为可能的治疗靶点。新辅助化疗是指在实施局部治疗方法(如手术或放疗)前所做的全身化疗，目的是使肿块缩小、及早杀灭看不见的转移细胞，以利于后续的手术、放疗等治疗。既往研究证实，乳腺癌新辅助化疗病理反应性能够反应患者对于化疗药物的敏感性。通过新辅助化疗达到病理完全缓解(pCR)的患者，其无病生存率和无复发生存率相较于未达到病理完全缓解(non-pCR)的患者均有明显提高。然而，新辅助化疗也有风险，部分患者接受新辅助化疗的效果不好，使病变增大或患者体质下降，也可能失去根治肿瘤的机会。因此在进行新辅助化疗前进行新辅助化疗反应性的预测对于控制新辅助化疗的风险是非常必要的。

既往研究提示，非编码RNA作为生命体内重要的调节分子参与到药物摄入、排出、代谢等多个阶段，可调控细胞内不同水平的多种药物代谢相关蛋白而影响化疗敏感性。环状RNA属于内源性非编码RNA的一种，其结构为共价环状闭合的单链RNA。环状RNA广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。最近的研究表明，一些环状RNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。环状RNA利用其microRNA应答元件结合miRNA,以阻断miRNA对其靶标表达的抑制作用，从而调控其他相关RNA的表达水平。环状RNA与蛋白编码基因一样，具有主要的生物学功能。例如既往研究报道，circAKT3以及circ_0076305分别在胃癌和肺癌中的铂类化疗药物的抗性中起重要作用。由此可见，环状RNA有望成为肿瘤治疗新的疗效判定标志物和靶向治疗的工具，为人类战胜三阴性乳腺癌提供新的策略。

发明内容

本发明的目的在于通过研究证实hsa_circRNA_038632在三阴性乳腺癌中高表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，将其应用于预测三阴性乳腺癌新辅助化疗的反应性预测，进而应用于医药领域。基于该特异性提供一种性价比高、易于推广应用的三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效评估试剂盒。

本发明试剂盒包括扩增hsa_circRNA_038632的PCR引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2～3所示。

本发明试剂盒还包括：Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶、随机逆转录引物；实时定量PCR缓冲液、内参实时定量PCR引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶、双蒸水。

将本发明的试剂盒应用于预测三阴性乳腺癌新辅助化疗的敏感性。

本发明人前期通过三阴性乳腺癌患者肿瘤组织环状RNA芯片筛选，证实了环状RNA参与到了三阴性乳腺癌的恶性生物学行为当中，影响肿瘤生长转移，并且有可能成为预后指标。后续的实验当中，本发明人又增加了三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，BT549，MDA-MB-468)对比正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A)的环状RNA筛选。将组织的芯片结果与细胞系的芯片结果二者取交集，发现同时在细胞系以及人组织样本中三阴性乳腺癌相关上调环状RNA仅有11个，下调环状RNA仅有3个。其中，环状RNA hsa_circRNA_038632在三阴性乳腺癌组织中表达显著高于对应癌旁组织，与芯片结果一致，经测序RNAhsa_circRNA_038632的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。为了验证hsa_circRNA_038632的生物学功能，本发明人利用pcDNA3.1+载体，构建出了hsa_circRNA_038632过表达质粒，将过表达质粒分别转染至MDA-MB-231和BT549使其过表达hsa_circRNA_038632。进一步通过细胞生长曲线测定(CCK8)、平板克隆实验和Transwell实验发现，过表达hsa_circRNA_038632能够促进三阴性乳腺癌生长增殖、侵袭作用(附图1和2)。并且本发明人在MDA-MB-231和BT549中转染针对环状RNA接口处设计的siRNA抑制hsa_circRNA_038632表达(siRNA#1:GATGTGAATATTCTCTCTCCT；siRNA#2:GAATATTCTCTCTCCTGGAGC)，初步探究了在分别加入梯度浓度的紫杉醇或阿霉素后，应用CCK8法检测48h后肿瘤细胞增殖率的变化。与不同浓度紫杉醇或阿霉素作用48h后，hsa_circRNA_038632敲低组的细胞株肿瘤细胞增殖率低于对照NC组(P＜0.001)。这项结果初步提示了hsa_circRNA_038632可能影响三阴性乳腺癌对于化疗药物的敏感性，是一个潜在的治疗靶点或治疗选择的预测指标。因此进一步，本发明人检测了89例接受新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者治疗前肿瘤组织中hsa_circRNA_038632的表达情况，然后对每一例检测的三阴性乳腺癌病人进行术后病理评估。其中37例患者疗效达到病理完全缓解(pCR),52例患者疗效为非病理完全缓解(non-pCR)。结果显示(附图3)与pCR组患者相比，non-pCR组患者治疗前组织中的hsa_circRNA_038632表达水平显著升高(P＜0.05)。

本发明的有益效果：本发明首次发现了hsa_circRNA_038632与三阴性乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性之间的相关性，通过检测hsa_circRNA_038632的表达水平可以预测三阴性乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性，从而有助于医生确定三阴性乳腺癌患者的化疗方案。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测hsa_circRNA_038632在正常组织和三阴性乳腺癌组织中不同表达水平的示意图。

图2为hsa_circRNA_038632能够促进三阴性乳腺癌细胞生长增殖、侵袭的示意图。(其中图2A、2B分别为MDA-MB-231和BT549细胞生长曲线图，显示了与不含hsa_circRNA_038632过表达载体的癌细胞相比，含有hsa_circRNA_038632过表达载体的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549细胞生长较快，细胞OD值较高；图2C、2D显示了与不含hsa_circRNA_038632过表达载体的癌细胞相比，含有hsa_circRNA_038632过表达载体的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549细胞生长较快，细胞密度较高)。

图3为在non-pCR与pCR组中hsa_circRNA_038632不同的表达水平示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反应性试剂盒组成(50次反应)

1.DEPC水或无酶水10ml，双蒸水10ml；

2.Trizol 50ml；

3.三氯甲烷100ml；

4.异丙醇100ml；

5. 5×逆转录缓冲液1ml；

6. 25mM氯化镁1ml；

7. 10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1ml；

8. 5U/μl RAN酶抑制剂500μl；

9. 200U/μl MMLV逆转录酶50μl或25U/μlAMV酶50μl；

10. 2×实时定量PCR缓冲液2ml；

11. 5U/μl Taq聚合酶50μl；

12. 5μM hsa_circRNA_038632特异性PCR引物50μl；

(1)其正向引物为5′-AGAGCTGCATCATCCTTGCA3′(SEQ ID NO：2)，

(2)其反向引物为5′-TCTTGTGCAGCTCCAGGAGA-3′(SEQ ID NO：3)。

13. 5μMβ-actin特异性PCR引物30μl

(1)其正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′(SEQ ID NO：4)，

(2)其反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(SEQ ID NO：5)。

14. 10μM环状RNA逆转录引物20μl(随机引物Random hexamers)。

15. 10μMβ-actin特逆转录引物20μl(随机引物Random hexamers)。

实施例2检测组织样本中的hsa_circRNA_038632

1、抽提组织RNA

取组织标本与研钵中加入液氮研磨标本；于研钵中加入0.6ml Trizol研钵标本，研磨成匀浆后用药勺加入tube管中；于tube管加入0.4ml Trizol；加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间并进行EB胶电泳检测RNA质量，-70℃保存。

2、特异性逆转录

使用普洛麦格Promega公司的逆转录试剂盒(A3500)和上海吉玛生物技术有限公司生产的逆转录特异性引物(QPM010)对hsa_circRNA_038632进行逆转录。20μL逆转录反应的体系如表1所示：

表1：20μL逆转录反应的体系

在进行逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混合成逆转录混合液，用手指轻弹装试剂的管子，将逆转录混合液用移液器吸打几次，不能用振荡器。逆转录程序为：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃10分钟。

3、hsa_circRNA_038632特异性实时定量PCR检测

先将hsa_circRNA_038632逆转录产物分别稀释至2倍，然后混匀。20μL反应体系如表2所示：

表2：20μL实时定量PCR反应体系

hsa_circRNA_038632实时定量PCR反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃12秒，62℃35秒。使用SYBR-Green染料进行实时定量PCR扩增。

4、测定CT指标

CT指同一样品中，待检hsa_circRNA_038632与内参β-actin平均Ct值的差值。即hsa_circRNA_038632CT＝hsa_circRNA_038632MeanCT-control MeanCT，本发明中，CT为hsa_circRNA_038632与β-actin的平均CT值的差值，获得相对定量ΔCT值，并进行判断。

实施例3hsa_circRNA_038632与三阴性乳腺癌病人新辅助化疗反应性的关系

发明人检测了89例接受新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者治疗前肿瘤组织中hsa_circRNA_038632的表达情况，然后对每一例检测的三阴性乳腺癌病人进行术后病理评估。按照国际抗癌联盟(UICC)实体瘤通用疗效评定标准进行。将疗效pCR的患者定义为化疗有效，将non-pCR的患者定义为化疗无效/欠敏感。所纳入患者均为女性，均由空心针穿刺确诊为乳腺浸润性癌，病理免疫组化结果显示为三阴型。影像学检测证实无远处转移。均采用紫杉醇联合蒽环类的新辅助化疗方案进行6周期的化疗。其中37例患者疗效达到pCR，52例患者疗效为non-pCR。根据归一化和标准化，使用1og2-ratio比较表达量的差异,结果用差异倍数(Fold Change)及校正后的显著水平(P值)两个水平进行评估，Fold change＝log2(non-pCR/pCR)。结果显示(附图3)与pCR组患者相比，non-pCR组患者治疗前组织中的hsa_circRNA_038632表达水平显著升高(P＜0.001)。统计学分析采用Graphpad Prism7软件进行统计学分析及作图。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省人民医院

<120> 一种环状RNA检测试剂盒预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反应性

<130> 12.3

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1708

<212> DNA

<213> human

<400> 1

tctctcctgg agctgcacaa gaggaggaaa gccctgactg agcctgaggc ccgatactac 60

ctacggcaaa ttgtgcttgg ctgccagtac ctgcaccgaa accgagttat tcatcgagac 120

ctcaagctgg gcaacctttt cctgaatgaa gatctggagg tgaaaatagg ggattttgga 180

ctggcaacca aagtcgaata tgacggggag aggaagaaga ccctgtgtgg gactcctaat 240

tacatagctc ccgaggtgct gagcaagaaa gggcacagtt tcgaggtgga tgtgtggtcc 300

attgggtgta tcatgtatac cttgttagtg ggcaaaccac cttttgagac ttcttgccta 360

aaagagacct acctccggat caagaagaat gaatacagta ttcccaagca catcaacccc 420

gtggccgcct ccctcatcca gaagatgctt cagacagatc ccactgcccg cccaaccatt 480

aacgagctgc ttaatgacga gttctttact tctggctata tccctgcccg tctccccatc 540

acctgcctga ccattccacc aaggttttcg attgctccca gcagcctgga ccccagcaac 600

cggaagcccc tcacagtcct caataaaggc ttggagaacc ccctgcctga gcgtccccgg 660

gaaaaagaag aaccagtggt tcgagagaca ggtgaggtgg tcgactgcca cctcagtgac 720

atgctgcagc agctgcacag tgtcaatgcc tccaagccct cggagcgtgg gctggtcagg 780

caagaggagg ctgaggatcc tgcctgcatc cccatcttct gggtcagcaa gtgggtggac 840

tattcggaca agtacggcct tgggtatcag ctctgtgata acagcgtggg ggtgctcttc 900

aatgactcaa cacgcctcat cctctacaat gatggtgaca gcctgcagta catagagcgt 960

gacggcactg agtcctacct caccgtgagt tcccatccca actccttgat gaagaagatc 1020

accctcctta aatatttccg caattacatg agcgagcact tgctgaaggc aggtgccaac 1080

atcacgccgc gcgaaggtga tgagctcgcc cggctgccct acctacggac ctggttccgc 1140

acccgcagcg ccatcatcct gcacctcagc aacggcagcg tgcagatcaa cttcttccag 1200

gatcacacca agctcatctt gtgcccactg atggcagccg tgacctacat cgacgagaag 1260

cgggacttcc gcacataccg cctgagtctc ctggaggagt acggctgctg caaggagctg 1320

gccagccggc tccgctacgc ccgcactatg gtggacaagc tgctgagctc acgctcggcc 1380

agcaaccgtc tcaaggcctc ctaatagctg ccctcccctc cggactggtg ccctcctcac 1440

tcccacctgc atctggggcc catactggtt ggctcccgcg gtgccatgtc tgcagtgtgc 1500

cccccagccc cggtggctgg gcagagctgc atcatccttg caggtggggg ttgctgtata 1560

agttattttt gtacatgttc gggtgtgggt tctacagcct tgtccccctc cccctcaacc 1620

ccaccatatg aattgtacag aatatttcta ttgaattcgg aactgtcctt tccttggctt 1680

tatgcacatt aaacagatgt gaatattc 1708

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 2

agagctgcat catccttgca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

tcttgtgcag ctccaggaga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

ctccttaatg tcacgcacga t 21

Claims (4)

1.一种检测环状RNA的试剂在制备预测三阴性乳腺癌新辅助化疗敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNA为hsa_circRNA_038632，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测hsa_circRNA_038632的PCR扩增引物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，检测hsa_circRNA_038632的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2～3所示。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶、随机逆转录引物；实时定量PCR缓冲液、内参实时定量PCR引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶、双蒸水。

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