CN111394462A - 一种肝癌索拉非尼耐药circRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种肝癌索拉非尼耐药circRNA标志物及其应用 Download PDF

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CN111394462A CN202010285639.4A CN202010285639A CN111394462A CN 111394462 A CN111394462 A CN 111394462A CN 202010285639 A CN202010285639 A CN 202010285639A CN 111394462 A CN111394462 A CN 111394462A
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Abstract

本发明公开了一种用于肝癌索拉非尼耐药诊断的circRNA标志物,所述circRNA标志物为circRNA‑SORE(circRNA_104797),其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的标志物的检测试剂可用于制备肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒以及肝癌预后评估试剂盒。本发明通过诊断肝癌索拉非尼耐药的试剂盒检测肝癌中的circRNA表达,有助于提前判断肝癌患者对索拉非尼的疗效。不仅可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后,即刻测定,在使用索拉非尼前即可评估药物疗效,为患者提供个性化的治疗方案,快速掌握病情预后。而且可以通过患者血清外泌体检测,检测方便,应用范围广泛。

Description

一种肝癌索拉非尼耐药circRNA标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地,涉及一种肝癌索拉非尼耐药circRNA标志物及其应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌,全球发病率不断上升。在2018年,HCC是全球第六大最常被诊断的癌症,也是第四大与癌症相关的死亡原因。索拉非尼是首个获得FDA批准的晚期HCC靶向治疗药物。先前的研究表明,索拉非尼将不符合肝移植或切除术资格的晚期HCC患者的中位总生存期(OS)延长了2.3到3个月。但是,许多HCC患者在治疗数月后对索拉非尼反应较差或出现耐药性。通常在治疗后6个月内观察到HCC中的索拉非尼耐药性。有力的证据表明索拉非尼在肝癌中的原发性耐药性和获得性耐药涉及多种机制,包括自噬,上皮-间质转化,肿瘤干细胞,肿瘤微环境和表观遗传调控,并建议涉及许多信号通路,例如如Wnt/β-catenin,TGFβ,Ras/MEK/ERK,PI3K/Akt,TNFα/NF-κB和JAK/STAT通路。但是,索拉非尼耐药的机制,特别是在体内和肝癌患者中,尚未得到很好的研究,仍然知之甚少。
环状RNA(circRNA)是一类内源非编码RNA(ncRNA),它们在真核转录组中显示复杂的组织和阶段特异性表达。与线性ncRNA相比,circRNA由于其闭环结构而更加稳定。越来越多的证据表明circRNA在各种与癌症相关的过程中起作用,例如肿瘤形成,进展,复发和耐药性。circRNA的最显著功能之一是通过直接结合mRNA充当miRNA海绵。例如,ciRS-7是第一个被广泛认知的circRNA,它与miR-7结合并作为特定的miR-7抑制剂来调节各种癌症中miR-7下游的基因。最近的研究表明,circRNAs也可以通过与蛋白质相互作用来发挥作用。
外泌体是一类细胞外囊泡,在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用,例如维持正常生理,调节免疫反应和刺激肿瘤进展。肿瘤来源外泌体在肿瘤进展中具有重要的基础作用。最近的研究表明,肿瘤来源的外泌体可能在包括HCC在内的各种恶性肿瘤中充当耐药性的传递者。此外,在某些癌症中,circRNA富含外泌体,因此可以用作一类基于外泌体的癌症生物标记物。因此circRNA在诊断肝癌索拉非尼耐药中具有巨大应用价值。
发明内容
为解决现有肝癌索拉非尼耐药诊断技术的不足,本发明提供了一种circRNA标志物,所述标志物是circRNA-SORE(circRNA_104797),其cDNA序列信息如SEQ ID NO.1所示。使用本发明的circRNA标志物可以通过检测肝癌组织和血清外泌体进行肝癌索拉非尼耐药的早期诊断。
本发明提供一种肝癌索拉非尼耐药的circRNA标志物circRNA-SORE(circRNA_104797),其cDNA序列信息如SEQ ID NO.1所示。
还提供一种上述标志物的检测试剂在制备肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒中的应用,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物,上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。
进一步地,所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、荧光定量PCR反应所需试剂。反转录反应所需试剂包括RNase free ddH2O,gDNA digester Mix,
Figure BDA0002448408550000021
III Super Mix,Primer Mix,优选地,
Figure BDA0002448408550000027
III Super Mix包含gDNA digester抑制剂、dNTP、RNase抑制剂和
Figure BDA0002448408550000022
III Reverse Transcriptase。Primer Mix包含优化配比的Oligo(dT)18和Random Primers N6。荧光定量PCR反应所需试剂为Hieff
Figure BDA0002448408550000026
qPCR SYBR GreenMaster Mix。优选地,Hieff
Figure BDA0002448408550000025
qPCR SYBR Green Master Mix包含
Figure BDA0002448408550000024
Taq DNAPolymerase、
Figure BDA0002448408550000023
Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+
进一步地,所述试剂盒还包括RNA提取所需试剂。RNA提取所需试剂根据提取方法不同所需试剂不同。优选地,采用Trizol法提取RNA,所需试剂包括Trizol、异丙醇、DEPC处理的75%乙醇等。
进一步地,所述试剂盒还包含血清样品外泌体分离试剂。如RNase。
还提供一种检测所述circRNA标志物的肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒。所述试剂盒包含检测上述circRNA-SORE(circRNA_104797)的上下游引物,上下游引物的序列信息如SEQ ID NO.2-3所示。进一步地,还包含反转录反应所需试剂、荧光定量PCR反应所需试剂、RNA提取所需试剂。
具体而言,本发明解决技术问题的技术方案包括:
1.建立索拉非尼耐药的肝癌细胞株。
2.肝癌索拉非尼耐药的circRNA差异表达谱分析:将索拉非尼耐药和索拉非尼敏感的肝癌细胞株的circRNA差异表达谱分析,在索拉非尼耐药和索拉非尼敏感的肝癌细胞株上进行验证,筛选出差异表达的circRNA。
3.对已筛选的差异表达circRNA,在经过手术切除肝癌且术后服用索拉非尼的患者中,验证肝癌组织circRNA表达量与患者预后的关系。
4.对已筛选的差异表达circRNA,在经过手术切除肝癌且术后服用索拉非尼的患者中,验证患者血清外泌体circRNA表达量与患者对索拉非尼敏感性的关系。
上述步骤中circRNA表达量通过QPCR进行验证。
采用QPCR进行差异表达circRNA的验证,具体操作步骤:
(1)提取样本总RNA;
(2)总RNA中加入Epicentre公司生产的RNase R,去除线性RNA并富集circRNA;
(3)逆转录成cDNA;
1.RNase free离心管中加入5x gDNA digester Mix 3μL,模版RNA 10pg—5μg,加入RNase free ddH2O定容至15μL,42℃孵育2分钟。
2.上述反应液15μL,加入5x
Figure BDA0002448408550000031
III Super Mix 4μL,Primer Mix 1μL形成20μL逆转录反应体系。
3.逆转录程序设置为25℃5分钟,55℃15分钟,85℃5分钟。
4.逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,放置于-80℃。
(4)使用Bio-Rad CFX96系统进行荧光定量PCR;
1.冰上配置下述体系:Hieff
Figure BDA0002448408550000032
qPCR SYBR Green Master Mix 25μL,10μM浓度的Forward Primer 1μL,10μM浓度的Reverse Primer 1μL,cDNA原液稀释5-10倍后的cDNA溶液1-5μL,无菌超纯水定容至50μL。
2.扩增程序:预变性95℃30秒,1个循环;变性95℃10秒,退火55-60℃20秒,延伸72℃20秒,共40个循环。
(5)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
步骤1具体操作为
(1.1)肝癌组织标本在组织破碎仪进行破碎,细胞标本及破碎后的组织加入Trizol,室温保存5min;
(1.2)加氯仿0.2ml,震荡后充分混匀,室温下放置5-10min;
(1.3)12000rpm高速离心15min,吸取上层水相到另一新离心管,注意不要吸到两层水相之间的蛋白。移入新管,加入等体积的-20摄氏度预冷的预冷异丙醇,充分颠倒混匀,置于冰上10min;
(1.4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液,按1ml/ml Trizol的比例加入DEPC水处理的75%乙醇洗涤沉淀(4℃保存),洗涤沉淀物,振荡混合,4℃下12000rpm高速离心5min;
(1.5)弃去乙醇液体,室温下放置5min以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀;
(1.6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-70℃
针对患者血清提取外泌体的circRNA,需要先将患者血清11000*g,70分钟,超速离心2次,获得血清外泌体,外泌体中加入RNase。之后步骤与上述提取RNA步骤,富集circRNA,逆转录,荧光定量实时PCR,分析步骤一样。
本发明还提供了一种上述标志物的检测试剂在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物,上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。进一步地,所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。更进一步地,还包括血清样品外泌体分离试剂。
本发明还提供了一种肝癌预后评估试剂盒,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物,上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。进一步地,所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。更进一步地,还包括血清样品外泌体分离试剂。
本发明的有益效果是:
1.目前缺乏肝癌索拉非尼耐药的标志物,本发明提供的组织的circRNA是一种新的生物标志物。结果易于检测,稳定可靠,有助于肝癌索拉非尼耐药的辅助诊断,并且为癌症耐药标志物的研究提供借鉴意义。
2.通过诊断肝癌索拉非尼耐药的试剂盒检测肝癌中的circRNA表达,有助于提前判断肝癌患者对索拉非尼的疗效。不仅可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后,即刻测定,在使用索拉非尼前即可评估药物疗效,为患者提供个性化的治疗方案,快速掌握病情预后。而且可以通过患者血清外泌体检测,检测方便,应用范围广泛。
3.circRNA检测试剂盒来源于circRNA芯片分析,并进行QPCR方法在大样本中进行验证,最终服务于一线临床问题,保证了试剂盒来源可靠,可应用性强,为相关的生物标志物研发提供经验。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明;
图1为索拉非尼耐药HepG2肝癌细胞株与正常HepG2肝癌细胞株的circRNA芯片测序的circRNA富集的火山图,图中,最右点为耐药HepG2肝癌细胞株中circRNA_104797的表达;
图2为索拉非尼耐药肝癌细胞株与正常肝癌细胞株(LM3、HepG2、SKhep1)的circRNA-SORE的表达量分析图,其中,横坐标P代表正常组,R代表耐药组;
图3为索拉非尼治疗肝癌患者血清外泌体circRNA-SORE表达量与患者索拉非尼应答关系图,其中,L表示血清外泌体circRNA-SORE表达量低的患者,H表示血清外泌体circRNA-SORE表达量高的患者。
图4为索拉非尼治疗肝癌患者(N=60,无疾病复发生存)肝癌组织circRNA-SORE表达量与患者预后关系图;
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到,其中,LM3细胞株购自中国武汉典型培养物保藏中心、HepG2、SKhep1细胞株购自美国ATCC公司。
发明人将肝癌细胞株LM3、HepG2、SKhep1长期进行索拉非尼诱导,使其成为对索拉非尼耐药的肝癌细胞株LM3-SR、HepG2-SR、SKhep1-SR,分别与正常肝癌细胞株(LM3-WT、HepG2-WT、SKhep1-WT)组成为3对肝癌细胞株。
实施例1肝癌索拉非尼耐药的circRNA筛选
(1)总RNA提取
(1.1)在索拉非尼耐药HepG2细胞和正常HepG2细胞中分别加入Trizol,室温保存5min;
(1.2)加氯仿0.2ml,震荡后充分混匀,室温下放置5-10min;
(1.3)12000rpm高速离心15min,吸取上层水相到另一新离心管,注意不要吸到两层水相之间的蛋白。移入新管,加入等体积的-20摄氏度预冷的预冷异丙醇,充分颠倒混匀,置于冰上10min;
(1.4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液,按1ml/ml Trizol的比例加入DEPC处理的75%乙醇洗涤沉淀沉淀物(4℃保存),振荡混合,4℃下12000rpm高速离心5min;
(1.5)弃去乙醇液体,室温下放置5min以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀;
(1.6)用Nanodrop2000紫外紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度,RNA冻存于-70摄氏度;
(2)总RNA中加入Epicentre公司生产的RNase R,去除线性RNA并富集circRNA,由上海康成生物科技有限公司进行circRNA芯片测序检测;
(3)根据circRNA芯片检测结果(如图1所示),circRNA-SORE(circRNA_104797)的表达在索拉非尼耐药的细胞株中表达明显上升。
实施例2荧光实时定量PCR验证差异表达的circRNA
(1)根据circRNA芯片的检测结果,选择circRNA-SORE(circRNA_104797)进行细胞株上QPCR验证。按照实例1中的总RNA提取方法,将LM3、HepG2、SKhep1 3对索拉非尼耐药和索拉非尼敏感肝癌细胞株进行总RNA提取。
(2)总RNA中加入Epicentre公司生产的RNase R,去除线性RNA并富集circRNA;
(3)逆转录成cDNA:
1.RNase free离心管中加入5x gDNA digester Mix 3μL,模版RNA 10pg—5μg,加入RNase free ddH2O定容至15μL,42℃孵育2分钟。
2.上述反应液15μL,加入5x
Figure BDA0002448408550000061
III Super Mix 4μL,Primer Mix 1μL形成20μL逆转录反应体系。
3.逆转录程序设置为25℃5分钟,55℃15分钟,85℃5分钟。
4.逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,放置于-80℃。
(4)使用Bio-Rad CFX96系统进行荧光定量PCR;
1.冰上配置下述体系:Hieff
Figure BDA0002448408550000062
qPCR SYBR Green Master Mix 25μL,10μM浓度的Forward Primer 1μL,10μM浓度的Reverse Primer 1μL,cDNA原液稀释5-10倍后的cDNA溶液1-5μL,无菌超纯水定容至50μL。
2.扩增程序:预变性95℃30秒,1个循环;变性95℃10秒,退火55-60℃20秒,延伸72℃20秒,共40个循环。
(5)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。分析发现,如图2所示,在3对肝癌细胞株中,circRNA-SORE(circRNA_104797)在3种索拉非尼耐药肝癌细胞株中均表达显著升高,进一步说明circRNA-SORE可以作为最终的肝癌索拉非尼耐药标志物。
实施例3肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒
肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上下游引物,上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。利用本发明的试剂盒结合常用的RNA提取试剂以及反转录试剂,可以特异性地检测样本中circRNA-SORE的表达量,有助于提前判断肝癌患者对索拉非尼的疗效。不仅可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后,即刻测定,在使用索拉非尼前即可评估药物疗效,为患者提供个性化的治疗方案,快速掌握病情预后。而且可以通过患者血清外泌体检测,检测方便,应用范围广泛。
发明人在浙江大学医学院附属邵逸夫医院收集了9例肝癌患者的血清标本。患者均接受肝癌手术,术后索拉非尼治疗。验证血清外泌体circRNA表达量与患者对索拉非尼治疗应答的关系。先将患者血清11000×g,70分钟,超速离心2次,获得血清外泌体,外泌体中加入RNase。之后步骤与上述提取RNA步骤,富集circRNA,逆转录,荧光定量实时PCR,分析步骤一样。结果如图3所示,血清外泌体circRNA-SORE表达量低的患者对索拉非尼应答率为80%,血清外泌体circRNA-SORE表达量高的患者对索拉非尼应答率仅为25%。
实施例4肝癌组织circRNA表达量与患者预后关系
发明人在浙江大学医学院附属邵逸夫医院收集了60例肝癌患者的肝癌标本。患者均接受肝癌手术,术后索拉非尼治疗。验证肝癌组织circRNA表达量与患者预后的关系。
肝癌组织进行匀浆破碎后,采用本发明试剂盒按照实例一中的总RNA提取步骤,提取总RNA。按照上述中的步骤依次进行富集circRNA,逆转录RNA成cDNA,QPCR反应,结果分析。结果如图4所示,肝癌组织circRNA-SORE表达量低的患者,无疾病复发生存预后更好。表明circRNA-SORE(circRNA_104797)还可以应用于肝癌预后评估,肝癌预后评估试剂盒中包括circRNA-SORE(circRNA_104797)的上下游引物,上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:2和3所示。利用本发明的试剂盒结合常用的RNA提取试剂以及反转录试剂,可以特异性地检测样本中circRNA-SORE的表达量,并根据表达量情况对患者的预后作出评估。同样地,本发明试剂盒不仅可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后,即刻测定,可以通过患者血清外泌体检测,检测方便,应用范围广泛。
以上实施例用来解释本发明,而不是对本发明进行限制,在本发明的精神和权利要求的保护范围内,对本发明做出的任何修改和改变,都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种肝癌索拉非尼耐药circRNA标志物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgatcacca aagagacaga gactccatca agcagcaaca actccag 47
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgctctagg aggtcagtcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtggagtc agaggtacgg 20

Claims (10)

1.一种肝癌索拉非尼耐药相关circRNA标志物,其特征在于,所述标志物为circRNA-SORE(circRNA_104797),其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述标志物的检测试剂在制备肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3所示。
3.权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。
4.权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包含血清样品外泌体分离试剂。
5.一种肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求5所述的肝癌索拉非尼耐药诊断试剂盒,其特征在于,还包含反转录反应所需试剂、荧光定量PCR反应所需试剂、RNA提取所需试剂。
7.一种权利要求1所述标志物的检测试剂在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3所示。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。
9.权利要求8所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包含血清样品外泌体分离试剂。
10.一种肝癌预后评估试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含circRNA-SORE(circRNA_104797)的上、下游引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3所示。
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